PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC APERGILLUSS NIGER CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE CAO ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

Kinh Doanh - Tiếp Thị - Báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, luận văn thạc sĩ, nghiên cứu - Y dược - Sinh học TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA: LÝ – HÓA – SINH ---------- LÊ THỊ THU HÀ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC APERGILLUSS NIGER CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE CAO ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 4 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ của ngƣời khác. Để hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệ p này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: - Giáo viên hƣớng dẫn tôi, Th.S Phan Thị Thanh Diễm, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và truyền niềm đam mê nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. - Ban giám hiệu, các thầy cô trƣờng Đại học Quảng Nam, đặc biệ t là các thầy cô trong Khoa Lý – Hóa – Sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm của mình cho chúng tôi trong suốt thời gian học tậ p và quá trình làm khóa luận. - Xin cảm ơn những lời động viên, khích lệ của bạn bè, đặc biệt là các bạ n trong lớp DT122SSH01 đã góp ý, chia sẻ giúp tôi rất nhiều trong quá trình thự c hiện khóa luận. Do trình độ còn hạn chế về kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệ m nên trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp khó tránh những thiếu sót, tôi rất mong đƣợc sự góp ý kiến của thầy cô giáo để bài khóa luận của tôi đƣợc hoàn chỉnh hơn. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn và kính chúc quý thầy cô dồ i dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạ t kiến thức cho thế hệ mai sau. Quảng Nam, tháng 4 năm 2016 Sinh viên thực hiện Lê Thị Thu Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệ u và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả khóa luận Lê Thị Thu Hà DANH MỤC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Hàm lƣợng pectin trong các loại trái cây 6 1.2 Phân loại enzyme pectinase 12-13 1.3 Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinase 18 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với cơ chất cảm ứng khác nhau 25 2.2 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với nguồn nitơ khác nhau 26 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc phân lập đƣợc. 29-30 3.2 Sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng nấm mốc 32 3.3 Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 34 DANH MỤC VIẾT TẮT A : Aspergillus MT : môi trƣờng PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar PEL : Pectate lyase PNL : Pectin lyase PMG : Polymethylgalacturonase DANH MỤC HÌNH Số hiệ u hình Tên hình Số trang 1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của pectin 5 1.2 Cấu trúc của pectinesterase từ carrot 8 1.3 Cấu tạo của Aspergillus 21 3.1 Các đặc điểm hình thái của chủng Aspergillus niger 31 3.2 Tốc độ sinh trƣởng của các chủng nấm mốc A. niger 33 3.3 Tốc độ sinh trƣởng của chủng H5(A. Sau 36h, B. Sau 48h) 33 3.4 Vòng phân giải pectin của chủng H1 34 3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng có cơ chất là pectin 35 3.6 Ảnh hƣởng của chất cảm ứng đến hoạt độ của enzyme pectinase. 35 3.7 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến hoạt độ của enzyme pectinase 36 3.8 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có nguồn cung cấp nitơ là (NH4)2SO4 (A) và vòng phân giải pectin của enzyme thu đƣợc (B) 37 3.9 Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của enzyme pectinase 37 3.10 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có pH là 5,5 (A) và vòng phân giải pectin của enzyme thu đƣợc (B) 38 3.11 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme pectinase 38 3.12 Vòng phân giải pectin của chủng H1ở 25 oC (A) và 35 oC (B). 39 3.13 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme pectinase 40 MỤC LỤC Phần 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1.1. Lí do chọn đề tài .............................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2 1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ................................................................... 2 1.4. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 2 Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Tổng quan về enzyme pectinase ..................................................................... 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ....................................................................................... 3 1.1.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 3 1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .............................................................. 4 1.1.2. Cơ chất của enzyme pectinase ..................................................................... 5 1.1.3. Khái niệm enzyme pectinase ........................................................................ 7 1.1.4. Cấu tạo enzyme pectinase ............................................................................ 7 1.1.5. Đặc điểm của enzyme pectinase .................................................................. 7 1.1.5.1. Enzyme pectinase từ nguồn thực vật: ....................................................... 7 1.1.5.2. Enzyme pectinase từ vi sinh vật ................................................................ 9 1.1.6. Phân loại enzyme pectinase ....................................................................... 12 1.1.7. Cơ chế tác động của enzyme pectinase ...................................................... 15 1.1.7.1. Pectinesterase (PE) .................................................................................. 15 1.1.7.2. Protopectinase ......................................................................................... 15 1.1.7.3. Các enzyme khử mạch polymer .............................................................. 15 1.1.8. Các ứng dụng cơ bản của enzyme pectinase .............................................. 16 1.1.8.1. Ứng dụng trong công nghiệp rƣợu vang ................................................. 16 1.1.8.2. Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast ............. 19 1.4. Tổng quan về nấm Aspergillus niger ............................................................ 20 1.4.1. Giới thiệu chung ......................................................................................... 20 1.4.2. Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger.............................................. 21 1.4.3. Cấu tạo cơ quan sinh sản ............................................................................ 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 23 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ...................................................................... 23 2.1.1. Địa điểm, thời gian ..................................................................................... 23 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 23 2.1.3. Thiết bị, hoá chất ........................................................................................ 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 24 2.2.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ........................................................................ 24 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập ................................................................................ 24 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc ................................................................. 25 2.2.4. Phƣơng pháp giữ giống .............................................................................. 25 2.2.5. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase củ a các chủng nấm mốc thu đƣợc ..................................................................................... 25 2.2.6. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến sinh tổng hợ p enzyme pectinase ................................................................................................. 25 2.2.7. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợ p enzyme pectinase ................................................................................................. 26 2.2.8. Phƣơng pháp xác định độ pH ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợ p enzyme pectinase ................................................................................................. 26 2.2.9. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợ p enzyme pectinase ................................................................................................. 26 2.2.10. Phƣơng pháp xác định độ ẩm. .................................................................. 27 2.2.11. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase........................................................................... 27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 28 3.1. Phân lập nấm từ vỏ quả bƣởi, cam và đất. .................................................... 28 3.2. Đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng nấm mốc Aspergillus niger phân lập đƣợc. ............................................................................................. 32 3.3. Khả năng sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm phân lập đƣợc. ........ 33 3.4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzyme pectinase .... 34 3.4.1. Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợ p enzyme pectinase của chủng H1 ........................................................................................ 34 3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợ p enzyme pectinase của chủng H1. ....................................................................................................... 36 3.4.3. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase củ a chủng H1 .............................................................................................................. 37 3.4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase củ a chủng H1 .............................................................................................................. 38 3.4.5. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợ p enzyme pectinase của chủng H1 ........................................................................................ 40 Phần 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 41 1. Kết luận ............................................................................................................ 41 2. Kiến nghị .......................................................................................................... 41 Phần 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 42 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Hàm lƣợng pectin trong các loại trái cây 6 1.2 Phân loại enzyme pectinase 12-13 1.3 Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinase 18 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với cơ chất cảm ứng khác nhau 25 2.2 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với nguồn nitơ khác nhau 26 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc phân lập đƣợc. 29-30 3.2 Sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng nấm mốc 32 3.3 Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 34 DANH MỤC VIẾT TẮT A : Aspergillus MT : môi trƣờng PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar PEL : Pectate lyase PNL : Pectin lyase PMG : Polymethylgalacturonase DANH MỤC HÌNH Số hiệ u hình Tên hình Số trang 1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của pectin 5 1.2 Cấu trúc của pectinesterase từ carrot 8 1.3 Cấu tạo của Aspergillus 21 3.1 Các đặc điểm hình thái của chủng Aspergillus niger 31 3.2 Tốc độ sinh trƣởng của các chủng nấm mốc A. niger 33 3.3 Tốc độ sinh trƣởng của chủng H5(A. Sau 36h, B. Sau 48h) 33 3.4 Vòng phân giải pectin của chủng H1 34 3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng có cơ chất là pectin 35 3.6 Ảnh hƣởng của chất cảm ứng đến hoạt độ của enzyme pectinase. 35 3.7 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến hoạt độ của enzyme pectinase 36 3.8 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có nguồn cung cấp nitơ là (NH4)2SO4 (A) và vòng phân giải pectin của enzyme thu đƣợc (B) 37 3.9 Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của enzyme pectinase 37 3.10 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có pH là 5,5 (A) và vòng phân giải pectin của enzyme thu đƣợc (B) 38 3.11 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme pectinase 38 3.12 Vòng phân giải pectin của chủng H1ở 25 oC (A) và 35 oC (B). 39 3.13 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme pectinase 40 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Lí do chọn đề tài Enzyme là một trong những chế phẩm sinh học đƣợc quan tâm nhất hiệ n nay, bởi vai trò của nó hết sức quan trọng. Hiện nay enzyme đã đƣợc thu nhận và ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực mang lại hiệu quả thiết thực. Đặc biệ t trong chế biến thực phẩm, chế phẩm enzyme đã đƣợc áp dụng để tạo ra sản phẩm có năng suất và chất lƣợng, rút ngắn thời gian sản xuất hạ đƣợc giá thành sản phẩm. Đối với nƣớc ta ngành công nghệ thực phẩm rất phát triển, do vậy nhu cầu về enzyme phục vụ trong sản xuất rất lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam xƣởng sản xuấ t chế phẩm enzyme rất ít, hàng năm nƣớc ta vẫn phải nhập ngoại một khối lƣợ ng lớn những loại enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b) 12. Pectinase là nhóm enzyme xúc tác cho sự thủy phân các polymer pectin đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm cũng nhƣ xử lý chấ t thải và nhiều lĩnh vực khác. Ở Việt Nam, chế phẩm pectinase đã đƣợc sử dụ ng khá phổ biến và đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Lê Văn Nhƣơng et al., 1978; Phí Quyết Tiến, 1999; Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọ c Hùng, 2008) 12. Tuy nhiên việc nghiên cứu thu nhận enzyme pectinase còn rất hạ n chế. Trong khi đó enzyme pectinase đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lƣợng dịch quả và có tác dụng làm trong nƣớc trái cây cũng nhƣ làm trong rƣợ u vang. Vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm và thu nhận nguồn enzyme ở Việ t Nam là vấn đề cần thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Bên cạnh việ c thu nhận enzyme từ thực vật, thì enzyme pectinase đƣợc thu nhận từ vi sinh vậ t là nguồn thu chủ yếu và đƣợc sử dụng rộng rãi. Nấm mốc đƣợc biết đến nhƣ nguồ n phổ biến nhất cho sản xuất enzyme này. Mặc dù vậy, không phải tất cả nấm mốc đều có khả năng sinh enzyme nhƣ nhau và ngay cả những dòng cùng một giống cũng không có khả năng sinh tổng hợp enzyme với hoạt tính tƣơng đồ ng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004; Parenicova, 2000). Ở Việt Nam, nghiên cứu tổ ng hợp các chế phẩm từ dòng Aspergillus nói chung cũng nhƣ Aspergillus niger nói 2 riêng mới dừng lại ở nghiên cứu thăm dò. Hoạt động của enzyme pectinase đƣợ c biết đến chủ yếu nhờ vào tác động của enzyme này trên pectin có độ methoxyl hóa cao. Chính vì thế, các nguồn phụ phẩm giàu pectin không chỉ đƣợc sử dụ ng nhƣ cơ chất cảm ứng cho quá trình lên men sinh tổng hợp, mà các chủ ng vi sinh vật đƣợc phân lập từ nguyên liệu giàu pectin cũng cho thấy tiềm năng củ a chúng trong việc thu nhận enzyme này 3. Với những ƣu điể m mà enzyme pectinase mang lại cho ngành công nghiệp chế biến rƣợu vang, thì phân lập và tuyển chọ n các dòng Aspergillus niger có khả năng sinh enzyme là hết sức quan trọng và cấ p thiết. Vì lí do đó tôi chọn đề tài nghiên cứu là “Phân lập và tuyển chọn chủ ng nấm mốc Apergilluss niger có khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase cao ứng dụng trong sản xuất rượu vang”. 1.2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập đƣợc một số chủng nấm mốc từ vỏ bƣởi, vỏ cam, đất. - Tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh tổ ng hợp enzyme . - Xác định nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp cho quá trình sinh tổng hợ p cao nhất của chủng Aspergillus niger. - Xác định đƣợc nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme củ a chủng Aspergillus niger. - Xác định đƣợc độ pH tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme củ a chủng Aspergillus niger. 1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Các dòng Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợ p enzyme hoạt tính cao - Phạm vi nghiên cứu: Các dòng Aspergillus niger bản địa đƣợc phân lập từ các nguồn nguyên liệu giàu pectin ở thành phố Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam. 1.4. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp xử lí số liệu - Phƣơng pháp nghiên cứu tổng hợp, so sánh - Phƣơng pháp thực nghiệm 3 Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về enzyme pectinase 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu 1.1.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới Pectinase đã đƣợc nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạ nh rất đa dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzyme pectinase cũng đƣợ c nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí. Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzyme pectinase đƣợc tiến hành nhiều trên đối tƣợng khác nhau nhƣ: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000).8, 11 Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase đề u là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiề u công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzyme pectinase củ a các chủng vi sinh vật nhƣ: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợ p các enzyme phân giải pectin “hay Solis (1997) đã “Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus”. 12 Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hƣởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme pectinas. Enzyme pectinase đƣợc tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trƣờng có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trƣờng giàu acid galacturonic hoặ c glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997). 10 4 Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổ ng hợp cảm ứng enzyme pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cacbon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trƣờng nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000, trong công trình nghiên cứu “Ảnh hƣởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợ p pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiề u nguồn cacbon vào cùng một môi trƣờng nuôi cấy nhƣ: pectin và glucose, pectin và glycerol,...gần đây các nghiên cứu đều hƣớng tới sử dụng các phế liệ u, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứ ng enzyme pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002). 8,10 1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nƣớc về enzyme pectinase, các hƣớ ng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzyme pectinase trên đối tƣợng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus. Có các công trình nghiên cứu nhƣ: - Phân lập và sàng lọc một số chủng Aspergillus niger sinh pectinase từ mộ t số vỏ củ, quả ở thành phố Huế của thầy giáo Trần Quốc Dung, Nguyễn Thị Kim Cơ, Nguyễn Thị Sƣơng, Nguyễn Thị Thu Chung - Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đạ i học Huế - Phan Thị Thanh Diễm, Nguyễn Hoàng Lan Anh-Trƣờng Đại họ c Quảng Nam. - Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase ở một số chủng Bacillus- Đặng Thị Mai Phƣơng. - Nghiên cứu khả năng sinh pectin methylesterase từ một số dòng Aspergillus niger đƣợc phân lập và tuyển chọn của Trần Thanh Trúc, Nguyễn Văn Mƣời, Nguyễn Văn Thành, Dƣơng Đỗ Thành Lân, Nguyễn Thị Kiều Linh, Lê Vƣơng Hải Nguyệt, Lê Thị Ngọc Hiếu, Nguyễn Tấn Đạt, Võ Thị Kiên Hả o, Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Vƣơng Tố Trinh 2012. 5 1.1.2. Cơ chất của enzyme pectinase Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật. Về phƣơng diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α- 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin gồ m có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl của acid galacturonic có thể đƣợc ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và đƣợc trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na+ , K+hoặc NH4+, hay bị decacboxyl hoá … Công thức nguyên của acid galacturonic: C6H10O7 Công thức cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin đƣợ c giới thiệu ở hình 1.1. Hình 1.1. Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của pectin Dựa vào loại biến đổi của khung sƣờn chính mà pectin đƣợc phân loạ i thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin (Be Miller, 1986). 10 Protopectin Đây là dạng pectin nguyên thuỷ. Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạ o ra pectin hay acid pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nƣớc đƣợc tìm thấy trong các mô thực vậ t (Kilara, 1982). Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm 6 nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau. Dƣới tác dụng củ a acid (dung dịch HCl 0.03), enzyme protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan. 2, 10 Acid pectic ( acid polygalacturonic) Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lƣợng các nhóm methoxyl không đáng kể. Dạng muối của acid pectic gọi là pectat. Acid pectinic Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lƣợ ng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của acid pectinic gọ i là pectinat (Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng gel với đƣờ ng và acid, hoặc với một số hợp chất khác nhƣ muối canxi (nếu hàm lƣợng methyl vừa đủ thấp). 2, 10 Pectin Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp gồm nhiều thành phầ n khác nhau mà trong đó acid pectic là thành phần chủ yếu. 7 Bảng 1.1. Hàm lƣợng pectin trong các loại trái cây Trái cây Hàm lƣợng pectin ( trọng lƣợng tƣơi) Táo 0,71-0,84 Cam 2,34-2,38 Chuối 0,59-1,28 0,59-1,28 Cà rốt 1,17-2,29 Nho 0,09-0,28 Bƣởi 3,30-4,50 Chanh 2,80-2,99 Cam 2,34-2,38 Mơ 0,71-1,32 7 1.1.3. Khái niệm enzyme pectinase Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic,- galactose, metanol. Enzyme pectinase đƣợc tìm thấy ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá. Trong các loại khác chỉ có enzyme pectinesterase. Chúng cũng có thể đƣợc chiết xuất từ nấm mốc. Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu “thao tác trên gen trên chủng Aspergillus nhằm tăng khả năng tổng hợp các enzyme phân giải pectine. 11 1.1.4. Cấu tạo enzyme pectinase Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic. Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic. Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đƣờng galactose cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế - H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO. Ngƣời ta cho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột. Trọng lƣợng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC. 1.1.5. Đặc điểm của enzyme pectinase 1.1.5.1. Enzyme pectinase từ nguồn thực vật: Pectinesterase: - Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme PE. Enzyme này thƣờng tồn tại dƣới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ƣu trong khoảng pH hơi kiề m. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, nhƣ Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hƣớng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme. - Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Khi bƣớc vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giả m xuống, nhƣng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trƣng của trái 8 chín. PE2 có khối lƣợng phân tử 23kD, pH tối ƣu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50 sau 5 phút đun ở 67oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ củ a enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự. 10 - PE của đậu nành là protein có khối lƣợng phân tử 33kD, hoạt động tối ƣu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm đƣợc hình thành do quá trình để methyl hoá các phân tử galacturonic acid. - Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lƣợ ng phân tử là 30kD, nhƣng có điểm đẳng điệ n khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đƣa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại. - Polyol có khối lƣợng phân tử thấp, nhƣ glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose.PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lƣợng phân tử 36,kD, nhƣng có điểm đẳng điệ n khác nhau là 10,05 và 11,0, theo thứ tự. pH tối ƣu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0. 10 - Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyme, mộ t trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơ n khi bị tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lƣợng là 51kD và 36kD, theo thứ tự.10 Hình 1.2. Cấu trúc của pectinesterase từ carrot 9 - Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme củ a kiwi có cùng khối lƣợng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điệ n là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt. Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thƣờng đƣợc tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩ n gây bệnh, chẳng hạn nhƣ Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG củ a thực vật bậc cao đƣợc nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín. 8 Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dƣới hai dạng, và cả hai đề u là endo-enzyme.PG1 có khối lƣợng phân tử 84kD và có khoảng 50 bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC.PG2 có khối lƣợng phân tử 44kD và có khoảng 50 bị bất hoạt ở 57oC. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6. Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạ o ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ƣu thế. Sự thủ y phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thƣớc cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối vớ i các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạ o thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan. 15 1.1.5.2. Enzyme pectinase từ vi sinh vật Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Nấm mốc: Penicillium glaucum, P.ehrlichii, P.chrysogenum, P.expanam, P.cilrimim, Aspergillus awamori, A.foetidus, A.niger, A.terrus, A.saitoi, A.aureus, A.oryzae, A.wentii, Fusarium moniliforme,… Nấm men: Saccharomyces fragilis Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes… 10 Các loài vi sinh vật này thƣờng có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hƣ hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật. Ngƣời ta thƣờng thu pectinase từ canh trƣờng bề mặt hoặc từ canh trƣờng bề sâu củ a nấm mốc. 8 Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp đƣợc enzime này A.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase. Nấm men Sacch.fragilis dƣờng nhƣ chỉ tạo ra endopectintraseliminase. Vi khuẩn Bac.polymyxa, Bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase. Pectinesterase: Pectinesterase thu đƣợc từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ƣu khác nhau: pH tối ƣu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ƣu từ 2,0 đế n 6,5. Trái lại ph tối ƣu của pectinesterase từ nguồn thực vật thƣợng đẳng là từ 6 đến 7,5 – 8. Nhiệt độ tối ƣu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C. Từ 55 đế n 620C thì enzyme bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ƣu của enzyme pectinesterase từ thực vật thƣợng đẳng cao hơn: từ 55 – 600C. 10 Pectinesterase có thể nhận đƣợc từ canh trƣờng nấm mốc A.niger có nhiệt độ tối ƣu là 30 – 45oC, PHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oC và từ thực vậ t (phopt=7,5-8, toopt= 55-60oC). Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộ c vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng nhƣ chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mố c cCnithyrium diplodiella và từ A.niger, trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủ y ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng củ a pectinesterase. Ngoài ra, ngƣời ta đã thu đƣợc enzyme pectinesterase ở trạng thái đông thể và ngƣời ta cũng đã xác lập đƣợc rằng n-axit cuối trong phân tử enzyme là enylalanin.11 Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trƣớc nhấ t là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do và enzyme sẽ thủy phân lần lƣợt cắt liên kết 11 ester dọc theo phân tử pectin. Hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiề u vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa. Chẳng hạn, đố i với tác động của pectinesterase từ nấm mốc A.niger, cần thiết phả i có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70. Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồ n Vi sinh vật. Polygalacturonase thƣờng đƣợc tìm thấy trong các phần tiết ngoạ i bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn nhƣ : Saccharomyces fragilis, Asperigillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum, Neurosrora crassa, các loài Ascomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum. pH tối ƣu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộ c vào nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ƣu nằ m trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzyme đó nhƣng khi tác dụng trên pectin thì lạ i có pH tối ƣu trong khoảng 5,5 – 6. Còn polygalacturonase đƣờng hóa khi tác dụ ng trên pectin thì pH tối ƣu từ 3 – 4 nhƣng khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ƣu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6. 7, 12 Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6 Polygalacturonase đƣờng hóa chủ yếu từ A.niger nếu đƣợc hoạt hóa bằ ng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5. Nhiệt độ tối ƣu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -450 C. Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thƣờng bền vững, nhƣng sẽ bị vô hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C. 12 1.1.6. Phân loại enzyme pectinase Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng: 7 Bảng 1.2. Phân loại enzyme pectinase Stt Enzyme (tên gọ i theo hệ thống) Enzyme (tên thƣờng gọi) Phản ứng xúc tác 1 Pectin- pectinhydrolase pectinesterase Pectin + H2O = n metanol + pectic acid 2 Poly-1,4 galacturonid- glycano hydrolase- PG Endopoly galacturonase (endo-PG) Thủy phân liên kết 1,4-D- galacturonid trong galacturonid không theo một trật tự nào 3 Poly-1,4-D- galacturonidgalactur on-hydrolase Exopoly galacturonase (exo-PG) Thủy phân liên kết 1,4-D- galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự đứt mạch của acid galacturonic 4 Poly-1,4-D- galacturonidmetilest er-glycanohydrolase Endopolymetil- galacturonase (Endo-PMG) Thủy phân liên kết 1,4-D- galacturonid trong pectin không theo một trật tự nhất định. 5 Poly-1,4-D- galacturonid digalacturonoliase Exo-pectatliase (exo-PKTE) Thủy phân liên kết 1,4-D- galacturonid trong pectat với sự tạo thành 4,5 aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định. 6 Poly-1,4-D- galacturonid glicanoliase Endopectatliase (PETE) Thủy phân liên kết -1,4-D- galacturonid trong pectat, trong alacturonic với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định 13 7 Poly-1,4-D- galacturonid metylester glicanoliase Endopectinliase (Endo-PTE) Thủy phân liên kết 1,4-D- galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định 7 Poly-1,4-D- galacturonid metylester glicanoliase Endopectinliase (Endo-PTE) Thủy phân liên kết 1,4-D- galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định » Pectinesterase (PE) Xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thƣờng tấ n công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu đƣợc từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ƣu khác nhau. Nếu thu từ nguồ n VSV thì pH tối ƣu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ƣu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ƣu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC. Pectinesterase thƣờng đƣợc hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+. » Polygalacturonase Còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kế t 1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử , và endo-PG (endo- poly1,4-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhƣng có chủ yếu ở một số nấ m mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thƣờng có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzyme polygalacturonase đƣợc chia làm bốn loại: » Polymethylgalacturonase: Còn gọi là 1,4-gaclacturonite methylesglucanohydrolase tác dụ ng trên polygalactorunic acid đã đƣợc ethoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại đƣợ c phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối 14 mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu II. » Polygalacturonase Enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng đƣợ c chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiể u II và exo-glucosidase- polygalacturonase kiể u IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả . Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thƣờng bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A. awamori. » Pectate lyase (PEL) Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4--D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endo- poly(1,4--D-galacturonic lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lƣợ ng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cầ n ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase không đƣợc tìm thấy trong cây xanh, nhƣng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rấ t quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. 1, 7 Ngoài ra còn có: » Pectin-transeliminase Hay còn đƣợc gọ i là poly-1,4-galaturonite methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid. » Polygalactorunate-transeliminase Còn đƣợc gọi là poly-1,4D-galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụ ng trên pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL) Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme. 15 1.1.7. Cơ chế tác động của enzyme pectinase Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase Enzyme polygalacturonase (pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. ngƣời ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzyme này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Ngƣời ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hƣởng đấn khả năng xúc tác của enzyme. 3, 4 1.1.7.1. Pectinesterase (PE) Pectinesterase còn đƣợc gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzyme này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. 14 1.1.7.2. Protopectinase Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao. 4 1.1.7.3. Các enzyme khử mạch polymer Chia làm 2 tiểu nhóm: a. Enzyme thủy phân liên kết glycoside (Hydrolase) Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại: - Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin - Exo-PMG: phân cắt lần lƣợt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin. 4, 10 Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại: - Endo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic. - Exo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. 16 b. Enzyme cắt (Lyase): Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đƣa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con đƣờng thủy phân. Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase. Cơ chế hoạt động của các enzyme lyase phân cắt pectin (pectate lyase) đƣợc đƣa ra nhƣ sau: các pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút của nhóm cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao các proton đến các oxy glycosidic, đểlại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5. 3, 4 Các enzyme lyase phân cắt pectin bao gồm: Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4- glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại: - Endo-PMGL: còn gọi là poly (methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin. - Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin. Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. Có 2 loại: - Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide)lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. - Exo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lƣợt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. 1.1.8. Các ứng dụng cơ bản của enzyme pectinase 1.1.8.1. Ứng dụng trong công nghiệp rƣợu vang Rƣợu vang đƣợc sản xuất chủ yếu từ nƣớc ép nho, quá trình sản xuất rƣợ u vang gồm 3 giai đoạn chủ yếu: - Thu hoạch quả - Lên men dịch quả - Xử lí và tàng trữ Bình thƣờng để thu đƣợc dịch quả ngƣời ta phải nghiền nát quả. Khi nghiền sẽ thu đƣợc dịch quả và bã nghiền. Bã nghiền sau khi tách dịch đƣợc đem vào ép. Dịch chảy ra trƣớc khi ép gọi là dịch tự chảy. Dịch tách ra sau khi ép gọi là dịch 17 ép. Thu đƣợc dịch quả đem làm trong rồi lên men. Trong sản xuất rƣợu vang ngƣời ta cũng dùng chế phẩm pecinase để tăng hiệu quả cũng nhƣ để làm trong rƣợu. Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu sau: - Chế phẩm không đƣợc làm giảm chất lƣợng của vang, không đƣợc gây ảnh hƣởng xấu đến hƣơng vị và màu sắc của sản phẩm. Nghĩa là chế phẩm phải đƣợc làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợ ng vang. - Chế phẩm đƣợc đƣa vào dịch hay bã nghiền để tăng cƣờng quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu quả chung và đặc biệt là hiệu suất củ phần tự chảy, có chất lƣợng cao. Để tăng nhanh và tố t quá trình làm trong dịch thì tƣơng quan hoạt độ của các enzyme chính nhƣ endo- PMG là 55.102 đơn vịmg protein chƣa trong chế phẩm, còn enzyme Cx là 57,5 đơn vịmg protein trong 1 lít dung dịch. Trong trƣờng hợp này không cần có mặt PE. Nhƣng nếu hoạt độ của endo- PMG ở trong chế phẩm là 31.102 đơn vị mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vịmg protein. Trong sản xuấ t vang nho giữa hàm lƣợng endo- PMG và Cx phải có sự tƣơng quan nhất đị nh. Khi chế phẩm có hoạt độ endo- PMG là 28,2.102 đơn vịmg protein và Cx là 28,7 đơn vị mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có...

Quảng Nam, tháng 4 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ của người khác Để hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Giáo viên hướng dẫn tôi, Th.S Phan Thị Thanh Diễm, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền niềm đam mê nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

- Ban giám hiệu, các thầy cô trường Đại học Quảng Nam, đặc biệt là các thầy cô trong Khoa Lý – Hóa – Sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm của mình cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập và quá trình làm khóa luận

- Xin cảm ơn những lời động viên, khích lệ của bạn bè, đặc biệt là các bạn trong lớp DT122SSH01 đã góp ý, chia sẻ giúp tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận

Do trình độ còn hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm nên trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp khó tránh những thiếu sót, tôi rất mong được sự góp ý kiến của thầy cô giáo để bài khóa luận của tôi được hoàn chỉnh hơn

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn và kính chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Thu Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong

bất kì công trình nào khác

Tác giả khóa luận

Lê Thị Thu Hà

DANH MỤC BẢNG

1.1 Hàm lượng pectin trong các loại trái cây 6

3.3 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng

DANH MỤC VIẾT TẮT

PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật

Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar

DANH MỤC HÌNH Số hiệu

Số trang

1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của

3.1 Các đặc điểm hình thái của chủng Aspergillus niger 31 3.2 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm mốc A niger 33 3.3 Tốc độ sinh trưởng của chủng H5(A Sau 36h, B Sau 48h) 33

3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong môi trường có cơ chất là

3.13 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme

MỤC LỤC

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Lí do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Phương pháp nghiên cứu 2

Phần 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về enzyme pectinase 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.1.1 Các nghiên cứu trên thế giới 3

1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

1.1.2 Cơ chất của enzyme pectinase 5

1.1.3 Khái niệm enzyme pectinase 7

1.1.4 Cấu tạo enzyme pectinase 7

1.1.5 Đặc điểm của enzyme pectinase 7

1.1.5.1 Enzyme pectinase từ nguồn thực vật: 7

1.1.5.2 Enzyme pectinase từ vi sinh vật 9

1.1.6 Phân loại enzyme pectinase 12

1.1.7 Cơ chế tác động của enzyme pectinase 15

1.1.7.1 Pectinesterase (PE) 15

1.1.7.2 Protopectinase 15

1.1.7.3 Các enzyme khử mạch polymer 15

1.1.8 Các ứng dụng cơ bản của enzyme pectinase 16

1.1.8.1 Ứng dụng trong công nghiệp rượu vang 16

1.1.8.2 Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast 19

1.4 Tổng quan về nấm Aspergillus niger 20

1.4.1 Giới thiệu chung 20

1.4.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger 21

1.4.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản 21

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 23

2.1.1 Địa điểm, thời gian 23

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.3 Thiết bị, hoá chất 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 24

2.2.2 Phương pháp phân lập 24

2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc 25

2.2.4 Phương pháp giữ giống 25

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng nấm mốc thu được 25

2.2.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến sinh tổng hợp enzyme pectinase 25

2.2.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp enzyme pectinase 26

2.2.8 Phương pháp xác định độ pH ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 26

2.2.9 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 26

2.2.10 Phương pháp xác định độ ẩm 27

2.2.11 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Phân lập nấm từ vỏ quả bưởi, cam và đất 28

3.2 Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng nấm mốc Aspergillus niger phân lập được 32

3.3 Khả năng sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm phân lập được 33

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzyme pectinase 34

3.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

DANH MỤC BẢNG

1.1 Hàm lượng pectin trong các loại trái cây 6

3.3 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng

DANH MỤC VIẾT TẮT

PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật

Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar

DANH MỤC HÌNH Số hiệu

Số trang

1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của

3.1 Các đặc điểm hình thái của chủng Aspergillus niger 31 3.2 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm mốc A niger 33 3.3 Tốc độ sinh trưởng của chủng H5(A Sau 36h, B Sau 48h) 33

3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong môi trường có cơ chất là

3.13 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme

1

Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Lí do chọn đề tài

Enzyme là một trong những chế phẩm sinh học được quan tâm nhất hiện nay, bởi vai trò của nó hết sức quan trọng Hiện nay enzyme đã được thu nhận và ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực mang lại hiệu quả thiết thực Đặc biệt trong chế biến thực phẩm, chế phẩm enzyme đã được áp dụng để tạo ra sản phẩm có năng suất và chất lượng, rút ngắn thời gian sản xuất hạ được giá thành sản phẩm Đối với nước ta ngành công nghệ thực phẩm rất phát triển, do vậy nhu cầu về enzyme phục vụ trong sản xuất rất lớn Tuy nhiên, ở Việt Nam xưởng sản xuất chế phẩm enzyme rất ít, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại một khối lượng lớn những loại enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b) [12] Pectinase là nhóm enzyme xúc tác cho sự thủy phân các polymer pectin đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm cũng như xử lý chất thải và nhiều lĩnh vực khác Ở Việt Nam, chế phẩm pectinase đã được sử dụng khá phổ biến và được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Lê Văn Nhương et al., 1978; Phí Quyết Tiến, 1999; Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng, 2008) [12] Tuy nhiên việc nghiên cứu thu nhận enzyme pectinase còn rất hạn chế Trong khi đó enzyme pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong nước trái cây cũng như làm trong rượu vang

Vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm và thu nhận nguồn enzyme ở Việt Nam là vấn đề cần thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao Bên cạnh việc thu nhận enzyme từ thực vật, thì enzyme pectinase được thu nhận từ vi sinh vật là nguồn thu chủ yếu và được sử dụng rộng rãi Nấm mốc được biết đến như nguồn phổ biến nhất cho sản xuất enzyme này Mặc dù vậy, không phải tất cả nấm mốc đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả những dòng cùng một giống cũng không có khả năng sinh tổng hợp enzyme với hoạt tính tương đồng (Nguyễn Đức Lượng, 2004; Parenicova, 2000) Ở Việt Nam, nghiên cứu tổng

hợp các chế phẩm từ dòng Aspergillus nói chung cũng như Aspergillus niger nói

2

riêng mới dừng lại ở nghiên cứu thăm dò Hoạt động của enzyme pectinase được biết đến chủ yếu nhờ vào tác động của enzyme này trên pectin có độ methoxyl hóa cao Chính vì thế, các nguồn phụ phẩm giàu pectin không chỉ được sử dụng như cơ chất cảm ứng cho quá trình lên men sinh tổng hợp, mà các chủng vi sinh vật được phân lập từ nguyên liệu giàu pectin cũng cho thấy tiềm năng của chúng trong việc thu nhận enzyme này [3] Với những ưu điểm mà enzyme pectinase mang lại cho ngành công nghiệp chế biến rượu vang, thì phân lập và tuyển chọn

các dòng Aspergillus niger có khả năng sinh enzyme là hết sức quan trọng và cấp

thiết Vì lí do đó tôi chọn đề tài nghiên cứu là “Phân lập và tuyển chọn chủng

nấm mốc Apergilluss niger có khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase cao ứng dụng trong sản xuất rượu vang”

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập được một số chủng nấm mốc từ vỏ bưởi, vỏ cam, đất

- Tuyển chọn được chủng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh tổng

hợp enzyme

- Xác định nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp

cao nhất của chủng Aspergillus niger

- Xác định được nhiệt độ tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme của

chủng Aspergillus niger

- Xác định được độ pH tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme của

chủng Aspergillus niger

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Các dòng Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp

enzyme hoạt tính cao

- Phạm vi nghiên cứu: Các dòng Aspergillus niger bản địa được phân lập từ

các nguồn nguyên liệu giàu pectin ở thành phố Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam

1.4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp xử lí số liệu

- Phương pháp nghiên cứu tổng hợp, so sánh - Phương pháp thực nghiệm

3

Phần 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về enzyme pectinase

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

1.1.1.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzyme pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng

enzyme pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác nhau như: Fusarium

oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993;

Taragano, 1997; Caltisho, 2000).[8, 11]

Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004) Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác

gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzyme phân

giải pectin “hay Solis (1997) đã “Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể

lai giữa các chủng Aspergillus” [12]

Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme pectinas Enzyme pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997) [10]

4

Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzyme pectinase cũng thay đổi Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cacbon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987) Năm 2000, trong công trình nghiên cứu “Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp

pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều

nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và glycerol, gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzyme pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8,10]

1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzyme pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzyme pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ

Aspergillus

Có các công trình nghiên cứu như:

- Phân lập và sàng lọc một số chủng Aspergillus niger sinh pectinase từ một

số vỏ củ, quả ở thành phố Huế của thầy giáo Trần Quốc Dung, Nguyễn Thị Kim Cơ, Nguyễn Thị Sương, Nguyễn Thị Thu Chung - Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế - Phan Thị Thanh Diễm, Nguyễn Hoàng Lan Anh-Trường Đại học Quảng Nam

- Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase ở một số chủng Bacillus- Đặng Thị Mai Phương

- Nghiên cứu khả năng sinh pectin methylesterase từ một số dòng

Aspergillus niger được phân lập và tuyển chọn của Trần Thanh Trúc, Nguyễn

Văn Mười, Nguyễn Văn Thành, Dương Đỗ Thành Lân, Nguyễn Thị Kiều Linh, Lê Vương Hải Nguyệt, Lê Thị Ngọc Hiếu, Nguyễn Tấn Đạt, Võ Thị Kiên Hảo, Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Vương Tố Trinh 2012

5

1.1.2 Cơ chất của enzyme pectinase

Pectin là cơ chất của enzyme pectinase Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α- 1,4 glucosid tạo nên Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose Các nhóm carboxyl* của acid galacturonic có thể được ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na+ , K+hoặc NH4+, hay bị decacboxyl hoá …

Công thức nguyên của acid galacturonic: C6H10O7

Công thức cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.1

Hình 1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của pectin

Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin (Be Miller, 1986) [10] * Protopectin

Đây là dạng pectin nguyên thuỷ Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid pectinic Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật (Kilara, 1982) Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm

6

nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzyme protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan [2, 10]

* Acid pectic ( acid polygalacturonic)

Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể Dạng muối của acid pectic gọi là pectat

* Acid pectinic

Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat (Kilara, 1982) Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng gel với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi (nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp) [2, 10]

7

1.1.3 Khái niệm enzyme pectinase

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic,- galactose, metanol Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá Trong các loại khác chỉ có enzyme pectinesterase Chúng cũng có thể được chiết xuất từ nấm mốc Couri và cộng sự (1995) đã

nghiên cứu “thao tác trên gen trên chủng Aspergillus nhằm tăng khả năng tổng

hợp các enzyme phân giải pectine [11]

1.1.4 Cấu tạo enzyme pectinase

Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic

Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO Người ta cho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột Trọng lượng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC

1.1.5 Đặc điểm của enzyme pectinase

1.1.5.1 Enzyme pectinase từ nguồn thực vật:

* Pectinesterase:

- Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme PE Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme

- Cà chua chứa ít nhất hai loại PE Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái

- Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE Cả hai có cùng khối lƣợng phân tử là 30kD, nhƣng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3 Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5 Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đƣa pH của dung dịch về 6,0 Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại

- Polyol có khối lƣợng phân tử thấp, nhƣ glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose.PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lƣợng phân tử 36,kD, nhƣng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0, theo thứ tự pH tối ƣu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0 [10]

- Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyme, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lƣợng là 51kD và 36kD, theo thứ tự.[10]

Hình 1.2 Cấu trúc của pectinesterase từ carrot

9

- Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3 Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt

* Polygalacturonase:

Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây

bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus

plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum Tuy nhiên, trong thực tế, PG của

thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín [8]

Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme.PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC.PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57oC PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6

Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế Sự thủy phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan [15]

1.1.5.2 Enzyme pectinase từ vi sinh vật

Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn

Nấm mốc: Penicillium glaucum, P.ehrlichii, P.chrysogenum, P.expanam,

P.cilrimim, Aspergillus awamori, A.foetidus, A.niger, A.terrus, A.saitoi, A.aureus, A.oryzae, A.wentii, Fusarium moniliforme,…

Nấm men: Saccharomyces fragilis

Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella

aerogenes…

10

Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc [8]

Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này A.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase

Nấm men Sacch.fragilis dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase Vi khuẩn Bac.polymyxa, Bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase

* Pectinesterase:

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0 đến 6,5 Trái

lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6 đến 7,5 – 8

Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C Từ 55 đến 620C thì enzyme bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600C [10]

Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt

độ tối ưu là 30 – 45oC, PHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oC và từ thực vật (phopt=7,5-8, toopt= 55-60oC) Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin Ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc

cCnithyrium diplodiella và từ A.niger, trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy ngân

nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase

Ngoài ra, người ta đã thu được enzyme pectinesterase ở trạng thái đông thể và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân tử enzyme là enylalanin.[11]

Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do và enzyme sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết

11

ester dọc theo phân tử pectin Hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa Chẳng hạn, đối

với tác động của pectinesterase từ nấm mốc A.niger, cần thiết phải có pectin ester

hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%

* Polygalacturonase:

Hầu hết các nghiên cứu về polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn Vi sinh vật Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào

của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces fragilis,

Asperigillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum, Neurosrora crassa, các loài Ascomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum

pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5 Cũng enzyme đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có pH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6 Còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6 [7, 12]

Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6

Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng

thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5

Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -450C Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C

12

1.1.6 Phân loại enzyme pectinase

Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng: [7]

Bảng 1.2 Phân loại enzyme pectinase Stt Enzyme (tên gọi

Endopoly galacturonase (endo-PG)

Thủy phân liên kết galacturonid trong

1,4-D-galacturonid không theo một trật tự nào

3

Poly-1,4-D-galacturonidgalacturon-hydrolase

Exopoly galacturonase (exo-PG)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự đứt mạch của acid galacturonic

1,4-D-4

Poly-1,4-D-galacturonidmetilester-glycanohydrolase

galacturonase (Endo-PMG)

Endopolymetil-Thủy phân liên kết galacturonid trong pectin không theo một trật tự nhất định

1,4-D-5

galacturonid digalacturonoliase

Poly-1,4-D-Exo-pectatliase (exo-PKTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat với sự tạo thành 4,5

1,4-D-aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định

6

galacturonid glicanoliase

Poly-1,4-D-Endopectatliase (PETE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat, trong alacturonic với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định

-1,4-D-13

7

galacturonid metylester glicanoliase

Poly-1,4-D-Endopectinliase (Endo-PTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định

1,4-D-7

galacturonid metylester glicanoliase

Poly-1,4-D-Endopectinliase (Endo-PTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định

1,4-D-» Pectinesterase (PE)

Xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau Nếu thu từ nguồn VSV thì pH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5 Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+

» Polygalacturonase

Còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết 1,4-glycosid Các exo-PG (exo-poly 1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzyme polygalacturonase được chia làm bốn loại:

» Polymethylgalacturonase:

Còn gọi là 1,4-gaclacturonite methylesglucanohydrolase tác dụng trên polygalactorunic acid đã được ethoxyl hoá (tức là pectin) Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối

thường bị giảm Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A

niger, A awamori

» Pectate lyase (PEL)

Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4 D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4 D-galacturonic lyase) đều tồn tại Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật [1, 7]

1.1.7.1 Pectinesterase (PE)

Pectinesterase còn đƣợc gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic Enzyme này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá [14]

a Enzyme thủy phân liên kết glycoside (Hydrolase)

* Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao Polymethylgalacturonase gồm 2 loại:

- Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin - Exo-PMG: phân cắt lần lƣợt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin [4, 10]

* Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại:

- Endo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic

- Exo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử

16

b Enzyme cắt (Lyase):

Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con đường thủy phân Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase Cơ chế hoạt động của các enzyme lyase phân cắt pectin (pectate lyase) được đưa ra như sau: các pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút của nhóm cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao các proton đến các oxy glycosidic, đểlại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5 [3, 4]

Các enzyme lyase phân cắt pectin bao gồm:

* Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại:

α-1-4 Endoα-1-4 PMGL: còn gọi là poly (methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin

- Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin

* Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic Có 2 loại:

- Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide)lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic

- Exo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử

1.1.8 Các ứng dụng cơ bản của enzyme pectinase 1.1.8.1 Ứng dụng trong công nghiệp rượu vang

Rượu vang được sản xuất chủ yếu từ nước ép nho, quá trình sản xuất rượu vang gồm 3 giai đoạn chủ yếu:

- Thu hoạch quả - Lên men dịch quả - Xử lí và tàng trữ

Bình thường để thu được dịch quả người ta phải nghiền nát quả Khi nghiền sẽ thu được dịch quả và bã nghiền Bã nghiền sau khi tách dịch được đem vào ép Dịch chảy ra trước khi ép gọi là dịch tự chảy Dịch tách ra sau khi ép gọi là dịch

17

ép Thu được dịch quả đem làm trong rồi lên men

Trong sản xuất rượu vang người ta cũng dùng chế phẩm pecinase để tăng

hiệu quả cũng như để làm trong rượu

Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu sau:

- Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm Nghĩa là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang

- Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu quả chung và đặc biệt là hiệu suất củ phần tự chảy, có chất lượng cao Để tăng nhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzyme chính như endo- PMG là 55.102 đơn vị/mg protein chưa trong chế phẩm, còn enzyme Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch Trong trường hợp này không cần có mặt PE Nhưng nếu hoạt độ của endo- PMG ở trong chế phẩm là 31.102

đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng endo- PMG và Cx phải có sự tương quan nhất định Khi chế phẩm có hoạt độ endo- PMG là 28,2.102 đơn vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/ mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo- PMG là 25,4.102 đơn vị/ mg P và Cx là 55 đơn vị/mg P

- Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa enzyme protein với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin

Để tránh gây tổn thất các chất màu của vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzyme oxy hóa trong chế phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế phẩm

- Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện có độ pH nhất định

Bảng 1.3 Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinase

Thời gian ép Thể tích dịch thu đƣợc

Không xử lí Khi có xử lí bằng enzyme

30 giây đầu 30 giây thứ 2 Phút thứ 2 Phút thứ 3 Phút thứ 4 Phút thứ 5 Phút thứ 6 Phút thứ 7 Phút thứ 8 Phút thứ 9 Phút thứ 10

400 100 90 90 80 60 50 50 50 50 40

675 225 215 205 110 110 110 110 100 100 90

Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch nhƣ protein, pectin sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt đo đó làm tăng tốc độ lọc Trong 1 giờ dịch thu đƣợc từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không đƣợc xử lý

A.Martakov đã chứng tỏ rằng khi xử lý bã nghiền bằng enzyme thì độ nhớt của dịch bị giảm đi ít hơn là khi xủa lý dịch, vì lẽ khi đó protopectin của thành tế bào cũng bị phân giải

19

Khi dịch không được xử lý bằng enzyme thì trong quá trình lắng, các hạt vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống Khi sử dụng enzyme thì các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng

Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của vang Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần hóa học của bã bị thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol Người ta thấy rằng khi xủa lí bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quá trình oxy hóa catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường có hoạt tính của vitamin P Như vậy xủa lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang.[14]

Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn Người ta cho rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao [1]

1.1.8.2 Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast

Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast (tế bào trần) cô lập từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai Đây có thể là một công cụ hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên (Gleba, 1978) [1]

Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật bằng cách sử lí với enzyme pectinase, sau đó tiếp tục xử lí với enzyme cellulase để chuyển mô này thành protoplast Nồng độ của enzyme là pectinase 0,5%(W/V) và cellulase 5%(W/V), chỉnh pH 5,6 bằng HCl 2N (Tanabe, 1968; Bock, 1983) [2]

20

1.4 Tổng quan về nấm Aspergillus niger

1.4.1 Giới thiệu chung

Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng

rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều

vùng địa lý khác nhau trên thế giới Hiện nay, A niger được sử dụng chủ yếu

trong công nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α - amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic [1, 9]

Nấm mốc là vi sinh vật có thay đổi đáng kể trong lịch sử phân loại Các nghiên cứu khởi đầu đã phân chia nấm thuộc ngành Thallophyta thuộc giới phụ

Cryptogamae, giới Plantae (thực vật) Các khảo sát về đặc tính cấu trúc dưới kính

hiển vi tiếp theo đã chứng minh nấm không thuộc thực vật lẫn động vật Samson và van Reenen-Hoekstra (1988) đã phân chia nấm thật thành 4 lớp:

Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes Hệ thống phân

loại này đã tồn tại một thời gian dài và A niger được phân loại thuộc giới nấm (Fungi), ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina, lớp Deuteromycetes, bộ

Moniliales, họ Moniliaceae, chi Aspergillus và loài Aspergillus niger [2]

Tuy nhiên, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70 của thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứu phân chia nhóm của Whittaker (1969, trích dẫn bởi Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi Sumbali, 2005) đã đề nghị khóa phân loại mới cho giới nấm nói chung

và A niger nói riêng thuộc: Ngành: Amastigomycota Ngành phụ: Ascomycotina

Lớp: Ascomycetes

Lớp phụ: Plectomycetidae Bộ: Eurotiales

Họ: Eurotiaceae

Giống:Aspergillus

Loài: Aspergillus niger

21

Với đặc điểm chính trong họ Eurotiaceae là bào tử đính ở dạng thể bình

(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010) [7]

1.4.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger

Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại: - Khuẩn ty dinh dưỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thước nhỏ, màu trắng Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trường nuôi cấy để hút dưỡng chất Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt Khuẩn ty sinh sản hướng vào không khí để lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành các hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình thành các bào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen (Nguồn: Klich, 2002; Samson et al., 2007) [1, 7, 14]

1.4.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản

Aspergillus niger là loại nấm không có giai đoạn sinh sản hữu tính, A

niger sinh sản vô tính chủ yếu bằng bào tử đính (Gams, 1985)

Hình 1.3 Cấu tạo của Aspergillus

Cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dài với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng

22

nhạt Xung quanh bề mặt túi là các cuống thể bình màu nâu, dài 10  15 m, là nơi sinh ra các thể bình Thể bình có một tầng hoặc hai tầng Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già) Bào tử đính hình cầu, thường dẹt, đường kính 4  5 m,

nhưng thường nhỏ hơn (Onions et al., 1981) Loài A niger được phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen [1, 4, 14]