Kỹ Thuật - Công Nghệ - Báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, luận văn thạc sĩ, nghiên cứu - Nguyên lý kế toán Vietnam J. Agri. Sci. 2016, Vol. 14, No. 5: 772-778 Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 5: 772-778 www.vnua.edu.vn 772 PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨ N NỘI SINH TỪ RỄ CÂY NHA ĐAM (ALOE VERA) Nguyễn Văn Giang, Trần Thị Đào, Trịnh Thị Thúy An Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Email: nvgiangvnua.edu.vn Ngày gửi bài: 12.11.2015 Ngày chấp nhận: 29.05.2016 TÓM TẮT Thực vật có mối quan hệ rất chặt chẽ với vi sinh vật đặc biệt là các vi khuẩn nội sinh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vi khuẩn nội sinh có tác động thúc đẩy tăng trưởng thực vật và kiểm soát sinh học đối với các tác nhân gây bệnh trên thực vật. Vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ nhiều loài thực vật trong đó bao gồm cả các cây trồng nông nghiệp và cây cỏ dại. Tuy nhiên, nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây nha đam (Aloe vera) còn hạn chế. Trong nghiên cứu này, 14 chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ cây nha đam được thu thập ở ba vùng khác nhau đã được phân lập trên môi trường NA. 2 chủng trong số 14 chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được có khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn là TB2 và TQ5, riêng chủng TQ5 có khả năng kháng vi khuẩn Burkholderia glumae. Chủng PT11 và TQ3 vừa có khả năng phân giải phosphate khó tan vừa có khả năng sinh IAA với hàm lượng cao. Điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp nhất cho sự sản sinh IAA của hai chủng vi khuẩn nội sinh này là 35oC và pH 6. Từ khóa: IAA, vi khuẩn đối kháng, vi khuẩn nội sinh. Isolation and Characteristics of Some Bacterial Endophytes from Root of Aloe Vera ABSTRACT Plants interact closely with microorganisms, especially endophytic bacteria. Many researches showed that endophytic bacteria have positive effect on plant growth and render plants resistance against phytopathogens. Bacterial endophytes have been isolated from different plants, including agricultural crops and wild plants. In this study, 14 bacterial isolates from roots of Aloe vera collected from three different areas in Vietnam were isolated on NA medium. Among them, two isolates, designated as TB2 and TQ5 showed high activity against pathogenic soft rot, Erwinia carotovora. Especially, TQ5 isolate showed resistance against both Burkholderia glumae and Erwinia carotovora, which are two serious plant pathogenic bacteria. The other two isolates, PT11 and TQ3 exhibited phosphate solubilizing capability and IAA producing activity. The optimum temperature and pH for IAA production of these isolates were 35oC and 6.0, respectively. Keywords: Antagonism, endophytic bacteria, IAA. 1. MỞ ĐẦU Vi sinh vêt nội sinh là nhĂng vi sinh vê t liên kết vĆi thăc vêt, sống trong các mô sống cû a cây chû mà không gây ra bçt kĊ tác hä i nào cho cây chû (Ahmed et al., 2012; Hallmann et al., 1997). Các vi sinh vêt nội sinh phổ biến bao gồ m các loài nçm, vi khuèn và xä khuè n, chúng có thể đþĉc phân lêp tÿ các cây trồng nông nghiệ p hay cây có hoang däi, tÿ câ cây một lá mæ m và cây hai lá mæm. Một số vi khuèn nội sinh có khâ nëng thúc đèy tëng trþćng thăc vêt và kiể m soát sinh học vĆi các tác nhân gây bệnh. Khâ nëng thúc đèy tëng trþćng thăc vêt có thể thông qua việc cung cçp các chçt dinh dþĈng cho cây, điều hña các phytohormone, hay làm tëng tính Nguyễn Văn Giang, Trần Thị Đào, Trịnh Thị Thúy An 773 khâ dýng cûa các nguyên tố khoáng. Các nghiên cĀu đã chĀng minh nhiều vi khuèn nộ i sinh có khâ nëng cố đðnh N2, tổng hĉ p indole-3-acetic acid, sâ n sinh siderophore, ACC deaminase và phân giâi phosphate khó tan. Bên cänh đò, vi khuèn nội sinh có khâ nëng kiểm soát sinh họ c vĆi các loäi nçm, vi khuèn và tuyế n trùng gây bệnh trên thăc vêt. Do đò, khi cþ trú trong mô thăc vêt, vi sinh vêt nội sinh đem lä i cho cây trồng nhiều điều kiện thuên lĉi giúp cây trồ ng phát triển tốt ( Dhanya and Padmavathy, 2014). Tÿ nhĂng lĉi ích và tiềm nëng to lĆn cû a các vi sinh vêt nội sinh, việc tìm kiếm và đánh giá đặc điểm cûa các vi sinh vêt nội sinh là một hþĆng đi đúng đín trong công cuộc phát triển một nề n nông nghiệp säch và bền vĂng Nha đam (Aloe vera) đþĉc biết đến là cây dþĉc liệu quý, có chĀa rçt nhiều hĉp chç t sinh học có tiềm nëng và đã đþĉc sā dýng phổ biế n trong ngành công nghiệp dþĉc, công nghiệp thă c phèm và mỹ phèm. LĆp gel bên trong lá cây nha đam chĀa nhiều hĉp chçt phenol nhþ aloin-A, aloesin, isoaloeresin D, aloesin E đþĉc Āng dýng trong điều trð bệnh ung bþĆu, bệnh tiểu đþą ng, viêm loét và bệnh ung thþ (Mamta Gupta et al ., 2012). Ở nþĆc ta, cåy nha đam chû yếu đþĉ c trồng trên nhĂng vùng đçt cát và đç t pha cát ven biển kém màu mĈ, canh tác các cây trồ ng khác kém hiệu quâ. Nhiều nhóm vi sinh vêt có vai trñ đa däng trong sinh lý học thăc vêt có thể đþĉc phát hiện tÿ cây nha đam. Tuy nhiên, đặc tính thúc đèy tëng trþćng thăc vêt cûa vi khuè n nội sinh tÿ cåy nha đam vén chþa đþĉ c nghiên cĀu đæy đû. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Rễ cåy nha đam khóe mänh đþĉc thu thê p tÿ các vùng: Phú Thọ , Thái Bình, Tuyên Quang. Méu vi khuèn gây bệnh cåy đþĉc cung cçp tÿ bộ sþu têp giống cûa Bộ môn Vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam: Erwinia carotovora ATCC 15713 tác nhân gây bệnh thối nhün, Burkholderia glumae gây bệnh đen lép hät lúa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập vi khuẩn nộ i sinh (Justin and Christopher, 2003) Méu rễ cåy sau khi đþĉc thu thêp đþĉc rāa dþĆi vñi nþĆc chây để loäi bó đçt và sau đò đþĉ c cít thành các lát nhó. Lát cít rễ sau đò đþĉ c ngâm trong ethanol 99 trong 1 phút, rāa lä i méu bìng nþĆc cçt vô trùng 1 læn sau đò tiế n hành khā trùng vĆi natri hypoclorit 3,125 trong 6 phút, rāa méu bìng nþĆc cç t vô trùng 1 læn, ngâm mé u trong ethanol 99 trong vòng 30 giây, rāa méu bìng nþĆc cçt vô trùng 1læn. Méu sau khi khā trùng đþĉc kiểm tra să vô trùng bề mặt bìng cách lçy 0,1ml nþĆc rāa méu læn cuối cùng cçy trang trên đïa petri chĀa môi trþąng NA (peptone 0,5, cao thðt bò 0,2, cao nçm men (yeast extract) 0,3, NaCl 0,5, agar 1,8, pH = 7), û méu ć 30°C và quan sát să phát triển cûa vi khuèn sau 2 ngày. Nếu không có să phát triển cûa vi khuèn và nçm trong thā nghiệm này chĀng tó việc khā trùng đã loäi bó hoàn toàn các vi sinh vêt trên bề mặt rễ. Méu rễ nha đam sau khi khā trùng xong đþĉc thçm khô và cçy trên môi trþąng NA ć 30°C trong 2 ngày để phân lêp vi khuèn nội sinh. 2.2.2. Đánh giá một số đặc điểm sinh học của các chủng phân lập được Đặc điểm sinh hóa: Khâ nëng di độ ng (Elbeltagy et al., 2000): Mỗi chûng vi khuèn đþĉc cçy vào giếng ć trung tâm c ûa đïa môi trþąng NA (nutrent agar) bán rín (0,2 agar) ć 30°C, quan sát să khuếch tán cûa vi khuè n sau 24 gią. Hoät tính cellulase đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp cûa Singh et al., (2013) trên môi trþąng có bổ sung cĄ chçt CMC 1, dung dðch đệm citrate, û ć 37°C, sā dýng dung dð ch lugol 1X làm thuốc nhuộm; Hoät tính pectinase đþĉc xác đðnh theo phþĄng pháp cûa Cotty et al. (1990) trên môi trþąng chĀa 1g pectin, 2g agar pha trong 100ml đệm phosphate pH = 7, û ć 37°C, sā dýng dung dðch lugol 1X làm thuố c nhuộm. Khâ nëng phån giâ i phosphate khó tan (Singh et al., 2013): Chûng vi khuèn đþĉc cç y chçm điểm trên đïa môi trþą ng Pikovaskya (1 Glucose; 0,5 Ca3(PO4)2; 0,05 (NH4)2SO4 ; 0,02 NaCl; 0,01 MgSO4.7H2O; 0,02 KCl; 0,05 yeast extract; 0,0002 MnSO4.H2O; Phân lập và đánh giá đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ cây nha đam (Aoe vera) 774 0,0002 FeSO4.7H2O, 2 agar, pH = 7) ć 30o C trong 3 ngày. Chûng vi khuèn có khâ nëng phån giâi phosphate khó tan sẽ tä o vòng sáng xung quanh khuèn läc. 2.2.3. Khảo sát khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn phân lập (Glickmann and Dessaux, 1995) Hàm lþĉng IAA sinh ra đþĉc xác đðnh bìng phþĄng pháp so màu sā dýng thuốc thā Salkowski (300ml H2SO4 98, 15ml FeCl3 0,5M). Các chûng vi khuèn đþĉc nuôi trong môi trþąng NA có bổ sung 0,1 tryptophan, 30°C, líc 200 vòngphút. Sau 48h, dðch vi khuèn đþĉc ly tâm 5.500 vòng phút trong 5 phút, thu dðch trong. 1ml dðch trong đþĉc bổ sung thêm 2ml thuốc thā Salkowski, líc đều, để trong bóng tối trong 20 phút ć nhiệt độ phòng. Dung dðch đþĉc so màu ć bþĆc sòng 530nm. Hàm lþĉng IAA trong dung dðch đþĉc xác đðnh thông qua đþąng chuèn sā dýng chçt chuèn là IAA (Merck), vĆi dâi nồng độ læn lþĉt là 0, 5, 10, 20, 30, 40 và 50 μgml. 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh IAA của các chủng phân lập Các chûng vi khuèn chọn lọc đþĉc nuôi cçy trên môi trþąng NA lóng có bổ sung L-Tryptophan (100 mgl) trong hai ngày ć các mĀc nhiệt độ (25, 30, 35°C) và dâi pH (4-8). Sau đò tiến hành xác đðnh hàm lþĉng IAA sinh ra. Khâo sát khâ nëng đối kháng cûa các chûng vi khuèn phân lêp vĆi một số vi khuèn gây bệnh cåy theo phþĄng pháp thói thäch (Nguyễn Lân Düng và Phäm Thð Trân Châu, 1978) Vi khuèn nội sinh đþĉc cçy đều trên đïa petri chĀa môi trþąng NA. Sau 2 ngày nuôi cçy, thói thäch vi khuèn đþĉc cçy vào đïa petri chĀa môi trþąng LB đã đþĉc cçy trâi vi khuèn gây bệnh cây û ć nhiệt độ 4 - 8°C trong khoâng 4 - 8 gią để chçt kháng khuèn khuếch tán vào môi trþąng, sau đò nuôi cçy ć 37°C và quan sát kết quâ sau 16h. 3. KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN 3.1. Một số đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập Tÿ các méu rễ cåy nha đam thu đþĉc ć ba vùng Phú Thọ, Tuyên Quang, Thái Bình, chúng tôi đã phån lêp đþĉc 14 méu vi khuèn nội sinh đþĉc gọi là chûng phân lêp (Bâng 1). Các chûng này đþĉc ký hiệu theo đða điểm lçy méu và đþĉc đánh số thĀ tă. Các chûng vi khuèn nội sinh phân lêp đþĉc có hình thái, kích thþĆc khuèn läc và màu síc đa däng. Các khuèn läc đều có bề mặt trĄn, trñn đều hoặc lþĉn sóng; màu tríng, tríng đýc, màu vàng nhät, vàng cam hoặc màu nâu. Trong số 14 chûng phân lêp đþĉc có 12 chûng là trăc khuèn, 2 chûng là cæu khuèn; có 3 vi khuèn Gram âm và 11 vi khuèn Gram dþĄng. Các chûng phân lêp đþĉc có khuèn läc trñn đều, màu tríng và vàng chiếm đa số. Tế bào cûa đa số các chûng này có hình que, ngín. Kết quâ này phù hĉp vĆi các nghiên cĀu khác về đặc điềm hình thái cûa một số vi khuèn nội sinh. Nguyễn HĂu Hiệp và cs. (2008) đã báo cáo khuèn läc cûa các vi khuèn nội sinh đþĉc phân lêp tÿ cây mía có däng tròn, mép khuèn läc nguyên, đa số có màu vàng cam, một số dòng có màu vàng nhät và đa số có däng que ngín. Kết quâ nghiên cĀu cûa LþĄng Thð Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011) cüng báo cáo về đặc điểm hình thái cûa vi khuèn nội sinh và có să tþĄng đồng vĆi hình thái cûa các vi khuèn phân lêp đþĉc trong nghiên cĀu này.Singh et al. (2013) đã báo cáo về đặc điểm hình thái cûa vi khuèn nội sinh nhþ khuèn läc có däng tròn, rìa tròn đều hoặc lþĉn sóng, hình thái tế bào chiếm phæn lĆn là trăc khuèn ngín. Khâ nëng di động cüng nhþ việc thể hiệ n hoät tính cellulase, hoät tính pectinase là nhĂng đặc điểm si...
Trang 1PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
NỘI SINH TỪ RỄ CÂY NHA ĐAM (ALOE VERA)
Nguyễn Văn Giang*, Trần Thị Đào, Trịnh Thị Thúy An
Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Email*: nvgiang@vnua.edu.vn
Ngày gửi bài: 12.11.2015 Ngày chấp nhận: 29.05.2016
TÓM TẮT
Thực vật có mối quan hệ rất chặt chẽ với vi sinh vật đặc biệt là các vi khuẩn nội sinh Nhiều nghiên cứu đã chỉ
ra rằng, vi khuẩn nội sinh có tác động thúc đẩy tăng trưởng thực vật và kiểm soát sinh học đối với các tác nhân gây bệnh trên thực vật Vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ nhiều loài thực vật trong đó bao gồm cả các cây trồng
nông nghiệp và cây cỏ dại Tuy nhiên, nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây nha đam (Aloe vera) còn hạn chế
Trong nghiên cứu này, 14 chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ cây nha đam được thu thập ở ba vùng khác nhau đã được phân lập trên môi trường NA 2 chủng trong số 14 chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được có khả năng đối kháng với
vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn là TB2 và TQ5, riêng chủng TQ5 có khả năng kháng vi khuẩn
Burkholderia glumae Chủng PT11 và TQ3 vừa có khả năng phân giải phosphate khó tan vừa có khả năng sinh IAA với hàm lượng cao Điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp nhất cho sự sản sinh IAA của hai chủng vi khuẩn nội sinh này
là 35oC và pH 6
Từ khóa: IAA, vi khuẩn đối kháng, vi khuẩn nội sinh
Isolation and Characteristics of Some Bacterial Endophytes from Root of Aloe Vera
ABSTRACT
Plants interact closely with microorganisms, especially endophytic bacteria Many researches showed that endophytic bacteria have positive effect on plant growth and render plants resistance against phytopathogens Bacterial endophytes have been isolated from different plants, including agricultural crops and wild plants In this
study, 14 bacterial isolates from roots of Aloe vera collected from three different areas in Vietnam were isolated on
NA medium Among them, two isolates, designated as TB2 and TQ5 showed high activity against pathogenic soft rot,
Erwinia carotovora Especially, TQ5 isolate showed resistance against both Burkholderia glumae and Erwinia carotovora, which are two serious plant pathogenic bacteria The other two isolates, PT11 and TQ3 exhibited
phosphate solubilizing capability and IAA producing activity The optimum temperature and pH for IAA production of these isolates were 35oC and 6.0, respectively
Keywords: Antagonism, endophytic bacteria, IAA
1 MỞ ĐẦU
Vi sinh vêt nội sinh là nhĂng vi sinh vêt
liên kết vĆi thăc vêt, sống trong các mô sống cûa
cây chû mà không gây ra bçt kĊ tác häi nào cho
cây chû (Ahmed et al., 2012; Hallmann et al.,
1997) Các vi sinh vêt nội sinh phổ biến bao gồm
các loài nçm, vi khuèn và xä khuèn, chúng có
thể đþĉc phân lêp tÿ các cây trồng nông nghiệp hay cây có hoang däi, tÿ câ cây một lá mæm và cây hai lá mæm Một số vi khuèn nội sinh có khâ nëng thúc đèy tëng trþćng thăc vêt và kiểm soát sinh học vĆi các tác nhân gây bệnh Khâ nëng thúc đèy tëng trþćng thăc vêt có thể thông qua việc cung cçp các chçt dinh dþĈng cho cây, điều hña các phytohormone, hay làm tëng tính
Trang 2khâ dýng cûa các nguyên tố khống Các nghiên
cĀu đã chĀng minh nhiều vi khuèn nội sinh cĩ
acid, sân sinh siderophore, ACC deaminase và
phân giâi phosphate khĩ tan Bên cänh đị, vi
khuèn nội sinh cĩ khâ nëng kiểm sốt sinh học
vĆi các lội nçm, vi khuèn và tuyến trùng gây
bệnh trên thăc vêt Do đị, khi cþ trú trong mơ
thăc vêt, vi sinh vêt nội sinh đem läi cho cây
trồng nhiều điều kiện thuên lĉi giúp cây trồng
Tÿ nhĂng lĉi ích và tiềm nëng to lĆn cûa các vi
sinh vêt nội sinh, việc tìm kiếm và đánh giá đặc
điểm cûa các vi sinh vêt nội sinh là một hþĆng
đi đúng đín trong cơng cuộc phát triển một nền
nơng nghiệp säch và bền vĂng
Nha đam (Aloe vera) đþĉc biết đến là cây
dþĉc liệu quý, cĩ chĀa rçt nhiều hĉp chçt sinh
học cĩ tiềm nëng và đã đþĉc sā dýng phổ biến
trong ngành cơng nghiệp dþĉc, cơng nghiệp thăc
phèm và mỹ phèm LĆp gel bên trong lá cây nha
đam chĀa nhiều hĉp chçt phenol nhþ aloin-A,
aloesin, isoaloeresin D, aloesin E đþĉc Āng dýng
trong điều trð bệnh ung bþĆu, bệnh tiểu đþąng,
viêm loét và bệnh ung thþ (Mamta Gupta et al.,
2012) Ở nþĆc ta, cåy nha đam chû yếu đþĉc
trồng trên nhĂng vùng đçt cát và đçt pha cát
ven biển kém màu mĈ, canh tác các cây trồng
khác kém hiệu quâ Nhiều nhĩm vi sinh vêt cĩ
vai trđ đa däng trong sinh lý học thăc vêt cĩ thể
đþĉc phát hiện tÿ cây nha đam Tuy nhiên, đặc
tính thúc đèy tëng trþćng thăc vêt cûa vi khuèn
nội sinh tÿ cåy nha đam vén chþa đþĉc nghiên
cĀu đỉy đû
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu
Rễ cåy nha đam khĩe mänh đþĉc thu thêp
tÿ các vùng: Phú Thọ, Thái Bình, Tuyên Quang
Méu vi khuèn gây bệnh cåy đþĉc cung cçp tÿ bộ
sþu têp giống cûa Bộ mơn Vi sinh, Khoa Cơng
nghệ sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam:
Erwinia carotovora ATCC 15713 tác nhân gây
bệnh thối nhün, Burkholderia glumae gây bệnh
đen lép hät lúa
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh (Justin and Christopher, 2003)
Méu rễ cåy sau khi đþĉc thu thêp đþĉc rāa dþĆi vđi nþĆc chây để lội bĩ đçt và sau đị đþĉc cít thành các lát nhĩ Lát cít rễ sau đị đþĉc ngâm trong ethanol 99% trong 1 phút, rāa läi méu bìng nþĆc cçt vơ trùng 1 lỉn sau đị tiến hành khā trùng vĆi natri hypoclorit 3,125% trong 6 phút, rāa méu bìng nþĆc cçt vơ trùng 1 lỉn, ngâm méu trong ethanol 99% trong vịng 30 giây, rāa méu bìng nþĆc cçt vơ trùng 1lỉn Méu sau khi khā trùng đþĉc kiểm tra să vơ trùng bề mặt bìng cách lçy 0,1ml nþĆc rāa méu lỉn cuối cùng cçy trang trên đïa petri chĀa mơi trþąng
NA (peptone 0,5%, cao thðt bị 0,2%, cao nçm men (yeast extract) 0,3%, NaCl 0,5%, agar 1,8%,
pH = 7), û méu ć 30°C và quan sát să phát triển cûa vi khuèn sau 2 ngày Nếu khơng cĩ să phát triển cûa vi khuèn và nçm trong thā nghiệm này chĀng tĩ việc khā trùng đã lội bĩ hồn tồn các vi sinh vêt trên bề mặt rễ Méu rễ nha đam sau khi khā trùng xong đþĉc thçm khơ và cçy trên mơi trþąng NA ć 30°C trong 2 ngày để phân lêp vi khuèn nội sinh
2.2.2 Đánh giá một số đặc điểm sinh học của các chủng phân lập được
Đặc điểm sinh hĩa: Khâ nëng di động
(Elbeltagy et al., 2000): Mỗi chûng vi khuèn
đþĉc cçy vào giếng ć trung tâm cûa đïa mơi trþąng NA (nutrent agar) bán rín (0,2% agar) ć 30°C, quan sát să khuếch tán cûa vi khuèn sau
24 gią Hột tính cellulase đþĉc xác đðnh theo
phþĄng pháp cûa Singh et al., (2013) trên mơi
trþąng cĩ bổ sung cĄ chçt CMC 1%, dung dðch đệm citrate, û ć 37°C, sā dýng dung dðch lugol 1X làm thuốc nhuộm; Hột tính pectinase đþĉc
xác đðnh theo phþĄng pháp cûa Cotty et al
(1990) trên mơi trþąng chĀa 1g pectin, 2g agar pha trong 100ml đệm phosphate pH = 7, û ć 37°C, sā dýng dung dðch lugol 1X làm thuốc nhuộm Khâ nëng phån giâi phosphate khĩ tan
(Singh et al., 2013): Chûng vi khuèn đþĉc cçy
chçm điểm trên đïa mơi trþąng Pikovaskya (1%
Trang 30,0002% FeSO4.7H2O, 2% agar, pH = 7) ć 30oC
trong 3 ngày Chûng vi khuèn cĩ khâ nëng phån
giâi phosphate khĩ tan sẽ täo vịng sáng xung
quanh khuèn läc
2.2.3 Khảo sát khả năng sinh IAA của các
chủng vi khuẩn phân lập (Glickmann and
Dessaux, 1995)
Hàm lþĉng IAA sinh ra đþĉc xác đðnh bìng
phþĄng pháp so màu sā dýng thuốc thā
0,5M) Các chûng vi khuèn đþĉc nuơi trong mơi
trþąng NA cĩ bổ sung 0,1% tryptophan, 30°C,
líc 200 vịng/phút Sau 48h, dðch vi khuèn đþĉc
ly tâm 5.500 vịng/ phút trong 5 phút, thu
dðch trong
1ml dðch trong đþĉc bổ sung thêm 2ml
thuốc thā Salkowski, líc đều, để trong bĩng tối
trong 20 phút ć nhiệt độ phịng Dung dðch đþĉc
so màu ć bþĆc sịng 530nm Hàm lþĉng IAA
trong dung dðch đþĉc xác đðnh thơng qua đþąng
chuèn sā dýng chçt chuèn là IAA (Merck), vĆi
dâi nồng độ lỉn lþĉt là 0, 5, 10, 20, 30, 40
và 50 µg/ml
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và
pH đến khả năng sinh IAA của các chủng
phân lập
Các chûng vi khuèn chọn lọc đþĉc nuơi cçy
trên mơi trþąng NA lĩng cĩ bổ sung
L-Tryptophan (100 mg/l) trong hai ngày ć các
mĀc nhiệt độ (25, 30, 35°C) và dâi pH (4-8) Sau
đị tiến hành xác đðnh hàm lþĉng IAA sinh ra
Khâo sát khâ nëng đối kháng cûa các chûng
vi khuèn phân lêp vĆi một số vi khuèn gây bệnh
cåy theo phþĄng pháp thĩi thäch (Nguyễn Lân
Düng và Phäm Thð Trân Châu, 1978)
Vi khuèn nội sinh đþĉc cçy đều trên đïa
petri chĀa mơi trþąng NA Sau 2 ngày nuơi cçy,
thĩi thäch vi khuèn đþĉc cçy vào đïa petri chĀa
mơi trþąng LB đã đþĉc cçy trâi vi khuèn gây
bệnh cây û ć nhiệt độ 4 - 8°C trong không 4 - 8
gią để chçt kháng khuèn khuếch tán vào mơi
trþąng, sau đị nuơi cçy ć 37°C và quan sát kết
quâ sau 16h
3 KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN
3.1 Một số đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập
Tÿ các méu rễ cåy nha đam thu đþĉc ć ba vùng Phú Thọ, Tuyên Quang, Thái Bình, chúng tơi đã phån lêp đþĉc 14 méu vi khuèn nội sinh đþĉc gọi là chûng phân lêp (Bâng 1)
Các chûng này đþĉc ký hiệu theo đða điểm lçy méu và đþĉc đánh số thĀ tă Các chûng vi khuèn nội sinh phân lêp đþĉc cĩ hình thái, kích thþĆc khuèn läc và màu síc đa däng Các khuèn läc đều cĩ bề mặt trĄn, trđn đều hoặc lþĉn sĩng; màu tríng, tríng đýc, màu vàng nhät, vàng cam hoặc màu nâu Trong số 14 chûng phân lêp đþĉc cĩ 12 chûng là trăc khuèn, 2 chûng là cỉu khuèn; cĩ 3 vi khuèn Gram âm và 11 vi khuèn Gram dþĄng Các chûng phân lêp đþĉc cĩ khuèn läc trđn đều, màu tríng và vàng chiếm đa số Tế bào cûa đa số các chûng này cĩ hình que, ngín Kết quâ này phù hĉp vĆi các nghiên cĀu khác về đặc điềm hình thái cûa một số vi khuèn nội sinh Nguyễn HĂu Hiệp và cs (2008) đã báo cáo khuèn läc cûa các vi khuèn nội sinh đþĉc phân lêp tÿ cây mía cĩ däng trịn, mép khuèn läc nguyên, đa số cĩ màu vàng cam, một số dịng cĩ màu vàng nhät và đa số cĩ däng que ngín Kết quâ nghiên cĀu cûa LþĄng Thð Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011) cüng báo cáo về đặc điểm hình thái cûa vi khuèn nội sinh và cĩ să tþĄng đồng vĆi hình thái cûa các vi khuèn phân lêp đþĉc trong nghiên cĀu này.Singh et al (2013)
đã báo cáo về đặc điểm hình thái cûa vi khuèn nội sinh nhþ khuèn läc cĩ däng trịn, rìa trịn đều hoặc lþĉn sĩng, hình thái tế bào chiếm phỉn lĆn là trăc khuèn ngín
Khâ nëng di động cüng nhþ việc thể hiện hột tính cellulase, hột tính pectinase là nhĂng đặc điểm sinh hĩa quan trọng giúp vi khuèn nội sinh cĩ thể xâm nhêp và di chuyển bên trong mơ thăc vêt Trong số 14 chûng vi khuèn nội sinh phân lêp đþĉc cĩ 8 chûng cĩ khâ nëng di động: PT11, PT17, TB2, TB17, TQ3, TQ4, TQ6 và TQ8; 5 chûng cĩ hột tính cellulose: PT2, PT5, TB2, TQ3 và TQ5, chỵ cĩ 2 chûng cĩ hột tính pectinase: TQ3 và TQ4 (Bâng 2)
Trang 4Bâng 1 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập
Chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào Nhuộm
Gram
Bề mặt Đặc tính quang học Mép khuẩn lạc Màu sắc
PT2 Trơn nhầy Đục Tròn đều Vàng nhạt Trực khuẩn ngắn + PT5 Trơn bóng Đục Lượn sóng Nâu Trực khuẩn ngắn + PT11 Trơn bóng Trong Tròn đều Trắng Trực khuẩn ngắn - PT17 Trơn bóng Đục Tròn đều Vàng nhạt Cầu khuẩn + TB2 Trơn bóng Đục Lượn sóng Vàng nhạt Trực khuẩn ngắn + TB7 Trơn bóng Đục Lượn sóng Nâu Trực khuẩn ngắn + TB8 Trơn bóng Đục Tròn đều Trắng đục Trực khuẩn ngắn + TB17 Trơn bóng Đục Tròn đều Trắng Trực khuẩn ngắn + TB18 Trơn bóng Đục Tròn đều Nâu Trực khuẩn ngắn + TQ3 Trơn nhầy Trong Tròn đều Vàng cam Trực khuẩn ngắn + TQ4 Trơn bóng Trong Tròn đều Trắng đục Trực khuẩn ngắn + TQ5 Trơn nhầy Đục Tròn đều Vàng nhạt Cầu khuẩn - TQ6 Trơn nhầy Trong Tròn đều Trắng đục Trực khuẩn ngắn - TQ8 Trơn nhầy Đục Lượn sóng Trắng đục Trực khuẩn ngắn +
Chú thích: (+) bắt màu thuốc nhuộm Gram; (-) không bắt màu thuốc nhuộm Gram
Bâng 2 Một số đặc điểm đặc trưng của các chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập
Chủng
Đặc điểm hóa sinh
Cellulase Pectinase Khả năng di động Khả năng phân giải phosphate khó tan Khả năng sinh IAA
Ghi chú: (+) có hoạt tính; (-) không có hoạt tính
Đối vĆi các vi khuèn thúc đèy tëng trþćng
thăc vêt, khâ nëng phån giâi phosphate khó tan
đþĉc xem là một trong nhĂng đặc tính quan
trọng liên quan đến nguồn dinh dþĈng cûa cây
trồng Trong số 14 chûng vi khuèn nội sinh phân lêp đþĉc có 8 chûng vi khuèn thể hiện khâ nëng phån giâi phosphate khó tan (Bâng 2): PT2, PT11, TB7, TB17, TB18, TQ3, TQ5 và
Trang 5TQ6 Cao Ngọc Điệp và Phan Thð Nhã (2011) đã
phân lêp đþĉc 45 chûng vi khuèn nội sinh tÿ
cây dĀa cĩ khâ nëng hđa tan lån khị tan
IAA là một hormone sinh trþćng ć thăc vêt
thuộc nhĩm auxin, gĩp phỉn quan trọng vào
kích thích sinh trþćng cûa cây trồng bìng cách
tëng să phát triển cûa rễ, số lþĉng rễ (Dhanya
and Padmavathy, 2014) Trong số 14 chûng vi
khuèn nội sinh phân lêp đþĉc cĩ 5 chûng cĩ khâ
nëng sân sinh IAA Bìng phþĄng pháp so màu
Salkovski, xác đðnh đþĉc hai chûng PT11 và
TQ3 cĩ khâ nëng sinh IAA mänh nhçt vĆi hàm
lþĉng IAA sân sinh ra mơi trþąng sau 6 ngày
nuơi cçy Chúng tơi tiến hành khâo sát tác động
cûa nhiệt độ và pH mơi trþąng nuơi cçy tĆi khâ
nëng tổng hĉp IAA cûa hai chûng này
Nhiệt độ và pH là các tác nhân vêt lý khơng
nhĂng ânh hþćng đến sinh trþćng cûa vi khuèn
mà cịn ânh hþćng sâu síc tĆi khâ nëng sinh ra
các chçt cĩ hột tính sinh học cûa chúng Do đị,
việc xác đðnh ânh hþćng cûa nhiệt độ và pH mơi
trþąng đến khâ nëng sinh IAA cûa các chûng vi
khuèn phân lêp đþĉc là cỉn thiết
Sau 4 - 5 ngày nuơi líc ć các mĀc nhiệt độ
nghiên cĀu (25, 30 và 35°C) trong tối, hàm
lþĉng IAA trong dðch nuơi đþĉc xác đðnh Khâ
nëng sinh IAA cûa chûng PT11 và TQ3 đều đät
cao nhçt khi nuơi ć 35°C, đät lỉn lþĉt là
36,32 µg/ml và 16,49 µg/ml; khi nuơi ć 25°C hai
chûng này sinh IAA thçp nhçt (Hình 2a) Điều
này cĩ thể đþĉc giâi thích do các chûng vi khuèn
này đþĉc phân lêp tÿ cåy nha đam, một lồi cây
chðu đþĉc nhiệt độ cao và thþąng đþĉc trồng ć nhĂng khu văc cị điều kiện khí hêu níng nĩng
So vĆi lþĉng IAA đþĉc tổng hĉp bći các chûng vi khuèn nội sinh tÿ cåy đêu (Pham Quang Hung and Annapurna, 2004) thì các chûng chûng tơi phân lêp đþĉc cĩ thể tổng hĉp đþĉc IAA vĆi hàm lþĉng tþĄng đþĄng và cao hĄn một chút, tuy nhiên vén thçp hĄn kết quâ thu đþĉc bći
Tsavkelova et al (2007)
Chûng PT11 và TQ3 đều cĩ khâ nëng sinh IAA cao khi nuơi trong mơi trþąng cĩ dâi pH rộng tÿ 5,0 đến 8,0; trong đị hàm lþĉng IAA đät cao nhçt khi nuơi hai chûng này ć mơi trþąng cĩ
pH 6,0, đät là 23,23 µg/ml (PT11) và chûng TQ3
là 17,18 µg/ml (Hình 2b)
3.2 Khâ năng đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh với các chủng vi khuẩn gây bệnh cây
Vi khuèn nội sinh đþĉc biết đến nhþ là nhân tố kiểm sốt sinh học vĆi các tác nhân gây bệnh häi thăc vêt (Berg and Hallmann, 2006;
Scherwinski et al., 2008; Malfanova et al.,
2011) Chúng tơi đánh giá khâ nëng Āc chế să phát triển cûa vi khuèn gây bệnh thối nhün và gây lem lép hät cûa 14 chûng vi khuèn nội sinh mĆi phân lêp Kết quâ 2 chûng trong số 14 chûng vi khuèn nội sinh phân lêp đþĉc cĩ khâ
nëng đối kháng vĆi vi khuèn Erwinia carotovora
ATCC 15713 gây bệnh thối nhün là TB2 và TQ5, riêng chûng TQ5 cĩ khâ nëng kháng vi
khuèn Burkholderia glumae (Bâng 3)
Hình 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ (a)
và pH (b) đến khâ năng sinh IAA của chủng PT11 và TQ3
0
10
20
30
40
50
Nhiệt độ, 0C
25 30 35
0 5 10 15 20 25 30
pH
PT11 TQ3
Trang 6Bâng 3 Khâ năng kháng vi khuẩn gây bệnh cây của các chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập
VKNS Erwinia carotovora TCC 15713 Burkholderia glumae
Ghi chú: VKNS-vi khuẩn nội sinh; (+) cĩ khả năng đối kháng; (-) khơng cĩ khả năng đối kháng
Vi khuèn Erwinia carotovora gây bệnh trên
nhiều đối tþĉng cây trồng nhþ khoai tåy, cà rốt,
dþa chuột và cà chua làm ânh hþćng đáng kể
đến nëng suçt và chçt lþĉng nơng sân Trong
khi đị, vi khuèn Burkholderia glumae gây lép
hät và làm thối thân, gốc lúa làm ânh hþćng rçt
lĆn đến sân lþĉng lúa Các biện pháp phịng trÿ
chû yếu vén là sā dýng các lội thuốc hĩa học
kết hĉp vĆi các biện pháp canh tác hĉp lċ Do đị,
việc tìm ra đþĉc 2 chûng vi khuèn nội sinh cĩ
khâ nëng kiểm sốt sinh học vĆi vi khuèn
Burkholderia glumae và Erwinia carotovora cĩ
ċ nghïa thăc tế lĆn, cĩ tiềm nëng để Āng dýng
làm chế phèm sinh học gĩp phỉn xây dăng một
nền nơng nghiệp säch và bền vĂng
4 KẾT LUẬN
Tÿ các méu rễ cåy nha đam khác nhau,
chúng tơi đã phån lêp đþĉc 14 chûng vi khuèn
nội sinh; trong đị chûng PT11 và TQ3 biểu hiện
khâ nëng phån giâi phosphate khĩ tan và khâ
nëng sinh IAA vĆi hàm lþĉng cao Điều kiện
nhiệt độ và pH thích hĉp nhçt cho să sân sinh
IAA cûa hai chûng vi khuèn nội sinh này là 35°C và pH = 6
Trong điều kiện phịng thí nghiệm, trong số
14 chûng vi khuèn nội sinh phân lêp đþĉc, chûng
TB2 và TQ5 kháng Erwinia carotovoraATCC
15713, riêng chûng TQ5 cĩ khâ nëng đối kháng
vi khuèn gây Burkholderia glumae
TÀI LIỆU THAM KHÂO Ahmed, M., M Hussain, M K Dhar, S Kaul (2012) Isolation of microbial endophytes from some ethnomedicinal plants of Jammu and Kashmir J Nat Prod Plant Resour., 2(2): 215-220
Berg G., J Hallmann (2006) Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes In: Microbial root endophytes Schulz B, Boyle C, Sieber TN (Eeds.) Springer, Berlin, pp 53-67 Cotty P I., T E Cleveland, R L Brown and Mellon J
production among Aspergillus flavus isolates
Appl Environ Microbio., 56: 3885-3887
Cao Ngọc Diệp và Phan Thị Nhã (2011) Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh trong cây khĩm
(Ananas comosus L.) trồng trên đất phèn thị xã Vị
Trang 7Thanh, tỉnh Hậu Giang Tạp chí Công nghệ Sinh
học, 9(2): 243-250
Dhanya N Nair and S Padmavathy (2014) Impact of
Environment and Humans The Scientific World
Journal, Volume 2014, Article ID 250693, 11
pages, http://dx.doi.org/10.1155/2014/250693
Elbeltagy A, K Nishioka, H Suzuki, T Sato, YI Sato, H
Morisaki, H Mitsui and K Minamisawa (2000)
Isolation and characterization of endophytic
bacteria from wild and traditionally cultivated rice
varieties Soil Sci Plant Nut., 46: 617-629
Glickmann, E and Y Dessaux (1995) A critical
examination of the specificity of the salkowski
reagent for indolic compounds produced by
phytopathogenic bacteria Appl Environ Microbio.,
61(2): 793-796
Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Mahaffee WF and
Kloepper JW (1997).Bacterial endophytes in
Microbiology, 43(10): 895-914
Justin T Coombs and Christopher MM Franco (2003)
Isolation and Identification of Actinobacteria from
Surface-Sterilized Wheat Roots Applied and
enviromental microbiology, pp 5603-5608
Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011) Phân
lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây cúc
xuyến chi (Wedelia trilobata L Hitche.) bằng kỹ
thuật PCR Tạp chí Khoa học, 18a: 168-176
Malfanova N, Kamilova F, Validov S, Shcherbakov A,
Chebotar V, Tikhonovich I, Lugtenberg B (2011)
Characterization of Bacillus subtilis HC8, a novel
plant-beneficial endophytic strain from giant hogweed.Microb Biotech, 4: 523-532
Mamta Gupta, Shashi Kiran, Arvind Gulati, Bikram Singh, Rupinder Tewari (2012) Isolation and identification of phosphate solubilizing bacteria able to enhance the growth and aloin-A
Microbiologycal Research, 167: 358-363
Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978) Một
số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Hữu Hiệp, Renato Fani, Lê Ngọc Thúy, Ngô Bảo Ngọc, Trần Thị Ngọc Tố và Phạm Thị Khánh Vân (2008) Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh
để sản xuất phân vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mía trồng tại tỉnh Sóc Trăng Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, 8: 149-157
Pham Quang Hungand K Annapurna (2004) Isolation and characterization of endophytic bacteria in
soybean (Glycine sp.) Omonrice, 12: 92-101
Scherwinski K, Grosch R, Berg G, (2008) Effect of bacterial antagonists on lettuce: active biocontrol
of Rhizoctonia solani and negligible, short-term effects on non-target microorganisms FEMS Microbiol Eco., 64: 106-16
Singh D, Sharma A & Saini GK (2013) Biochemical and molecular characterisation of the bacterial endophytes from native sugarcane varieties of Himalayan region 3 Biotech., 3(3): 205-212 Tsavkelova E A, Cherdyntseva T A, Botina S G, Netrusov A I (2007) Bacteria associated with orchid roots and microbial productionof auxin Microbiol Res., 162: 69-76