Kinh Doanh - Tiếp Thị - Nông - Lâm - Ngư - Kiến trúc - Xây dựng Vietnam J. Agri. Sci. 2023, Vol. 21, No. 10: 1317-1326 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2023, 21(10): 1317-1326 www.vnua.edu.vn 1317 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA ĐẬU TƯƠNG Trần Thị Định1, Thân Thị Hương1 , Nguyễn Thị Hoàng Lan1, Lê Minh Nguyệt1, Đặng Thu Hương2, Nguyễn Thị Minh3 1Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2Bộ môn Công nghệ sinh học vi sinh, Viện Công nghiệp thực phẩm 3Khoa Tài Nguyên - Môi Trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tác giả liên hệ: ttdinhvnua.edu.vn Ngày nhận bài: 10.05.2023 Ngày chấp nhận đăng: 05.10.2023 TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic ứng dụng cho lên men sữa chua đậu tương. Từ 17 nguồn mẫu lên men tự nhiên, 51 chủng vi khuẩn lactic được phân lập, tất cả các chủng đều có khả năng lên men sữa đậu tương. Từ kết quả phân tích chất lượng sữa chua, 10 chủng vi khuẩn tiềm năng nhất đượ c sàng lọc. Kết quả định danh bằng phương pháp MALDI-TOFMS cho thấy 10 chủng vi khuẩn này thuộc 3 loài Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và Streptococcus equinus, trong đó, chủng vi khuẩn Lactococcus lactis K1 là chủng được đánh giá tốt nhất cho lên men sữa chua đậu tương vì sở hữu những đặc điểm nổi trội như khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, đảm bảo an toàn sinh học và lên men sữa chua có chất lượng tốt, đặc biệt chủ ng vi khuẩn có khả năng sinh hàm lượng exopolyscharide rất cao (1.381,7 mgkg). Sữa chua đậu tương bước đầu nhận được sự ưa thích của người tiêu dùng. Từ khóa: Vi khuẩn lactic, đặc tính sinh hóa, sữa chua đậu tương. Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria for use in Soy Yogurt Production ABSTRACT This study was conducted to isolate and select potential lactic acid bacteria for soy yogurt production. From 17 natural fermentation samples, 51 lactic acid strains capable of fermenting soy milk into soy yogurt were isolated. Based on the quality analysis of soy yogurt, 10 strains were selected. Using MALDI-TOFMS technique, these 10 strains were classified into 3 species: Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, and Streptococcus equinus . Among them, Lactococcus lactis K1 was evaluated as the best strain for soymilk fermentation due to its outstanding characteristics such as high growth rate, biological safety, and production of high-quality yogurt, especially with the ability to produce a high amount of exopolysaccharide (1,381.7 mgkg). The soy yogurt initially received positive responses from consumers. Keywords: Lactic acid bacteria, biochemical characterization, soy yogurt. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Đêu tþĄng (Glycine max L. Merrill) là cây công nghiệp ngín ngày và có vð trí quan trọ ng trong nền nông nghiệp Việt Nam và nhiều nþĆ c trên thế giĆi (Træn Vën Điền, 2007). Đêu tþĄng rçt giàu dinh dþĈng và đþĉc coi là nguồ n cung cçp protein hoàn chînh và chĀa một lþĉng đáng kể các axit amin không thay thế, cæn thiết cho cĄ thể nhþ isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin (Lokuruka, 2010). Bên cänh đò, đêu tþĄng cüng chĀa nhiề u axit béo không no, isoflavone và không chĀ a cholesterol và lactose. Vì vêy, các sân phèm tÿ đêu tþĄng rçt phù hĉp để thay thế các sâ n phèm tÿ sĂa động vêt dành cho ngþą i không dung näp lactose hay bð dð Āng vĆ i protein trong sĂa (Lin cs., 2004). Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương 1318 Mặc dù đêu tþĄng là loäi thăc phèm bổ dþĈng, tốt cho sĀc khóe nhþng să tiêu thý các sân phèm tÿ đêu tþĄng cñn hän chế vì sâ n phèm cò mùi ngái đặc trþng do enzyme lipoxygenase xúc tác cho phân Āng oxy hóa chç t béo täo thành các hĉp chçt bay hĄi gåy mùi khò chðu nhþ hexanal, pentanal, đồng thąi chĀa mộ t số chçt kháng dinh dþĈng, khò tiêu hòa điể n hình là axit phytic, raffinose và stachyose (Li cs., 2014). Để khíc phýc nhĂng hän chế này, lên men sĂa đêu tþĄng bìng vi khuèn lactic là giâ i pháp công nghệ phù hĉ p vì quá trình lên men giúp câi thiện đặc tính hóa lý, câ m quan và mang läi lĉi ích sĀc khóe cho ngþąi sā dý ng (Manorama cs., 2012). Nhiều nghiên cĀu đã công bố các chûng vi khuèn lactic có khâ nëng sinh tổng hĉp -galactosidase, kích hoä t enzyme phytase có tác dýng xúc tác thû y phân nhĂng hĉp chç t carbohydrate gây mùi ngái, làm giâm giá trð và khâ nëng hçp thu dinh dþĈ ng (Donkor Shah, 2006). Sā dýng sĂa chua đêu tþĄng đþĉc chĀng minh có khâ nëng gia tëng hçp thu isoflavone và các axit amin tă do, tëng hoät tính kháng oxy hòa, ngën ngÿa tình trä ng gan nhiễm mĈ, điều chînh să chuyển hóa cholesterol, giâm huyết áp bâo vệ sĀc khó e tim mäch, phòng chống ung thþ, câi thiện hþĄng vð và giá trð dinh dþĈng cho sân phè m (Drake cs., 2006). Vi khuèn lactic có yêu cæu cao về dinh dþĈng, thành phæn môi trþąng có chĀa các hĉ p chçt cacbohydrat đĄn giâ n, axit amin, peptit, dén xuçt cûa axit nucleic và vitamin là cæn thiế t cho să sinh trþćng, phát triển cû a chúng (Hati cs., 2018). SĂa bò có thành phæn gồm đþą ng lactose (5), protein (3,3) và pH 6,6-6,7 là một môi trþąng phát triển lċ tþćng cho hæu hế t các loäi vi sinh vêt, trong đò cò vi khuè n lactic (Hati cs., 2018). S Ăa đêu tþĄng mặc dù cüng khá giàu dinh dþĈng vĆi hàm lþĉng protein cao, chĀa nhiều vitamin (A, B12, D) và chçt khoáng nhþng thành phæn có să khác biệt so vĆi sĂa bò đặc biệt về thành phæn và hàm lþĉng carbohydrat, do đò să trao đổi chçt cûa vi khuè n lactic trong sĂa đêu tþĄng và sĂa bñ cüng khác nhau (Horáčková č cs., 2015; Hati cs., 2018). Mýc tiêu cûa nghiên cĀu này nhì m phân lêp và tuyển chọn chûng vi khuèn lactic có khâ nëng lên men đặc hiệu, giâm mùi ngái cûa đêu tþĄng, sinh tổng hĉp các chçt có tác dýng câ i thiện cçu trúc và hþĄng vð cûa sân phèm và an toàn cho ngþąi sā dýng. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Đêu tþĄng đþĉc trồng täi Hà Nội, làm nguyên liệu cho nguồn méu phân lêp và chế biế n sĂa đêu tþĄng cho lên men lactic. Nguồn mé u cho phân lêp đþĉc lên men tă nhiên gồm mẻ (1 méu), nþĆc chua thu nhên tÿ quá trình làm đêu phý (3 méu), đêu phý lên men (2 méu), sĂa đêu tþĄng thû công lên men (2 méu), bã đêu lên men (2 méu), sĂa đêu tþĄng Fami lên men (2 méu), đêu tþĄng luộc lên men (2 méu), tþĄng bæ n (1 méu), dþa muối (1 méu), nem chua (1 méu). Hóa chçt chuèn bð môi trþąng MRS cho nuôi cçy vi khuèn lactic và phân tích các chî tiêu gồm kit tách chiết DNA G-spin™ cung cç p bći iNtRON Bio (Hàn Quố c); kit API 50 CHL cung cçp bć i BioMérieux (Pháp); kháng sinh và các cặp mồi đặc hiệu; peptone, cao thðt cung cç p bći Himedia (Ấn Độ). NhĂng hóa chç t thông dýng khác đþĉc cung cçp bć i Samchun (Hàn Quốc) đät độ tinh khiết phân tích. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic Vi khuèn lactic đþĉc phân lêp theo phþĄng pháp mô tâ bći (Đàm Sao Mai cs., 2011). 2.2.2. Xác định đặc điể m hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa cû a vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp mô tâ bći Jame (2002). 2.2.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic cho lên men sữa chua đậu tương Chûng vi khuèn lactic đã phån lêp đþĉc thā nghiệm làm giống khći động cho lên men sĂa chua đêu tþĄng. TrþĆc tiên, các chûng vi khuèn đþĉc hoät hòa trên môi trþąng MRS lóng, nuôi ć nhiệt độ 30C trong 24h, tČ lệ tiếp giống 10. Sau đò, dðch giống đþĉc ly tâm thu sinh khối rồ i bổ sung vào sĂa đêu tþĄng. Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh 1319 SĂa đêu tþĄng cò pH 6,5, hàm lþĉng axit 0,82 gl đþĉc bổ sung sucrose để đät hàm lþĉ ng chçt khô hòa tan tổng số là 16Bx và thanh trùng ć 95C trong 10 phút. Sau khi xā lý nhiệt, sĂa đêu tþĄng đþĉc làm nguội đến 40-43C rồi tiế p giống vi khuèn. Quá trình lên men đþĉc thă c hiện ć 37C trong 8h. Sau khi lên men kế t thúc, sĂa chua đêu tþĄng đþĉc bâo quân ć 4 C trong 12h để ổn đðnh träng thái trþĆ c khi phân tích. SĂa chua đêu tþĄng đþĉc đánh giá chçt lþĉ ng gồm các chî tiêu pH, hàm lþĉng axit tổng số , nhên xét câm quan (träng thái đông tý và mùi vð cûa sân phèm) để tuyển chọn nhĂng chû ng vi khuèn có khâ nëng lên men sĂa chua đêu tþĄng. NhĂng chûng vi khuèn lactic đã tuyển chọn đþĉc đðnh danh bìng kč thuêt khối phổ MALDI-TOF MS (Vü QuĊnh HþĄng, 2022). Mộ t chûng vi khuèn tiềm nëng nhçt đþĉc lăa chọ n dăa trên kết quâ đðnh danh bìng giâi trình tă gen, khâ nëng sinh trþćng, phát triển và chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng. Méu sĂa chua đêu tþĄng lên men tÿ chûng vi khuèn tiềm nëng này sẽ đþĉc đánh giá chçt lþĉng såu hĄn, vĆi các chî tiêu gồm nồng độ chçt khô hòa tan tổng số (TSS), pH, axit tổng số, khâ nëng giĂ nþĆc, hàm lþĉng exopolysaccharide (EPS) và đánh giá câ m quan bìng phép thā thð hiếu. 2.2.4. Phân tích chất lượng sữa chua đậu tương Hàm lþĉng chçt khô hòa tan tổng số đþĉc xác đðnh theo TCVN 7771:2007 (ISO 2173:2003). Hàm lþĉng axit hĂu cĄ tổng số đþĉc xác đðnh theo TCVN 5483-1991 (ISO 750-1981). Hàm lþĉng EPS trong s Ăa chua đêu tþĄng đþĉc phån tích theo phþĄng pháp mô tâ bć i Enikeev (2012) và Nielsen (2010). Khâ nëng giĂ nþĆc cûa s Ăa chua đêu tþĄng đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp mô tâ bć i Korkmaz cs. (2021). Chçt lþĉng câm quan cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc đánh giá theo phþĄng pháp cho điể m thð hiếu trên thang điểm tÿ 1-9 (Hà Duyên Tþ, 2006). 2.2.5. Đánh giá tính đặ c tính an toàn sinh học của chủng vi khuẩn lactic Đánh giá đặc điểm tan máu: Khâ nëng làm tan máu cûa vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp cûa Gómez cs. (2016). Môi trþąng dùng để đánh giá khâ nëng làm tan máu cûa vi khuèn lactic là Blood Agar Base bổ sung thêm 5 máu cÿu. Bảng 1. Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại Mồi Trình tự (5’3’) 27F 5'''' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'''' 1492R 5'''' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'''' Bảng 2. Đặc tính của sữa chua đậu tương lên men bởi các chủng vi khuẩn lactic tiềm năng Ký hiệu chủng TSS (Bx) Axit tổng số () pH Trạng thái đông tụ Mùi vị K1 12,53 ± 0,06 0,62 ± 0,02 4,45 ± 0,01 ++++ +++ K3 12,73 ± 0,06 0,50 ± 0,01 4,84 ± 0,01 ++++ ++ NCDN2.1 12,60 ± 0,10 0,52 ± 0,01 4,78 ± 0,00 +++ ++ NCDN2.3 12,70 ± 0,10 0,61 ± 0,01 4,65 ± 0,01 +++ +++ SD2.1 12,63 ± 0,12 0,44 ± 0,00 4,91 ± 0,01 +++ +++ SD2.2 13,17 ± 0,06 0,48 ± 0,00 4,87 ± 0,05 +++ +++ FAM2.2 13,30 ± 0,10 0,60 ± 0,00 4,52 ± 0,00 +++ +++ FAM2.3 12,43 ± 0,12 0,44 ± 0,01 4,92 ± 0,01 +++ +++ TBHY3 12,57 ± 0,12 0,48 ± 0,02 4,88 ± 0,01 +++ +++ MEDN2.4 12,80 ± 0,10 0,43 ± 0,01 4,99 ± 0,01 +++ ++ Ghi chú: (++++): Rất tốt; (+++): Tốt, (++): Trung bình, (+): Kém. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương 1320 Đánh giá phát hiện gen kháng kháng sinh : Phát hiện gen kháng kháng sinh cûa chû ng vi khuèn lactic đþĉc thăc hiện theo phþĄng pháp cûa Guo cs. (2017). 2.2.6. Xác định đặc tính sinh trưở ng, phát triển của chủng vi khuẩn lactic Đánh giá khâ năng sử dụng các nguồ n carbohydrate: Khâ nëng sā dýng các nguồ n carbohydrate cûa vi khuèn lactic đþĉc đánh giá bìng cách sā dýng bộ kit API 50 CHL (BioMérieux, Pháp), chĀa 49 loä i carbohydrate khác nhau. Đánh giá khâ năng phát triển của vi khuẩ n khi nuôi cấy ở nhiệt độ và pH khác nhau: Chû ng vi khuèn lactic đþĉc cçy ria trên đïa thäch MRS, sau đò nuôi ć dâi nhiệt độ tÿ 15-42C và pH tÿ 4,0-9,5. Sau 48h nuôi cçy quan sát khâ nëng sinh trþćng phát triển cûa vi khuèn. 2.2.7. Định danh bằng giải trình tự gen Phån đoän rADN cûa vi sinh vê t sau khi tách chiết đþĉc khuyếch đäi bìng phân Ā ng PCR vĆi các cặp mồi đặc hiệu sā dý ng trong phân loäi (Bâng 1). Sân phèm PCR sau khi khuyếch đäi đþĉc phân tích trình tă tä i hãng 1st BASE (Malaysia). Các chuỗi DNA đþĉ c so sánh vĆi cĄ sć dĂ liệu cû a GenBank thông qua giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiế m BLAST nucleotide-nucleotide. Các chuỗi liên quan đþĉ c chuyển tâi về sau đò xā lý bìng phæn mề m BioEdit (Hall, 1999). 2.2.8. Xử lý số liệu Số liệu về chî tiêu chçt lþĉng đþĉc biểu diễ n bìng giá trð trung bình cûa ba læn phân tích lặ p läi và độ lệch chuèn. Điểm thð hiếu cho mỗi chî tiêu câm quan cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc thể hiện bći giá trð trung bình và sai số chuèn cûa 90 ngþąi thā. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩ n lactic từ nguồn mẫu lên men tự nhiên Tÿ 17 nguồn méu, chúng tôi thu nhên đþĉ c 51 chûng vi khuèn lactic. NhĂng chûng này có các đặc điểm điển hình nhþ khuèn läc tròn, lồ i, có màu tríng trong, tríng đýc, hoặc tríng sĂ a täo vòng phân giâi khi nuôi cçy trên môi trþąng đïa thäch MRS có bổ sung CaCO3 . Quan sát hình thái tế bào cûa các chûng vi khuè n này cho thçy có 14 chûng thuộc nhóm trăc khuèn, tế bào xếp đĄn, xếp đôi và xếp chuỗi; 37 chûng vi khuèn thuộc nhóm cæu khuèn, tế bào xếp đĄn, xếp đôi và kết đám. Kết quâ phân tích một số đặc điểm sinh lċ, sinh hòa cüng cho thç y 51 chûng vi khuèn này đều mang nhĂng đặc điể m cûa vi khuèn lactic theo mô tâ cûa Vinderola cs. (2019) đò là vi khuèn Gram dþĄng, không cò khâ nëng di động và không sinh catalase. Để tuyển chọn chûng vi khuèn tiềm nëng cho lên men sĂa chua đêu tþĄng, 51 chû ng vi khuèn lactic đã phån lêp đþĉc sā dý ng làm giống khći động cho lên men sĂa chua đêu tþĄng. Kết quâ cho thçy 51 chûng này đề u có khâ nëng lên men sĂa đêu tþĄng, chuyển hóa đþąng thành axit lactic, giâm pH đến điểm đîng điện cûa protein, giúp đông tý sĂa và täo vð chua, gi âm mùi ngái đặc trþng cûa đêu tþĄng. Tuy nhiên, đặc tính câm quan cûa các méu sĂ a chua có să khác biệt. Các chûng vi khuèn đþĉc đánh giá cao là nhĂng chûng täo hþĄng thĄm cho sĂa chua, có khâ nëng đông tý tốt, cç u trúc mðn và không bð tách nþĆc. Bâng 2 thể hiện kế t quâ đánh giá chçt lþĉng s Ăa chua đêu tþĄng đþĉc lên men bći 10 chûng vi khuèn lactic tiềm nëng nhçt. Kết quâ phân tích chçt lþĉng cûa 10 mé u sĂa chua đêu tþĄng cho thçy nồng độ chç t khô hòa tan tổng số cûa các méu s Ăa chua đêu tþĄng đều giâm xuống, tÿ 16Bx đến 12,5-13,3 Bx. Nguyên nhân TSS giâm trong quá trình lên men là do vi khuèn lactic bài tiế t các enzyme xúc tác cho các phân Āng hóa sinh trong chu trình đþąng phån để phân giâi đþą ng thành axit lactic và một số sân phèm phý. Các chûng vi khuèn khác nhau có khâ nëng sinh axit lactic không nhþ nhau. Kết quâ Bâ ng 2 cho thçy hàm lþĉng axit tổng số tính theo axit lactic trong các méu sĂa chua biến động tÿ 0,43-0,62. Méu sĂa chua lên men tÿ chû ng K1, NCDN2.3, FAM2.2 có giá trð axit cao nhç t (0,60-0,62) và khác biệt cò ċ nghïa thố ng kê so vĆi nhĂng méu sĂa chua còn läi. Kết quâ này phù hĉp vĆi nghiên cĀu cûa Chun cs. (2007) Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh 1321 khi lên men sĂa đêu tþĄng vĆi 4 chûng vi khuè n lactic Lactobacillus paraplantarum KM, Enterococcus durans KH, Streptococcus salivarius HM và Weissella confusa JY, hàm lþĉng axit tổng số cûa sân phèm đät 0,62. Cùng vĆi să tëng lên cûa axit tổng số , pH cûa sĂa chua cüng giâm xuống, tÿ 6,4 đế n 4,5-4,9. Đåy là khoâng pH rçt phù hĉp cho quá trình đông tý protein, täo cçu trúc đặc trþng cho sĂa chua. Kết quâ này tþĄng tă nhþ số liệ u công bố bći Li cs. (2014) khi lên men sĂa đêu tþĄng bìng một số chûng vi khuèn lactic, trong đò pH cûa sĂa chua đêu tþĄng trong nghiên cĀ u này là 4,6-5,1. Kết quâ nhên xét các đặc tính câm quan về träng thái đông tý và mùi vð cûa sĂa chua đêu tþĄng cho thçy trong số 51 chûng vi khuè n phân lêp đþĉc thì 10 chûng ć bâng 2 đþĉc đánh giá là có tiềm nëng cho lên men sĂa chua đêu tþĄng. Bâng 3 mô tâ đặc điểm và kết quâ đð nh danh cûa 10 chûng này. Kết quâ đðnh danh cho thç y 10 chûng vi khuèn thuộc 3 loài gồm Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và Streptococcus equinus. Cën cĀ kết quâ đðnh danh vi khuèn, khâ nëng sinh trþćng, tính ổn đðnh về sinh trþć ng, phát triển trong suốt quá trình phân lê p và tuyển chọn cüng nhþ chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng, chûng vi khuèn K1 thuộc loài Lactococcus lactis đþĉc lăa chọn để thăc hiệ n các nghiên cĀu tiếp theo. 3.2. Đánh giá đặc tính an toàn sinh học củ a chủng Lactococcus lactis K1 Đánh giá khâ năng làm tan máu: Să víng mặt cûa khâ nëng làm tan máu đþĉc coi là điều kiện an toàn tiên quyết cho việc lăa chọn chûng vi khuèn probiotic bći đåy là một yếu tố độc lăc đþĉc biết đến ć các vi sinh vêt gây bệnh. Kết quâ nuôi cçy chûng vi khuèn Lactococcus lactis K1 trên m...
Vietnam J Agri Sci 2023, Vol 21, No 10: 1317-1326 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2023, 21(10): 1317-1326 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA ĐẬU TƯƠNG Trần Thị Định1*, Thân Thị Hương1, Nguyễn Thị Hoàng Lan1, Lê Minh Nguyệt1, Đặng Thu Hương2, Nguyễn Thị Minh3 1Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2Bộ môn Công nghệ sinh học vi sinh, Viện Công nghiệp thực phẩm 3Khoa Tài Nguyên - Môi Trường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam *Tác giả liên hệ: ttdinh@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 10.05.2023 Ngày chấp nhận đăng: 05.10.2023 TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic ứng dụng cho lên men sữa chua đậu tương Từ 17 nguồn mẫu lên men tự nhiên, 51 chủng vi khuẩn lactic được phân lập, tất cả các chủng đều có khả năng lên men sữa đậu tương Từ kết quả phân tích chất lượng sữa chua, 10 chủng vi khuẩn tiềm năng nhất được sàng lọc Kết quả định danh bằng phương pháp MALDI-TOF/MS cho thấy 10 chủng vi khuẩn này thuộc 3 loài Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và Streptococcus equinus, trong đó, chủng vi khuẩn Lactococcus lactis K1 là chủng được đánh giá tốt nhất cho lên men sữa chua đậu tương vì sở hữu những đặc điểm nổi trội như khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, đảm bảo an toàn sinh học và lên men sữa chua có chất lượng tốt, đặc biệt chủng vi khuẩn có khả năng sinh hàm lượng exopolyscharide rất cao (1.381,7 mg/kg) Sữa chua đậu tương bước đầu nhận được sự ưa thích của người tiêu dùng Từ khóa: Vi khuẩn lactic, đặc tính sinh hóa, sữa chua đậu tương Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria for use in Soy Yogurt Production ABSTRACT This study was conducted to isolate and select potential lactic acid bacteria for soy yogurt production From 17 natural fermentation samples, 51 lactic acid strains capable of fermenting soy milk into soy yogurt were isolated Based on the quality analysis of soy yogurt, 10 strains were selected Using MALDI-TOF/MS technique, these 10 strains were classified into 3 species: Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, and Streptococcus equinus Among them, Lactococcus lactis K1 was evaluated as the best strain for soymilk fermentation due to its outstanding characteristics such as high growth rate, biological safety, and production of high-quality yogurt, especially with the ability to produce a high amount of exopolysaccharide (1,381.7 mg/kg) The soy yogurt initially received positive responses from consumers Keywords: Lactic acid bacteria, biochemical characterization, soy yogurt 1 ĐẶT VẤN ĐỀ cĄ thể nhþ isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin (Lokuruka, Đêu tþĄng (Glycine max L Merrill) là cây 2010) Bên cänh đò, đêu tþĄng cüng chĀa nhiều công nghiệp ngín ngày và có vð trí quan trọng axit béo không no, isoflavone và không chĀa trong nền nông nghiệp Việt Nam và nhiều nþĆc cholesterol và lactose Vì vêy, các sân phèm tÿ trên thế giĆi (Træn Vën Điền, 2007) Đêu tþĄng đêu tþĄng rçt phù hĉp để thay thế các sân rçt giàu dinh dþĈng và đþĉc coi là nguồn cung phèm tÿ sĂa động vêt dành cho ngþąi không cçp protein hoàn chînh và chĀa một lþĉng đáng dung näp lactose hay bð dð Āng vĆi protein trong kể các axit amin không thay thế, cæn thiết cho sĂa (Lin & cs., 2004) 1317 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương Mặc dù đêu tþĄng là loäi thăc phèm bổ tþĄng, sinh tổng hĉp các chçt có tác dýng câi dþĈng, tốt cho sĀc khóe nhþng să tiêu thý các thiện cçu trúc và hþĄng vð cûa sân phèm và an sân phèm tÿ đêu tþĄng cñn hän chế vì sân toàn cho ngþąi sā dýng phèm cò mùi ngái đặc trþng do enzyme lipoxygenase xúc tác cho phân Āng oxy hóa chçt 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU béo täo thành các hĉp chçt bay hĄi gåy mùi khò chðu nhþ hexanal, pentanal, đồng thąi chĀa một 2.1 Vật liệu số chçt kháng dinh dþĈng, khò tiêu hòa điển hình là axit phytic, raffinose và stachyose (Li & Đêu tþĄng đþĉc trồng täi Hà Nội, làm cs., 2014) Để khíc phýc nhĂng hän chế này, lên nguyên liệu cho nguồn méu phân lêp và chế biến men sĂa đêu tþĄng bìng vi khuèn lactic là giâi sĂa đêu tþĄng cho lên men lactic Nguồn méu cho pháp công nghệ phù hĉp vì quá trình lên men phân lêp đþĉc lên men tă nhiên gồm mẻ (1 méu), giúp câi thiện đặc tính hóa lý, câm quan và nþĆc chua thu nhên tÿ quá trình làm đêu phý mang läi lĉi ích sĀc khóe cho ngþąi sā dýng (3 méu), đêu phý lên men (2 méu), sĂa đêu tþĄng (Manorama & cs., 2012) Nhiều nghiên cĀu đã thû công lên men (2 méu), bã đêu lên men công bố các chûng vi khuèn lactic có khâ nëng (2 méu), sĂa đêu tþĄng Fami lên men (2 méu), sinh tổng hĉp -galactosidase, kích hoät đêu tþĄng luộc lên men (2 méu), tþĄng bæn enzyme phytase có tác dýng xúc tác thûy phân (1 méu), dþa muối (1 méu), nem chua (1 méu) nhĂng hĉp chçt carbohydrate gây mùi ngái, làm giâm giá trð và khâ nëng hçp thu dinh dþĈng Hóa chçt chuèn bð môi trþąng MRS cho (Donkor & Shah, 2006) Sā dýng sĂa chua đêu nuôi cçy vi khuèn lactic và phân tích các chî tþĄng đþĉc chĀng minh có khâ nëng gia tëng tiêu gồm kit tách chiết DNA G-spin™ cung cçp hçp thu isoflavone và các axit amin tă do, tëng bći iNtRON Bio (Hàn Quốc); kit API 50 CHL hoät tính kháng oxy hòa, ngën ngÿa tình träng cung cçp bći BioMérieux (Pháp); kháng sinh và gan nhiễm mĈ, điều chînh să chuyển hóa các cặp mồi đặc hiệu; peptone, cao thðt cung cçp cholesterol, giâm huyết áp bâo vệ sĀc khóe tim bći Himedia (Ấn Độ) NhĂng hóa chçt thông mäch, phòng chống ung thþ, câi thiện hþĄng dýng khác đþĉc cung cçp bći Samchun (Hàn vð và giá trð dinh dþĈng cho sân phèm (Drake & Quốc) đät độ tinh khiết phân tích cs., 2006) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Vi khuèn lactic có yêu cæu cao về dinh dþĈng, thành phæn môi trþąng có chĀa các hĉp 2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic chçt cacbohydrat đĄn giân, axit amin, peptit, Vi khuèn lactic đþĉc phân lêp theo phþĄng dén xuçt cûa axit nucleic và vitamin là cæn thiết cho să sinh trþćng, phát triển cûa chúng (Hati pháp mô tâ bći (Đàm Sao Mai & cs., 2011) & cs., 2018) SĂa bò có thành phæn gồm đþąng lactose (5%), protein (3,3%) và pH 6,6-6,7 là một 2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý môi trþąng phát triển lċ tþćng cho hæu hết các và sinh hóa của vi khuẩn lactic loäi vi sinh vêt, trong đò cò vi khuèn lactic (Hati & cs., 2018) SĂa đêu tþĄng mặc dù cüng khá Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa cûa giàu dinh dþĈng vĆi hàm lþĉng protein cao, vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp chĀa nhiều vitamin (A, B12, D) và chçt khoáng mô tâ bći Jame (2002) nhþng thành phæn có să khác biệt so vĆi sĂa bò đặc biệt về thành phæn và hàm lþĉng 2.2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic carbohydrat, do đò să trao đổi chçt cûa vi khuèn cho lên men sữa chua đậu tương lactic trong sĂa đêu tþĄng và sĂa bñ cüng khác nhau (Horáčková č& cs., 2015; Hati & cs., 2018) Chûng vi khuèn lactic đã phån lêp đþĉc thā nghiệm làm giống khći động cho lên men sĂa Mýc tiêu cûa nghiên cĀu này nhìm phân chua đêu tþĄng TrþĆc tiên, các chûng vi khuèn lêp và tuyển chọn chûng vi khuèn lactic có khâ đþĉc hoät hòa trên môi trþąng MRS lóng, nuôi ć nëng lên men đặc hiệu, giâm mùi ngái cûa đêu nhiệt độ 30C trong 24h, tČ lệ tiếp giống 10% Sau đò, dðch giống đþĉc ly tâm thu sinh khối rồi 1318 bổ sung vào sĂa đêu tþĄng Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh SĂa đêu tþĄng cò pH 6,5, hàm lþĉng axit 2.2.4 Phân tích chất lượng sữa chua 0,82 g/l đþĉc bổ sung sucrose để đät hàm lþĉng đậu tương chçt khô hòa tan tổng số là 16Bx và thanh trùng ć 95C trong 10 phút Sau khi xā lý nhiệt, sĂa Hàm lþĉng chçt khô hòa tan tổng số đþĉc xác đêu tþĄng đþĉc làm nguội đến 40-43C rồi tiếp đðnh theo TCVN 7771:2007 (ISO 2173:2003) giống vi khuèn Quá trình lên men đþĉc thăc hiện ć 37C trong 8h Sau khi lên men kết thúc, Hàm lþĉng axit hĂu cĄ tổng số đþĉc xác sĂa chua đêu tþĄng đþĉc bâo quân ć 4C trong đðnh theo TCVN 5483-1991 (ISO 750-1981) 12h để ổn đðnh träng thái trþĆc khi phân tích SĂa chua đêu tþĄng đþĉc đánh giá chçt lþĉng Hàm lþĉng EPS trong sĂa chua đêu tþĄng gồm các chî tiêu pH, hàm lþĉng axit tổng số, đþĉc phån tích theo phþĄng pháp mô tâ bći nhên xét câm quan (träng thái đông tý và mùi vð Enikeev (2012) và Nielsen (2010) cûa sân phèm) để tuyển chọn nhĂng chûng vi khuèn có khâ nëng lên men sĂa chua đêu tþĄng Khâ nëng giĂ nþĆc cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp mô tâ bći NhĂng chûng vi khuèn lactic đã tuyển chọn Korkmaz & cs (2021) đþĉc đðnh danh bìng kč thuêt khối phổ MALDI-TOF MS (Vü QuĊnh HþĄng, 2022) Một Chçt lþĉng câm quan cûa sĂa chua đêu chûng vi khuèn tiềm nëng nhçt đþĉc lăa chọn tþĄng đþĉc đánh giá theo phþĄng pháp cho điểm dăa trên kết quâ đðnh danh bìng giâi trình tă thð hiếu trên thang điểm tÿ 1-9 (Hà Duyên gen, khâ nëng sinh trþćng, phát triển và chçt Tþ, 2006) lþĉng sĂa chua đêu tþĄng Méu sĂa chua đêu tþĄng lên men tÿ chûng vi khuèn tiềm nëng này 2.2.5 Đánh giá tính đặc tính an toàn sinh sẽ đþĉc đánh giá chçt lþĉng såu hĄn, vĆi các chî học của chủng vi khuẩn lactic tiêu gồm nồng độ chçt khô hòa tan tổng số (TSS), pH, axit tổng số, khâ nëng giĂ nþĆc, hàm Đánh giá đặc điểm tan máu: Khâ nëng làm lþĉng exopolysaccharide (EPS) và đánh giá câm tan máu cûa vi khuèn lactic đþĉc xác đðnh theo quan bìng phép thā thð hiếu phþĄng pháp cûa Gómez & cs (2016) Môi trþąng dùng để đánh giá khâ nëng làm tan máu cûa vi khuèn lactic là Blood Agar Base bổ sung thêm 5% máu cÿu Bảng 1 Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại Mồi Trình tự (5’3’) 27F 5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3' 1492R 5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3' Bảng 2 Đặc tính của sữa chua đậu tương lên men bởi các chủng vi khuẩn lactic tiềm năng Ký hiệu chủng TSS (Bx) Axit tổng số (%) pH Trạng thái đông tụ Mùi vị K1 12,53 ± 0,06 0,62 ± 0,02 4,45 ± 0,01 ++++ +++ K3 12,73 ± 0,06 0,50 ± 0,01 4,84 ± 0,01 ++++ ++ NCDN2.1 12,60 ± 0,10 0,52 ± 0,01 4,78 ± 0,00 +++ ++ NCDN2.3 12,70 ± 0,10 0,61 ± 0,01 4,65 ± 0,01 +++ +++ SD2.1 12,63 ± 0,12 0,44 ± 0,00 4,91 ± 0,01 +++ +++ SD2.2 13,17 ± 0,06 0,48 ± 0,00 4,87 ± 0,05 +++ +++ FAM2.2 13,30 ± 0,10 0,60 ± 0,00 4,52 ± 0,00 +++ +++ FAM2.3 12,43 ± 0,12 0,44 ± 0,01 4,92 ± 0,01 +++ +++ TBHY3 12,57 ± 0,12 0,48 ± 0,02 4,88 ± 0,01 +++ +++ MEDN2.4 12,80 ± 0,10 0,43 ± 0,01 4,99 ± 0,01 +++ ++ Ghi chú: (++++): Rất tốt; (+++): Tốt, (++): Trung bình, (+): Kém 1319 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương Đánh giá phát hiện gen kháng kháng sinh: có màu tríng trong, tríng đýc, hoặc tríng sĂa Phát hiện gen kháng kháng sinh cûa chûng vi täo vòng phân giâi khi nuôi cçy trên môi trþąng khuèn lactic đþĉc thăc hiện theo phþĄng pháp đïa thäch MRS có bổ sung CaCO3 Quan sát cûa Guo & cs (2017) hình thái tế bào cûa các chûng vi khuèn này cho thçy có 14 chûng thuộc nhóm trăc khuèn, tế bào 2.2.6 Xác định đặc tính sinh trưởng, phát xếp đĄn, xếp đôi và xếp chuỗi; 37 chûng vi triển của chủng vi khuẩn lactic khuèn thuộc nhóm cæu khuèn, tế bào xếp đĄn, xếp đôi và kết đám Kết quâ phân tích một số Đánh giá khâ năng sử dụng các nguồn đặc điểm sinh lċ, sinh hòa cüng cho thçy 51 carbohydrate: Khâ nëng sā dýng các nguồn chûng vi khuèn này đều mang nhĂng đặc điểm carbohydrate cûa vi khuèn lactic đþĉc đánh giá cûa vi khuèn lactic theo mô tâ cûa Vinderola & bìng cách sā dýng bộ kit API 50 CHL cs (2019) đò là vi khuèn Gram dþĄng, không cò (BioMérieux, Pháp), chĀa 49 loäi carbohydrate khâ nëng di động và không sinh catalase khác nhau Để tuyển chọn chûng vi khuèn tiềm nëng Đánh giá khâ năng phát triển của vi khuẩn cho lên men sĂa chua đêu tþĄng, 51 chûng vi khi nuôi cấy ở nhiệt độ và pH khác nhau: Chûng khuèn lactic đã phån lêp đþĉc sā dýng làm vi khuèn lactic đþĉc cçy ria trên đïa thäch MRS, giống khći động cho lên men sĂa chua đêu sau đò nuôi ć dâi nhiệt độ tÿ 15-42C và pH tÿ tþĄng Kết quâ cho thçy 51 chûng này đều có 4,0-9,5 Sau 48h nuôi cçy quan sát khâ nëng khâ nëng lên men sĂa đêu tþĄng, chuyển hóa sinh trþćng phát triển cûa vi khuèn đþąng thành axit lactic, giâm pH đến điểm đîng điện cûa protein, giúp đông tý sĂa và täo vð 2.2.7 Định danh bằng giải trình tự gen chua, giâm mùi ngái đặc trþng cûa đêu tþĄng Phån đoän rADN cûa vi sinh vêt sau khi Tuy nhiên, đặc tính câm quan cûa các méu sĂa chua có să khác biệt Các chûng vi khuèn đþĉc tách chiết đþĉc khuyếch đäi bìng phân Āng đánh giá cao là nhĂng chûng täo hþĄng thĄm PCR vĆi các cặp mồi đặc hiệu sā dýng trong cho sĂa chua, có khâ nëng đông tý tốt, cçu trúc phân loäi (Bâng 1) Sân phèm PCR sau khi mðn và không bð tách nþĆc Bâng 2 thể hiện kết khuyếch đäi đþĉc phân tích trình tă täi hãng quâ đánh giá chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng 1st BASE (Malaysia) Các chuỗi DNA đþĉc so đþĉc lên men bći 10 chûng vi khuèn lactic tiềm sánh vĆi cĄ sć dĂ liệu cûa GenBank thông qua nëng nhçt giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide Các chuỗi liên quan đþĉc Kết quâ phân tích chçt lþĉng cûa 10 méu chuyển tâi về sau đò xā lý bìng phæn mềm sĂa chua đêu tþĄng cho thçy nồng độ chçt khô BioEdit (Hall, 1999) hòa tan tổng số cûa các méu sĂa chua đêu tþĄng đều giâm xuống, tÿ 16Bx đến 12,5-13,3Bx 2.2.8 Xử lý số liệu Nguyên nhân TSS giâm trong quá trình lên Số liệu về chî tiêu chçt lþĉng đþĉc biểu diễn men là do vi khuèn lactic bài tiết các enzyme xúc tác cho các phân Āng hóa sinh trong chu bìng giá trð trung bình cûa ba læn phân tích lặp trình đþąng phån để phân giâi đþąng thành axit läi và độ lệch chuèn Điểm thð hiếu cho mỗi chî lactic và một số sân phèm phý tiêu câm quan cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc thể hiện bći giá trð trung bình và sai số chuèn cûa Các chûng vi khuèn khác nhau có khâ nëng 90 ngþąi thā sinh axit lactic không nhþ nhau Kết quâ Bâng 2 cho thçy hàm lþĉng axit tổng số tính theo axit 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN lactic trong các méu sĂa chua biến động tÿ 0,43-0,62% Méu sĂa chua lên men tÿ chûng 3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn K1, NCDN2.3, FAM2.2 có giá trð axit cao nhçt lactic từ nguồn mẫu lên men tự nhiên (0,60-0,62%) và khác biệt cò ċ nghïa thống kê so vĆi nhĂng méu sĂa chua còn läi Kết quâ này Tÿ 17 nguồn méu, chúng tôi thu nhên đþĉc phù hĉp vĆi nghiên cĀu cûa Chun & cs (2007) 51 chûng vi khuèn lactic NhĂng chûng này có các đặc điểm điển hình nhþ khuèn läc tròn, lồi, 1320 Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh khi lên men sĂa đêu tþĄng vĆi 4 chûng vi khuèn Cën cĀ kết quâ đðnh danh vi khuèn, khâ lactic Lactobacillus paraplantarum KM, nëng sinh trþćng, tính ổn đðnh về sinh trþćng, Enterococcus durans KH, Streptococcus phát triển trong suốt quá trình phân lêp và salivarius HM và Weissella confusa JY, hàm tuyển chọn cüng nhþ chçt lþĉng sĂa chua đêu lþĉng axit tổng số cûa sân phèm đät 0,62% tþĄng, chûng vi khuèn K1 thuộc loài Lactococcus lactis đþĉc lăa chọn để thăc hiện Cùng vĆi să tëng lên cûa axit tổng số, các nghiên cĀu tiếp theo pH cûa sĂa chua cüng giâm xuống, tÿ 6,4 đến 4,5-4,9 Đåy là khoâng pH rçt phù hĉp cho quá 3.2 Đánh giá đặc tính an toàn sinh học của trình đông tý protein, täo cçu trúc đặc trþng cho chủng Lactococcus lactis K1 sĂa chua Kết quâ này tþĄng tă nhþ số liệu công bố bći Li & cs (2014) khi lên men sĂa đêu tþĄng Đánh giá khâ năng làm tan máu: Să víng bìng một số chûng vi khuèn lactic, trong đò mặt cûa khâ nëng làm tan máu đþĉc coi là điều pH cûa sĂa chua đêu tþĄng trong nghiên cĀu kiện an toàn tiên quyết cho việc lăa chọn chûng này là 4,6-5,1 vi khuèn probiotic bći đåy là một yếu tố độc lăc đþĉc biết đến ć các vi sinh vêt gây bệnh Kết Kết quâ nhên xét các đặc tính câm quan về quâ nuôi cçy chûng vi khuèn Lactococcus lactis träng thái đông tý và mùi vð cûa sĂa chua đêu K1 trên môi trþąng Blood Agar Base bổ sung 5% tþĄng cho thçy trong số 51 chûng vi khuèn phân máu cÿu cho thçy có să xuçt hiện cûa khuèn läc lêp đþĉc thì 10 chûng ć bâng 2 đþĉc đánh giá là trên đïa thäch, tuy nhiên màu môi trþąng không có tiềm nëng cho lên men sĂa chua đêu tþĄng thay đổi, do đò phân Āng là âm tính (gamma Bâng 3 mô tâ đặc điểm và kết quâ đðnh danh hemolysis) Nhþ vêy, chúng tôi kết luên chûng cûa 10 chûng này Kết quâ đðnh danh cho thçy vi khuèn Lactococcus lactis K1 không có khâ 10 chûng vi khuèn thuộc 3 loài gồm nëng làm tan máu và đû điều kiện an toàn để Enterococcus faecium, Lactococcus lactis và thăc hiện các thí nghiệm tiếp theo Streptococcus equinus Bảng 3 Đặc điểm của 10 chủng vi khuẩn lactic tiềm năng cho lên men sữa chua đậu tương Ký hiệu Nguồn Hình thái Hình thái Khả năng Catalase Gram Định danh chủng phân lập khuẩn lạc tế bào di động K1 K3 Bã đậu lên men Tròn, lồi, trắng đục, Cầu khuẩn, xếp - - + Lactococcus lactis NCDN2.1 bóng đơn/xếp đôi/xếp đám NCDN2.3 Bã đậu lên men - - + Enterococcus faecium SD2.1 Tròn, hơi lồi, trắng Cầu khuẩn, xếp Nước chua làm trong, bóng đơn/xếp đôi/xếp đám - - + Enterococcus faecium SD2.2 đậu phụ FAM2.2 Nước chua làm Tròn, lồi, trắng sữa, Cầu khuẩn, xếp - - + Streptococcus equinus FAM2.3 đậu phụ bóng đơn/xếp đôi/xếp đám TBHY3 Sữa đậu tương - - + Enterococcus faecium MEDN2.4 thủ công lên Tròn, lồi, trắng đục, Cầu khuẩn, xếp men bóng đơn/xếp đôi/xếp đám - - + Enterococcus faecium Sữa đậu tương thủ công lên men Tròn, lồi, trắng đục, Cầu khuẩn, xếp - - + Lactococcus lactis Sữa đậu tương bóng đơn/xếp đôi/xếp đám Fami lên men - - + Enterococcus faecium Sữa đậu tương Tròn, lồi, trắng sữa, Cầu khuẩn, xếp Fami lên men bóng đơn/xếp đôi/xếp đám - - + Enterococcus faecium Tương bần Tròn, lồi, trắng đục, Cầu khuẩn, xếp - - + Enterococcus faecium Mẻ viền trong, bóng đơn/xếp đôi/xếp đám Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám Tròn, lồi, trắng trong Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn, xếp đơn/xếp đôi/xếp đám 1321 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương Bảng 4 Kết quả kiểm tra gen kháng kháng sinh của chủng Lactococcus lactis K1 Loại kháng sinh Gen kháng kháng sinh Sự có mặt gen kháng kháng sinh Kích thước đoạn khuếch đại (bp) Gentamicin aac(6’)-aph(2’’) - 220 Streptomycin ac(6’)Ieaph(2’’)Ia - 348 aadA - 597 Kanamycin aadE - 282 Tetracycline ant(6) - 565 Erythromycin aph(3’’)-III - 292 ant(2’’)-I - 329 Clindamycin tet(K) - 697 Chloramphenicol tet(W) - 168 Ampicillin erm(B) - 639 erm(B)-1 - 405 Vancomycin erm(C) - 642 lnu(A) - 323 lnu(B) - 925 catA - 486 cat - 300 blaZ - 240 bla - 297 mecA - 1429 vanE - 513 vanX - 454 Ghi chú: (-): Không phát hiện gen kháng kháng sinh; (+): Có gen kháng kháng sinh Kiểm tra gen kháng kháng sinh: Kiểu hình chûng vi khuèn lactic Lactococcus lactis K1 Kết kháng kháng sinh cûa vi sinh vêt có thể đþĉc quâ đþĉc trình bày ć bâng 4 quy đðnh bći kiểu gen Bên cänh đò, kiểu hình nhäy câm vĆi kháng sinh vén có thể mang gen Kết quâ ć bâng 4 cho thçy chûng vi khuèn kháng kháng sinh ć träng thái không biểu hiện Lactococcus lactis K1 không mang các gen (Anisimova & cs., 2019) Vi khuèn mang gen kháng kháng sinh trong phäm vi nghiên cĀu kháng kháng sinh trong thăc phèm có thể trć Tÿ kết quâ kiểm tra khâ nëng làm tan máu và thành mối nguy đối vĆi con ngþąi khi chúng trć gen kháng kháng sinh cûa chûng vi khuèn thành vêt trung gian truyền nhĂng gen kháng Lactococcus lactis K1, chúng tôi kết luên chûng kháng sinh này cho các vi sinh vêt gây bệnh vi khuèn này an toàn và có thể sā dýng đþĉc thông qua chuỗi thăc phèm TrþĆc đåy trong thăc phèm Hình 1 thể hiện hình thái các chûng vi khuèn lactic thuộc chi Lactococcus khuèn läc và tế bào cûa chûng Lactococcus thþąng đþĉc coi là an toàn và có thể sā dýng lactis K1 trong thăc phèm (GRAS) Tuy nhiên, một số chûng vi khuèn thuộc loài Lactococcus lactis đã 3.3 Xác định đặc tính sinh trưởng, phát đþĉc phát hiện có mang gen kháng kháng sinh triển của chủng vi khuẩn lactic tetracycline và erythromycin (Ahsraf, 2011) Do Lactococcus lactis K1 đò, trong nghiên cĀu này, 21 gen quy đðnh să đề kháng vĆi 9 loäi kháng sinh (gentamicin, Khâ năng sử dụng các nguồn streptomycin, kanamycin, tetracycline, carbohydrate: Kết quâ xác đðnh phổ lên men erythromycin, clindamycin, chloramphenicol, các loäi đþąng cûa chûng vi khuèn Lactococcus ampicillin, vancomycin đþĉc kiểm tra trên lactis K1 cho thçy sau 24 gią chûng vi khuèn có khâ nëng sā dýng 13 loäi đþąng, sau 48 gią 1322 Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh chûng vi khuèn có khâ nëng sā dýng 17 loäi rộng, trong đò phâi kể đến sucrose, glucose, đþąng làm cĄ chçt cho quá trình lên men (Bâng fructose là nhĂng loäi đþąng quan trọng phýc 5) Nhþ vêy, phổ sā dýng carborhydrate cûa vý cho nghiên cĀu Āng dýng chûng vi khuèn chûng vi khuèn Lactococcus lactis K1 khá cho lên men sĂa chua đêu tþĄng A B Hình 1 (A) Hình thái khuẩn lạc; (B) Hình thái tế bào của Lactococcus lactis K1 Bảng 5 Khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate của chủng vi khuẩn Lactococcus lactis K1 Thời gian Thời gian Nguồn carbohydrate 24 giờ 48 giờ Nguồn carbohydrate 24 giờ 48 giờ Đối chứng - Esculin - - Glycerol Salicin Erythritol - Cellobiose -/+ +/- D-Arabinose Maltose L-Arabinose - Lactose + + Ribose Melibiose D-Xylose - Sucrose + + L-Xylose Trehalose Adonitol - Inulin + + Methyl - D- Xyloside Melezitose Galactose - +/- Raffinose - - Glucose Starch Fructose - -/+ Glycogen + + Mannose Xylitol Sorbose - Gentiobiose + + Rhamnose D-Turanose Dulcitol - - D-Lyxose - - Inositol D- tagatose Mannitol - - D-Fucose - - Sorbitol L-Fucose -Metyl-D-Mannoside + + D-Arabitol - - -Metyl-D-Glucoside L-Arabitol N-Acetyl-Glucosamine + + Gluconate - -/+ Amygdalin 2-keto- Gluconate Arbutin + + 5- keto- Gluconate - - + + - - - - + + - - - - - - - - - - - - + + - - - - - - - - - - - - - - + + - -/+ - - - - - - - - Ghi chú: (+): Lên men tốt; (+/-): Lên men khá; (-/+): Lên men yếu; (-): Không sử dụng 1323 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương Phổ pH và nhiệt độ sinh trưởng phát triển: đêu tþĄng vĆi tî lệ tiếp giống 10%, sau đò lên Kết quâ kiểm tra khâ nëng phát triển cûa men ć nhiệt độ 38C trong 8h Kết quâ phân Lactococcus lactis K1 trong môi trþąng có pH tích chçt lþĉng sĂa chua đêu tþĄng đþĉc trình ban đæu khác nhau cho thçy ć pH 4,0 và pH 5,0 bày trong bâng 7 chûng vi khuèn có khâ nëng phát triển nhþng tþĄng đối yếu, trong khi đò phát triển mänh ć SĂa chua đêu tþĄng lên men bći chûng pH 6,0; 7,0; 8,5; và 9,5 Về ânh hþćng cûa nhiệt Lactococcus lactis K1 có TSS là 12,87Bx và độ, Lactococcus lactis K1 không sinh trþćng ć hàm lþĉng axit tổng số là 0,61% Nhþ vêy trong 15C nhþng phát triển tốt ć 25C, 30C, 37C và quá trình lên men chûng vi khuèn này đã sā 42C (Bâng 6) Điều này chĀng tó chûng vi dýng cĄ chçt trong sĂa để täo axit lactic và một khuèn thuộc nhòm þa çm và nhiệt độ lên men số hĉp chçt thĀ cçp, täo hþĄng thĄm và vð hài tối thích cûa nò tþĄng tă nhþ các chûng vi hòa cho sân phèm Giá trð pH cûa méu sĂa chua khuèn lactic thþĄng mäi cho lên men sĂa chua đêu tþĄng là 4,46; tþĄng đồng vĆi các nghiên động vêt cĀu khác về sĂa chua đêu tþĄng vĆi giá trð pH trong khoâng 4,1-4,7 (Chun & cs., 2007) Theo 3.4 Đánh giá chất lượng sữa chua đậu báo cáo cûa Chun & cs (2007) să đông tý xây ra tương lên men bởi chủng Lactococcus và cçu trúc cûa sĂa chua đêu tþĄng đþĉc hình lactis K1 thành khi đät đến pH phù hĉp Các méu sĂa chua động vêt thþĄng mäi trên thð trþąng có giá Để khîng đðnh tiềm nëng Āng dýng cûa trð pH trong khoâng 4,2-4,4 Nhþ vêy chûng chûng vi khuèn Lactococcus lactis K1 làm giống Lactococcus lactis K1 có khâ nëng lên men tốt khći động cho sân xuçt sĂa chua đêu tþĄng, sĂa đêu tþĄng chûng vi khuèn đþĉc hoät hóa và cçy vào sĂa Bảng 6 Kết quả kiểm tra phổ pH và nhiệt độ sinh trưởng, phát triển của chủng Lactococcus lactis K1 pH ban đầu Nhiệt độ sinh trưởng (C) 4 5 6 7 8,5 9,5 15 25 30 37 42 -/+ +/- + + + + - + + + + Ghi chú: (+): Khâ năng sinh trưởng tốt; (+/-): Khâ năng sinh trưởng khá; (-/+): Khâ năng sinh trưởng yếu; (-): Không phát triển được Bảng 7 Kết quả đánh giá chất lượng sữa chua đậu tương lên men bởi chủng Lactococcus lactis K1 Chỉ tiêu Giá trị Đơn vị TSS 12,87 ± 0,06 Bx pH 4,46 ± 0,01 Hàm lượng axit tổng số 0,61 ± 0,01 % Hàm lượng EPS 1381,7 ± 59,6 mg/kg Khả năng giữ nước 40,24 ± 1,42 % Bảng 8 Kết quả đánh giá cảm quan sữa chua đậu tương lên men từ chủng Lactococcus lactis K1 Cấu trúc Mùi hương Vị Cảm giác trong miệng Chất lượng tổng thể 5,9 ± 2,2 5,8 ± 2,1 6,0 ± 2,2 5,9 ± 2,0 6,0 ± 2,0 1324 Trần Thị Định, Thân Thị Hương, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Lê Minh Nguyệt, Đặng Thu Hương, Nguyễn Thị Minh Khâ nëng giĂ nþĆc cûa sĂa chua lên men tÿ dinh dþĈng và nâng cao chçt lþĉng câm quan Lactococcus lactis K1 là 40,24%, tþĄng đþĄng cho sân phèm vĆi kết quâ công bố bći Nguyễn ĐĀc Doan & Đỗ Thð Hà (2020) trong đò khâ nëng giĂ nþĆc cûa 4 KẾT LUẬN méu sĂa chua cûa nhóm này là 40,0-42,0% Tuy nhiên trong nghiên cĀu này tác giâ sā dýng Trong nghiên cĀu này chúng tôi đã phån nguyên liệu đêu tþĄng nây mæm và sĂa đêu lêp đþĉc 51 chûng vi khuèn lactic tÿ 17 nguồn tþĄng đþĉc bổ sung nguyên liệu phý là sĂa bột méu lên men tă nhiên Sau quá trình tuyển gæy (3%) và bột whey (2%), lên men bìng chûng chọn, 10 chûng vi khuèn lactic đã đþĉc đánh giá vi khuèn Lactobacillus bulgaricus và là có tiềm nëng lên men sĂa chua đêu tþĄng Streptococcus thermophilus là sân phèm thþĄng Trong số đò chûng vi khuèn lactic Lactococcus mäi cûa công ty CHR Hansen (Đan Mäch) Một lactis K1 đþĉc lăa chọn vì chçt lþĉng sĂa chua nghiên cĀu khác cûa Park (2015) cüng ghi nhên đåu tþĄng đþĉc täo thành bći chûng là tốt nhçt khâ nëng giĂ nþĆc cûa sĂa chua đêu tþĄng là Lactococcus lactis K1 đâm bâo tính an toàn sinh 41,3-45,5% Nghiên cĀu cüng kết luên rìng khâ học nhþ không gåy tan máu và không mang gen nëng giĂ nþĆc càng cao, độ nhĆt cûa sân phèm kháng kháng sinh, Āng dýng đþĉc trong lên sĂa chua đêu tþĄng càng lĆn men thăc phèm, có khâ nëng sā dýng 17 nguồn carbohydrate khác nhau, sinh trþćng tốt trong SĂa chua lên men bći chûng Lactococcus khoâng nhiệt độ 25-42C, thích hĉp vĆi môi lactis K1 cò hàm lþĉng EPS là 1.381,7 mg/kg So trþąng nuôi cçy có pH trung tính và kiềm HĄn sánh vĆi kết quâ nghiên cĀu cûa Li & cs (2014) nĂa, sĂa chua đêu tþĄng lên men tÿ trong đò sĂa chua đêu tþĄng lên men bći các Lactococcus lactis K1 có chçt lþĉng tốt, các chî chûng vi khuèn lactic DVS YC-X11 là tiêu hóa lý phù hĉp vĆi sân phèm sĂa chua đêu 287,08 mg/l; L rhamnosus 6005 là 635,75 mg/l; tþĄng, bþĆc đæu nhên đþĉc să þa thích cûa L plantarum 70810 là 832,15 mg/l, thì ngþąi tiêu dùng Lactococcus lactis K1 bài tiết EPS cao hĄn EPS là một polysacharide mäch dài, có tác dýng câi TÀI LIỆU THAM KHẢO thiện cçu trúc cûa sĂa chua, tëng độ kết dính, täo nên să ổn đðnh cûa hệ nhü tþĄng, do đò hän Anisimova E.A & Yarullina D.R (2019) Antibiotic chế hiện tþĉng tách nþĆc Ngoài ra, EPS đþĉc resistance of Lactobacillus strains Current công nhên là an toàn cho sĀc khóe và có các hoät microbiology 76: 1407-1416 tính sinh học giúp ngën ngÿa, điều trð các bệnh nhþ tiêu chây và nhiễm trùng, chống ung thþ, Ashraf R & Shah N.P (2011) Antibiotic resistance of điều hòa miễn dðch, chống oxy hóa (Li, 2014) probiotic organisms and safety of probiotic dairy products International Food Research SĂa chua đêu tþĄng lên men bći Journal 18(3) Lactococcus lactis K1 cñn đþĉc đánh giá câm quan bìng phép thā thð hiếu Kết quâ cho thçy Chun J., Kim G.M., Lee K.W., Choi I.D., Kwon G.H., đặc tính về mùi vð và chçt lþĉng tổng thể cûa Park J.Y & Kim J.H (2007) Conversion of sĂa chua đêu tþĄng đþĉc hội đồng câm quan isoflavone glucosides to aglycones in soymilk by đánh giá ć mĀc thích, trong khi đò điểm cçu fermentation with lactic acid bacteria Journal of trúc đþĉc đánh giá ć mĀc tþĄng đối thích (Bâng Food Science 72(2): M39-M44 8) Nhþ vêy, sĂa chua đêu tþĄng lên men bći Lactococcus lactis K1 bþĆc đæu đã đþĉc ngþąi Donkor O.N & Shah N.P (2008) Production of tiêu dùng chçp nhên và có tiềm nëng Āng dýng ‐Glucosidase and Hydrolysis of Isoflavone trong sân xuçt Tuy nhiên, các giâi pháp công Phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus, nghệ nhþ sā dýng nguyên liệu phý gồm rau, Bifidobacterium lactis, and Lactobacillus casei trái cây, bột sĂa gæy, kem béo và phý gia câi in Soymilk Journal of Food Science thiện cçu trúc bổ sung vào sĂa chua đêu tþĄng 73(1): M15-M20 cæn tiếp týc đþĉc nghiên cĀu để câi thiện giá trð Drake M.A., Chen X.Q., Tamarapu S & Leenanon B (2000) Soy protein fortification affects sensory, chemical, and microbiological properties of dairy yogurts Journal of Food Science 65(7): 1244-1247 Đàm Sao Mai, Trịnh Ngọc Nam, Bùi Hồng Quân, Lê Hồng Thía & Đào Hồng Hà (2011) Thực tập Vi 1325 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ứng dụng trong lên men sữa chua đậu tương sinh vật học Nhà xuất bản Đại học Công nghiệp physicochemical and rheological properties of TP Hồ Chí Minh fermented soymilk produced with Enikeev R (2012) Development of a new method for exopolysaccharide (EPS) producing lactic acid determination of exopolysaccharide quantity in fermented milk products and its application in bacteria strains LWT-Food Science and technology of kefir production Food Chemistry 134(4): 2437-2441 Technology 57(2): 477-485 Gómez N.C., Ramiro J.M., Quecan B.X & de Melo Lin F.M., Chiu C.H & Pan T.M (2004) Fermentation Franco B.D (2016) Use of potential probiotic lactic of a milk - soymilk and Lycium chinense Miller acid bacteria (LAB) biofilms for the control of mixture using a new isolate of Lactobacillus Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, paracasei subsp paracasei NTU101 and and Escherichia coli O157: H7 biofilms formation Bifidobacterium longum Journal of Industrial Frontiers in Microbiology 863 Microbiology and Biotechnology 31(12): 559-564 Guo H., Pan L., Li L., Lu J., Kwok L., Menghe B & Lokuruka M.N.I (2010) Soybean nutritional Zhang W (2017) Characterization of antibiotic properties: The good and the bad about soy foods resistance genes from Lactobacillus isolated from consumption - A review African Journal of Food, traditional dairy products Journal of food science Agriculture, Nutrition and Development 10(4) 82(3): 724-730 Nielsen S.S (2010) Phenol-sulfuric acid method for Hà Duyên Tư (2006) Kỹ thuật phân tích cảm quan total carbohydrates Food analysis laboratory thực phẩm Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật manual pp 47-53 Hati S., Patel N & Mandal S (2018) Comparative Nguyễn Đức Doan & Đỗ Thị Hà (2020) Ảnh hưởng growth behaviour and biofunctionality of lactic của các phương pháp xử lý nhiệt kết hợp với lên acid bacteria during fermentation of soy milk and men đến hàm lượng axit gamma-aminobutyric, axit bovine milk Probiotics and antimicrobial proteins phytic và tính chất lý-hóa của sữa chua đậu nành 10: 277-283 nẩy mầm Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 18(5): 367-377 Horáčková Š., Muehlhansova A., Slukova M., Park M.J & Lee S.Y (2015) Quality characteristics of Schulzová V & Plockova M (2015) Fermentation soy yogurt produced using proteases and mixed of soymilk by yoghurt and bifidobacteria strains microbial consortia Journal of the Korean Society Czech Journal of Food Sciences 33(4): 313-319 for Applied Biological Chemistry 58: 761-769 James C & Natalie S (2014) Microbiology A Trần Văn Điền (2007) Cây đậu tương Nhà xuất laboratory manual Pearson Education bảnNông nghiệp Hà Nội tr 3-4 Korkmaz I.O., Bilici C & Korkmaz S (2021) Sensory, Vinderola G., Ouwehand A, Salminen S Wright A.V pH, synaeresis, water-holding capacity, and microbiological changes in homemade yogurt (2019) Lactic acid bacteria Microbiological and prepared with maca (Lepidium meyenii) powder Functional Aspect 5th edition CRC Press 764p and propolis extract International Journal of Gastronomy and Food Science 23: 100291 Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến & Nguyễn Thị Thanh Thủy (2022) Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic Li C., Li W., Chen X., Feng M., Rui X., Jiang M & để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Dong M (2014) Microbiological, 20(12): 1581-1590 1326