Kinh Doanh - Tiếp Thị - Nông - Lâm - Ngư - Kiến trúc - Xây dựng Vietnam J. Agri. Sci. 2023, Vol. 21, No. 10: 1317-1326 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2023, 21(10): 1317-1326 www.vnua.edu.vn 1317 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA ĐẬU TƯƠNG Trần Thị Định1, Thân Thị Hương1 , Nguyễn Thị Hoàng Lan1, Lê Minh Nguyệt1, Đặng Thu Hương2, Nguyễn Thị Minh3 1Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2Bộ môn Công nghệ sinh học vi sinh, Viện Công nghiệp thực phẩm 3Khoa Tài Nguyên - Môi Trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tác giả liên hệ: ttdinhvnua.edu.vn Ngày nhận bài: 10.05.2023 Ngày chấp nhận đăng: 05.10.2023 TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic ứng dụng cho lên men sữa chua đậu tương. Từ 17 nguồn mẫu lên men tự nhiên, 51 chủng vi khuẩn lactic được phân lập, tất cả các chủng đều có khả năng lên men sữa đậu tương. Từ kết quả phân tích chất lượng sữa chua, 10 chủng vi khuẩn tiềm năng nhất đượ c sàng lọc. Kết quả định danh bằng phương pháp MALDI-TOFMS cho thấy 10 chủng vi khuẩn này thuộc 3 loài Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và Streptococcus equinus, trong đó, chủng vi khuẩn Lactococcus lactis K1 là chủng được đánh giá tốt nhất cho lên men sữa chua đậu tương vì sở hữu những đặc điểm nổi trội như khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, đảm bảo an toàn sinh học và lên men sữa chua có chất lượng tốt, đặc biệt chủ ng vi khuẩn có khả năng sinh hàm lượng exopolyscharide rất cao (1.381,7 mgkg). Sữa chua đậu tương bước đầu nhận được sự ưa thích của người tiêu dùng. Từ khóa: Vi khuẩn lactic, đặc tính sinh hóa, sữa chua đậu tương. Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria for use in Soy Yogurt Production ABSTRACT This study was conducted to isolate and select potential lactic acid bacteria for soy yogurt production. From 17 natural fermentation samples, 51 lactic acid strains capable of fermenting soy milk into soy yogurt were isolated. Based on the quality analysis of soy yogurt, 10 strains were selected. Using MALDI-TOFMS technique, these 10 strains were classified into 3 species: Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, and Streptococcus equinus . Among them, Lactococcus lactis K1 was evaluated as the best strain for soymilk fermentation due to its outstanding characteristics such as high growth rate, biological safety, and production of high-quality yogurt, especially with the ability to produce a high amount of exopolysaccharide (1,381.7 mgkg). The soy yogurt initially received positive responses from consumers. Keywords: Lactic acid bacteria, biochemical characterization, soy yogurt. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Đêu tþĄng (Glycine max L. Merrill) là cây công nghiệp ngín ngày và có vð trí quan trọ ng trong nền nông nghiệp Việt Nam và nhiều nþĆ c trên thế giĆi (Træn Vën Điền, 2007). Đêu tþĄng rçt giàu dinh dþĈng và đþĉc coi là nguồ n cung cçp protein hoàn chînh và chĀa một lþĉng đáng kể các axit amin không thay thế, cæn thiết cho cĄ thể nhþ isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin (Lokuruka, 2010). Bên cänh đò, đêu tþĄng cüng chĀa nhiề u axit béo không no, isoflavone và không chĀ a cholesterol và lactose. Vì vêy, các sân phèm tÿ đêu tþĄng rçt phù hĉp để thay thế các sâ n phèm tÿ sĂa động vêt dành cho ngþą i không dung näp lactose hay bð dð Āng vĆ i protein trong sĂa (Lin cs., 2004). Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương 1318 Mặc dù đêu tþĄng là loäi thăc phèm bổ dþĈng, tốt cho sĀc khóe nhþng să tiêu thý các sân phèm tÿ đêu tþĄng cñn hän chế vì sâ n phèm cò mùi ngái đặc trþng do enzyme lipoxygenase xúc tác cho phân Āng oxy hóa chç t béo täo thành các hĉp chçt bay hĄi gåy mùi khò chðu nhþ hexanal, pentanal, đồng thąi chĀa mộ t số chçt kháng dinh dþĈng, khò tiêu hòa điể n hình là axit phytic, raffinose và stachyose (Li cs., 2014). Để khíc phýc nhĂng hän chế này, lên men sĂa đêu tþĄng bìng vi khuèn lactic là giâ i pháp công nghệ phù hĉ p vì quá trình lên men giúp câi thiện đặc tính hóa lý, câ m quan và mang läi lĉi ích sĀc khóe cho ngþąi sā dý ng (Manorama cs., 2012). Nhiều nghiên cĀu đã công bố các chûng vi khuèn lactic có khâ nëng sinh tổng hĉp -galactosidase, kích hoä t enzyme phytase có tác dýng xúc tác thû y phân nhĂng hĉp chç t carbohydrate gây mùi ngái, làm giâm giá trð và khâ nëng hçp thu dinh dþĈ ng (Donkor Shah, 2006). Sā dýng sĂa chua đêu tþĄng đþĉc chĀng minh có khâ nëng gia tëng hçp thu isoflavone và các axit amin tă do, tëng hoät tính kháng oxy hòa, ngën ngÿa tình trä ng gan nhiễm mĈ, điều chînh să chuyển hóa cholesterol, giâm huyết áp bâo vệ sĀc khó e tim mäch, phòng chống ung thþ, câi thiện hþĄng vð và giá trð dinh dþĈng cho sân phè m (Drake cs., 2006). Vi khuèn lactic có yêu cæu cao về dinh dþĈng, thành phæn môi trþąng có chĀa các hĉ p chçt cacbohydrat đĄn giâ n, axit amin, peptit, dén xuçt cûa axit nucleic và vitamin là cæn thiế t cho să sinh trþćng, phát triển cû a chúng (Hati cs., 2018). SĂa bò có thành phæn gồm đþą ng lactose (5), protein (3,3) và pH 6,6-6,7 là một môi trþąng phát triển lċ tþćng cho hæu hế t các loäi vi sinh vêt, trong đò cò vi khuè n lactic (Hati cs., 2018). S Ăa đêu tþĄng mặc dù cüng khá giàu dinh dþĈng vĆi hàm lþĉng protein cao, chĀa nhiều vitamin (A, B12, D) và chçt khoáng nhþng thành phæn có să khác biệt so vĆi sĂa bò đặc biệt về thành phæn và hàm lþĉng carbohydrat, do đò să trao đổi chçt cûa vi khuè n lactic trong sĂa đêu tþĄng và sĂa bñ cüng khác nhau (Horáčková č cs., 2015; Hati cs., 2018). Mýc tiêu cûa nghiên cĀu này nhì m phân lêp và tuyển chọn chûng vi khuèn lactic có khâ nëng lên men đặc hiệu, giâm mùi ngái cûa đêu tþĄng, sinh tổng hĉp các chçt có tác dýng câ i thiện cçu trúc và hþĄng vð cûa sân phèm và an toàn cho ngþąi sā dýng. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Đêu tþĄng đþĉc trồng täi Hà Nội, làm nguyên liệu cho nguồn méu phân lêp và chế biế n sĂa đêu tþĄng cho lên men lactic. Nguồn mé u cho phân lêp đþĉc lên men tă nhiên gồm mẻ (1 méu), nþĆc chua thu nhên tÿ quá trình làm đêu phý (3 méu), đêu phý lên men (2 méu), sĂa đêu tþĄng thû công lên men (2 méu), bã đêu lên men (2 méu), sĂa đêu tþĄng Fami lên men (2 méu), đêu tþĄng luộc lên men (2 méu), tþĄng bæ n (1 méu), dþa muối (1 méu), nem chua (1 méu). Hóa chçt chuèn bð môi trþąng MRS cho nuôi cçy vi khuèn lactic và phân tích các chî tiêu gồm kit tách chiết DNA G-spin™ cung cç p bći iNtRON Bio (Hàn Quố c); kit API 50 CHL cung cçp bć i BioMérieux (Pháp); kháng sinh và các cặp mồi đặc hiệu; peptone, cao thðt cung cç p bći Himedia (Ấn Độ). NhĂng hóa chç t thông dýng khác đþĉc cung cçp bć i Samchun (Hàn Quốc) đät độ tinh khiết phân tích. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic Vi khuèn lactic đþĉc phân lêp theo phþĄng pháp mô tâ bći (Đàm Sao Mai cs., 2011). 2.2.2. Xác định đặc điể m hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa cû a vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp mô tâ bći Jame (2002). 2.2.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic cho lên men sữa chua đậu tương Chûng vi khuèn lactic đã phån lêp đþĉc thā nghiệm làm giống khći động cho lên men sĂa chua đêu tþĄng. TrþĆc tiên, các chûng vi khuèn đþĉc hoät hòa trên môi trþąng MRS lóng, nuôi ć nhiệt độ 30C trong 24h, tČ lệ tiếp giống 10. Sau đò, dðch giống đþĉc ly tâm thu sinh khối rồ i bổ sung vào sĂa đêu tþĄng. Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh 1319 SĂa đêu tþĄng cò pH 6,5, hàm lþĉng axit 0,82 gl đþĉc bổ sung sucrose để đät hàm lþĉ ng chçt khô hòa tan tổng số là 16Bx và thanh trùng ć 95C trong 10 phút. Sau khi xā lý nhiệt, sĂa đêu tþĄng đþĉc làm nguội đến 40-43C rồi tiế p giống vi khuèn. Quá trình lên men đþĉc thă c hiện ć 37C trong 8h. Sau khi lên men kế t thúc, sĂa chua đêu tþĄng đþĉc bâo quân ć 4 C trong 12h để ổn đðnh träng thái trþĆ c khi phân tích. SĂa chua đêu tþĄng đþĉc đánh giá chçt lþĉ ng gồm các chî tiêu pH, hàm lþĉng axit tổng số , nhên xét câm quan (träng thái đông tý và mùi vð cûa sân phèm) để tuyển chọn nhĂng chû ng vi khuèn có khâ nëng lên men sĂa chua đêu tþĄng. NhĂng chûng vi khuèn lactic đã tuyển chọn đþĉc đðnh danh bìng kč thuêt khối phổ MALDI-TOF MS (Vü QuĊnh HþĄng, 2022). Mộ t chûng vi khuèn tiềm nëng nhçt đþĉc lăa chọ n dăa trên kết quâ đðnh danh bìng giâi trình tă gen, khâ nëng sinh trþćng, phát triển và chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng. Méu sĂa chua đêu tþĄng lên men tÿ chûng vi khuèn tiềm nëng này sẽ đþĉc đánh giá chçt lþĉng såu hĄn, vĆi các chî tiêu gồm nồng độ chçt khô hòa tan tổng số (TSS), pH, axit tổng số, khâ nëng giĂ nþĆc, hàm lþĉng exopolysaccharide (EPS) và đánh giá câ m quan bìng phép thā thð hiếu. 2.2.4. Phân tích chất lượng sữa chua đậu tương Hàm lþĉng chçt khô hòa tan tổng số đþĉc xác đðnh theo TCVN 7771:2007 (ISO 2173:2003). Hàm lþĉng axit hĂu cĄ tổng số đþĉc xác đðnh theo TCVN 5483-1991 (ISO 750-1981). Hàm lþĉng EPS trong s Ăa chua đêu tþĄng đþĉc phån tích theo phþĄng pháp mô tâ bć i Enikeev (2012) và Nielsen (2010). Khâ nëng giĂ nþĆc cûa s Ăa chua đêu tþĄng đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp mô tâ bć i Korkmaz cs. (2021). Chçt lþĉng câm quan cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc đánh giá theo phþĄng pháp cho điể m thð hiếu trên thang điểm tÿ 1-9 (Hà Duyên Tþ, 2006). 2.2.5. Đánh giá tính đặ c tính an toàn sinh học của chủng vi khuẩn lactic Đánh giá đặc điểm tan máu: Khâ nëng làm tan máu cûa vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp cûa Gómez cs. (2016). Môi trþąng dùng để đánh giá khâ nëng làm tan máu cûa vi khuèn lactic là Blood Agar Base bổ sung thêm 5 máu cÿu. Bảng 1. Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại Mồi Trình tự (5’3’) 27F 5'''' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'''' 1492R 5'''' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'''' Bảng 2. Đặc tính của sữa chua đậu tương lên men bởi các chủng vi khuẩn lactic tiềm năng Ký hiệu chủng TSS (Bx) Axit tổng số () pH Trạng thái đông tụ Mùi vị K1 12,53 ± 0,06 0,62 ± 0,02 4,45 ± 0,01 ++++ +++ K3 12,73 ± 0,06 0,50 ± 0,01 4,84 ± 0,01 ++++ ++ NCDN2.1 12,60 ± 0,10 0,52 ± 0,01 4,78 ± 0,00 +++ ++ NCDN2.3 12,70 ± 0,10 0,61 ± 0,01 4,65 ± 0,01 +++ +++ SD2.1 12,63 ± 0,12 0,44 ± 0,00 4,91 ± 0,01 +++ +++ SD2.2 13,17 ± 0,06 0,48 ± 0,00 4,87 ± 0,05 +++ +++ FAM2.2 13,30 ± 0,10 0,60 ± 0,00 4,52 ± 0,00 +++ +++ FAM2.3 12,43 ± 0,12 0,44 ± 0,01 4,92 ± 0,01 +++ +++ TBHY3 12,57 ± 0,12 0,48 ± 0,02 4,88 ± 0,01 +++ +++ MEDN2.4 12,80 ± 0,10 0,43 ± 0,01 4,99 ± 0,01 +++ ++ Ghi chú: (++++): Rất tốt; (+++): Tốt, (++): Trung bình, (+): Kém. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương 1320 Đánh giá phát hiện gen kháng kháng sinh : Phát hiện gen kháng kháng sinh cûa chû ng vi khuèn lactic đþĉc thăc hiện theo phþĄng pháp cûa Guo cs. (2017). 2.2.6. Xác định đặc tính sinh trưở ng, phát triển của chủng vi khuẩn lactic Đánh giá khâ năng sử dụng các nguồ n carbohydrate: Khâ nëng sā dýng các nguồ n carbohydrate cûa vi khuèn lactic đþĉc đánh giá bìng cách sā dýng bộ kit API 50 CHL (BioMérieux, Pháp), chĀa 49 loä i carbohydrate khác nhau. Đánh giá khâ năng phát triển của vi khuẩ n khi nuôi cấy ở nhiệt độ và pH khác nhau: Chû ng vi khuèn lactic đþĉc cçy ria trên đïa thäch MRS, sau đò nuôi ć dâi nhiệt độ tÿ 15-42C và pH tÿ 4,0-9,5. Sau 48h nuôi cçy quan sát khâ nëng sinh trþćng phát triển cûa vi khuèn. 2.2.7. Định danh bằng giải trình tự gen Phån đoän rADN cûa vi sinh vê t sau khi tách chiết đþĉc khuyếch đäi bìng phân Ā ng PCR vĆi các cặp mồi đặc hiệu sā dý ng trong phân loäi (Bâng 1). Sân phèm PCR sau khi khuyếch đäi đþĉc phân tích trình tă tä i hãng 1st BASE (Malaysia). Các chuỗi DNA đþĉ c so sánh vĆi cĄ sć dĂ liệu cû a GenBank thông qua giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiế m BLAST nucleotide-nucleotide. Các chuỗi liên quan đþĉ c chuyển tâi về sau đò xā lý bìng phæn mề m BioEdit (Hall, 1999). 2.2.8. Xử lý số liệu Số liệu về chî tiêu chçt lþĉng đþĉc biểu diễ n bìng giá trð trung bình cûa ba læn phân tích lặ p läi và độ lệch chuèn. Điểm thð hiếu cho mỗi chî tiêu câm quan cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc thể hiện bći giá trð trung bình và sai số chuèn cûa 90 ngþąi thā. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩ n lactic từ nguồn mẫu lên men tự nhiên Tÿ 17 nguồn méu, chúng tôi thu nhên đþĉ c 51 chûng vi khuèn lactic. NhĂng chûng này có các đặc điểm điển hình nhþ khuèn läc tròn, lồ i, có màu tríng trong, tríng đýc, hoặc tríng sĂ a täo vòng phân giâi khi nuôi cçy trên môi trþąng đïa thäch MRS có bổ sung CaCO3 . Quan sát hình thái tế bào cûa các chûng vi khuè n này cho thçy có 14 chûng thuộc nhóm trăc khuèn, tế bào xếp đĄn, xếp đôi và xếp chuỗi; 37 chûng vi khuèn thuộc nhóm cæu khuèn, tế bào xếp đĄn, xếp đôi và kết đám. Kết quâ phân tích một số đặc điểm sinh lċ, sinh hòa cüng cho thç y 51 chûng vi khuèn này đều mang nhĂng đặc điể m cûa vi khuèn lactic theo mô tâ cûa Vinderola cs. (2019) đò là vi khuèn Gram dþĄng, không cò khâ nëng di động và không sinh catalase. Để tuyển chọn chûng vi khuèn tiềm nëng cho lên men sĂa chua đêu tþĄng, 51 chû ng vi khuèn lactic đã phån lêp đþĉc sā dý ng làm giống khći động cho lên men sĂa chua đêu tþĄng. Kết quâ cho thçy 51 chûng này đề u có khâ nëng lên men sĂa đêu tþĄng, chuyển hóa đþąng thành axit lactic, giâm pH đến điểm đîng điện cûa protein, giúp đông tý sĂa và täo vð chua, gi âm mùi ngái đặc trþng cûa đêu tþĄng. Tuy nhiên, đặc tính câm quan cûa các méu sĂ a chua có să khác biệt. Các chûng vi khuèn đþĉc đánh giá cao là nhĂng chûng täo hþĄng thĄm cho sĂa chua, có khâ nëng đông tý tốt, cç u trúc mðn và không bð tách nþĆc. Bâng 2 thể hiện kế t quâ đánh giá chçt lþĉng s Ăa chua đêu tþĄng đþĉc lên men bći 10 chûng vi khuèn lactic tiềm nëng nhçt. Kết quâ phân tích chçt lþĉng cûa 10 mé u sĂa chua đêu tþĄng cho thçy nồng độ chç t khô hòa tan tổng số cûa các méu s Ăa chua đêu tþĄng đều giâm xuống, tÿ 16Bx đến 12,5-13,3 Bx. Nguyên nhân TSS giâm trong quá trình lên men là do vi khuèn lactic bài tiế t các enzyme xúc tác cho các phân Āng hóa sinh trong chu trình đþąng phån để phân giâi đþą ng thành axit lactic và một số sân phèm phý. Các chûng vi khuèn khác nhau có khâ nëng sinh axit lactic không nhþ nhau. Kết quâ Bâ ng 2 cho thçy hàm lþĉng axit tổng số tính theo axit lactic trong các méu sĂa chua biến động tÿ 0,43-0,62. Méu sĂa chua lên men tÿ chû ng K1, NCDN2.3, FAM2.2 có giá trð axit cao nhç t (0,60-0,62) và khác biệt cò ċ nghïa thố ng kê so vĆi nhĂng méu sĂa chua còn läi. Kết quâ này phù hĉp vĆi nghiên cĀu cûa Chun cs. (2007) Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh 1321 khi lên men sĂa đêu tþĄng vĆi 4 chûng vi khuè n lactic Lactobacillus paraplantarum KM, Enterococcus durans KH, Streptococcus salivarius HM và Weissella confusa JY, hàm lþĉng axit tổng số cûa sân phèm đät 0,62. Cùng vĆi să tëng lên cûa axit tổng số , pH cûa sĂa chua cüng giâm xuống, tÿ 6,4 đế n 4,5-4,9. Đåy là khoâng pH rçt phù hĉp cho quá trình đông tý protein, täo cçu trúc đặc trþng cho sĂa chua. Kết quâ này tþĄng tă nhþ số liệ u công bố bći Li cs. (2014) khi lên men sĂa đêu tþĄng bìng một số chûng vi khuèn lactic, trong đò pH cûa sĂa chua đêu tþĄng trong nghiên cĀ u này là 4,6-5,1. Kết quâ nhên xét các đặc tính câm quan về träng thái đông tý và mùi vð cûa sĂa chua đêu tþĄng cho thçy trong số 51 chûng vi khuè n phân lêp đþĉc thì 10 chûng ć bâng 2 đþĉc đánh giá là có tiềm nëng cho lên men sĂa chua đêu tþĄng. Bâng 3 mô tâ đặc điểm và kết quâ đð nh danh cûa 10 chûng này. Kết quâ đðnh danh cho thç y 10 chûng vi khuèn thuộc 3 loài gồm Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và Streptococcus equinus. Cën cĀ kết quâ đðnh danh vi khuèn, khâ nëng sinh trþćng, tính ổn đðnh về sinh trþć ng, phát triển trong suốt quá trình phân lê p và tuyển chọn cüng nhþ chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng, chûng vi khuèn K1 thuộc loài Lactococcus lactis đþĉc lăa chọn để thăc hiệ n các nghiên cĀu tiếp theo. 3.2. Đánh giá đặc tính an toàn sinh học củ a chủng Lactococcus lactis K1 Đánh giá khâ năng làm tan máu: Să víng mặt cûa khâ nëng làm tan máu đþĉc coi là điều kiện an toàn tiên quyết cho việc lăa chọn chûng vi khuèn probiotic bći đåy là một yếu tố độc lăc đþĉc biết đến ć các vi sinh vêt gây bệnh. Kết quâ nuôi cçy chûng vi khuèn Lactococcus lactis K1 trên m...
Trang 1PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA ĐẬU TƯƠNG
Trần Thị Định1*, Thân Thị Hương1, Nguyễn Thị Hoàng Lan1, Lê Minh Nguyệt1, Đặng Thu Hương2
, Nguyễn Thị Minh3
1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2
Bộ môn Công nghệ sinh học vi sinh, Viện Công nghiệp thực phẩm 3
Khoa Tài Nguyên - Môi Trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
* Tác giả liên hệ: ttdinh@vnua.edu.vn
TÓM TẮT
Nghiên cứu được tiến hành nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic ứng dụng cho lên men sữa chua đậu tương Từ 17 nguồn mẫu lên men tự nhiên, 51 chủng vi khuẩn lactic được phân lập, tất cả các chủng đều có khả năng lên men sữa đậu tương Từ kết quả phân tích chất lượng sữa chua, 10 chủng vi khuẩn tiềm năng nhất được sàng lọc Kết quả định danh bằng phương pháp MALDI-TOF/MS cho thấy 10 chủng vi khuẩn này thuộc 3 loài
Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và Streptococcus equinus, trong đó, chủng vi khuẩn Lactococcus lactis K1
là chủng được đánh giá tốt nhất cho lên men sữa chua đậu tương vì sở hữu những đặc điểm nổi trội như khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, đảm bảo an toàn sinh học và lên men sữa chua có chất lượng tốt, đặc biệt chủng vi khuẩn có khả năng sinh hàm lượng exopolyscharide rất cao (1.381,7 mg/kg) Sữa chua đậu tương bước đầu nhận được sự ưa thích của người tiêu dùng
Từ khóa: Vi khuẩn lactic, đặc tính sinh hóa, sữa chua đậu tương
Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria for use in Soy Yogurt Production
ABSTRACT
This study was conducted to isolate and select potential lactic acid bacteria for soy yogurt production From 17 natural fermentation samples, 51 lactic acid strains capable of fermenting soy milk into soy yogurt were isolated Based on the quality analysis of soy yogurt, 10 strains were selected Using MALDI-TOF/MS technique, these 10
strains were classified into 3 species: Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, and Streptococcus equinus Among them, Lactococcus lactis K1 was evaluated as the best strain for soymilk fermentation due to its outstanding
characteristics such as high growth rate, biological safety, and production of high-quality yogurt, especially with the ability to produce a high amount of exopolysaccharide (1,381.7 mg/kg) The soy yogurt initially received positive responses from consumers
Keywords: Lactic acid bacteria, biochemical characterization, soy yogurt
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Đêu tþĄng (Glycine max L Merrill) là cây
công nghiệp ngín ngày và có vð trí quan trọng
trong nền nông nghiệp Việt Nam và nhiều nþĆc
trên thế giĆi (Træn Vën Điền, 2007) Đêu tþĄng
rçt giàu dinh dþĈng và đþĉc coi là nguồn cung
cçp protein hoàn chînh và chĀa một lþĉng đáng
kể các axit amin không thay thế, cæn thiết cho
cĄ thể nhþ isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin (Lokuruka, 2010) Bên cänh đò, đêu tþĄng cüng chĀa nhiều axit béo không no, isoflavone và không chĀa cholesterol và lactose Vì vêy, các sân phèm tÿ đêu tþĄng rçt phù hĉp để thay thế các sân phèm tÿ sĂa động vêt dành cho ngþąi không dung näp lactose hay bð dð Āng vĆi protein trong sĂa (Lin & cs., 2004)
Trang 2Mặc dù đêu tþĄng là lội thăc phèm bổ
dþĈng, tốt cho sĀc khĩe nhþng să tiêu thý các
sân phèm tÿ đêu tþĄng cđn hän chế vì sân
phèm cị mùi ngái đặc trþng do enzyme
lipoxygenase xúc tác cho phân Āng oxy hĩa chçt
béo täo thành các hĉp chçt bay hĄi gåy mùi khị
chðu nhþ hexanal, pentanal, đồng thąi chĀa một
số chçt kháng dinh dþĈng, khị tiêu hịa điển
hình là axit phytic, raffinose và stachyose (Li &
cs., 2014) Để khíc phýc nhĂng hän chế này, lên
men sĂa đêu tþĄng bìng vi khuèn lactic là giâi
pháp cơng nghệ phù hĉp vì quá trình lên men
giúp câi thiện đặc tính hĩa lý, câm quan và
mang läi lĉi ích sĀc khĩe cho ngþąi sā dýng
(Manorama & cs., 2012) Nhiều nghiên cĀu đã
cơng bố các chûng vi khuèn lactic cĩ khâ nëng
sinh tổng hĉp -galactosidase, kích hột
enzyme phytase cĩ tác dýng xúc tác thûy phân
nhĂng hĉp chçt carbohydrate gây mùi ngái, làm
giâm giá trð và khâ nëng hçp thu dinh dþĈng
(Donkor & Shah, 2006) Sā dýng sĂa chua đêu
tþĄng đþĉc chĀng minh cĩ khâ nëng gia tëng
hçp thu isoflavone và các axit amin tă do, tëng
hột tính kháng oxy hịa, ngën ngÿa tình träng
gan nhiễm mĈ, điều chỵnh să chuyển hĩa
cholesterol, giâm huyết áp bâo vệ sĀc khĩe tim
mäch, phịng chống ung thþ, câi thiện hþĄng
vð và giá trð dinh dþĈng cho sân phèm (Drake &
cs., 2006)
Vi khuèn lactic cĩ yêu cỉu cao về dinh
dþĈng, thành phỉn mơi trþąng cĩ chĀa các hĉp
chçt cacbohydrat đĄn giân, axit amin, peptit,
dén xuçt cûa axit nucleic và vitamin là cỉn thiết
cho să sinh trþćng, phát triển cûa chúng (Hati
& cs., 2018) SĂa bị cĩ thành phỉn gồm đþąng
lactose (5%), protein (3,3%) và pH 6,6-6,7 là một
mơi trþąng phát triển lċ tþćng cho hỉu hết các
lội vi sinh vêt, trong đị cị vi khuèn lactic (Hati
& cs., 2018) SĂa đêu tþĄng mặc dù cüng khá
giàu dinh dþĈng vĆi hàm lþĉng protein cao,
chĀa nhiều vitamin (A, B12, D) và chçt khống
nhþng thành phỉn cĩ să khác biệt so vĆi sĂa bị
đặc biệt về thành phỉn và hàm lþĉng
carbohydrat, do đị să trao đổi chçt cûa vi khuèn
lactic trong sĂa đêu tþĄng và sĂa bđ cüng khác
nhau (Horáčková č& cs., 2015; Hati & cs., 2018)
Mýc tiêu cûa nghiên cĀu này nhìm phân
lêp và tuyển chọn chûng vi khuèn lactic cĩ khâ
nëng lên men đặc hiệu, giâm mùi ngái cûa đêu
tþĄng, sinh tổng hĉp các chçt cĩ tác dýng câi thiện cçu trúc và hþĄng vð cûa sân phèm và an tồn cho ngþąi sā dýng
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Đêu tþĄng đþĉc trồng täi Hà Nội, làm nguyên liệu cho nguồn méu phân lêp và chế biến sĂa đêu tþĄng cho lên men lactic Nguồn méu cho phân lêp đþĉc lên men tă nhiên gồm mẻ (1 méu), nþĆc chua thu nhên tÿ quá trình làm đêu phý (3 méu), đêu phý lên men (2 méu), sĂa đêu tþĄng thû cơng lên men (2 méu), bã đêu lên men (2 méu), sĂa đêu tþĄng Fami lên men (2 méu), đêu tþĄng luộc lên men (2 méu), tþĄng bỉn (1 méu), dþa muối (1 méu), nem chua (1 méu) Hĩa chçt chuèn bð mơi trþąng MRS cho nuơi cçy vi khuèn lactic và phân tích các chỵ tiêu gồm kit tách chiết DNA G-spin™ cung cçp bći iNtRON Bio (Hàn Quốc); kit API 50 CHL cung cçp bći BioMérieux (Pháp); kháng sinh và các cặp mồi đặc hiệu; peptone, cao thðt cung cçp bći Himedia (Ấn Độ) NhĂng hĩa chçt thơng dýng khác đþĉc cung cçp bći Samchun (Hàn Quốc) đät độ tinh khiết phân tích
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic
Vi khuèn lactic đþĉc phân lêp theo phþĄng pháp mơ tâ bći (Đàm Sao Mai & cs., 2011)
2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý
và sinh hĩa của vi khuẩn lactic
Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hĩa cûa
vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp
mơ tâ bći Jame (2002)
2.2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic cho lên men sữa chua đậu tương
Chûng vi khuèn lactic đã phån lêp đþĉc thā nghiệm làm giống khći động cho lên men sĂa chua đêu tþĄng TrþĆc tiên, các chûng vi khuèn đþĉc hột hịa trên mơi trþąng MRS lĩng, nuơi ć nhiệt độ 30C trong 24h, tČ lệ tiếp giống 10% Sau đị, dðch giống đþĉc ly tâm thu sinh khối rồi
bổ sung vào sĂa đêu tþĄng
Trang 3SĂa đêu tþĄng cò pH 6,5, hàm lþĉng axit
0,82 g/l đþĉc bổ sung sucrose để đät hàm lþĉng
chçt khô hòa tan tổng số là 16Bx và thanh trùng
ć 95C trong 10 phút Sau khi xā lý nhiệt, sĂa
đêu tþĄng đþĉc làm nguội đến 40-43C rồi tiếp
giống vi khuèn Quá trình lên men đþĉc thăc
hiện ć 37C trong 8h Sau khi lên men kết thúc,
sĂa chua đêu tþĄng đþĉc bâo quân ć 4C trong
12h để ổn đðnh träng thái trþĆc khi phân tích
SĂa chua đêu tþĄng đþĉc đánh giá chçt lþĉng
gồm các chî tiêu pH, hàm lþĉng axit tổng số,
nhên xét câm quan (träng thái đông tý và mùi vð
cûa sân phèm) để tuyển chọn nhĂng chûng vi
khuèn có khâ nëng lên men sĂa chua đêu tþĄng
NhĂng chûng vi khuèn lactic đã tuyển chọn
đþĉc đðnh danh bìng kč thuêt khối phổ
MALDI-TOF MS (Vü QuĊnh HþĄng, 2022) Một
chûng vi khuèn tiềm nëng nhçt đþĉc lăa chọn
dăa trên kết quâ đðnh danh bìng giâi trình tă
gen, khâ nëng sinh trþćng, phát triển và chçt
lþĉng sĂa chua đêu tþĄng Méu sĂa chua đêu
tþĄng lên men tÿ chûng vi khuèn tiềm nëng này
sẽ đþĉc đánh giá chçt lþĉng såu hĄn, vĆi các chî
tiêu gồm nồng độ chçt khô hòa tan tổng số
(TSS), pH, axit tổng số, khâ nëng giĂ nþĆc, hàm
lþĉng exopolysaccharide (EPS) và đánh giá câm
quan bìng phép thā thð hiếu
2.2.4 Phân tích chất lượng sữa chua đậu tương
Hàm lþĉng chçt khô hòa tan tổng số đþĉc xác đðnh theo TCVN 7771:2007 (ISO 2173:2003) Hàm lþĉng axit hĂu cĄ tổng số đþĉc xác đðnh theo TCVN 5483-1991 (ISO 750-1981) Hàm lþĉng EPS trong sĂa chua đêu tþĄng đþĉc phån tích theo phþĄng pháp mô tâ bći Enikeev (2012) và Nielsen (2010)
Khâ nëng giĂ nþĆc cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp mô tâ bći Korkmaz & cs (2021)
Chçt lþĉng câm quan cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc đánh giá theo phþĄng pháp cho điểm thð hiếu trên thang điểm tÿ 1-9 (Hà Duyên
Tþ, 2006)
2.2.5 Đánh giá tính đặc tính an toàn sinh học của chủng vi khuẩn lactic
Đánh giá đặc điểm tan máu: Khâ nëng làm
tan máu cûa vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp cûa Gómez & cs (2016) Môi trþąng dùng để đánh giá khâ nëng làm tan máu cûa vi khuèn lactic là Blood Agar Base bổ sung thêm 5% máu cÿu
Bảng 1 Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại
27F 5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3' 1492R 5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'
Bảng 2 Đặc tính của sữa chua đậu tương lên men bởi các chủng vi khuẩn lactic tiềm năng
Ký hiệu chủng TSS ( Bx) Axit tổng số (%) pH Trạng thái đông tụ Mùi vị
Ghi chú: (++++): Rất tốt; (+++): Tốt, (++): Trung bình, (+): Kém
Trang 4Đánh giá phát hiện gen kháng kháng sinh:
Phát hiện gen kháng kháng sinh cûa chûng vi
khuèn lactic đþĉc thăc hiện theo phþĄng pháp
cûa Guo & cs (2017)
2.2.6 Xác định đặc tính sinh trưởng, phát
triển của chủng vi khuẩn lactic
Đánh giá khâ năng sử dụng các nguồn
carbohydrate: Khâ nëng sā dýng các nguồn
carbohydrate cûa vi khuèn lactic đþĉc đánh giá
bìng cách sā dýng bộ kit API 50 CHL
(BioMérieux, Pháp), chĀa 49 lội carbohydrate
khác nhau
Đánh giá khâ năng phát triển của vi khuẩn
khi nuơi cấy ở nhiệt độ và pH khác nhau: Chûng
vi khuèn lactic đþĉc cçy ria trên đïa thäch MRS,
sau đị nuơi ć dâi nhiệt độ tÿ 15-42C và pH tÿ
4,0-9,5 Sau 48h nuơi cçy quan sát khâ nëng
sinh trþćng phát triển cûa vi khuèn
2.2.7 Định danh bằng giải trình tự gen
Phån độn rADN cûa vi sinh vêt sau khi
tách chiết đþĉc khuyếch đäi bìng phân Āng
PCR vĆi các cặp mồi đặc hiệu sā dýng trong
phân lội (Bâng 1) Sân phèm PCR sau khi
khuyếch đäi đþĉc phân tích trình tă täi hãng
1st BASE (Malaysia) Các chuỗi DNA đþĉc so
sánh vĆi cĄ sć dĂ liệu cûa GenBank thơng qua
giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiếm BLAST
nucleotide-nucleotide Các chuỗi liên quan đþĉc
chuyển tâi về sau đị xā lý bìng phỉn mềm
BioEdit (Hall, 1999)
2.2.8 Xử lý số liệu
Số liệu về chỵ tiêu chçt lþĉng đþĉc biểu diễn
bìng giá trð trung bình cûa ba lỉn phân tích lặp
läi và độ lệch chuèn Điểm thð hiếu cho mỗi chỵ
tiêu câm quan cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc thể
hiện bći giá trð trung bình và sai số chuèn cûa
90 ngþąi thā
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn
lactic từ nguồn mẫu lên men tự nhiên
Tÿ 17 nguồn méu, chúng tơi thu nhên đþĉc
51 chûng vi khuèn lactic NhĂng chûng này cĩ
các đặc điểm điển hình nhþ khuèn läc trịn, lồi,
cĩ màu tríng trong, tríng đýc, hoặc tríng sĂa täo vịng phân giâi khi nuơi cçy trên mơi trþąng đïa thäch MRS cĩ bổ sung CaCO3 Quan sát hình thái tế bào cûa các chûng vi khuèn này cho thçy cĩ 14 chûng thuộc nhĩm trăc khuèn, tế bào xếp đĄn, xếp đơi và xếp chuỗi; 37 chûng vi khuèn thuộc nhĩm cỉu khuèn, tế bào xếp đĄn, xếp đơi và kết đám Kết quâ phân tích một số đặc điểm sinh lċ, sinh hịa cüng cho thçy 51 chûng vi khuèn này đều mang nhĂng đặc điểm cûa vi khuèn lactic theo mơ tâ cûa Vinderola &
cs (2019) đị là vi khuèn Gram dþĄng, khơng cị khâ nëng di động và khơng sinh catalase
Để tuyển chọn chûng vi khuèn tiềm nëng cho lên men sĂa chua đêu tþĄng, 51 chûng vi khuèn lactic đã phån lêp đþĉc sā dýng làm giống khći động cho lên men sĂa chua đêu tþĄng Kết quâ cho thçy 51 chûng này đều cĩ khâ nëng lên men sĂa đêu tþĄng, chuyển hĩa đþąng thành axit lactic, giâm pH đến điểm đỵng điện cûa protein, giúp đơng tý sĂa và täo vð chua, giâm mùi ngái đặc trþng cûa đêu tþĄng Tuy nhiên, đặc tính câm quan cûa các méu sĂa chua cĩ să khác biệt Các chûng vi khuèn đþĉc đánh giá cao là nhĂng chûng täo hþĄng thĄm cho sĂa chua, cĩ khâ nëng đơng tý tốt, cçu trúc mðn và khơng bð tách nþĆc Bâng 2 thể hiện kết quâ đánh giá chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng đþĉc lên men bći 10 chûng vi khuèn lactic tiềm nëng nhçt
Kết quâ phân tích chçt lþĉng cûa 10 méu sĂa chua đêu tþĄng cho thçy nồng độ chçt khơ hịa tan tổng số cûa các méu sĂa chua đêu tþĄng đều giâm xuống, tÿ 16Bx đến 12,5-13,3Bx Nguyên nhân TSS giâm trong quá trình lên men là do vi khuèn lactic bài tiết các enzyme xúc tác cho các phân Āng hĩa sinh trong chu trình đþąng phån để phân giâi đþąng thành axit lactic và một số sân phèm phý
Các chûng vi khuèn khác nhau cĩ khâ nëng sinh axit lactic khơng nhþ nhau Kết quâ Bâng
2 cho thçy hàm lþĉng axit tổng số tính theo axit lactic trong các méu sĂa chua biến động tÿ 0,43-0,62% Méu sĂa chua lên men tÿ chûng K1, NCDN2.3, FAM2.2 cĩ giá trð axit cao nhçt (0,60-0,62%) và khác biệt cị ċ nghïa thống kê so vĆi nhĂng méu sĂa chua cịn läi Kết quâ này phù hĉp vĆi nghiên cĀu cûa Chun & cs (2007)
Trang 5khi lên men sĂa đêu tþĄng vĆi 4 chûng vi khuèn
lactic Lactobacillus paraplantarum KM,
Enterococcus durans KH, Streptococcus
salivarius HM và Weissella confusa JY, hàm
lþĉng axit tổng số cûa sân phèm đät 0,62%
Cùng vĆi să tëng lên cûa axit tổng số,
pH cûa sĂa chua cüng giâm xuống, tÿ 6,4 đến
4,5-4,9 Đåy là khoâng pH rçt phù hĉp cho quá
trình đông tý protein, täo cçu trúc đặc trþng cho
sĂa chua Kết quâ này tþĄng tă nhþ số liệu công
bố bći Li & cs (2014) khi lên men sĂa đêu tþĄng
bìng một số chûng vi khuèn lactic, trong đò
pH cûa sĂa chua đêu tþĄng trong nghiên cĀu
này là 4,6-5,1
Kết quâ nhên xét các đặc tính câm quan về
träng thái đông tý và mùi vð cûa sĂa chua đêu
tþĄng cho thçy trong số 51 chûng vi khuèn phân
lêp đþĉc thì 10 chûng ć bâng 2 đþĉc đánh giá là
có tiềm nëng cho lên men sĂa chua đêu tþĄng
Bâng 3 mô tâ đặc điểm và kết quâ đðnh danh
cûa 10 chûng này Kết quâ đðnh danh cho thçy
10 chûng vi khuèn thuộc 3 loài gồm
Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và
Streptococcus equinus
Cën cĀ kết quâ đðnh danh vi khuèn, khâ nëng sinh trþćng, tính ổn đðnh về sinh trþćng, phát triển trong suốt quá trình phân lêp và tuyển chọn cüng nhþ chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng, chûng vi khuèn K1 thuộc loài
Lactococcus lactis đþĉc lăa chọn để thăc hiện
các nghiên cĀu tiếp theo
3.2 Đánh giá đặc tính an toàn sinh học của
chủng Lactococcus lactis K1
Đánh giá khâ năng làm tan máu: Să víng
mặt cûa khâ nëng làm tan máu đþĉc coi là điều kiện an toàn tiên quyết cho việc lăa chọn chûng
vi khuèn probiotic bći đåy là một yếu tố độc lăc đþĉc biết đến ć các vi sinh vêt gây bệnh Kết
quâ nuôi cçy chûng vi khuèn Lactococcus lactis
K1 trên môi trþąng Blood Agar Base bổ sung 5% máu cÿu cho thçy có să xuçt hiện cûa khuèn läc trên đïa thäch, tuy nhiên màu môi trþąng không thay đổi, do đò phân Āng là âm tính (gamma hemolysis) Nhþ vêy, chúng tôi kết luên chûng
vi khuèn Lactococcus lactis K1 không có khâ
nëng làm tan máu và đû điều kiện an toàn để thăc hiện các thí nghiệm tiếp theo
Bảng 3 Đặc điểm của 10 chủng vi khuẩn lactic tiềm năng cho lên men sữa chua đậu tương
Ký hiệu
chủng phân lập Nguồn khuẩn lạc Hình thái Hình thái tế bào Khả năng di động Catalase Gram Định danh K1 Bã đậu lên men Tròn, lồi, trắng đục,
bóng
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Lactococcus lactis
K3 Bã đậu lên men Tròn, hơi lồi, trắng
trong, bóng
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Enterococcus faecium
NCDN2.1 Nước chua làm
đậu phụ
Tròn, lồi, trắng sữa, bóng
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Enterococcus faecium
NCDN2.3 Nước chua làm
đậu phụ
Tròn, lồi, trắng đục, bóng
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám - - + Streptococcus equinus SD2.1 Sữa đậu tương
thủ công lên
men
Tròn, lồi, trắng đục, bóng
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Enterococcus faecium
SD2.2 Sữa đậu tương
thủ công lên men
Tròn, lồi, trắng sữa, bóng
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Enterococcus faecium
FAM2.2 Sữa đậu tương
Fami lên men
Tròn, lồi, trắng đục, viền trong, bóng
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Lactococcus lactis
FAM2.3 Sữa đậu tương
Fami lên men
Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn, xếp
đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Enterococcus faecium
TBHY3 Tương bần Tròn, lồi, trắng
trong
Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám - - + Enterococcus faecium MEDN2.4 Mẻ Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn, xếp
đơn/xếp đôi/xếp đám
- - + Enterococcus faecium
Trang 6Bảng 4 Kết quả kiểm tra gen kháng kháng sinh của chủng Lactococcus lactis K1
Loại kháng sinh Gen kháng kháng sinh Sự cĩ mặt gen kháng kháng sinh Kích thước đoạn khuếch đại (bp)
Ghi chú: (-): Khơng phát hiện gen kháng kháng sinh; (+): Cĩ gen kháng kháng sinh
Kiểm tra gen kháng kháng sinh: Kiểu hình
kháng kháng sinh cûa vi sinh vêt cĩ thể đþĉc
quy đðnh bći kiểu gen Bên cänh đị, kiểu hình
nhäy câm vĆi kháng sinh vén cĩ thể mang gen
kháng kháng sinh ć träng thái khơng biểu hiện
(Anisimova & cs., 2019) Vi khuèn mang gen
kháng kháng sinh trong thăc phèm cĩ thể trć
thành mối nguy đối vĆi con ngþąi khi chúng trć
thành vêt trung gian truyền nhĂng gen kháng
kháng sinh này cho các vi sinh vêt gây bệnh
thơng qua chuỗi thăc phèm TrþĆc đåy
các chûng vi khuèn lactic thuộc chi Lactococcus
thþąng đþĉc coi là an tồn và cĩ thể sā dýng
trong thăc phèm (GRAS) Tuy nhiên, một số
chûng vi khuèn thuộc lồi Lactococcus lactis đã
đþĉc phát hiện cĩ mang gen kháng kháng sinh
tetracycline và erythromycin (Ahsraf, 2011) Do
đị, trong nghiên cĀu này, 21 gen quy đðnh să đề
kháng vĆi 9 lội kháng sinh (gentamicin,
streptomycin, kanamycin, tetracycline,
erythromycin, clindamycin, chloramphenicol,
ampicillin, vancomycin đþĉc kiểm tra trên
chûng vi khuèn lactic Lactococcus lactis K1 Kết
quâ đþĉc trình bày ć bâng 4
Kết quâ ć bâng 4 cho thçy chûng vi khuèn
Lactococcus lactis K1 khơng mang các gen
kháng kháng sinh trong phäm vi nghiên cĀu
Tÿ kết quâ kiểm tra khâ nëng làm tan máu và gen kháng kháng sinh cûa chûng vi khuèn
Lactococcus lactis K1, chúng tơi kết luên chûng
vi khuèn này an tồn và cĩ thể sā dýng đþĉc trong thăc phèm Hình 1 thể hiện hình thái
khuèn läc và tế bào cûa chûng Lactococcus lactis K1
3.3 Xác định đặc tính sinh trưởng, phát
Lactococcus lactis K1
Khâ năng sử dụng các nguồn carbohydrate: Kết quâ xác đðnh phổ lên men các lội đþąng cûa chûng vi khuèn Lactococcus lactis K1 cho thçy sau 24 gią chûng vi khuèn
cĩ khâ nëng sā dýng 13 lội đþąng, sau 48 gią
Trang 7chûng vi khuèn cĩ khâ nëng sā dýng 17 lội
đþąng làm cĄ chçt cho quá trình lên men (Bâng
5) Nhþ vêy, phổ sā dýng carborhydrate cûa
chûng vi khuèn Lactococcus lactis K1 khá
rộng, trong đị phâi kể đến sucrose, glucose, fructose là nhĂng lội đþąng quan trọng phýc
vý cho nghiên cĀu Āng dýng chûng vi khuèn cho lên men sĂa chua đêu tþĄng
Hình 1 (A) Hình thái khuẩn lạc; (B) Hình thái tế bào của Lactococcus lactis K1 Bảng 5 Khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate của chủng vi khuẩn Lactococcus lactis K1
Nguồn carbohydrate Thời gian Nguồn carbohydrate Thời gian
Ghi chú: (+): Lên men tốt; (+/-): Lên men khá; (-/+): Lên men yếu; (-): Khơng sử dụng
Trang 8Phổ pH và nhiệt độ sinh trưởng phát triển:
Kết quâ kiểm tra khâ nëng phát triển cûa
Lactococcus lactis K1 trong mơi trþąng cĩ pH
ban đỉu khác nhau cho thçy ć pH 4,0 và pH 5,0
chûng vi khuèn cĩ khâ nëng phát triển nhþng
tþĄng đối yếu, trong khi đị phát triển mänh ć
pH 6,0; 7,0; 8,5; và 9,5 Về ânh hþćng cûa nhiệt
độ, Lactococcus lactis K1 khơng sinh trþćng ć
15C nhþng phát triển tốt ć 25C, 30C, 37C và
42C (Bâng 6) Điều này chĀng tĩ chûng vi
khuèn thuộc nhịm þa çm và nhiệt độ lên men
tối thích cûa nị tþĄng tă nhþ các chûng vi
khuèn lactic thþĄng mäi cho lên men sĂa chua
động vêt
3.4 Đánh giá chất lượng sữa chua đậu
tương lên men bởi chủng Lactococcus
lactis K1
Để khỵng đðnh tiềm nëng Āng dýng cûa
chûng vi khuèn Lactococcus lactis K1 làm giống
khći động cho sân xuçt sĂa chua đêu tþĄng,
chûng vi khuèn đþĉc hột hĩa và cçy vào sĂa
đêu tþĄng vĆi tỵ lệ tiếp giống 10%, sau đị lên men ć nhiệt độ 38C trong 8h Kết quâ phân tích chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng đþĉc trình bày trong bâng 7
SĂa chua đêu tþĄng lên men bći chûng
Lactococcus lactis K1 cĩ TSS là 12,87Bx và hàm lþĉng axit tổng số là 0,61% Nhþ vêy trong quá trình lên men chûng vi khuèn này đã sā dýng cĄ chçt trong sĂa để täo axit lactic và một
số hĉp chçt thĀ cçp, täo hþĄng thĄm và vð hài hịa cho sân phèm Giá trð pH cûa méu sĂa chua đêu tþĄng là 4,46; tþĄng đồng vĆi các nghiên cĀu khác về sĂa chua đêu tþĄng vĆi giá trð pH trong không 4,1-4,7 (Chun & cs., 2007) Theo báo cáo cûa Chun & cs (2007) să đơng tý xây ra
và cçu trúc cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc hình thành khi đät đến pH phù hĉp Các méu sĂa chua động vêt thþĄng mäi trên thð trþąng cĩ giá trð pH trong không 4,2-4,4 Nhþ vêy chûng
Lactococcus lactis K1 cĩ khâ nëng lên men tốt
sĂa đêu tþĄng
Bảng 6 Kết quả kiểm tra phổ pH
và nhiệt độ sinh trưởng, phát triển của chủng Lactococcus lactis K1
Ghi chú: (+): Khâ năng sinh trưởng tốt; (+/-): Khâ năng sinh trưởng khá; (-/+): Khâ năng sinh trưởng yếu; (-): Khơng phát triển được
Bảng 7 Kết quả đánh giá chất lượng sữa chua đậu tương
lên men bởi chủng Lactococcus lactis K1
Bảng 8 Kết quả đánh giá cảm quan sữa chua đậu tương
lên men từ chủng Lactococcus lactis K1
Cấu trúc Mùi hương Vị Cảm giác trong miệng Chất lượng tổng thể
Trang 9Khâ nëng giĂ nþĆc cûa sĂa chua lên men tÿ
Lactococcus lactis K1 là 40,24%, tþĄng đþĄng
vĆi kết quâ cơng bố bći Nguyễn ĐĀc Doan & Đỗ
Thð Hà (2020) trong đị khâ nëng giĂ nþĆc cûa
méu sĂa chua cûa nhĩm này là 40,0-42,0% Tuy
nhiên trong nghiên cĀu này tác giâ sā dýng
nguyên liệu đêu tþĄng nây mỉm và sĂa đêu
tþĄng đþĉc bổ sung nguyên liệu phý là sĂa bột
gỉy (3%) và bột whey (2%), lên men bìng chûng
vi khuèn Lactobacillus bulgaricus và
Streptococcus thermophilus là sân phèm thþĄng
mäi cûa cơng ty CHR Hansen (Đan Mäch) Một
nghiên cĀu khác cûa Park (2015) cüng ghi nhên
khâ nëng giĂ nþĆc cûa sĂa chua đêu tþĄng là
41,3-45,5% Nghiên cĀu cüng kết luên rìng khâ
nëng giĂ nþĆc càng cao, độ nhĆt cûa sân phèm
sĂa chua đêu tþĄng càng lĆn
SĂa chua lên men bći chûng Lactococcus
lactis K1 cị hàm lþĉng EPS là 1.381,7 mg/kg So
sánh vĆi kết quâ nghiên cĀu cûa Li & cs (2014)
trong đị sĂa chua đêu tþĄng lên men bći các
chûng vi khuèn lactic DVS YC-X11 là
287,08 mg/l; L rhamnosus 6005 là 635,75 mg/l;
L plantarum 70810 là 832,15 mg/l, thì
Lactococcus lactis K1 bài tiết EPS cao hĄn EPS
là một polysacharide mäch dài, cĩ tác dýng câi
thiện cçu trúc cûa sĂa chua, tëng độ kết dính,
täo nên să ổn đðnh cûa hệ nhü tþĄng, do đị hän
chế hiện tþĉng tách nþĆc Ngồi ra, EPS đþĉc
cơng nhên là an tồn cho sĀc khĩe và cĩ các hột
tính sinh học giúp ngën ngÿa, điều trð các bệnh
nhþ tiêu chây và nhiễm trùng, chống ung thþ,
điều hịa miễn dðch, chống oxy hĩa (Li, 2014)
SĂa chua đêu tþĄng lên men bći
Lactococcus lactis K1 cđn đþĉc đánh giá câm
quan bìng phép thā thð hiếu Kết quâ cho thçy
đặc tính về mùi vð và chçt lþĉng tổng thể cûa
sĂa chua đêu tþĄng đþĉc hội đồng câm quan
đánh giá ć mĀc thích, trong khi đị điểm cçu
trúc đþĉc đánh giá ć mĀc tþĄng đối thích (Bâng
8) Nhþ vêy, sĂa chua đêu tþĄng lên men bći
Lactococcus lactis K1 bþĆc đỉu đã đþĉc ngþąi
tiêu dùng chçp nhên và cĩ tiềm nëng Āng dýng
trong sân xuçt Tuy nhiên, các giâi pháp cơng
nghệ nhþ sā dýng nguyên liệu phý gồm rau,
trái cây, bột sĂa gỉy, kem béo và phý gia câi
thiện cçu trúc bổ sung vào sĂa chua đêu tþĄng
cỉn tiếp týc đþĉc nghiên cĀu để câi thiện giá trð
dinh dþĈng và nâng cao chçt lþĉng câm quan cho sân phèm
4 KẾT LUẬN Trong nghiên cĀu này chúng tơi đã phån lêp đþĉc 51 chûng vi khuèn lactic tÿ 17 nguồn méu lên men tă nhiên Sau quá trình tuyển chọn, 10 chûng vi khuèn lactic đã đþĉc đánh giá
là cĩ tiềm nëng lên men sĂa chua đêu tþĄng
Trong số đị chûng vi khuèn lactic Lactococcus lactis K1 đþĉc lăa chọn vì chçt lþĉng sĂa chua
đåu tþĄng đþĉc täo thành bći chûng là tốt nhçt
Lactococcus lactis K1 đâm bâo tính an tồn sinh
học nhþ khơng gåy tan máu và khơng mang gen kháng kháng sinh, Āng dýng đþĉc trong lên men thăc phèm, cĩ khâ nëng sā dýng 17 nguồn carbohydrate khác nhau, sinh trþćng tốt trong không nhiệt độ 25-42C, thích hĉp vĆi mơi trþąng nuơi cçy cĩ pH trung tính và kiềm HĄn nĂa, sĂa chua đêu tþĄng lên men tÿ
Lactococcus lactis K1 cĩ chçt lþĉng tốt, các chỵ
tiêu hĩa lý phù hĉp vĆi sân phèm sĂa chua đêu tþĄng, bþĆc đỉu nhên đþĉc să þa thích cûa
ngþąi tiêu dùng
TÀI LIỆU THAM KHẢO Anisimova E.A & Yarullina D.R (2019) Antibiotic
resistance of Lactobacillus strains Current
microbiology 76: 1407-1416
Ashraf R & Shah N.P (2011) Antibiotic resistance of probiotic organisms and safety of probiotic dairy products International Food Research Journal 18(3)
Chun J., Kim G.M., Lee K.W., Choi I.D., Kwon G.H., Park J.Y & Kim J.H (2007) Conversion of isoflavone glucosides to aglycones in soymilk by fermentation with lactic acid bacteria Journal of Food Science 72(2): M39-M44
Donkor O.N & Shah N.P (2008) Production of
‐Glucosidase and Hydrolysis of Isoflavone Phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, and Lactobacillus casei
in Soymilk Journal of Food Science 73(1): M15-M20
Drake M.A., Chen X.Q., Tamarapu S & Leenanon B (2000) Soy protein fortification affects sensory, chemical, and microbiological properties of dairy yogurts Journal of Food Science 65(7): 1244-1247 Đàm Sao Mai, Trịnh Ngọc Nam, Bùi Hồng Quân, Lê Hồng Thía & Đào Hồng Hà (2011) Thực tập Vi
Trang 10sinh vật học Nhà xuất bản Đại học Công nghiệp
TP Hồ Chí Minh
Enikeev R (2012) Development of a new method for
determination of exopolysaccharide quantity in
fermented milk products and its application in
technology of kefir production Food Chemistry
134(4): 2437-2441
Gómez N.C., Ramiro J.M., Quecan B.X & de Melo
Franco B.D (2016) Use of potential probiotic lactic
acid bacteria (LAB) biofilms for the control of
Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium,
and Escherichia coli O157: H7 biofilms formation
Frontiers in Microbiology 863
Guo H., Pan L., Li L., Lu J., Kwok L., Menghe B &
Zhang W (2017) Characterization of antibiotic
resistance genes from Lactobacillus isolated from
traditional dairy products Journal of food science
82(3): 724-730
Hà Duyên Tư (2006) Kỹ thuật phân tích cảm quan
thực phẩm Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật
Hati S., Patel N & Mandal S (2018) Comparative
growth behaviour and biofunctionality of lactic
acid bacteria during fermentation of soy milk and
bovine milk Probiotics and antimicrobial proteins
10: 277-283
Horáčková Š., Muehlhansova A., Slukova M.,
Schulzová V & Plockova M (2015) Fermentation
of soymilk by yoghurt and bifidobacteria strains
Czech Journal of Food Sciences 33(4): 313-319
James C & Natalie S (2014) Microbiology A
laboratory manual Pearson Education
Korkmaz I.O., Bilici C & Korkmaz S (2021) Sensory,
pH, synaeresis, water-holding capacity, and
microbiological changes in homemade yogurt
prepared with maca (Lepidium meyenii) powder
and propolis extract International Journal of
Gastronomy and Food Science 23: 100291
Li C., Li W., Chen X., Feng M., Rui X., Jiang M &
Dong M (2014) Microbiological,
physicochemical and rheological properties of fermented soymilk produced with exopolysaccharide (EPS) producing lactic acid bacteria strains LWT-Food Science and Technology 57(2): 477-485
Lin F.M., Chiu C.H & Pan T.M (2004) Fermentation
of a milk - soymilk and Lycium chinense Miller mixture using a new isolate of Lactobacillus paracasei subsp paracasei NTU101 and
Bifidobacterium longum Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology 31(12): 559-564 Lokuruka M.N.I (2010) Soybean nutritional properties: The good and the bad about soy foods consumption - A review African Journal of Food, Agriculture, Nutrition and Development 10(4) Nielsen S.S (2010) Phenol-sulfuric acid method for total carbohydrates Food analysis laboratory manual pp 47-53
Nguyễn Đức Doan & Đỗ Thị Hà (2020) Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý nhiệt kết hợp với lên men đến hàm lượng axit gamma-aminobutyric, axit phytic và tính chất lý-hóa của sữa chua đậu nành nẩy mầm Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 18(5): 367-377
Park M.J & Lee S.Y (2015) Quality characteristics of soy yogurt produced using proteases and mixed microbial consortia Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry 58: 761-769 Trần Văn Điền (2007) Cây đậu tương Nhà xuất bảnNông nghiệp Hà Nội tr 3-4
Vinderola G., Ouwehand A, Salminen S Wright A.V (2019) Lactic acid bacteria Microbiological and Functional Aspect 5th edition CRC Press 764p
Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến & Nguyễn Thị Thanh Thủy (2022) Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic
để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 20(12): 1581-1590