Nội dung: - Phân tích các chỉ tiêu cơ bản của nguyên liệu dịch quả điều; - Khảo sát sự ảnh hưởng của xư lý enzyme đến khả năng khử vị chát trong dịchquả điều, gồm 3 yếu tố: thời gian gi
TỔNG QUAN
Tổng quan về quả điều
1.1.1 Cấu tạo và giá trị của thịt quả điều
Quả điều (Cashew Apple) thuộc họ Đào Lộn Hột hay còn gọi là họ Xoài, là đế hoa hay còn gọi là quả giả của cây điều (Anacardium Occidentale L.) Cây thuộc giới Plantae, bộ Sapinadales, họ Anacarrdiaceae, chi Anacardium Điều hay còn gọi là đào lộn hột là một loại cây công nghiệp dài ngày thuộc họ Xoài Cây này có nguồn gốc từ đông bắc Brasil, nơi nó được gọi bằng tiếng Bồ Đào Nha là Caju hay Cajueiro Ngày nay nó được trồng khắp các khu vực khí hậu nhiệt đới để lấy nhân hạt chế biến làm thực phẩm Cây điều (đào lộn hột) cao từ khoảng 3 - 9m Lá mọc so le, cuống ngắn.
Hoa nhỏ, màu trắng có mùi thơm dịu Quả khô, không tự mở, hình thận, dài 2–3 cm, vỏ ngoài cứng, mặt hõm vào, cuống quả phình to thành hình trái lê hay đào, màu đỏ, vàng hay trắng Do vậy người ta thường có cảm tưởng phần cuống quả phình ra là quả, còn quả thật đính vào là hạt, do đó mà có tên đào lộn hột (tức đào có hột nằm ngoài quả) Hạt hình thận, có chứa dầu béo Phần quả giả có vị chát, ngọt, tùy thuộc vào giống, thời điểm thu hái địa phương trồng điều.
Hạt điều có giá trị thương phẩm cao, phần quả giả rất dễ bị dập cũng như có thời hạn bảo quản không cao, có vị chát không phù hợp với cảm quan của người tiêu dùng.
Giá trị thương phẩm của quả thật cao nên được hái riêng, còn quả giả bị tách khỏi phần
“hạt điều” khi tiếp xúc với môi trường bên ngoài gây khó khăn trong việc bảo quản, thậm chí còn gây ô nhiễm vi sinh.
Thịt quả chín có thể được ăn sống, nấu thành cà ri hoặc lên men thành giấm hoặc đồ uống cồn Tại Campuchia, cây điều được trồng như cây cảnh và được coi như một món cao lương mỹ vị khi ăn cùng với muối Khi sử dụng ăn liền như một loại quả, vị chát của quả có thể được loại bỏ bằng cách hấp quả trong 5 phút trước khi đem đi rửa trong nước lạnh hoặc ngâm trong nước muối nóng trong 5 phút Đôi khi trái giả còn được dùng làm các loại mứt: Jam, Preserve, Chutney ở một số đất nước Đặc biệt các đồ uống có cồn cũng như không có cồn từ thịt quả còn là những sản phẩm truyền thống ở Ấn Độ và Châu Phi Ở Brazil nước quả ép và bã thịt quả điều được sử dụng
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 17 làm đồ ngọt, nước giải khỏt, rượu mạnh cachaỗa Ở Panama thịt điều khi chế biến cùng nước, đường trong một khoảng thời gian dài để tạo thành món tráng miệng dạng Jam mang tờn dulce de maraủún, đụi khi được kết hợp với một số thành phần khỏc như tinh bột để tạo thành dạng bánh
Với mỗi một tấn hạt điều được thu hoạch, ta có tất cả từ 10-15 tấn thịt quả điều và hiện tại ở Việt Nam, thịt quả điều đang được sử dụng như thức ăn gia súc, đặc biệt trên thế giới hơn 80% thịt quả được xử lý như phế phẩm của ngành điều.
Hình 1.1: Cấu tạo quả điều
Thịt quả đã và đang là trung tâm chú ý của các nhà nghiên cứu với những tiềm năng về mặt vi sinh, dinh dưỡng, cảm quan cũng như một loại thực phẩm chức năng, một bài thuốc quý Điều đặc biệt thu hút ở thịt quả chính là sự có mặt của vô vàn chất khoáng và vitamin,… đặc biệt là vitamin C và các polysaccharide.
1.1.2 Các thuộc tính chính của quả điều giả
1.1.2.1 Tính chất hóa lý đa dạng Ảnh hưởng của quá trình thanh trùng lên nước quả
Nước quả sau khi được thanh trùng có lượng đường tổng, đường khử hầu như không đổi Lượng pH, lượng chất khô tổng số, nồng độ axit giảm nhẹ trong giảm nhẹ trong 100 giờ đầu Lượng vitamin C theo thời gian giản đi rất nhanh chóng, đặc biệt là tại 5 tiếng sau khi được thanh trùng (tại 90°C/12s).
Tạo ra các hợp chất thơm
Thịt quả khi chín sinh ra mùi thơm nhẹ nhàng và khi hỏng sẽ tạo ra các mùi khó chịu Hiện đã định lượng được một số hợp chất dễ bay hơi có trong quả điều: 29 hợp
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 18 chất este, 16 hợp chất terpen, 9 hợp chất hydrocarbon, 7 axit carboncyliccx, 7 hợp chất aldehide, 3 hợp chất cồn, 2 hợp chất ketone, 2 lactone và 1 hợp chất norisoprenoid.
Thịt quả điều chín đều thường có hương ngọt hoa quả nhờ hợp chất metyl 3-metyl- trans-2-butenoate và metyl 3-metyl pentanoate Hương lá cây nhờ các aldehyde 5 hoặc 6 carbon như: cis-3-hexenol, hexanal, 2-metyl-2-pentenal, hương thối của quả giả hỏng là của 2-metyl butanoic acid Bên cạnh các hợp chất thơm trong thịt quả, một số nghiên cứu đã định tính được một số tinh dầu trong thịt quả đỏ và vàng Trong đó, axit palmitic, axit oleic có mặt thường xuyên trong trái đỏ, trái vàng và bao gồm các tinh dầu chính như: furfural, axit palmitic, axit 4-hydroxydodecanoic, lactone, (E)-hex-2- enal, (Z)-hex-3-enol và hexadecanol Ảnh hưởng trong quá trình nuôi trồng và bảo quản
Mặc dù là loại quả tuân theo mô hình hô hấp thường biến (non-climateric), nhưng Thịt quả lại có tốc độ hô hấp cao (62-72 ml/kg.h) và lượng gia tăng của etylen ổn định (200-400 ml/kg.h) Lượng etylen và các thành phần dễ bay hơi thoát ra sau thu hoạch giảm mạnh Đi kèm với đó là sự gia tăng đột ngột của acid abscisic ở cuống và toàn bộ quả giả ở cuối quá trình phát triển làm giảm các khoang trống cũng như độ cứng của quả Chính vì lớp da mềm của quả hậu thu hoạch, thịt quả dễ bị tấn công bởi ruồi giấm mang trong nó các bào tử nấm như Rhizopus, Aspergilus và Collectorichum Để giảm nguy cơ xâm hại của các tác nhân gây hại và khử trùng bề mặt các quả giả, ta cần nhúng nhanh thịt quả vào dung dịch 0,25% axit citric hoặc 0,1 % - 0,3% axit ascorbic trước khi ăn tươi cũng như đưa vào quá trình sản xuất
Từ đó, ta thấy một loạt các dấu hiệu về sự biến đổi liên tục của các thông số: hóa học, cảm quan, hóa lý,… của trái điều trong suốt các quá trình: thanh trùng, tiệt trùng, phát triển, chín, thu hái, bảo quản, và các quá trình chế biến khác.
1.1.2.2 Giá trị dinh dưỡng cao Bài thuốc quý với hoạt tính sinh học cao
Thịt quả điều được định danh là một loài cây thuốc có nguồn gốc từ lục địa Nam Mỹ Quả giả với hàm lượng ẩm 65-85%, có thể chiết xuất thành nước quả giàu các chất khoáng, đường, polyphenol và Tannin Trong đó, theo một số nghiên cứu về các giống điều, thịt quả tại Ariyalur, Ấn Độ, tuy trái đỏ có hàm lượng nước và hàm lượng
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 19 chất khoáng cao hơn trái vàng, giá trị dinh dưỡng (hàm lượng đường tổng, đường khử, protein, vitamin C) ở trái vàng lại cao hơn trái đỏ, nhưng nhìn chung các chỉ tiêu dinh dưỡng của cả hai loại thịt quả này đều cao hơn so với của các quả thông thường Bởi vậy, nước thịt quả điều và sản phẩm phụ của chúng là dược phẩm tiềm năng cho các chứng đau nhức cơ bản, cũng như nước giải khát tăng lực cho những ngày nóng bức.
Tiêu thụ nước từ thịt quả điều nguyên chất giúp giảm các bệnh đường ruột mãn tính, giảm rát họng và giảm vôi hóa xương khớp Nhờ các thuộc tính của các chất chát, nước Thịt quả chưng cất được cho là giúp giảm đau thấp khớp và đau dây thần kinh.
Tannin và Tannin trong quả điều
Tannin là một thuật ngữ hóa học có định nghĩa lỏng lẻo, cho đến hiện tại với kiến thức thường thức được mọi người sử dụng, Tannin được biết đến như một tác nhân gây vị chát cũng như hậu vị chát trong một số sản phẩm chè, rượu, các sản phẩm từ hoa quả nói chung, dưới đây là một số định nghĩa về Tannin được tổng hợp lại:
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 25
“Tannin” là thuật ngữ được cho là bắt nguồn từ ngôn ngữ Celtic cổ đại (Trung Âu) mang nghĩa “cây sồi” – nguồn cung cấp nguyên liệu để xử lý thuộc da điển hình (Tannin) Việc dùng các hợp chất hữu cơ này từ gỗ sồi đã giúp cho những bộ lạc từ thời tiền sử cho đến ngành dệt may ngày nay có thể thuộc được da tạo nên các sản phẩm không chỉ giữ ấm cho cơ thể mà còn rất bền theo thời gian và tạo nên các giá trị lớn về mặt thời trang Tuy nhiên, hiện nay, với sự phát triển của khoa học công nghệ, Tannin không còn là hợp chất tiết ra từ cây sồi với chức năng thuộc da, mà nó được nghiên cứu là một hợp chất đa gốc phenol tồn tại trong hầu hết các bộ phận của thực vật như nhành cây, gỗ, lá, quả, hạt, rễ Thông thường, việc tiết ra nhiều Tannin là dấu hiệu ngã bệnh của cây, từ đó ta có thể kết luận rằng: Tannin có vai trò như một hợp chất kháng khuẩn, kháng côn trùng, tác nhân gây hại Tannin thưởng có màu vàng nhạt hoặc bột trắng vô định hình hoặc lấp lánh, gần như không màu, cấu trúc lỏng lẻo với mùi lạ và vị chát.
Dựa trên các công thức cấu tạo cũng như nguồn gốc hiện đã khám phá và vai trò của chúng trong việc sinh trưởng và phát triển của thực vật, Tannin được định nghĩa như các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật, chúng có thể là các este galloyl và các đồng phân của chúng Các gốc galloyl sẽ gắn vào các gốc polyol, catechin và các hợp chất triterpenoid, bởi vậy có thể nói Tannin là các chuỗi proanthocyanidin kết nối với nhau bởi các liên kết polymer, trong đó các gốc flavanyl thường được kết nối với các gốc thay thế khác Các liên kết trong Tannin có thể bị phân cắt bởi axit, bazo, hoặc một số enzyme, trong đó galloTannin (thuộc nhóm Tannin thủy phân) sau khi được thủy phân sẽ tạo thành glucose và axit gallic Về công thức cấu tạo, Tannin ngoài việc là một hợp chất polyphenol cao phân tử ra, không có các danh pháp rõ ràng về các gốc còn lại của chúng, thậm chí vẫn còn nhiều hợp chất Tannin đang được tranh cãi bởi không phải tất cả những chất polyphenol có khả năng thuộc được da là Tannin, và không phải những chất Tannin có thể thuộc được da (Karamali Khanbabaee and Teunis van Ree).
Bae-Smith và Swain định nghĩa Tannin là hợp chất phenol tan được trong nước với phân tử lượng từ 300-3000, có các tính chất hóa lý khác giống như của một hợp chất phenol như khả năng kết tủa alkaloid, gelatin và các protein khác.
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 26
Haslam đã thay thế thuật ngữ “Tannin” bằng thuật ngữ “polyphenol”, để nhất mạnh sự tồn tại của rất nhiều gốc phenol trong cấu trúc phân tử của những hợp chất này Ông nhấn mạnh, khối lượng phân tử của nó lên đến 20,000 và các hợp chất này không chỉ tạo hợp chất với protein, alkaloid mà còn với một số polysaccharide Tuy nhiên một số tác giả vẫn sử dụng thuật ngữ “Tannin” để nhấn mạnh các khả năng đặc biệt của Tannin mà chỉ có hợp chất phenolic này có: khả năng kết tủa protein.
Hiện tại có rất nhiều ý kiến trái chiều về định nghĩa Tannin dựa trên cấu trúc phân tử cũng như các đặc tính của chúng, sau đây là một số định nghĩa:
“Tannin là một polyphenol với những tính chất đặc trưng: tạo vị chát, tạo màu sẫm cho nước quả, có khả năng chống oxi hóa, kết tủa với các hợp chất alkaloid, muối kim loại và một số polysaccharide”.
“Tannin là những hợp chất của polyphenol có trong thực vật, trong phân tử không có nitơ Tannin có phân tử lượng từ 300 đến 3000 Da thậm chí lên đến 20000 Da.
Tannin tan trong nước, cồn, axeton, không tan trong ete và chlororm, có vị chát và được phát hiện dương tính với thí nghiệm thuộc da”
Một số lượng lớn các nhóm phenolic hydroxyl cho phép Tannin tạo phức với các protein và một lượng thấp hơn thì hình thành phức hợp với các đại phân tử khác như cellulose và pectin (Mueller Harvey et al, 1987)
Hình 1.2: Cấu tạo của Tannin
Sau lignin, Tannin là nhóm thứ hai chứa nhiều phenolic nhất trong thực vật Tanin được coi là hợp chất thứ cấp vì chúng không tham gia vào quá trình trao đổi chất (Bhat et al, 1998) Tannin có chức năng làm lành vết thương và hoạt động như các sắc tố
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 27
Tannin bảo vệ cây khỏi sự tấn công bởi vi khuẩn, làm bất hoạt virut và xâm lấn enzym ngoại bào của vi sinh vật Các vi sinh vật tấn công bằng cách tiết enzym sẽ bị bất hoạt toàn bộ hoặc một phần bởi sự hình thành phức hợp giữa cơ chất của vi sinh vật với protein (không phải enzym) trong thực vật, và phân tử Tannin (Lekha và Lonsane, 1997) Tannin cũng đóng góp vào sự phòng vệ hóa học, bảo vệ thực vật trước côn trùng và động vật có vú ăn cỏ (Hartzefelt et al, 2002) Tannin gây ảnh hưởng xấu lên động vật, vi sinh vật, môi trường Một lượng lớn nhóm phenol hydroxyl cho phép Tannin tạo phức hợp không hòa tan và khó tiêu hóa, chủ yếu với protein, tinh bột, cellulose, pectin và các enzym tiêu hóa Do đó, chúng làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn và lượng thức ăn hấp thu được ở động vật, đặc biệt đối với động vật nhai lại Chúng cũng ức chế sự tăng trưởng của một số vi sinh vật và chống lại vi khuẩn tấn công bằng cách ức chế enzym thông qua phá vỡ màng tế bào Tannin trong chất thải nông nghiệp gây ô nhiễm nghiêm trọng trong môi trường Do đó, Tannin có tác động tiêu cực đến các sinh vật sống (Kumar et al, 1999) Ảnh hưởng Tannin đến quần thể sống trên trái đất:
Tannin có mặt ở trong vô số loại thực vật, được tận dụng như nguồn thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Tannin được ví như một con dao hai lưỡi, bởi mặc dù chúng mang các hoạt tính chống các chất hóa học, gốc tự do sinh ung thư và gây đột biến, Tannin đồng thời có thể giúp hình thành các khối u, độc tính với gan hoặc các hoạt động kháng dinh dưỡng Khối lượng phân tử của phân tử Tannin đã được nghiên cứu là có ảnh hưởng đến các thuộc tính, cơ chế hoạt động của Tannin Tannin với khối lượng phân tử cao hơn có lượng chất phản dinh dưỡng nhiều hơn và có hoạt tính sinh học giảm Các Tannin có khối lượng phân tử nhỏ hơn thì có ít các chất kháng dinh dưỡng và dễ được hấp thụ hơn.
Mặc dù Tannin có khả năng gây độc đến các sinh vật sống, một số vi sinh vật có khả năng kháng Tannin và phá hủy cấu trúc Tannin thành các oligomeric Tannins và một số đồng phân có lợi khác như acid gallic và pyrogallol GalloTannin bị phân hủy bởi một số vi khuẩn, nấm men và mốc, trên cơ chế thủy phân các este galloyl của Tannin.
1.2.1.2 Phân loại Tannin SVTH Đào Vũ Thanh Vân 28
Nếu dựa trên kinh nghiệm, tập quán từ xưa cũng như các nghiên cứu hiện có, ta có thể chia các loại Tannin thành Tannin ngưng tụ, Tannin thủy phân, Tannin khác.
* Tannin ngưng tụ (CT): hay Proanthocyanidin, là các polymer của các flavonoid phenols Được hình thành từ những đơn phân cơ bản là catechin và epicatechin, đó là hai chất đồng phân của nhau Phân tử cơ bản thuộc loại flavonoid có cacbon số 4 là nhóm metylen (-CH2-) dễ ngưng tụ thành các polyme Sự ngưng tụ thường xảy ra ở dây nối cacbon – cacbon, ví dụ giữa C8 của catechin và C4 của epicatechin tạo thành dimer
Hình 1.3: Cấu tạo của Tannin thủy phân (a), Tannin ngưng tụ (b)
1 Flavan-3-ols (-)Epicatechin (+)Catechin 2 Thêm một gốc phenolic thứ 3 ở vòng B sẽ có: (-)Epigallocatechin và
(+)Gallocatechin Không thuộc được da nhưng có thể biến thành các hợp chất có thể thuộc da.
3 Nếu chỉ có một gốc phenolic ở vòng B thì sẽ có: (-)Epiafzelechin và
4 Nhóm Tannin ngưng tụ quan trọng nhất là 5-deoxy-flavna 3-ols (Quebracho)
Profisetinidins và prorobinetinidins Nó chuyển sang dạng fisetinidn and robinetinidin ở phản ứng với acid butanol (dùng để định lượng Tannin).
5 Flavan-3,4-diols hay luecoanthocyanidins thường hay bị nhầm với proanthocyanidins, mặc dù chúng không liên kết hay tạo phức với protein Nó chuyển
Chế phẩm Enzyme Tannase
Tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) (enzyme thủy phân gốc acyl của Tannin), xúc tác thủy phân các liên kết este galloyl của Tannin Enzyme tannase hay còn gọi là Acyl Tannin hydrolase (EC 3.1.1.20), được sử dụng chủ yếu cho quá trình chuyển hóa sinh học để tạo thành 9 phân tử acid gallic và một phân tử đường Enzyme tannase xúc tác thủy phân các liên kết ester và liên kết depside có trong Tannin thủy phân để tạo thành glucose và acid gallic Ngoài ra thì enzyme tannase còn xúc tác thủy phân liên kết ester có mặt trong các hợp chất Tannin như acid tannic, methyl gallate, ethyl gallate, n- propylgallate và izoamylgallate Phản ứng xúc tác điển hình của tannase là phá vỡ cầu nối hydro của epigallocatechin-3-ol gallate.
Trong đó, nhóm acyl là một nhóm chức được tổng hợp bằng cách tách một hay nhiều nhóm hydroxyl của oxoaxít Trong hóa hữu cơ, nhóm acyl thường được tổng hợp từ một axít carboxylic (RC O OH ) Do đó, công thức của nhóm acyl là RC(=O)-, với một liên kết đôi giữa nguyên tử cácbon và nguyên tử oxy (nhóm carbonyl), và một liên đơn giữa nhóm R với cácbon Nhóm acyl cũng có thể tổng hợp từ các axít khác như axít sulfonic, axít phốtphonic Kể từ khi được khám phá ra, Tannase đã có những ứng dụng nhất định trong các ngành thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, đồ uống, dược phẩm cũng như trong ngành công nghiệp hóa học Đã có nhiều nhà nghiên cứu khoa học thực phẩm, sinh học trên thế giới đã chọn nghiên cứu về tannase và các ứng dụng của chúng, nhưng lại có rất ít các kiến thức được khám phá ra về enzyme này ở quy mô cấu trúc phân tử, bởi vậy nên các ứng dụng về tannase tại quy mô công nghiệp vẫn còn bị giới hạn Hiện tại, mới chỉ có một số chủng vi khuẩn sinh tannase được nghiên cứu Staphylococcus lugdunensis Lactobacillus plantarum, , and Enterobacter sp.
Trong đó, tannase từ L.plantarum đã được nghiên cứu kỹ lưỡng về đặc điểm cấu trúc và thuộc tính hóa sinh L.plantarum là một vi khuẩn sinh axit lactic mà thường được gặp trong quá trình lên men các loại thực vật giàu Tannin Những sản phẩm lên men từ
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 38 loại vi khuẩn này được sử dụng trong thức ăn hàng ngày và thức ăn chăn nuôi phải kể đến như: olive, nước quả nho và một số loại lên men rau quả khác Trong số các vi khuẩn lactic, các dòng từ L.plantarum thường chứa hoạt tính của enzyme tannase, trong đó quá trình phân cắt (hạ thấp phân tử) Tannin được xảy ra do hoạt động của enzyme tannase và enzyme gallate debocarboxylase thủy phân các axit gallic Các đoạn gen mã hóa tannase (tanB Lp , hay còn được gọi là tanLp1) và gallate decarboxylase (lpdBCD) trực tiếp tham gia vào giai đoạn phân hủy Tannin đã được định danh.
Tannase là một enzyme thủy phân hoạt động trên nguồn cơ chất là Tannin, có khối lượng phân tử khoảng 150 kDa đến 300 kDa Nhiệt độ tối ưu từ 30-60 C, pH tối ưu là o 3,5-8 tùy thuộc vào nguồn gốc của tannase Tannase ổn định trong một vài tháng ở 30 o C, tuy nhiên ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của tannase cũng đã được một số nghiên cứu đề cập, trong đó Mg và Hg làm tăng cường hoạt tính của tannase, 2+ + còn một số ion khác như Ba , Ca , Zn , Hg , Ag …lại ức chế hoạt tính của tannase 2+ 2+ 2+ 2+ +
1.3.2 Hình thức của hoạt động thủy phân
Tannase được biết đến là một enzyme thủy phân các liên kết ester của acid tannic mặc dù acid tannic được biết đến là một chất làm biết tính protein Theo nghiên cứu của Libuchi et al, 1972 thì tannase có mặt để thủy phân hoàn toàn acid tannic (hình 1.4) thành acid gallic (hình V) và glucose (hình VI) thông qua 2, 3, 4, 6 tetragalloyl glucose (hình III) và 2 kiểu của monogalloyl glucose (hình IV) Nguồn : Libuchi et al.
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 39
Hình 1.4: Con đường thủy phân acid tannic bởi enzyme tannase
1.3.3 Các nguồn thu nhận enzyme tannase
Tannase được tổng hợp khi có mặt acid tannic, vì thế chúng có ở khắp nơi trong thế giới sinh vật: thực vật, động vật, vi sinh vật.
1.3.3.1 Thu nhận tannase từ thực vật
Có rất nhiều loài thực vật có chứa Tannin, đây là nguồn cơ chất sản sinh ra enzyme tannase Trong đó thì các loại thực vật giàu Tannin thủy phân và Tannin ngưng tụ là nguồn chính để thu nhận enzyme tannase, Tannin thủy phân và Tannin ngưng tụ có thể có trong cùng một cây nhưng lại nằm trong những mô riêng biệt trong cây (Lekha and Lonsane, 1997) Một số thực vật có chứa Tannin như: quả Myrobolan (Terminalia chebuna), quả Divi Divi (Caesalpinia coiria), gỗ sồi (Quercus rubra) và từ lá của cây Karee (Rhus typhina)… Một vấn đề đặt ra ở đây là tại sao tannase lại tồn tại trong vỏ cây và lá của thực vật? Madhavakrishna et al (1960), đã đề xuất rằng khi sinh trưởng thực vật tổng hợp một lượng lớn các acid gallic, acid chebulinic và acid hexahydroxyphenic bị ester hóa với glucose dưới sự xúc tác của tannase để tạo thành các Tannin phức tạp Khi cây có hiện tượng rụng quả thì hoạt động của liên kết ester trong tannase góp phần tích cực vào việc thủy phân Tannin.
Chất Tannin trong nguyên liệu thực vật giúp cho thực vật có thể tự bảo vệ mình chống lại sự xâm nhập của vi sinh và sự tấn công của động vật ăn cỏ, khi lá của thực vật bị tấn công bởi thực vật ăn cỏ thì các tế bào bị mất một số phần làm cho tannase
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 40 tiếp xúc với Tannin trong lá và thủy phân Tannin thành các chất độc hại trong thực vật bậc cao.
1.3.3.2 Thu nhận enzyme tannase từ động vật Đã có một số nghiên cứu chỉ ra rằng có một lượng nhỏ enzyme tannase được tìm thấy ở niêm mạc dạ cỏ của gia súc, tannase cũng được tìm thấy ở màng niêm mạc và ruột non của bò Hơn thế, tannase còn được sản sinh bởi các ấu trùng nốt sần phát triển trong nốt sần thực vật để thủy phân acid tannic (Lekha and Lonsane).
1.3.3.3 Thu nhận enzyme tannase từ vi sinh vật
Vi sinh vật là nguồn cung cấp enzyme vô cùng quan trọng, trong tất cả các sinh vật có khả năng tạo enzyme tannase thì Aspergillus có khả năng sản xuất enzyme thương mại hiệu quả nhất Tannase được sản xuất như màng liên kết hay enzyme trong tế bào, không phải tất cả enzyme đều hoạt động để chống lại các cơ chất Tannin khác nhau.
Tannase từ nấm hoạt động tốt hơn trong việc làm giảm Tannin thủy phân, trong khi đó tannase từ nấm men lại làm giảm acid tannic tốt hơn và có ái lực thấp với Tannin tự nhiên (Deschamps et al., 1983), ở đầu bên kia quang phổ tannase từ vi khuẩn có thể thủy phân Tannin tự nhiên và acid tannic rất hiệu quả (Lewis and Starkey, 1969; Deschamps et al., 1983).
Chryphonectria parasitica đã được phát hiện là gây bệnh bạc lá ở cây hạt dẻ Mỹ, tỷ lệ tăng trưởng của loại nấm này đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của nấm trong quá trình hình thành bệnh bạc lá Sự tăng trưởng cho thấy loại nấm này có thể sử dụng các chất Tannin có nhiều trong vỏ hạt dẻ Điều này cho thấy, loại nấm này có thể sử dụng Tannin trong vỏ cây như nguồn cacbon hữu cơ trong quá trình sinh bệnh Chất Tannin trong vỏ cây đóng vai trò quan trọng vì nó rất nhậy cảm với bệnh bạc lá của cây hạt dẻ.
Một số môi trường của vi khuẩn đã phát hiện thấy khả năng phân giải Tannin của tannase ngoại bào, do đó giải phóng acid gallic và glucose (Deschamps, 1983) đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Bacillus polymyxia và klebsiella planticola có thể sản xuất tannase ngoại bào từ vỏ hạt dẻ như là nguồn cacbon duy
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 41 nhất Sự phong phú của các nhóm vi khuẩn có thể phân giải Tannin được tìm thấy trong đường tiêu hóa của động vật nhai lại (Deschamps et al., 1983).
Dạng nấm sợi cũng có khả năng phân giải Tannin như một nguồn cacbon duy nhất (Lewis and Starkey, 1969; Hadi et al., 1994) Các nhà nghiên cứu cho thấy sự phân giải Tannin tăng khi bổ sung các chất trao đổi khác (Gang et al., 1977) cho rằng Aspergillus niger và penicillium spp tăng trưởng tốt hơn trong môi trường có chứa đường và Tannin (Bhat et al., 1997, 1998), điều này cho thấy việc bổ sung nguồn cacbon và nitơ thúc đẩy sự sản xuất tannase cho sự phân cắt tiếp theo của các phân tử Tannin để tăng cường giải phóng nguồn cung cấp cacbon Sự phân giải Tannin từ nấm men đã không được đi sâu vào nghiên cứu Aoki et al (1976), đã phân lập và báo cáo về sự suy thoái galloTannin bởi các loài nấm men Candida có thể sản xuất enzyme tannase Tannase từ nấm men này có thể thủy phân các liên kết ester và depside từ các acid tannic để tạo thành acid gallic và glucose.
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme tannase
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
- Quả điều được nhập từ vườn điều trồng hữu cơ tại Bình Phước, quả điều được tách quả thật, phần quả giả được phân loại, quả dập thối được loại bỏ, các quả không có dấu hiệu hư hỏng sẽ được mang đi ngâm rửa, sau đó được ép trong máy ép trục vít, rồi lọc thô qua vải lọc Phần nước quả nhận được vẫn còn rất nhiều bã, và cần phải đưa đi lọc khi đem đi nghiên cứu cũng như khi phối chế sản phẩm Dịch được chuyển về phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm vào tháng 1 năm 2021, được bảo quản lạnh đông trong tủ lạnh phòng thí nghiệm C4-111
Acid citric, mang đến vị chua, dùng để cân bằng vị chua và phần trăm axit cho sản phẩm.
+ Sản phẩm đã được đi xác định hàm lượng axit với hàm lượng acid 70%
+ Hương chanh: 0,5% (theo thông số của nhà sản xuất) - Đường kính: mang đến vị ngọt, dùng để cân bằng vị ngọt và nồng độ chất khô hòa tan cho sản phẩm Dùng để pha đường 20 Bx, mang đi phối trộn với nước quả điều.
Tannase (EC 3.1.1.20) (enzyme thủy phân gốc acyl của Tannin), xúc tác thủy phân các liên kết este galloyl của Tannin, Tannase thuộc về nhóm enzyme esterase.
Chế phẩm enzyme Tannase của hãng Kikkoman (Nhật Bản) có nguồn gốc từ Aspergillus Oryzae, bởi vậy sẽ có pH tối ưu tại: 3-5,5; điểm đẳng điện pI tại: 3,8; nhiệt độ tối ưu tại: 30-40 C, nhiệt độ ổn định tại: 55 C Một số thông tin do nhà sản xuất đưa 0 0 ra bao gồm:
Bảng 2.1: Chỉ tiêu sản phẩm enzyme từ hãng Kikkoman Biochemifa
Thuộc tính Bột xám trắng mịn và không mùi
Thế tích giảm khi sấy (%) ≤5
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 48
Phần còn lại khi đốt (%) ≤1
Bảo quản ≤10 C, bảo quản khỏi ánh sáng 0
Hạn sử dụng 2 năm sau ngày sản xuất
Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
- Thuốc thử Metyl da cam 1%, Metyl xanh, Phenolphtalein;
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc;
- Dung dịch indigocarmin : hòa tan 6g indigocarmin vào 1l dung dịch H2SO4
- Dung dịch axit gallic 2,5 g/l: cân 0,11 gam axit gallic.H O cho vào cốc sạch khô,2 thêm khoảng 10ml nước cất vào, khuấy tan sau đó chuyển vào bình định mức 50ml.
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 49
Tiếp theo hút 5ml cồn tuyệt đối cho tiếp vào bình định mức Rồi thêm nước cất vào định mức chính xác 50ml;
- Chỉ thị hồ tinh bột;
- Dung dịch DPPH 0,1mM trong Methanol: cân 0.0039g DPPH rồi định mức lên 100mL bằng Methanol;
- Máy đo cường độ màu OD; cuvet;
- Bếp điện; Nồi cách thủy;
- Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ đến 550-600 0 C;
- Bình tam giác 250ml; Cốc mỏ vịt 50ml-1l; Pipet 2-25ml; Falcon 15-50 ml;
Eppendof 2ml; Micropipet 10-100, 100-1000; Phễu; Bình định mức dung tích 100ml, 250 ml, 1l; Ống đong 100ml; Ống sinh hàn;
- Khúc xạ kế phòng thí nghiệm chia độ tới 0,2% hàm lượng chất khô và sai số nhỏ hơn 0,2%;
- Đũa thủy tinh dẹt đầu;
- Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ 105 - 150 0 C;
- Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g (cân 4 số) cùng với hộp cân;
- Tủ sấy dụng cụ chuyên dụng;
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 50
Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của dịch quả điều (Thí nghiệm 1)
- Xác định hàm lượng Polyphenol tổng số bằng phương pháp so màu Folin-Cioucalteau;
- Xác định hàm lượng tannin tổng số dùng KMnO4 ; - Xác định vitamin C; - Xác định hàm lượng Pectin; - Xác định hàm lượng axit
Khảo sát các phương pháp khử chát của dịch quả điều (Thí nghiệm 2)
Khảo sát phương pháp sử dụng Enzyme Tannase trong quá trình khử chát Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của dịch quả sau khi xử lý Enzyme Tannase (Thí nghiệm 3)
Hoàn thiện quy trình sản xuất nước quả điều
- Xác định độ ẩm: bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi;
- Xác định giá trị pH bằng máy đo FP20;
- Hàm lượng chất rắn hòa tan tổng số theo TCVN 4414-87;
- Xác định hàm lượng đường tổng số theo TCVN 4594-88;
- Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Graxianop;
- Hàm lượng axit (%) theo TCVN 5483 – 2007;
- Xác định lượng polyphenol tổng số bằng phương pháp so màu Folin Ciocalteau; - Xác định hàm lượng vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ Iốt;
- Xác định hàm lượng tannin bằng phương pháp kali pemanganat;
- Xác định hoạt tính chống oxi hoá theo phương pháp DPPH;
- Xác định hàm lượng pectin bằng phương pháp canxi pectate.
Phối chế nước quả điều (Thí nghiệm 4)
- Phối trộn các thành phần - Đánh giá sản phẩm bằng phương pháp cảm quan - Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm cuối:
+ Vi sinh vật tổng số;
+ Nồng độ chất khô hòa tan tổng số Đánh giá Đánh giá
Khảo sát các yếu tố chỉ tiêu hoạt động của Enzyme:
- Yếu tố nồng độ Enzyme.
Bố trí thí nghiệm
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm SVTH Đào Vũ Thanh Vân 51
2.3.1.1 Phương pháp phân tích chỉ tiêu dịch ép quả điều 2.3.1.1.1 Xác định hàm lượng chất rắn hòa tan tổng số bằng khúc xạ kế theo TCVN 4414:19:
Phương pháp này dựa trên độ khúc xạ ánh sáng của đường và một số hợp chất hữu cơ khác quy ra đường Đọc hàm lượng phần trăm trực tiếp trên thang chia độ của khúc xạ kế ở 20 0 C.
Khúc xạ kế phòng thí nghiệm chia độ tới 0,2% hàm lượng chất khô và sai số nhỏ hơn 0,2%;
Cốc thủy tinh dung tích 50ml; Đũa thủy tinh dẹt đầu.
Trước khi thử cần kiểm tra độ chính xác của khúc xạ kế bằng cách:
Lau sạch mặt lăng kính bằng bông thấm nước cất để khô, điều chỉnh thị trường của khúc xạ kế cho rõ nét phần phân quang, điều chỉnh điểm 0 của khúc xạ kế bằng nước cất ghi nhiệt độ lúc điều chỉnh Lau khô mặt lăng kính và tiến hành đo mẫu ngay để nhiệt độ đo không chênh với nhiệt độ điều chỉnh máy.
Lắc đều mẫu, dùng đũa thủy tinh dẹt đầu đưa 2 - 3 giọt mẫu vào lăng kính dưới, đậy lăng kính trên lại Nếu dùng khúc xạ kế để bàn Abbe điều chỉnh cho vạch phân quang về đúng tâm điểm, đọc chỉ số phần trăm trên thang chia độ, ghi nhiệt độ khi đo.
Chú ý: không thể đọc kết quả trong bóng tối, có thể điều chỉnh núm sao cho chỉ số hiện lên rõ nhất có thể.
Lấy kết quả đọc được trên máy và hiệu chỉnh về 0 0 C.
2.3.1.1.2 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5613-2015
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 52
Mẫu được cân để xác định trọng lượng sau đó được sấy khô bằng cách làm nóng để làm bốc hơi hết hoàn toàn lượng nước hay chính là hơi ẩm của vật mẫu Sau khi đã sấy khô, mẫu sẽ được cân lại để xác định trọng lượng Bằng việc so sánh trọng lượng của mẫu trước và sau khi sấy Người ta có thể xác định được lượng nước có trong mẫu và xác định độ ẩm của mẫu bằng việc tính toán và phân tích sự thay đổi này.
Thông thường độ ẩm trong nguyên liệu được xác định theo phương pháp sấy nhưng chỉ cho kết quả gần đúng Vì khi sấy ở nhiệt độ cao, một số chất hữu cơ của nguyên liệu sẽ bị phân huỷ và bay hơi cùng với nước, khi đó lại có một lượng nhỏ nước liên kết không bay hơi hết Để hạn chế sai số người ta chỉ sấy ở 100 - 105 C và 0 kéo dài 3 - 4 giờ Đôi khi muốn rút ngắn thời gian sấy người ta thực hiện ở 130 C 0 trong 40 phút.
Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ 105 - 150 0 C;
Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g (cân 4 số) cùng với hộp cân;
Cân khoảng 5 gam dịch đã lọc trong hộp nhôm đã biết trọng lượng Mở nắp và đặt hộp nhôm vào tủ sấy có nhiệt độ 105 C, sau 3 giờ sấy đậy nắp và làm nguội trong bình 0 hút ẩm, sau đó cân lại, ghi số cân Sấy tiếp 30 - 60 phút, sau đó đem làm nguội và cân lại lần 2 Nếu sai số giữa hai lần không quá 0,001 gam thì xem như quá trình tách nước kết thúc.
Kết quả: Độ ẩm của nguyên liệu (%) được tính theo công thức:
W (% m/m) =m 1 −m 2 m 1 −m 0 ×100 Trong đó: m1 = khối lượng mẫu và cốc sấy trước khi sấy, g; m2 = khối lượng mẫu và cốc sấy sau khi sấy đến khối lượng không đổi, g; m0 = khối lượng cốc sấy đã sấy đến khối lượng không đổi, g.
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 53
2.3.1.1.3 Xác định hàm lượng pectin bằng phương pháp canxi pectate
Trong môi trường kiềm loãng, pectin hòa tan sẽ giải phóng ra nhóm methoxyl thành rượu methylic và axit pectic tự do Axit pectic tự do trong môi trường có mặt axit axetic sẽ kết hợp với CaCl thành dạng muối kết tủa canxi pectat Từ hàm lượng2 muối kết tủa có thể tính được hàm lượng pectin trong mẫu.
Xà phòng hóa thành axit pectic bằng cách cho 20ml dịch quả vào bình tam giác 250mL, thêm 100mL NaOH 0.1N để trong 7 giờ Thêm 50ml dung dịch CH3COOH 0.1N và để yên 5 phút Thêm 50ml CaCl 1N và để yên 1 giờ.2 Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi.
Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho đến khi không còn ion Cl nữa: thử - với dung dịch AgNO 1% Đặt giấy lọc có kết tủa vào cốc, cân và sấy ở 105 C đến3 o trọng lượng không đổi.
Hàm lượng pectin trong dịch quả được tính theo công thức:
Pectin = m× 0.92 V ×1000 , g / Trong đó, m: khối lượng cặn canxi pectat thu được (g);
0.92: hệ số chuyển từ canxi pectat sang pectin;
V: số ml dịch quả đã lấy mang đi phân tích.
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 54
2.3.1.1.4 Xác định giá trị pH bằng máy đo FP20
Nguyên tắc: Đo giá trị pH bằng cách đo sự khác biệt điện thế giữa điện cực pH và điện cực tham chiếu Máy đo sau đó chuyển đổi giá trị điện thế sang kết quả pH
Hiệu chỉnh điện cực về pH 7 bằng dung dịch đệm hoặc rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm khô Các mẫu được lấy tại các điểm khác nhau, và các lần đo mỗi mẫu 3 lần Đợi đến máy hiện lên dấu mũi tên, ta ghi lại kết quả đo tương ứng với mỗi lần đo.
Rửa điện cực và lặp lại các bước trên sau mỗi lần đo, lấy khoảng giá trị trung bình và ghi kết quả lại.
2.3.1.1.5 Xác định hàm lượng đường tổng và đường khử theo phương pháp Graxianop
Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp Graxianop
Nguyên tắc: Đây là phương pháp được áp dụng nhiều nhất trong các nhà máy rượu ở nước ta, phương pháp này chỉ chính xác khi xác định hàm lượng tinh bột trong dung dịch tinh khiết, còn đối với bột thô thì kết quả nhận được thường cao hơn so với thực tế Vì trong điều kiện thuỷ phân sẽ có một phần pentozan và hemixenluloza bị thủy phân thành đường pentoza, nhưng đường này lại không thể chuyển hóa thành rượu bởi nấm men khi lên men Do đó, trên thực tế đáng lẽ phải trừ bớt lượng pentoza có trong dịch thuỷ phân, nhưng các nhà máy của ta chưa làm điều này Một phần do xác định đường pentoza mất khá nhiều thời gian (4 – 5 giờ), mặt khác do nhiều người chưa hiểu đúng, chưa quan tâm đúng mức đến công tác phân tích tinh bột.
Thuỷ phân đường không khử thành đường khử trong dung dịch HCl 2% ở điều kiện đun sôi trong bình cách thuỷ trong thời gian 2 giờ Dịch đã thuỷ phân được làm nguội và trung hoà bằng NaOH với chỉ thị methyl da cam Hàm lượng đường trong dung dịch được xác định theo các phương pháp xác định như Betran, Lain-Aynol, Graxianop…
Bình định mức dung tích 100, 250 ml;
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 55
Bình tam giác dung tích 250ml;
Phễu thuỷ tinh; Ống đong dung tích 100 ml; Ống sinh hàn khí;
Cân phân tích có độ chính xác 0,001g;
Nhiệt kế đo được đến 100 C 0
Cân khoảng 9,5 ml dịch quả điều rồi chuyển toàn bộ vào bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 250 ml Tiếp theo cho thêm 100 ml HCl 2% (100 ml nước cất cộng 6 ml HCl 35%), đậy nút cao su và nối với ống sinh hàn khí Lắc nhẹ rồi đặt vào nồi đun cách thuỷ, đun tới sôi và cho sôi khoảng 2 giờ Mức nước ở nồi cách thuỷ phải luôn cao hơn mức nước trong bình thuỷ phân, phải chuẩn bị nước sôi để bổ sung vào Sau 2 giờ thuỷ phân, toàn bộ lượng tinh bột đã chuyển hoá thành glucoza, làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm 4 - 5 giọt metyl da cam, dùng NaOH 10% để trung hoà axit tới đổi màu Chú ý chỉ trung hoà khi đã làm nguội đến 30 C, vì ở nhiệt độ cao và kiềm 0 cục bộ thì glucoza sẽ bị phân huỷ làm kết quả kém chính xác Trung hoà xong ta chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 250 ml, tráng bình rồi thêm nước cất tới ngấn bình và đem lọc Dịch đường thu được có thể xác định theo phương pháp Graxianop.
Hàm lượng đường trong nguyên liệu Total Sugar (%) được tính theo công thức sau:
SVTH Đào Vũ Thanh Vân 56
2K3Fe(CN)6 + 2KOH + CH2OH(CHOH)4CHO to 2 K4Fe(CN)6 + 2H2O +
COOH(CHOH)4COOH Total Sugar (g/100ml)=a×250 100× b×m
Trong đó: a = số gam glucoza tương ứng với 20 ml ferixyanua kali ; b = số ml dịch đường loãng tiêu hao khi định phân ; m = số ml ở mẫu thí nghiệm.
