Kỹ Thuật - Công Nghệ - Nông - Lâm - Ngư - Y dược - Sinh học 1 UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA: LÝ – HÓA - SINH ---------- PHẠM THỊ THÙY TRÂM N T N ỌN N BACILLUS Ả N NG VIBRIO G N T KHÓA LU N TỐT NGHI ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 4 năm 2015 2 UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠ Ọ Q ẢNG NA KHOA: LÝ – HÓA – SINH ---------- KHÓA LU N TỐT NGHI ĐẠI HỌC Tên đề tài: N T N ỌN N BACILLUS Ả N NG VIBRIO G N T Sinh viên thực hiện Ạ T Ị T TR MSSV: 2111012752 ÊN NG N : Ư ẠM SINH - KTNN KHÓA 2011 - 2015 Cán bộ hướng dẫn T AN T Ị T AN MSCB: T35-15111-21878 ảng m, tháng 4 năm 2015 3 LỜ A ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫ n của cô Thạc sĩ Phan Thị Thanh Diễm. Các số liệu và kết quả nêu trong sskhóa luận tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. Sinh viên thực hiện PHẠM THỊ THÙY TRÂM 4 LỜI CẢ ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực, cố gắng của bả n thân còn có sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của quý thầy cô, sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu. Qua đây, cho phép tôi bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất đến cô giáo Thạc sĩ Phan Thị Thanh Diễm là giáo viên hướng dẫn đã định hướng, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành đề tài khóa luận này. Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo nhà trường của trường Đại học Quảng Nam đã tạo điều kiện cho tôi mượn phòng thí nghiệm Sinh Học gồm có các máy móc, thiết bị cầ n thiết cho đề tài để tôi có thể tiến hành nghiên cứu đề tài một cách thuận lợi. Bên cạnh đó, tôi cũng xin cảm ơn hai người bạn cùng nghiên cứu với tôi đã hỗ trợ cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm. Cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô đã dành thời gian để đọ c, nhận xét và chấm điểm luận văn này để giúp cho Luận văn tốt nghiệp của tôi có thể hoàn chỉnh hơn. Do hạn chế về khả năng và thời gian nghiên cứu nên đề tài của tôi vẫ n còn nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo để tôi hoàn thiện hơn đề tài nghiên cứu của mình. Xin chân thành cảm ơn. Sinh viên thực hiện PHẠM THỊ THÙY TRÂM 5 MỤC LỤC PHẦN 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu. ..........................................................................16 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu. ...........................................................................................16 1.2.2. Nội dung. .............................................................................................................16 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. .........................................................................16 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu. .........................................................................................16 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu. ............................................................................................ 17 1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. .........................................................................17 1.4.1. Địa điểm. .............................................................................................................17 1.4.2. Thời gian. .............................................................................................................17 1.5. Phương pháp nghiên cứu. .......................................................................................17 PHẦN 2. NỘI DUNG ....................................................................................................18 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................18 1.1. Ngành thủy sản. ......................................................................................................18 1.1.1. Tổng quan ngành thủy sản. ..................................................................................18 1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam. .........................................................................18 1.2. Tình hình dịch bệnh ở tôm, nguyên nhân và phương pháp giải quyết. ..................19 1.2.1. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi. .....................................................................19 1.2.2. Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản. ......................21 1.2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio. .........................................................................21 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản. ..............21 1.2.3. Một số bệnh điển hình ở trong qua trình nuôi tôm. ............................................22 1.2.3.1. Bệnh thân đỏ đốm trắ ng (SEMBV - Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus)...................................................................................................................22 1.2.3.2. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV). ............................................................... 23 1.2.3.3. Bệnh đầu vàng (YHD - Yellow Head Disease). ...............................................23 1.2.3.4. Bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm. ........................................................................24 1.2.4. Các phương pháp xử lý........................................................................................24 1.2.4.1. Phương pháp phòng bệnh. ................................................................................24 6 1.2.4.2. Phương pháp trị bệnh. ......................................................................................25 1.3.1. Khái niệm Probiotic. ............................................................................................ 26 1.3.2. Tác dụng của probiotic. .......................................................................................27 1.3.2.1. Tăng cường khả năng tiêu hóa. ........................................................................27 1.3.2.2. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa. ................................................27 1.3.2.3. Kích thích hệ miễn dịch ....................................................................................28 1.3.2.4.. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose. .......................................................................................................................................28 1.3.2.5. Sinh tổng hợp ra các chất kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến. .........29 1.3.2.6. Một số tác dụng khác ........................................................................................29 1.3.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng probiotic trong nuôi tôm trên thế giới và Việ t Nam. .............................................................................................................................. 29 1.4. Vi khuẩn Bacillus. ..................................................................................................31 1.4.1. Vị trí phân loại. ....................................................................................................31 1.4.2. Đặc điểm sinh học. .............................................................................................. 31 1.4.3. Một số loại Bacillus thường gặp trong tự nhiên. .................................................32 1.4.3.1. Bacillus subtilis. ............................................................................................... 32 1.4.3.2. Bacillus megaterium. ........................................................................................33 1.4.3.3. Bacillus mensentericus. ....................................................................................33 1.4.3.4. Bacillus cereus..................................................................................................34 1.4.3.5. Bacillus pumilu. ................................................................................................ 34 1.4.3.6. Bacillus polymyxa ............................................................................................. 34 1.4.3.7. Bacillus brevis. .................................................................................................34 1.4.3.8. Bacillus simplex. ............................................................................................... 35 1.4.3.9. Bacillus linchenniformis. ..................................................................................35 1.4.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus. .............................................35 1.4.4.1. Cải thiện sức khỏe. ...........................................................................................35 1.4.4.2. Cải thiện môi trường.........................................................................................36 1.4.5. Lợi thế khi chọn Bacillus làm chế phẩm sinh học...............................................38 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 40 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu. ..............................................................................40 7 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................. 40 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu. ...........................................................40 2.1.2.1. Dụng cụ.............................................................................................................40 2.1.2.2. Thiết bị. .............................................................................................................40 2.1.2.3. Hóa chất. ...........................................................................................................40 2.1.2.3. Môi trường. .......................................................................................................40 2.2. Phương pháp nghiên cứu. .......................................................................................41 2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ ruột tôm. ....................................41 2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn. ...................................42 2.2.3. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn...............................................................................42 2.2.4. Phương pháp nhân giống. ....................................................................................42 2.2.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường dịch thể. .....42 2.2.6. Xác định khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. 43 2.2.6.1. Phương pháp cấy đường chữ thập trên môi trường thạch đĩa. .........................43 2.2.6.2. Phương pháp xác định vòng vô khuẩn trên môi trường thạch. ........................43 2.2.8. Phương pháp xác định khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn Vibrio trên môi trường dịch thể. ............................................................................................... 44 2.2.9. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus spp. trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. ........................................................................................45 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ............................................................... 46 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ mẫu ruột tôm. .......................46 3.1.2. Kết quả kiểm tra bằng phản ứng catalaza. ...........................................................47 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn. .........................................49 3.3. Hoạt hóa các chủng vi khuẩn..................................................................................52 3.4. Số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường dịch thể. .............................................53 3.5. Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã đượ c phân lập..........................................................................................................................54 3.5.1. Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã đượ c phân lập bằng phương pháp cấy chữ thập. ....................................................................55 3.5.2. Khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã đượ c phân lập bằng phương pháp xác định vòng vô khuẩn trên môi trường thạch đĩa. ........57 8 3.6. Khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đã tuyển chọ n. .......................................................................................................................................63 3.7. Khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn Vibrio trên môi trường dịch thể . .......................................................................................................................................64 PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. ......................................................................69 1.1. Kết luận...................................................................................................................69 1.2. Kiến nghị. ...............................................................................................................69 PHẦN 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................71 9 DANH MỤC CÁC TỪ VI T TẤT Chữ viết tắt Ý ng ĩa ĐBSCL Đồng bằng song Cửu Long NA1,5 Nutrient Agar 1,5. NB Môi trường Nutrient Broth SEMBV Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus MBV Monodon Baculovirus YHD Yellow Head Disease 10 DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệ u bảng Tên bảng Trang 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp. đã phân lập. 35 3.2. Số lượng tế bào của Vibrio và Bacillus spp. trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu. 39 3.3. Nuôi chấm điểm các chủng Bacillus spp. sau 24h và vi khuẩn Vibrio. 43 3.4 Nuôi chấm điểm các chủng Bacillus spp. sau 48h và vi khuẩn Vibrio. 46 3.5 Khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. 49 3.6 Số lượng tế bào các chủng Bacillus spp. trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 42 11 DANH MỤC CÁC BI ĐỒ Số hiệu đồ thị Tên đồ thị Trang 3.1. Số lượng các chủng vi khuẩn trong 1ml nuôi cấy ban đầu. 40 3.2. Khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. nuôi sau 24h với Vibiro. 44 3.3 Khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. nuôi sau 48h với Vibiro. 47 3.4. Số lượng tế bào các chủng Bacillus spp. trên môi trường có nước nuôi tôm. 53 12 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệ u hình Tên hình Trang 2.1. Sơ đồ pha loãng vi khuẩn. 27 2.2 Phương pháp cấy đường chữ thập 29 2.3. Phương pháp xác định tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn. 30 3.1. Mẫu tôm dùng để phân lập Bacillus. 32 3.2. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L1 33 3.3. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L2 33 3.4. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L3 34 3.5. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L4 34 3.6. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L10. 34 3.7. Phản ứng catalaza của chủng Bacillus spp. L11 34 3.8. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L1. 36 3.9. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L2. 36 3.10. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L4. 36 3.11. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L5. 36 3.12. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L6. 37 3.13. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L7. 37 3.14. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L8. 37 13 3.15. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L9. 37 3.16. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L10. 38 3.17. Hình dạng khuẩn lạc của chủng Bacillus spp. L11. 38 3.18. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. cấy truyền trong ống thạch nghiêng trên môi trường NA1,5. 38 3.19. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L1 với Vibrio. 34 3.20. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L2 với Vibrio. 41 3.21. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L3 với Vibrio. 41 3.22. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L4 với Vibrio. 41 3.23. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L5 với Vibrio. 42 3.24. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L7 với Vibrio. 42 3.25. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L10 với Vibrio. 42 3.26. Cấy chữ thập chủng Bacillus spp. L11 với Vibrio. 42 3.27. Khả năng đối kháng của Bacillus spp. L4 (nuôi chấm điểm 24h) với Vibrio sau 24h, 48h, 72h. 42 3.28. Khả năng đối kháng của Bacillus spp. L4 (nuôi chấm điểm 24h) với Vibrio sau 24h, 48h, 72h. 48 3.29. Các chủng Bacillus spp. đối kháng lẫn nhau tạo ra vòng vô khuẩn. 50 3.30. Số lượng tế bào Vibrio trước khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể. 51 3.31. Số lượng tế bào Vibrio sau khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể. 51 14 3.32. Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L2 trước khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 3.33. Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L2 sau khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 3.34 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L4 trước khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 3.35 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn Bacillus spp. L4 sau khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm. 54 15 ẦN 1 ĐẦ 1.1. Lý do chọn đề tài. Nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam có vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong đó, nuôi tôm xuất khẩu đang ngày càng được chú trọng và đẩy mạnh, đem lại hiệu quả cao, đưa tổng lượng xuất khẩu hàng năm tăng lên. Tuy nhiên, ngành nuôi tôm đang gặp khó khăn lớn dẫn đến thất bại ở nhiều nơi. Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy. Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những nhóm vi sinh vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là tôm nuôi bị bệnh. Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước và phòng bệnh là cấp thiết. Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, làm cho tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệ nh do vi khuẩn, chủ yếu là nhóm Vibrio, gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi. Các bệnh vi khuẩn đó là bệnh đầu vàng, thân đỏ, đốm trắng và phát sáng. Trong đó bệnh phát sáng hiện đang gây hậu quả rất nặng nề. Bệnh này do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm sú và một số loài tôm khác. Bệnh xuất hiện từ giai đoạn ấu trùng, tôm bột đến tôm trưởng thành ở trong cả bể ương và ao nuôi. Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh. Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người. Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong tôm nuôi, vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Hiện nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Một xu hướng mới hiện nay được áp dụng nhằm ngăn ngừa dịch bệnh cho tôm là việc sử dụng chế phẩm men vi sinh sống nhằm giúp cho tôm có khả năng hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn, đồng thời cải tạo được môi trường nuôi, từ đó tôm sẽ có khả năng chống chịu bệnh tật và áp lực môi trường tốt hơn. Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu này còn mới mẻ, chưa có nhiều nghiên cứu chọn lọc các chủng vi khuẩn từ vùng nuôi để dùng làm chế phẩm vi sinh phù hợp. Vì vậy, 16 việc sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm gặp nhiều khó khăn trong việc nâng cao sức đề kháng cho tôm. Bên cạnh đó, phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loạ i. Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế. Việ c nghiên cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệ nh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩ m vi sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Một trong những nhóm vi khuẩn có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh ở tôm là vi khuẩn Bacillus. Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhấ t, nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm probiotic. Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi đã chọn và nghiên cứu đề tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh ở Tôm”. 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu. 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu. Đề tài được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủ ng vi khuẩn Bacillus spp. hoạt tính mạnh có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio gây bệnh ở tôm. 1.2.2. Nội dung. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứ u sau: - Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có hoạt tính cao từ các mẫu ruộ t tôm bị bệnh và tôm không bị bệnh. - Tuyển chọn chủng Bacillus spp. có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio gây bệ nh trên tôm từ các chủng Bacillus spp. đã phân lập được và từ bộ sưu tập vi khuẩn Bacillus spp. của tổ bộ môn sinh. - Khảo sát đặc điểm hình thái và nuôi cấy của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được. 1 3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu. Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập từ ruột tôm. 17 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu. Trên địa bàn thành phố Tam kỳ, tỉnh Quảng Nam. 1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. 1.4.1. Địa điểm. Tại phòng thí nghiệm Sinh Học - trường Đại học Quảng Nam. 1.4.2. Thời gian. Từ tháng 102014 đến tháng 42015. 1 5 ương p áp ng iên cứu. - Phương pháp thực nghiệm tại phòng thí nghiệm. - Phương pháp nghiên cứu, tổng hợp tài liệu (sách, báo, internet…). - Phương pháp xử lý số liệu. 18 PHẦN 2. NỘI DUNG ƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 1 1 Ngàn t ủy sản 1.1.1. Tổng quan ngành thủy sản. Việt Nam có vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên thuận lợi tạo ra thế mạnh nổi trội để phát triển ngành công nghiệp thủy sản. Xuất khẩu thủy sản, do đó, trở thành một trong những lĩnh vực mũi nhọn của ngành kinh tế 21. Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07năm. Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước 20. Sản phẩm thủy sản xuất khẩu của Việt Nam rất đa dạng về chủng loạ i, tuy nhiên hai sản phẩm đóng góp lớn nhất cho sự phát triển của ngành cũng như là hai sản phẩ m xuất khẩu chính là cá tra và tôm 21. Trong những năm gần đây, ngành nuôi tôm nước ta đã trở thành một trong nhữ ng ngành kinh tế chủ đạo của quốc gia. Diện tích nuôi tôm không ngừng được mở rộ ng. Trong số các mặt hàng thủy sản, tôm đang giữ vị trí đứng đầu về giá trị xuất khẩu củ a toàn ngành 25. Mặt hàng tôm đã vượt lên chiếm 40,7 tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của Việ t Nam. Thị trường tiêu thụ tôm đã vươn tới 90 nước, trong đó 3 thị trường chính (EU, Mĩ, Nhật Bản) chiếm trên 70 tổng kim ngạch xuất khẩu tôm của nước ta 26. Tuy nhiên, trong năm 2010, thủy sản Việt Nam nói chung đang đứng trước khó khăn phải đối mặt với những rào cản kỹ thuật từ phía nhà nhập khẩu 25. Mộ t trong những khó khăn của xuất khẩu là dư lượng hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm thủ y hải sản. Do đó, cần phải xây dựng giải pháp kỹ thuật không dùng thuố c kháng sinh và các chất hóa học hoặc tìm các chất thay thế an toàn nhằm đạt được các sản phẩm thủ y sản an toàn vệ sinh thực phẩm 19. 1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam. Hiện nay tôm vẫn là loài có vai trò quan trọng, đóng góp cho sự phát triển củ a ngành thủy sản Việt Nam nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng. Tôm có hai loại 19 sản phẩm chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trong đó tỷ lệ tôm thẻ chân trắng gia tăng trong thời gian gần đây, nhưng tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu cơ bả n 21. Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng mới bắt đầu nuôi trong năm 2008 và phát triển nhanh trong vài năm gần đây. Diện tích nuôi năm 2009 mới đạt 3.398 ha, chiếm tỷ lệ nhỏ khoảng 0,58 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng, nhưng đến năm 2013 diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng đã tăng lên 44.601 ha, chiếm 7,4 diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng 15. Năm 2009 - 2013, tốc độ tăng trưởng bình quân 0,9 năm. Diệ n tích nuôi tôm sú vẫn chiếm tỷ trọng lớn trong tổng diện tích nuôi với 558.795 ha, chiếm 92,6 tổ ng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng và chiếm 94,9 tổng điện tích nuôi tôm sú của cả nước. Tuy nhiên, diện tích nuôi tôm sú có xu hướng giảm dần trong giai đoạ n 2009 - 2013 với tốc độ giảm bình quân 0,84năm. Trong giai đoạn này, diện tích nuôi tôm nước lợ vùng Đồng bằng sông Cửu Long tăng bình quân 0,9 năm, sản lượ ng nuôi lại tăng bình quân 8,7năm (tăng từ 308.855 tấn lên 431.569 tấn), điều này cho thấ y mức độ áp dụng khoa học công nghệ trong nuôi tôm nước lợ 15. Năm 2013, theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, cả nước có khoảng 29 tỉnh, thành nuôi tôm nước lợ, với tổng diện tích thả nuôi 652.612 ha, sản lượng đạ t 475.854 tấn. Trong đó, khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long chiếm 92,5 diệ n tích và 79,8 sản lượng của cả nước 15. Tính đến thời điểm 31102014, cả nước đã thả nuôi 675.830 ha (đạt 100,9 kế hoạch và bằng 103,6 so với cùng kỳ 2013), trong đó diện tích nuôi tôm sú là 582.514 ha, tôm chân trắng là 93.316 ha (đạt 133,3 kế hoạch năm 2014, bằng 146,4 cùng kỳ năm 2013). Sản lượng thu hoạch 568.668 tấn (đạt 103,4 kế hoạch năm 2014 và bằng 105,1 so với cùng kỳ 2013), trong đó sản lượng tôm sú đạt 240.937 tấn, tôm chân trắng 327.731 tấn 15. 1.2. Tình hình dịch bệnh ở tôm, nguyên nhân và phương pháp giải quyết. 1 2 1 Tìn ìn dịc bện trên tôm nuôi Từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do dịch bệnh. Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến 20 năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn. Tại Việt Nam trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng 7. Các chương trình nghiên cứu trên tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy các tác nhân gây bệnh chính bao gồm nhóm vi khuẩn Vibrio và các virus quan trọng như MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo và cs, 1997). Sự giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987). Dựa vào khoảng 49 đặc tính kiểu hình và khoảng 210 mẫu phân lập đại diện đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Vibrio harveyi, Vibrio cholerae dòng Albensis và Photobacterium leiognathi 5. Năm 2012, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 120 xã thuộc 54 huyện của 19 tỉ nh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha và bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tạ i 192 xã thuộc 52 huyện của 16 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 28.005 ha 15. Năm 2013, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 282 xã thuộc 94 huyện của 28 tỉ nh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha. So với năm 2012, dịch bệnh đốm trắng tăng 3.617 ha, tương đương khoảng 1,4 lần. Số lượng xã, huyện, tỉnh có d ịch cũng tăng so với cùng kỳ năm 2012 và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 199 xã thuộ c 59 huyện của 19 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.875 ha. So với năm 2012, dịch bệnh hoại tử gan tụy tăng chút ít về phạm vi có dịch, nhưng tổng diện tích chỉ bằng khoảng 21 15. Năm 2014, trong 9 tháng đầu năm, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tạ i 233 xã thuộc 65 huyện của 21 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 18.321 ha. So với cả năm 2013, phạm vi dịch đã xuất hiện gần tương đương, nhưng diện tích bệnh lại cao hơn 1,5 lần, khoảng 5.970 ha và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 224 xã thuộ c 59 huyện của 22 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.119 ha. So với cả năm 2013, dịch đã xuất hiện ở phạm vi nhiều hơn, nhưng diện tích bệnh lại chỉ bằ ng 87, khoảng 5.119 ha. So với năm 2012, phạm vi có dịch bệnh xuất hiện nhiều hơn, nhưng tổng diện tích bị bệnh chỉ bằng khoảng 18 15. 21 1.2.2. Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản. 1.2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio. Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là nhóm vi khuẩn có dạ ng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 μm. Vibrio không hình thành bào tử và có khả năng chuyển động nhờ tiên mao hay nhiều tiên mao mảnh (Đỗ Thị Hòa, 2004). Là các vi khuẩn màu Gram âm, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, sinh khí H2S (Trần Linh Thướ c, 2008). Hầu hết các loài của chi Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặ n, thích hợp ở 20 - 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc biệt giáp xác nuôi ven biể n và trên biển. Môi trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose) là môi trường chọn lọ c của Vibrio. Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, Vibrio đượ c chia làm 2 nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạ c màu vàng; nhóm không có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu xanh lá cây. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 - 30oC 5. Các loài Vibrio có mật độ cao trong môi trường nước, bao gồm cả cửa sông, vùng nước ven biển và trầm tích biển và khắp nơi trong nuôi trồng thủy sản. Một số nghiên cứu cho thấy Vibrio xuất hiện với mật độ dày đặc trong sinh vật biển, như san hô, cá, động vật thân mềm, tôm, cỏ biển, bọt biển và động vật nổi (Thompson và cs, 2004). Kết quả nghiêncứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ. Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới 5. 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây r trên động vật thủy sản. Bệnh Vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra. Trong bệnh Vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh Vibriosis ở động vật thủy sản. Cùng với việc thâm canh hóa nghề nuôi trong những năm gần đây, tôm nuôi của toàn thế giới đang chịu ảnh hưởng của dịch bệnh, 22 bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus. Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá và động vật thân mềm nước mặn phát triển, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản, đặc biệt là trong nuôi tôm. Vibrio harveyi là tác nhân gây bệnh chủ yếu cho tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và tôm sú Penaeus monodon 5. Hiện nay người ta đã phân lập và định danh được 172 chủng vi khuẩn từ tôm bệnh và tìm thấy khoảng 90 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio (Nguyễn Thị Tĩnh, 2010). Ở Việt Nam đã phân lập được các loài Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae, Vibrio mimicus trên cá, tôm nhiễm bệnh (Oanh et al,. 1999). Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm khi việc sử dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều mà ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc 5. Nhầm ngăn ngừa những tổn thất do bệnh Vibriosis gây ra trên tôm cả về mặt môi trường kinh tế và kinh tế xã hội, cần phải có những giải pháp nhằm tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh đồng thời giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hóa chất. 1.2.3. Một số bệnh điển hình ở trong qua trình nuôi tôm. 1.2.3.1. Bệnh thân đỏ đốm trắng (SEMBV - Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus). Tác nhân gây bệnh: bệnh thân đỏ đốm trắng là do một loại virus có tên khoa học viết tắt là SEMBV (Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus) gây ra. Virus này cảm nhiễm ở các mô có nguồn gốc trung bì và ngoại bì như: mang, lớp biểu mô của vỏ, thần kinh, dạ dày và một số cơ quan khác. Khi xâm nhập vào cơ thể tôm sẽ lan ra các bộ phận khác của cơ thể, khi chúng xâm nhập được vào tế bào sẽ xâm nhập tiếp vào nhân và phát triển về số lượng rất nhanh làm cho kích cỡ của nhân to ra ta thấy rõ qua kính hiển vi. Khi virus phát triển đến một mức độ nào đó nó sẽ giết chết tế bào và virus sẽ bung cùng với tế bào ra khỏi cơ thể tôm lan truyền ra nguồn nước, khi gặp tôm khỏe khác lại tiếp tục xâm nhập và cứ thế tiếp diễn. Nếu virus không xâm nhập được vào tế bào của tôm thì nó sẽ chết vì nó chỉ sống được tự do trong môi trường nước 4 ngày. Virus này sống và tồn tại được trong môi trường nước ngọt và mặn do đó tôm nuôi ở các độ mặn khác nhau từ 5 - 40o đều cảm nhiễm virus và gây bệnh. Như thế cho thấy rằng virus này có khả năng gây bệnh cho tôm ở bất cứ ao nuôi tôm nào. 23 Ngoài ra trên cơ thể những con tôm bệnh thân đỏ đốm trắng còn bị nhiễm các tác nhân cơ hội khác như: vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật (Protozoa)… 22. Dấu hiệu bệnh lý: con tôm yếu dạt vào bờ; trên thân tôm xuất hiện các đốm trắng tròn, to nhỏ khác nhau nằm dưới lớp vỏ kitin ở phần đầu ngực và vỏ các đốt bụng, cũng có một số ít trường hợp tôm bị bệnh này nhưng không có đốm trắng; màu sắc tôm chuyển sang màu hồng tối hoặc nhợt nhạt; khả năng tiêu hoá thức ăn bị giảm sút nghiêm trọng, đa phần các con tôm dạt bờ đều không ăn; tôm chết từ rải rác tới hàng loạt, có thể chết cả ao trong vòng 5 - 7 ngày, đặc biệt chết nhiều sau khi lột xác. Kết quả kiểm tra mô học cho thấy nhân ở tế bào bị cảm nhiễm phình to chiếm chỗ cả nguyên sinh chất 22. 1.2.3.2. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV). Tác nhân gây bệnh: bệnh MBV gây ra trên tôm bởi một loại virus thuộc giống Baculovirus, thuộc nhóm virus có hình thể ẩn trong nhân tế bào mà nó cảm nhiễm. Dấu hiệu bệnh: nếu tôm giống thả nuôi có mức độ nhiễm MBV cao thì có thể gây chết hàng loạt trong hai tuần đầu, nếu không gây chết loại virus này cũng làm tôm mẫn cảm hơn với các tác nhân khác nên tôm nuôi thường hay bị còi cọc, chậm lớn và thường xuất hiện các dấu hiệu khác như đen mang, cụt râu, đỏ thân. Một dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của những con tôm bị nhiễm MBV là sự tồn tại các thể ẩn hình cầu trong nhân tế bào gan, nhờ vậy có thể phát hiện được dễ dàng bệnh này dưới kính hiển vi. 1.2.3.3. Bệnh đầ vàng (YHD - Yellow Head Disease). Tác nhân gây bệnh: gây bệnh đầu vàng trên tôm nuôi là loại virus có tên Rhabdovirus. Ðây là loài virus có nhân ARN. Virus này có thể ký sinh ở nhiều nội quan khác nhau của tôm như: gan tụy, mang, máu, dạ dày… Ngoài ra, tôm bị bệnh đầu vàng còn có khả năng bị cảm nhiễm một số tác nhân cơ hội khác như: vi khuẩn, nguyên sinh động vật… 22. Dấu hiệu bệnh lý: bệnh có dấu hiệu rất đặc thù là tôm nuôi đột nhiên tiêu thụ thức ăn mạnh hơn bình thường trong vài ngày liên tiếp, sau đó bỏ ăn hoàn toàn; tôm bị bệnh lờ đờ, bắt đầu dạt vào bờ ao; màu sắc của tôm trở nên nhợt nhạt, phần đầu ngực có màu vàng do gan tụy và mang tôm chuyển sang màu vàng, giáp đầu ngực bị phồng, mang tiết dịch có mùi hôi; sau 2 - 3 ngày kể từ khi có hiện tượng dạt bờ, tôm bắt đầu chết. Sau 5 - 7 ngày có khả năng chết toàn bộ tôm trong ao 22. 24 1.2.3.4. Bệnh phát sáng ở ấ trùng tôm. Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, nhất là ở tôm sú. Trong thời gian gần đây nhiều bà con nuôi tôm sú bị thiệt hại nặng khi mua phải tôm sú giống nhiễm bệnh phát sáng 5. Khi tôm bị bệnh phát sáng thường yếu, lờ đờ, kém bắt mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục. Khi bệnh xảy ra trong các trại giống, tác hại thường lớn, đặc biệt ở các giai đoạn tiền ấu trùng như zoea, mysis. Khi bệnh xảy ra ở dạng cấp tính có thể làm tôm ấu trùng chết hàng loạt, tỷ lệ chết có thể lên đến 100 trong bể ấp do sự nhiễm khuẩn toàn thân. Bệnh phát sáng thường gây tác hại lớn ở giai đoạn ấu trùng và hậu ấu trùng. Giai đoạn ấu niên trong ao nuôi thịt cũng có thể bị ảnh hưởng, nhưng tác hại thấp hơn. Từ mẫu tôm bị bệnh phát sáng người ta đã phân lập được Vibrio harveyi, Vibrio vulificus và Vibrio parahaemolyticus 5. 1.2.4. Các phương pháp xử lý. 1.2.4.1. Phương pháp phòng bệnh. Việc đầu tiên phải làm trước mỗi vụ nuôi là làm tốt công việc sát trùng bể, ao, dụng cụ và nguồn nước trước mỗi đợt sản xuất. Đối với ao nuôi phải cải tạo ao thật kỹ, vét sạch bùn đáy, bón vôi, phơi ao, khoáng hóa nền đáy tiêu diệt mầm bệnh. Nguồn nước phải được sát trùng bằng các phương pháp khác nhau: phương pháp cơ học (lọc), phương pháp hóa học (xử lý bằng thuốc sát trùng), phương pháp lý học (sát trùng bằng đèn cực tím), phương pháp sinh học, phương pháp sinh thái để tiêu diệt và kìm hãm sự phát triển của Vibrio 7. Độ mặn và nhiệt độ cao là điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển mạnh. Vì vậy cần giảm độ mặn trong ao nuôi tôm thịt xuống 15 - 20‰ để kìm hãm sự phát triển của Vibrio 7. Vào mùa hè nhiệt độ thường cao, để hạn chế khả năng tăng nhiệt cần duy trì mức nước trong ao nuôi đạt độ sâu từ 1,2 - 1,5m. Ô nhiễm môi trường trong quá trình nuôi do lượng thức ăn dư thừa và do động vật thủy sản thải ra là yếu tố nguy hiểm dẫn đến phát sinh dịch bệnh. 25 Cần lựa chọn thức ăn có chất lượng tốt, xác định khẩu phần thức ăn chính xác, tránh dư thừa. Với thức ăn tươi sống cần được sát trùng bằng một số thuốc diệt khuẩn (formalin, iodine) rồi rửa lại bằng nước sạch trước khi cho ấu trùng ăn. Có thể dùng chế phẩm vi sinh (probiotic) để cân bằng sinh thái trong hệ thống nuôi và giảm lượng chất thải hữu cơ trong ao, bể, kìm hãm sự phát triển của Vibrio gây bệnh. Không dùng kháng sinh (antibiotic) để phòng bệnh, có thể dùng chất khử trùng (formol, …) để diệt khuẩn ngoài môi trường, nhưng phải lựa chọn nồng độ thuốc không ảnh hưởng tới vật nuôi và chỉ dùng khi thật sự cần thiết, coi đó chỉ là giải pháp cuối cùng. Khi bệnh đã xảy ra, trước khi xả bỏ, cần dùng thuốc diệt khuẩn (chlorine, formol) để sát trùng nước, diệt vi khuẩn 5. Có thể tăng hệ miễn dịch tự nhiên của động vật nuôi thủy sản bằng quản lý môi trường tốt và bổ sung một số sản phẩm như vitamin C, A, E sẽ kích thích cơ quan tạo kháng thể; hạn chế dùng hóa dược trong nuôi trồng thủy sản. Một biện pháp hữu hiệu nhằm tăng sức đề kháng của tôm và các loài động vật thủy sản khác là sử dụng nhóm vi sinh vật hữu ích gọi là vi sinh vật probiotic (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) như Zymetin, Dikaku và Biodream trộn vào thức ăn sẽ giúp cho động vật thủy sản tiêu hoá tốt. Các vi sinh vật này sẽ cạnh tranh thức ăn với các vi khuẩn Vibrio gây bệnh và chiếm địa bàn ở đường ruột của vật nuôi, loại bỏ vi khuẩn Vibrio gây bệnh trong ruột vật nuôi 7. Như vậy để phòng trị bệnh cho động vật thủy sản do Vibrio gây bệnh gây ra cần thực hiện tốt các biện pháp từ khâu chọn giống ban đầu, cải tạo ao loại bỏ hết các chất hữu cơ vào đầu vụ và cuối vụ, thực hiện nuôi tôm trong độ mặn thấp, giữ nước có màu xanh vỏ đậu, hạn chế khả năng tăng cao nhiệt độ, không cho ăn dư, tăng cường sức khỏe tôm nuôi bằng thức ăn giàu dinh dưỡng, vitamine và bổ sung chế phẩm probiotic, xử lý môi trường nuôi và có mật độ nuôi phù hợp với trình độ quản lí… 5. 1.2.4.2. Phương pháp trị bệnh. Khi bệnh Vibriosis đã xuất hiện, có thể dùng kháng sinh để trị bệnh. Giảm mật độ vi khuẩn trong nước và cải thiện điều kiện môi trường bằng một số biện pháp kĩ thuật: xifon đáy, thay nước đáy, dùng một số loại thuốc diệt khuẩn 26 như: benzalkonoum chloride (BKC), iodine… sau đó thay một phần nước trong ao, gây lại màu nước 7. Tuy vậy ở giai đoạn tiền ấu trùng và hậu ấu trùng, do sức chịu đựng của vật nuôi với thuốc rất kém và khi bệnh đã xảy ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn, vì vậy dùng thuốc khó khăn và ít có hiệu quả 5. 1.3. Probiotic và tình hình nghiên cứu về probiotic cho tôm trên thế giới và Việt Nam. 1.3.1. Khái niệm Probiotic. Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “cho cuộc sống”. Khái niệm probiotic đã xuất hiện từ những năm đầu thế kỷ XX nhưng đến năm 1960 người ta mới quan tâm đến probiotic. Đã có nhiều định nghĩa từ thuật ngữ này, như Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên: probiotic là các chất được tiết ra bởi một loài vi sinh vậ t có khả năng thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác và có ý nghĩa ngược với kháng sinh. Năm 1971, Sperti đã mô tả probiotic như là dịch chiết tế bào có khả năng kích thích sinh trưởng của vi sinh vật 8. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989) 3. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiệ n, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiề u trong các ấn phẩm khoa học. Một là: theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”. Hai là: theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” 10. Ngày nay, khái niệm probiotic dùng để chỉ những vi sinh vật sống được bổ sung vào đường tiêu hóa của con người và vật nuôi làm tăng cường sức khỏe cho con ngườ i và vật nuôi thông qua việc cải thiện cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruộ t 1. Probiotic là chất bổ sung chế độ ăn dựa vào các vi sinh vật sống, mà khi được sử dụng 27 với lượng thỏa đáng sẽ có tác dụng có lợi trên sinh vật chủ, cải thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn ở ruột giúp ngăn ngừa rối loạn về tiêu hóa đặc biệt là các tình trạng tiêu chả y cấp hoặc tiêu chảy do sử dụng kháng sinh. 1.3.2. Tác dụng của probiotic. 1.3.2.1. Tăng cường khả năng tiê hó . Vi khuẩn probiotic giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng, giúp tiêu hóa các chất giàu năng lượng chưa được sử dụng, kích thích sự tăng trưởng tế bào, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại, làm cho hệ miễn dịch chỉ phản ứng đối với các vi khuẩn gây bệnh. Trong các thực phẩm lên men với Lactobacillus sẽ làm tăng chất lượng, tăng khả năng tiêu hóa và đồng hóa các chất dinh dưỡ ng. Vì vậy, Lactobacillus đã được xem là nhân tố kích thích sự hấp thu dinh dưỡ ng. Ngoài ra, vi khuẩn probiotic tham gia cạnh tranh và kìm hãm sự sinh trưởng của các vi sinh vậ t có hại trong đường ruột giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột 12. Probiotic kích thích tính thèm ăn, làm tăng khả năng hoạt động tiêu hóa của nhu động ruột, đồng thời tích lũy các chất và tiết ra các enzyme tiêu hóa như: α- amylase, protetase, lipase, cellulose (Han boong Industry Co.Ltd.2001) tiêu hóa các chất 2. 1.3.2.2. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiê hó . Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiế t ra các kháng sinh hay là các chất cạnh tranh 3. Probiotic tác động lên hệ vi sinh vật đường ruột với cơ chế tác động như: cạ nh tranh chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh; cạnh tranh vớ i các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột, vị trí nào đượ c các vi khuẩn probiotic gắn kết thì các độc tố đường ruột bị ngăn chặn; vi khuẩ n probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, những hợp chấ t này có thể làm giảm hoạt tính của các vi sinh vật gây bệnh, các độc tố được tạ o ra và làm giảm khả năng trao đổi chất của vi khuẩn gây bệnh 3. Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở các ch ủng probiotic đó là: Hydrogen peroxide, acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, Bacteriocin, Diacetyl. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH trong khoang ruột 28 thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yế u là acetate, propionate, acid lactic 9. 1.3.2.3. Kích thích hệ miễn dịch Có nhiều nghiên cứu cho thấy tác động của việc bổ sung một số probiotic lên chức năng hàng rào miễn dịch của cơ thể. Các nghiên cứu trên người cho thấy việc bổ sung L.Casei, L.Bulgaricus và L.Acidophilus kích thích tăng sản sinh đại thực bào và tăng thực bào đối với trẻ trẻ được bổ sung probiotic và giảm sự thẩm thấu của ruộ t khi bổ sung Lactobacilli và ở những trẻ đẻ non được bổ sung Bifidobacteria tăng khả năng kháng khuẩn 1. Ở người trưởng thành khi sử dụng L.Acidophilus La1 và Bifidobacteria làm tăng IgA đặc hiệu, cũng như B.Lactics làm tăng hoạt động thực bào chống lại E.Coli, tăng khả năng tiêu diệt tế bào 4. Ngoài ra, probiotic có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, làm tăng hàm lượng globulin, tăng cường hiệu quả của một số vaccin như vaccin thương hàn. Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào củ a vi sinh vật hay hạt carbon, tăng khả năng sản xuất kháng thể thường gọ i là IgG và IgM và interon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu). Probiotic còn tăng khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột như kháng thể IgA. Như vậy probiotic tác độ ng lên hàng rào miễn dịch của cơ thể theo cơ chế miễn dịch đặc hiệu (miễn dịch thu được) và miễ n dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên). Miễn dịch đặc hiệu tốt cần thiết cho việ c bảo vệ cơ thể, giảm cơ hội cho các phản ứng gây viêm, loét hay dị ứng 6. 1.3.2.4.. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp đượ c lactose. Sự không dung nạp đường lactose xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, ở những người bị viêm ruột mãn tính, cấp tính và những người phẫu thuật ruột, gây ra sự đầy hơi, khó tiêu khi hấp thụ thực phẩm có chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu cho thấ y khả năng không dung nạp đường lactose là do thiếu nghiêm trọng enzyme lactase (β- galactosidase) trong ruột, thiếu hụt có thể do thể trạng hoặc do tổn thương niêm mạc ruột. Phần lớn lactose không chuyển hóa được ở ruột non sẽ tới đại tràng và tại đây lactose sẽ được sử dụng bởi tạp khuẩn, để sản sinh ra acid béo chuỗi ngắn như: hydrogen, methan và cacbonat làm cho chúng ta chướng hơi, co thắt ruột, đau từng 29 cơn và tiêu chảy. Khi sử dụng càng nhiều sản phẩm chứa nhiều lactose thì hiện tượng này càng được biểu hiện rõ hơn 8. Các chủng vi khuẩn lên men acid lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cả i thiện các triệu chứng đầy hơi, khó tiêu khi sử dụng lactose. Các thử nghiệm cho thấ y việc sử dụng lactose có trong sữa Proby tốt hơn sử dụng lactose trong các sản phẩ m khác vì hoạt tính dung nạp lactose của β- galactosidase có trong Proby cao hơn nhiều. Hầu hết các vi khuẩn probiotic sử dụng để lên men sữa bao gồm Lacitc bulgaricus và Lactic thermophiles vừa sản sinh ra lactose vừa khích thích lactose trong ruột sản sinh, giúp cải thiện rõ rệt khả năng dung nạp lactose và hỗ trợ tiêu hóa ở đường ruột 10. 1.3.2.5. Sinh tổng hợp ra các chất kháng ng thư và chống các yếu tố đột biến. Một số chủng Lactobacilli như Lactoacidophius làm giảm hoạt độ ủa các enzyme β- glucoronidase, nitroreductase và azoreductase là những enzyme xúc tác sản sinh các chất gây ung thư trong hệ tiêu hóa. Probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết, ung thư bàng quang, ngoài ra probiotic còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu 9. Nhờ sự sản xuất các hợp chất kháng ung thư: sinh ra những acid yếu có lợi cho đường ruột như acid butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành và hồi phục chức năng. Điều hòa những enzyme gây tiền chất ung thư ruột, ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch 18. 1.3.2.6. Một số tác dụng khác Probiotic ngoài những tác động trên còn có một số tác động như: ngăn ngừa bệ nh tiêu chảy, các rối loạn tiêu hóa đường ruột, giảm cholesterol trong máu, cải thiện nhu động ruột… 24. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng probiotic trong nuôi tôm trên thế giớ i và Việt Nam. Khi sử dụng một loại probiotic thân thiện môi trường có tên thương mại là Environ - AC của tập đoạn Biostadt India Ltd, để xử lý sinh học môi trường ao nuôi tôm ở một trang tại tôm sú tại làng Srijang gần Chandipur nằm ở vùng duyên hải Balasore ven biển Oissa (Ấn Độ) thì khi phân tích mẫu nước trước khi sử dụng probiotic đã cho thấy sự hiện diện của NH3, H2S, NO2 và mật độ vi khuẩn Vibrio rất cao. Trong khi 30 đó, sau khi sử dụng Probiotic thì từ ngày nuôi thứ 70 trở đi, mức độ độc hại không chỉ giảm mà còn giảm triệt để tới bằng mức 0, số lượng Vibrio cũng giảm đi đáng kể. Những phát hiện tương tự như các quan sát thực hiện bởi Ravichandranand Jall aluddin (2000) sử dụng Environ - AC với liều lương đầu 25kgha, sau đó là 10 Kg cách tuần 14. Nghiên cứu này cho thấy trong ao được xử lý probiotic, các quần thể vi khuẩn Vibrio phát triển chậm trong khi đó, ở ao không được xử lý bằng probiotic số lượng Vibrio tăng rất nhanh. Prabhu và cộng sự (1999) trong nghiên cứu của mình cũng thấy được mức độ ammoniac andnitrie trong ao xử lý băng probiotic thấp hơn trong ao đối chứng. Nghiên cứu của Jha và Naik (2007, 2008, 2009) cho thấy ao nuôi sử dụng probiotic có tỷ lệ vi khuẩn Vibrio rất hạn chế và không hình thành các loại khí độc hại như amoniac, nitrit hydrogen sulphide, vv, trong khi ở các ao đối chứng, vi khuẩn Vibrio tăng nhanh và phát hiện nhiều loại khí độc hại 14. Tất cả các tác giả trên đều khuyến cáo việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi tôm để phân hủy các chất hữu cơ, làm giảm và kiểm so...
NỘI DUNG
1.1.1 Tổng quan ngành thủy sản
Việt Nam có vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên thuận lợi tạo ra thế mạnh nổi trội để phát triển ngành công nghiệp thủy sản Xuất khẩu thủy sản, do đó, trở thành một trong những lĩnh vực mũi nhọn của ngành kinh tế [21] Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước [20]
Sản phẩm thủy sản xuất khẩu của Việt Nam rất đa dạng về chủng loại, tuy nhiên hai sản phẩm đóng góp lớn nhất cho sự phát triển của ngành cũng như là hai sản phẩm xuất khẩu chính là cá tra và tôm [21]
Trong những năm gần đây, ngành nuôi tôm nước ta đã trở thành một trong những ngành kinh tế chủ đạo của quốc gia Diện tích nuôi tôm không ngừng được mở rộng Trong số các mặt hàng thủy sản, tôm đang giữ vị trí đứng đầu về giá trị xuất khẩu của toàn ngành [25]
Mặt hàng tôm đã vượt lên chiếm 40,7% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam Thị trường tiêu thụ tôm đã vươn tới 90 nước, trong đó 3 thị trường chính (EU,
Mĩ, Nhật Bản) chiếm trên 70% tổng kim ngạch xuất khẩu tôm của nước ta [26]
Tuy nhiên, trong năm 2010, thủy sản Việt Nam nói chung đang đứng trước khó khăn phải đối mặt với những rào cản kỹ thuật từ phía nhà nhập khẩu [25] Một trong những khó khăn của xuất khẩu là dư lượng hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm thủy hải sản Do đó, cần phải xây dựng giải pháp kỹ thuật không dùng thuốc kháng sinh và các chất hóa học hoặc tìm các chất thay thế an toàn nhằm đạt được các sản phẩm thủy sản an toàn vệ sinh thực phẩm [19]
1.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Hiện nay tôm vẫn là loài có vai trò quan trọng, đóng góp cho sự phát triển của ngành thủy sản Việt Nam nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng Tôm có hai loại sản phẩm chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trong đó tỷ lệ tôm thẻ chân trắng gia tăng trong thời gian gần đây, nhưng tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu cơ bản [21] Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng mới bắt đầu nuôi trong năm 2008 và phát triển nhanh trong vài năm gần đây Diện tích nuôi năm 2009 mới đạt 3.398 ha, chiếm tỷ lệ nhỏ khoảng 0,58% tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng, nhưng đến năm 2013 diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng đã tăng lên 44.601 ha, chiếm 7,4% diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng [15]
Năm 2009 - 2013, tốc độ tăng trưởng bình quân 0,9 %/năm Diện tích nuôi tôm sú vẫn chiếm tỷ trọng lớn trong tổng diện tích nuôi với 558.795 ha, chiếm 92,6% tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng và chiếm 94,9% tổng điện tích nuôi tôm sú của cả nước Tuy nhiên, diện tích nuôi tôm sú có xu hướng giảm dần trong giai đoạn 2009 -
2013 với tốc độ giảm bình quân 0,84%/năm Trong giai đoạn này, diện tích nuôi tôm nước lợ vùng Đồng bằng sông Cửu Long tăng bình quân 0,9 %/năm, sản lượng nuôi lại tăng bình quân 8,7%/năm (tăng từ 308.855 tấn lên 431.569 tấn), điều này cho thấy mức độ áp dụng khoa học công nghệ trong nuôi tôm nước lợ [15]
Năm 2013, theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, cả nước có khoảng 29 tỉnh, thành nuôi tôm nước lợ, với tổng diện tích thả nuôi 652.612 ha, sản lượng đạt 475.854 tấn Trong đó, khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long chiếm 92,5% diện tích và 79,8 % sản lượng của cả nước [15]
Tính đến thời điểm 31/10/2014, cả nước đã thả nuôi 675.830 ha (đạt 100,9% kế hoạch và bằng 103,6% so với cùng kỳ 2013), trong đó diện tích nuôi tôm sú là 582.514 ha, tôm chân trắng là 93.316 ha (đạt 133,3% kế hoạch năm 2014, bằng 146,4 cùng kỳ năm 2013) Sản lượng thu hoạch 568.668 tấn (đạt 103,4% kế hoạch năm 2014 và bằng 105,1% so với cùng kỳ 2013), trong đó sản lượng tôm sú đạt 240.937 tấn, tôm chân trắng 327.731 tấn [15]
1.2 Tình hình dịch bệnh ở tôm, nguyên nhân và phương pháp giải quyết
1 2 1 Tìn ìn dịc bện trên tôm nuôi
Từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do dịch bệnh Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn Tại Việt Nam trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng [7]
Các chương trình nghiên cứu trên tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy các tác nhân gây bệnh chính bao gồm nhóm vi khuẩn Vibrio và các virus quan trọng như MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo và cs, 1997) Sự giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987) Dựa vào khoảng 49 đặc tính kiểu hình và khoảng 210 mẫu phân lập đại diện đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Vibrio harveyi, Vibrio cholerae dòng Albensis và Photobacterium leiognathi [5]
Năm 2012, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 120 xã thuộc 54 huyện của 19 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha và bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 192 xã thuộc 52 huyện của 16 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 28.005 ha [15] Năm 2013, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 282 xã thuộc 94 huyện của 28 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 8.734 ha So với năm 2012, dịch bệnh đốm trắng tăng 3.617 ha, tương đương khoảng 1,4 lần Số lượng xã, huyện, tỉnh có dịch cũng tăng so với cùng kỳ năm 2012 và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 199 xã thuộc
59 huyện của 19 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.875 ha So với năm 2012, dịch bệnh hoại tử gan tụy tăng chút ít về phạm vi có dịch, nhưng tổng diện tích chỉ bằng khoảng 21% [15]
Năm 2014, trong 9 tháng đầu năm, dịch bệnh đốm trắng xuất hiện tại 233 xã thuộc 65 huyện của 21 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 18.321 ha So với cả năm 2013, phạm vi dịch đã xuất hiện gần tương đương, nhưng diện tích bệnh lại cao hơn 1,5 lần, khoảng 5.970 ha và dịch bệnh hoại tử gan tụy xuất hiện tại 224 xã thuộc
59 huyện của 22 tỉnh, thành làm tổng diện tích bị bệnh là 5.119 ha So với cả năm
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
- Vi khuẩn Bacillus spp tự phân lập
- Các chủng vi khuẩn kiểm định: chủng Vibrio gây bệnh mua ở Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
- Tôm bệnh và tôm không bị bệnh
2.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.1.2.1 Dụng cụ Đĩa petri, pipep, micropipep, cốc đong các loại, bình tam giác các loại (50 ml,
250 ml, 500 ml…), ống nghiệm, que cấy, que trang, ống Durham, đèn cồn, lamen, kính hiển vi và một số dụng cụ khác tại phòng thí nghiệm Sinh học trường Đại học Quảng Nam
Tủ sấy (memert - Đức, tủ lạnh giữ mẫu (Vestrost Reetech), tủ ấm (ise cube), tủ cấy (Trung Quốc), bếp điện, máy lắc, cân điện tử, nồi khử trùng áp lực, máy do pH, máy cất nước một lần, máy li tâm
Cao thịt (Trung Quốc), Pepton (Trung Quốc), muối (Việt Nam), agar (Việt Nam)
Tất cả các hóa chất đều tinh sạch ở mức phân tích
- Môi trường Nutrient Agar 1,5% (NA1,5%) (g/l): Cao thịt: 3(g/l); Pepton: 5(g/l); NaCl: 8(g/l); agar: 15(g/l); pH 7,5
- Môi trường Nutrient Broth (NB): Cao thịt: 3(g/l); Pepton: 5(g/l); NaCl: 8(g/l)
- Môi trường MPA: Pepton 5(g/l); NaCl 5(g/l); Cao thịt 5(g/l); thạch 20(g/l); nước cất 1lit; pH = 7,5
Các môi trường được hấp thanh trùng ở điều kiện 1 atm, 121C trong 30 phút.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp từ ruột tôm
- Bước 1: Khử trùng các dụng cụ dùng để mổ tôm (dao, kéo và panh) và nghiền mẫu ruột tôm
- Bước 2: Mổ tôm bằng dụng cụ đã khử trùng sau đó thu ruột tôm
- Bước 3: Ruột tôm được nghiền nhỏ, thu hỗn hợp và tiến hành pha loãng bằng nước cất 1 lần
Mẫu phân lập được pha loãng trong nước muối 1,5% NaCl vô trùng theo sơ đồ sau:
Hình 2.1 Sơ đồ pha loãng vi khuẩn
Các mẫu pha loãng được gây sốc nhiệt ở 80C khoảng 20 phút rồi làm lạnh ngay tức khắc dưới vòi nước Sau đó lấy 1 ml mẫu pha loãng ở các độ độ pha loãng từ 10 2 đến 10 8 trang đều lên môi trường NA1,5% thạch đĩa, ủ ở 30C trong 72 giờ và thu các khuẩn lạc riêng rẽ Mỗi khuẩn lạc riêng rẽ được kiểm tra bằng phản ứng catalaza Nếu khuẩn lạc nào cho kết quả catalaza dương tính được cấy truyền sang ống thạch nghiêng, giữ ở 30C trong 72 giờ
2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn
Trang dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus spp trên đĩa môi trường thạch NA1,5%, nuôi trong tủ ấm 30ºC trong 48 giờ để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc
2.2.3 Hoạt hóa các chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn Bacillus spp phân lập được giữ giống trên môi trường thạch MPA mặn và được hoạt hóa giống bằng cách cấy truyền trên môi trường NA1,5% thạch đĩa giữ ở 30C trong 3 ngày Sau đó, các khuẩn lạc riêng rẽ được thu lại và cấy truyền sang từng ống nghiệm chứa môi trường thạch NA1,5% giữ trong điều kiện 80C trong 20 phút để loại bỏ các vi sinh vật không sinh bào tử Sau khi để trở về nhiệt độ thường, các ống nghiệm cấy truyền được giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30C trong 3 ngày Các ống nghiệm giống đó được giữ trong tủ lạnh ở 4C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo Cấy truyền định kỳ 2 tháng 1 lần
Các chủng vi khuẩn Bacillus spp trong bộ sưu tập cũng như các chủng phân lập được từ ruột tôm được nhân giống trong môi trường NB như sau: dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn trong ống nghiệm giữ giống đưa sang môi trường
NB Nuôi lắc 160 vòng/phút ở 30C trong 24 giờ và thu dịch nhân giống từng chủng vi khuẩn nghiên cứu
Các chủng Vibrio được nhân giống trên môi trường NB tương tự như nhân giống các chủng vi khuẩn Bacillus spp nghiên cứu
2.2.5 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường dịch thể
Dùng pipet lấy 1 ml dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn 24 giờ tuổi Pha loãng dịch nuụi cấy theo phương phỏp pha loóng giới hạn rồi dựng micropipette lấy 100 àl dịch pha loãng trải đều trên môi trường thạch đĩa petri Nuôi ủ ở 30C trong 24 giờ Đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trong mỗi đĩa petri, từ đó xác định được số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức:
N: tổng số tế bào trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu
A: số khuẩn lạc (CFU: Colony Foming Unit) trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri
Df: độ pha loãng dịch huyền phù n: thể tớch dịch pha loóng đem cấy trờn mỗi đĩa petri (100 àl)
Số khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri được coi là tốt để xác định số lượng tế bào nếu khi cấy 100 àl dịch pha loóng, trờn mỗi đĩa petri cú khoảng 25 - 300 khuẩn lạc Nếu số lượng nhỏ hơn 10 thì kết quả phải loại bỏ
2.2.6 Xác định khả năng đối kháng với Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus spp
2.2.6.1 Phương pháp cấy đường chữ thập trên môi trường thạch đĩ
Hoạt động đối kháng của vi khuẩn Bacillus spp., đối với các chủng Vibrio được kiểm tra trên môi trường NA1,5% thạch đĩa bằng phương pháp cấy đường chữ thập Dùng que cấy vô trùng lấy giống chủng Vibrio tạo 1 đường cấy thẳng chủng Vibrio trên đĩa thạch, tiếp tục dùng que cấy vô trùng lấy giống chủng Bacillus tạo đường cấy thẳng chủng Bacillus vuông góc với đường cấy đầu tiên (hình 3), sau đó hộp lồng được ủ ở 30C trong thời gian 96 giờ
Hình 2.2 Phương pháp cấy đường chữ thập
2.2.6.2 Phương pháp xác định vòng vô kh ẩn trên môi trường thạch
Các chủng Bacillus spp được cấy chẩm điểm trên 3 đĩa thạch chứa môi trường
NA1,5%, giữ ở nhiệt độ 30C trong 24h, 48h và 72h Chủng Vibrio tạo cặp đối kháng với Bacillus spp theo phương pháp cấy chữ thập ở trên được nuôi cấy qua đêm trong môi trường Nutrient Broth, ở 30C 0,2 ml dịch nuôi cấy Vibrio được bổ sung và trộn
Bacillus spp đều với 20 ml môi trường NA1,5% ở nhiệt độ 40 - 45C Hỗn hợp này được đổ nhẹ lên trên bề mặt đĩa thạch đã cấy chấm điểm Bacillus spp tạo cặp đối kháng trước đó Sau
24 - 48h ủ ở 30C xác định kích thước vòng vô khuẩn xuất hiện xung quanh điểm cấy
Bacillus spp So sánh kích thước vòng vô khuẩn của từng chủng Bacillus spp đã sinh trưởng ở 24h, 48h và 72h
2.2.7 Phương pháp xác định khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn
Khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus spp tuyển chọn được xác định bằng phương pháp cấy đường cắt ngang nhau của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trường NA1,5% thạch đĩa (như trong hình 4) và ủ ở 30C trong
48 giờ Xác định vùng vô khuẩn xuất hiện tại các điểm giao nhau giữa 2 vạch cấy Nếu các chủng vi khuẩn không đối kháng nhau thì tại các điểm giao nhau giữa 2 vạch cấy không xuất hiện vùng vô khuẩn
Hình 2.3 Phương pháp xác định tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn
2.2.8 Phương pháp xác định khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn Vibrio trên môi trường dịch thể
Nuôi cấy lắc 160 vòng/phút vi khuẩn Bacillus spp trên môi trường NB ở 30C trong 72 giờ, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ sinh khối tế bào Nhỏ
200 àl dịch ly tõm vào mỗi bỡnh tam giỏc chứa 10 ml mụi trường NB đó bổ sung 200 àl dịch nhõn giống cỏc chủng Vibrio Nuụi cấy lắc 160 vũng/phỳt ở 30C trong 24 giờ Xác định số lượng tế bào Vibrio phát triển trong môi trường trước và sau khi nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
2.2.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus spp trên môi trường chỉ có nước nuôi tôm
Nước nuôi ấu trùng tôm có nồng độ muối là 31‰ và pH 8,3 Nước nuôi ấu trùng tụm được thanh trựng ở 121C trong 30 phỳt Cấy 100 àl dịch nhõn giống chủng
Bacillus spp nuôi cấy trong 24 giờ vào mỗi bình tam giác chứa 10 ml nước nuôi ấu trùng tôm vô trùng Nuôi lắc 160 vòng/phút ở 30C trong 24 giờ Xác định số lượng tế bào của chủng Bacillus spp trong dịch trước và sau khi nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
