Nghien cuu kha nang doi khang va tiem nang ung 118167

MỞ ĐẦU Biện pháp sinh học sử dụng sinh vật, vi sinh vật đối kháng hay sản phẩm chúng kiểm soát sinh học, nhằm ngăn chặn, diệt trừ sinh vật, vi sinh vật gây bệnh có nhiều ưu điểm to lớn Nó khơng phịng, trị sâu bệnh hại có hiệu mà cịn khắc phục nhược điểm biện pháp sử dụng chất hoá học bảo vệ thực vật Biện pháp sinh học khơng gây nhiễm mơi trường, góp phần vào việc giữ cân sinh thái, khơng độc hại với người sử dụng, nông phẩm tạo có chất lượng cao, an tồn với sức khoẻ người vật ni Vì biện pháp sinh học sử dụng phổ biến nhiều nước phát triển bước mở rộng, khuyến khích sử dụng hầu giới có nhiều triển vọng phát triển mạnh tương lai Trong năm gần đây, việc sử dụng nấm đối kháng nghiên cứu nhiều, phải kể đến lồi nấm thuộc chi Trichoderma Nó có nhiều tiềm sử dụng đấu tranh sinh học Hiện nay, nhiều nước giới chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật phân bón chứa Trichoderma sản xuất sử dụng phổ biến thực tiễn Ở Việt Nam, năm trở lại có nhiều nghiên cứu hướng vào khả đối kháng tạo chế phẩm phân bón hay thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ loài Trichoderma đặc biệt thành phố Hồ Chí Minh Tuy nhiên, nghiên cứu Trichoderma từ RNM cịn chưa có Tất nghiên cứu Trichoderma nhằm mục đích góp phần vào việc tạo ngày nhiều chế phẩm có nguồn gốc sinh vật sử dụng có hiệu bảo vệ thực vật nhằm làm giảm tiến tới thay dần việc dùng chất hoá học bảo vệ thực vật mà người nông dân lạm dụng Một thực tế cho thấy là, trồng sản phẩm sau thu hoạch bị nhiễm sâu, bệnh hại làm giảm đáng kể suất chất lượng sản phẩm nhiễm nặng giảm tới 50% sản lượng chí dẫn tới trắng Trong bệnh gây nấm phổ biến, có khoảng 250000 lồi nấm có khả gây bệnh cho [10] Tổ chức lương thực LHQ (FAO) thống kê thấy rằng, bệnh vi nấm gây thiệt hại cho nông nghiệp chiếm tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp giới [99] Có nhiều biện pháp khác phịng, trừ sâu, bệnh sử dụng bảo vệ thực vật biện pháp có ưu, nhược điểm riêng Tuy nhiên, thấy nhiều nước giới đặc biệt nước ta, biện pháp dùng chất hoá học bảo vệ thực vật sử dụng phổ biến Hơn nữa, nhiều người nông dân khơng có hiểu biết đầy đủ lại q lạm dụng thuốc, gây tượng nhiễm môi trường nghiêm trọng, cân sinh thái đồng thời ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ người Ở Việt Nam, năm sử dụng tới 25000 thuốc hoá học bảo vệ thực vật, năm 2003 nhập tới 166 triệu USD thuốc hoá học bảo vệ thực vật 28% thuốc phịng diệt nấm [5] Thực tế, phải đối mặt giải hậu gây từ việc sử dụng tràn lan, khơng có khoa học thuốc hố học bảo vệ thực vật Nó khơng làm nhiễm nghiêm trọng mơi trường đất, nước, khơng khí ảnh hưởng trực tiếp đến sinh vật sống mơi trường Và dư lượng thuốc tồn lưu nơng phẩm cịn ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ người làm phát sinh nhiều bệnh nan y ung thư, viêm phổi, thai dị dạng…hơn nữa, việc lạm dụng thuốc gây tượng quen thuốc loại sâu vi sinh vật gây bệnh Đứng trước thực tiễn đó, việc tạo chế phẩm sinh học có hiệu cao phịng, trị sâu, bệnh tiến tới thay dần biện pháp sử dụng chất hoá học bảo vệ thực vật u cầu địi hỏi cấp thiết khơng để làm giảm thiệt hại sâu bệnh gây ra, góp phần nâng cao suất, chất lượng sản phẩm nơng nghiệp mà cịn mục đích giải vấn đề môi trường nâng cao chất lượng đời sống người Các loài Trichoderma biết đến với khả kháng nấm bệnh nhiều loại trồng sử dụng tác nhân tích cực phân bón sinh học nhằm hạn chế nhiễm bệnh từ đất Để góp phần nghiên cứu tìm hiểu khả đối kháng chủng Trichoderma từ RNM, với mong muốn tìm chủng có khả áp dụng bảo vệ thực vật, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả đối kháng tiềm ứng dụng số chủng Trichoderma phân lập từ RNM số nấm bệnh thực vật” Mục tiêu đề tài chọn lọc số chủng Trichoderma có khả đối kháng cao với nấm bệnh Bước đầu nghiên cứu khả ứng dụng số chủng Trichoderma có khả đối kháng mạnh với nấm bệnh Phytophthora capsici ớt - Nghiên cứu hoạt tính enzyme chitinase, cellulase giải thích chế đối kháng Trichoderma với nấm bệnh - Song song với việc nghiên cứu khả phòng, trừ nấm bệnh đề tài nghiên cứu ảnh hưởng Trichoderma đến khả sinh trưởng, phát triển Từ đánh giá chọn lọc chủng có hiệu cao khơng phịng, trừ nấm bệnh mà cịn có khả phối trộn vào phân bón hữu làm tăng khả phân giải chất hữu kích thích sinh trưởng CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái, khả sinh sản nấm Trichoderma 1.1.1 Đặc điểm hình thái Sợi nấm (Hypha) thường khơng màu, có vách ngăn, có khả phân nhánh nhiều Cuống sinh bào tử (Conidiophore) không màu, thường phân nhánh có khơng phân nhánh hay phân nhánh (Hypocreanum) hay phân nhánh ngắn (longibrachiatum), có phân nhánh nhiều cấp (T satunisporum) Cuống sinh bào tử nhánh rộng (Pachibasium) hay nhỏ (T virens) hình thành theo vịng đồng tâm mọc dọc theo sợi nấm [29] Những nhánh bên đối xứng mọc từ cuống sinh bào tử gọi thể bình Đơi thể bình mọc trực tiếp từ phần nhỏ hệ sợi Các nhánh mọc vng góc với hệ sợi gốc Cuống sinh bào tử đặc biệt chứa hay vài thể bình Trong số lồi (ví dụ T polysporum) nhánh dài, đơn hay nhánh, móc nối, thẳng hay khúc khuỷu, có vách mỏng, nhăn nheo hay nhẵn kéo dài tận Thể bình (Phialide) điển hình có hình chai, hình trụ, gần cầu, phình rộng Thể bình trục chiều rộng với thể bình phân nhánh hay rộng nhiều Những thể bình mọc thành vịng xoắn dọc cuống sinh bào tử thẳng góc 90°, đơn lẻ (T polysporum) tạo thành chùm (T longibrachiatum) 1.1.2 Các loại bào tử Trichoderma: Bào tử trần (Conidia) loại bào tử chủ yếu chi Trichoderma, thường có màu xanh lục, trắng vàng sáng nhạt, đơn bào Các bào tử có dạng bụi, mịn, có dạng nhớt giọt chất lỏng xanh lục hay vàng sáng Đa số bào tử có hình dạng elip, hình cầu, trịn hình oval tùy theo lồi, kích thước 24 x 3-5µm [29] Bề mặt bào tử thường nhẵn, số lồi bề mặt bào tử ráp, có mấu hạt cơm (T viride, T saturnisporum) [29] Bào tử áo/dây (Chlamydospores) Các bào tử áo thường có thành dày, đơn bào, đa bào, dạng cầu gần cầu Chúng hình thành tận sợi nấm bên sợi nấm hay điểm hệ sợi sinh dưỡng sau khoảng 10 ngày nuôi cấy 20 oC Bào tử áo có khả chống chịu tốt với điều kiện mơi trường Sự hình thành bào tử mơi trường: Đa số lồi Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm nhiều điều kiện môi trường tự nhiên nhân tạo điều kiện sáng tối xen kẽ hay điều kiện hoàn toàn sáng tối.Trên môi trường PDA thạch đĩa, ánh sáng 85 Lux khoảng 20- 30 giây làm tăng hiệu nảy mầm bước sóng 254 nm 1100nm Trichoderma khơng hình thành bào tử hình thành bào tử nhiều bước sóng 380- 440 nm Các hỗn hợp azaguanine, 5- fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol ethidium bromide ngăn cản hình thành cấu trúc thứ cấp (bào tử áo) thể quan trọng hình thái học, làm tăng tiềm phòng trừ sinh học [14] Hiện Trichoderma xếp vào họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; loài Trichoderma phân thành nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Satutnisporum, Pachybarium Hypocreanum [29] Trong đó, nhóm Trichoderma, Hypocreanum, Pachybasium Longibrachiatum có giai đoạn sinh sản hữu tính Hypocrea.Các Trichoderma thuộc nhóm Saturnisporum chưa tìm thấy hình thức sinh sản hữu tính Tuy nhiên, giai đoạn hữu tính Hypocrea khơng sử dụng cho mục đích kiểm sốt sinh học [49] 1.2 Đặc điểm sinh trưởng Trichoderma Những loài nấm thuộc chi Trichoderma phân bố rộng rãi dễ dàng phân lập từ đất Chúng thường xuất loại đất giàu dinh dưỡng thường sống mơi trường đất phèn, ẩm ướt, diện môi trường đất kiềm [15] Qua điều tra phát người ta thấy nấm Trichoderma sinh sống tồn phổ biến tàn dư thực vật đất [16] Theo Samuels (năm 2006), Trichoderma khơng sống nội kí sinh với thực vật tìm thấy thực vật sống [81] Chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh, sản sinh số lượng lớn bào tử có màu xanh Nhiều lồi sản sinh số lượng lớn bào tử có thành dày (Chlamydospores) thường nằm hệ sợi [81] Trichoderma loại nấm hoại sinh đất chúng có khả sử dụng nguồn hỗn hợp carbon nitrogen môi trường Nguồn carbon lượng Trichoderma sử dụng monosaccharides, disaccharides với hỗn hợp polysaccharide, purine, pyrimidine, axit amin, aldehydes axit hữu Đặc biệt yếu tố dinh dưỡng cần thiết cho Trichoderma axit béo, methanol, methylamine, formate NH3[15] Muối, nguồn sunfur hỗn hợp vitamin có ảnh hưởng đáng kể đến khả sinh trưởng Trichoderma Đặc biệt muối NaCl làm giảm sinh trưởng phát triển số loài Trichoderma [15] Những chủng Trichoderma sinh trưởng nhanh chúng bổ sung vào đất chúng có sức kháng sẵn có với nhiều phức hợp độc gồm thuốc diệt cỏ, thuốc diệt nấm pesticide DDT phức hợp phenol Với lí này, bổ sung trước chủng Trichoderma vào đất trồng có hiệu điều khiển số nguồn bệnh tồn lưu đất Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, hay Sclerotium rolfsii kết hợp luân phiên với methyl bromide, benomyl, captan hay hố chất khác [96] Ngồi ra, Trichoderma cịn có ưu trội chúng có cấp độ cao so với nhiều vi sinh vật khác khả huy động biến đổi chất dinh dưỡng đất Việc sử dụng hiệu chất dinh dưỡng có sẵn đất hợp chất polimer (cellulose, glucan, chitin…), thu nhận lượng cho khả định loài Trichoderma đấu tranh sinh tồn [35] 1.3 Các sản phẩm trao đổi nấm Trichoderma Các sản phẩm trao đổi Trichoderma gồm sản phẩm sơ cấp enzyme (chitinase, β-1,3 glucanase, cellulase) [23] hay sản phẩm thứ cấp kháng sinh (gliotoxin, gliovirin, viridian, valinotricin) [91] hay độc tố khác (isonitrin D, pyrindine, furanone) [36,72] Các chất trao đổi sơ cấp thứ cấp nghiên cứu Trichoderma chất sinh theo chế có lợi cho việc sử dụng chúng đấu tranh sinh học [72] Weidling (1932) [82] phân lập gliotoxin, sản phẩm trao đổi hữu có khả kết tinh độc Gliotoxin có khả chống Rhizoctonia solani nồng độ thấp Một chất độc thứ hai có tên viridian phát tinh chế Brian Mc Growan từ loài T viride Cả hai chất có hiệu lực cao nhiều loại nấm bệnh Ngoài sản phẩm trao đổi trên, người ta xác đinh nhiều loại chất độc khác tiết từ Trichoderma có hiệu ức chế mạnh nấm bệnh Nghiên cứu Jinamara [61] dịch nuôi cấyTrichoderma chứa chất ức chế chống lại nhiều vi sinh vật khác Những kháng sinh sản sinh T harzianum biết đến 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one, 6-n-pentenyl-2H-pyran-2one, pyridine, anthraquinones, butenolides, isonitrin D F, trichorzianines, furanone [36,72] Những kháng sinh chất ức chế sản sinh T virens nghiên cứu tách chiết gliotoxin, gliovirin, gliocladic acid, heptilidic axit, viridian, viridiol valinotricin [91] Ahmed Imtiaj Tae-Soo lee (2008) [18] nghiên cứu hiệu đối kháng ba loài Trichoderma đối nấm Alternaria porri gây bệnh u rễ hành thấy dịch chiết nuôi cấy sản sinh ba loài Trichoderma: T harzianum, T pseudokoningii T virens có khả khuấch tán, ngăn cản ức chế sinh trưởng hệ sợi nảy mầm bào tử A porri Vì cho tác nhân kiểm sốt sinh học có tiềm lớn chống lại nấm bệnh A porri Ngoài chất kháng sinh ra, lồi Trichoderma cịn có khả tiết nhiều loại sản phẩm sơ cấp enzyme exo- endoglucanase, chitinase, cellulase Chức enzyme phân hủy thành phần tạo nên tính rắn thành tế bào nấm gây bệnh thực vật [39] Chitinase phân thành β-1,4-acetylgucosamindase, endochitinase, exochitinase Nhiều thí đối kháng chứng minh enzyme chitinase có vai trị quan trọng tượng kí sinh nấm [66] Những dạng đột biến T harzianum sinh mạnh enzyme chitinase có khả ức chế Fusarium oxysporum Sclerotinia rolfsii mạnh dạng tự nhiên Hơn dịch chiết chứa enzyme chitinase có khả ức chế gần hoàn toàn nảy mầm nấm Botrytis cinerea, nấm gây bệnh thối cổ (neck rot) hành [94] Enzyme glucanase phá hủy thành chitin Người ta thấy β-1,3-glucanase ức chế nảy mầm bào tử hay sinh trưởng nấm bệnh phối hợp với enzyme chitinase [27,46] hay với chất kháng sinh (gliotoxin, gliovirin) [52,58] Những dạng đột biến biểu mạnh β-1,3-glucanase có khả ức chế mạnh sinh trưởng Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani Phytophthora citrophthora Dạng đột biến T28 T harzianum biểu cao hoạt động β1,3-glucanase điều kiện có kích thích khơng kích thích nấm bệnh biểu hiệu ức chế bệnh cao Hiệu đối kháng P citrophthora (có cellulose glucans thành phần thành tế bào) mạnh so với khả chống lại Botrytis Rhizoctonia (có chitin glucan thành phần thành tế bào) [27] Mặc dù có số nghiên cứu ảnh hưởng cellulase (cellobiohydrolases, endoglucanase, β-1,3- glucosidase) tới tính kháng nấm bệnh Trichoderma vai trò thực enzyme chế đối kháng chưa biết rõ Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu enzyme ngoại bào, chủ yếu cellulase có vai trị đặc biệt quan trọng việc sử dụng chủng Trichoderma chế phẩm sinh học làm giàu cho đất, kích thích tăng trưởng phòng trừ bệnh nấm cho [58] Sự sinh enzyme protease có hiệu đáng kể kiểm sốt sinh học Phịng trừ sinh học nấm Botrytis cinerea gây bệnh đậu tương T harzianum phần cho hoạt động protease [58] Protease liên quan đến việc làm giảm protein lạ sinh nấm bệnh Protease kiềm Prb1 từ T harzianum chứng minh có vai trị quan trọng kiểm soát sinh học Dạng đột biến làm tăng hoạt động protease kiềm Prb1của Trichoderma biểu tăng hiệu kiểm soát sinh học chống lại R solani [27] Gen sinh protease kiềm ngoại bào (tvsp1) tạo dòng từ T virens biểu mạnh mẽ gen có ý nghĩa tăng cường bảo vệ chống lại R solani Những gen thể tiềm lớn cải thiện khả kiểm soát sinh học protease kiềm hiệu việc chống lại nấm bệnh thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes) [75] chống lại giun tròn [58] Một trypsin kiềm tách từ chủng Trichoderma 2413 có hiệu làm giảm ấu trùng giun kí sinh hệ rễ hiệu phối hợp với protein khác sinh hoạt động đối kháng chủng [89] 1.4 Ảnh hưởng số nhân tố môi trường tới Trichoderma - Ảnh hưởng nhiệt độ: Phần lớn chủng Trichoderma ưa ấm Nhiệt độ thấp mùa đơng gây ảnh hưởng với khả kiểm soát sinh học chúng [64] Một số chủng loài T viride T harzianum có khả chịu lạnh có tiềm cao kiểm soát sinh học nhiều nấm bệnh thực vật gây bệnh mạnh điều kiện đất khô nhiệt độ thấp [64] Trong phương pháp nuôi cấy đối đôi (Dual methods) 10 oC, chủng Trichoderma chịu lạnh sinh cấu trúc giác bám thể tính đối kháng với số nấm bệnh thực vật Rhizoctonia solani Fusarium oxysporum f.sp dianthi [21] Ở chủng chịu lạnh enzyme ngoại bào liên quan đến hoạt động kí sinh β1,4-N-acetyl-glucosaminidase (NAGase), β-glucosidase protease dạng trypsin chymotrypsin sinh nhiều 10oC giữ hoạt động cao chí 5oC [64] - Ảnh hưởng nước: Điều kiện nước ảnh hưởng mạnh tới nảy mầm bào tử, sinh trưởng hệ sợi [68] Nước ảnh hưởng tới khả phân giải, tương tác với nấm khác, tiết hoạt động enzyme Trichoderma Sự tiết cellobiohydrolase NAGase tối đa nước cao Trong hoạt động cực đại tiết β-glucosidase, β-xylosidase enzyme dạng chymotrypsin xảy nước thấp nước sinh trưởng [64] - Ảnh hưởng pH: Delgado-Jarana cs [40,41] nghiên cứu thấy độ pH có ảnh hưởng lên sinh trưởng hệ sợi, hoạt động enzyme ngoại bào, khả kí sinh cạnh tranh dinh dưỡng Trichoderma Trichoderma sinh trưởng dải pH rộng 2-6 pH phù hợp Giá trị pH phù hợp β- glucosidase, cellobiohydrolase NAGase 5, β-xylosidase 3, pH=6 hoạt động protease kiềm pH=6-7 hoạt động protease giống chymotripsin Những enzyme ngoại bào liên quan tới tượng kí sinh biểu hoạt động dải giá trị pH rộng so với pH cho sinh trưởng hệ sợi [64] Một số loại thuốc kháng sinh bị giảm hoạt tính pH cao; độ ẩm độ pH thấp gây suy thối enzyme protease axit [40,41]; tăng trưởng nhiều loài nấm bị ức chế axit yếu axit sorbic giảm nhanh chóng tế bào chất độ pH khơng bào [40] Do đó, khả phát triển mạnh với điều kiện pH bên đặc tính quan trọng đặc tính Trichoderma chúng thích nghi tốt với đất chua - Ảnh hưởng ion kim loại: Một số ion kim loại nặng (Cu, Zn, Ni, Fe Co…) cần thiết cho hình thành sợi nấm nồng độ cao chúng gây độc nghiêm trọng [71] Sự tích lũy kim loại nặng có ảnh hưởng lớn lên hình thành bào tử Khi nghiên cứu ảnh hưởng 10 kim loại nặng (Al, Cu, Ni, Co, Cd, Zn, Mn, Pb, Hg, Fe) lên sinh trưởng hoạt động số enzyme ngoại bào (protease dạng trypsin, chymotrypsin, NAGase, β-1,3-glucanase, βglucosidase, cellobiohydrolase, β-xylosidase, endoxylanase) chủng T aureoviride T122, T harzianum T66, T334 T viride T124, T128 thấy sinh trưởng hệ sợi hoạt động enzyme ngoại bào bị ảnh hưởng đáng kể kim loại Ở nồng độ 1mmol, Hg ức chế mạnh hoạt động enzyme ngoại bào kiểm tra [65] 1.5 Một số chế đối kháng Trichoderma Nghiên cứu chế đối kháng có ý nghĩa quan trọng lẽ muốn sử dụng hiệu tác nhân kiểm soát bệnh thực vật, phải hiểu tác nhân làm việc giới hạn chúng Trên sở đó, tác động có hiệu tới khâu nuôi dưỡng, bảo quản cuối sử dụng tác nhân kiểm soát sinh học cho khai thác tốt khả kiểm soát bệnh chúng Nhiều nghiên cứu từ trước tới rằng, chi Trichoderma sở hữu nhiều chế khác phòng trừ tiêu diệt nấm bệnh như: tượng kí sinh nấm, sản sinh kháng sinh, tiết enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh, khả nămg cạnh tranh mạnh chất dinh dưỡng không gian, chịu đựng điều kiện bất lợi việc tăng phát triển hệ rễ; cảm ứng chế tự bảo vệ thực vật, tiết chất làm bất hoạt enzyme gây bệnh [3] 1.5.1 Cơ chế kí sinh Kí sinh nấm tượng cơng trực tiếp nấm lên nấm khác Nó trình phức tạp bao gồm bước sau: nhận biết có mặt nấm bệnh, sau q trình công, xuyên qua thành tế bào cuối giết chết nấm bệnh Một số chi tiết chế Trichoderma nghiên cứu làm sáng tỏ Thứ nhất, nấm Trichoderma nhận sợi nấm khác nhanh chóng sinh trưởng hướng chúng [33], sau phần sợi nấm sinh trưởng bám sát sợi nấm