PHẦN 1 : THIẾT KẾ PRIMERS VÀ KIỂM TRA ĐỘ TIN CẬY CỦA PRIMER I. Bài tập 1. Bài tập 1: Thiết kế 3 cặp primers để phát hiện 3 loài vi khuẩn khác nhau có thể gây hư hỏng sản phẩm hoặc gây bệnh cho người. Mỗi loài vi khuẩn 1 cặp. Bước 1: truy cập vào web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Trên thanh công cụ tìm kiếm, nhập tên VSV 16S rRNA Salmonella và chuyển hướng tìm kiếm sang “Nucleotide” ở ô bên trái. 16S rRNA E.coli Tìm bộ gene (1 phần hoặc hoàn toàn) của vi sinh vật muốn tìm trong thực phẩm tại: Bước 1. Thiết kế primers trên NCBI website https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Trên thanh công cụ tìm kiếm, nhập tên VSV cần tìm. Bước 2. Chuyển hướng tìm kiếm sang “Nucleotide” ở ô bên trái. Bước 3. Click vào nút “Search” Bước 4. Kết quả hiện ra, chọn vào loài VSV cần tìm – FASTA (hiện ra nucleotides), Genebank (các thông tin về từng đoạn gene).Sau khi vào FASTA và tìm ra bộ gene ta có thể bắt đầu tiến hành thiết kế primers.
THIẾT KẾ PRIMERS VÀ KIỂM TRA ĐỘ TIN CẬY CỦA PRIMER
Bài tập
Thiết kế 3 cặp primers để phát hiện 3 loài vi khuẩn khác nhau có thể gây hư hỏng sản phẩm hoặc gây bệnh cho người Mỗi loài vi khuẩn 1 cặp.
Bước 1: truy cập vào web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Trên thanh công cụ tìm kiếm, nhập tên VSV 16S rRNA Salmonella và chuyển hướng tìm kiếm sang “Nucleotide” ở ô bên trái
Bước 2 : Click vào nút “Search”
Bước 3: Kết quả hiện ra, chọn vào loài VSV cần tìm – FASTA (hiện ra nucleotides), Genebank (các thông tin về từng đoạn gene).
Sau khi vào FASTA và tìm ra bộ gene ta có thể bắt đầu tiến hành thiết kế primers
Thiết kế primers trên website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi https://www.nlm.nih.gov/oet/ed/ncbi/2022_03_primer.html (chi tiết về cach tạo primers)Bước 1 Copy đoạn gene của VSV hoặc FASTA đã tìm bên trên xuống ô “Enter accession, gi, or FASTA sequence” và điều chỉnh tạo primers.
Bước 2 : Click vào thanh “Get Primers”.
Bước 3: Lưu ra file word cặp primers hoàn chỉnh (sau đó sẽ gửi cho các công ty sinh học phân tử tạo đoạn mồi).
Forward primer CTCAGATTGAACGCTGGCGG Reverse primer CTTGACGTCATCCCCACCTT Kiểm tra độ tương thích của đoạn mồi trên phản ứng PCR (software)
Bước 1 Vào website: http://insilico.ehu.eus/
Bước 2 Chọn công cụ “PCR Amplification”
Bước 3 Chọn tên VSV mình muốn kiểm tra bằng đoạn mồi/primers.
Bước 4 Nhập đoạn mồi/primers của mình vào thanh công cụ.
Bước 5: Ở thanh Microorganism chọn dòng cuối: “Apply to all….”
Bước 6 Ở cửa sổ: “Maximum length of bands” không cần điều chỉnh, do 3000 base pairs(đơn vị chiều dài gene) là đủ lớn.
Bước 7 Chọn “Amplify” và chờ xem kết quả.
Kết quả trả ra sẽ cho ta biết đoạn primers/mồi của chúng ta đã thiết kế có công hiệu để xác định các dòng VSV chúng ta mong muốn không.
Kết quả mô phỏng trước hình ảnh khi chúng ta chạy PCR và gel thành công.
16S rRNA E.coliTìm bộ gene (1 phần hoặc hoàn toàn) của vi sinh vật muốn tìm trong thực phẩm tại:
Bước 1 Thiết kế primers trên NCBI website https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Trên thanh công cụ tìm kiếm, nhập tên VSV cần tìm.
Bước 2 Chuyển hướng tìm kiếm sang “Nucleotide” ở ô bên trái
Bước 3 Click vào nút “Search”
Bước 4 Kết quả hiện ra, chọn vào loài VSV cần tìm – FASTA (hiện ra nucleotides), Genebank (các thông tin về từng đoạn gene).Sau khi vào FASTA và tìm ra bộ gene ta có thể bắt đầu tiến hành thiết kế primers.
Thiết kế primers trên website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi https://www.nlm.nih.gov/oet/ed/ncbi/2022_03_primer.html (chi tiết về cach tạo primers) Bước 1 Copy đoạn gene của VSV hoặc FASTA đã tìm bên trên xuống ô “Enter accession, gi, or FASTA sequence”
Hoặc từ màn hình chính của FASTA, chọn chức năng “Pick Primers” bên phải.
Bước 2 Điều chỉnh các thông số tạo primers.
Bước 3 Click vào thanh “Get Primers”.
Bước 4 Lưu ra file word cặp primers hoàn chỉnh (sau đó sẽ gửi cho các công ty sinh học phân tử tạo đoạn mồi).
Forward primer CTCAGATTGAACGCTGGCGG Reverse primer CTTGACGTCATCCCCACCTT
Kiểm tra độ tương thích của đoạn mồi trên phản ứng PCR (software)
Bước 1 Vào website: http://insilico.ehu.eus/
Bước 2 Chọn công cụ “PCR Amplification”
Bước 3 Chọn tên VSV mình muốn kiểm tra bằng đoạn mồi/primers.
Bước 4 Nhập đoạn mồi/primers của mình vào thanh công cụ.
Bước 5 Ở thanh Microorganism chọn dòng cuối: “Apply to all….”
Bước 6 Ở cửa sổ: “Maximum length of bands” không cần điều chỉnh, do 3000 base pairs (đơn vị chiều dài gene) là đủ lớn.
Bước 7 Chọn “Amplify” và chờ xem kết quả.
Kết quả trả ra sẽ cho ta biết đoạn primers/mồi của chúng ta đã thiết kế có công hiệu để xác định các dòng VSV chúng ta mong muốn không Kết quả mô phỏng trước hình ảnh khi chúng ta chạy PCR và gel thành công.
16S rRNA Shigella Tìm bộ gene (1 phần hoặc hoàn toàn) của vi sinh vật muốn tìm trong thực phẩm tại:
Bước 1 Thiết kế primers trên NCBI website https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Trên thanh công cụ tìm kiếm, nhập tên VSV cần tìm.
Bước 2 Chuyển hướng tìm kiếm sang “Nucleotide” ở ô bên trái
Bước 3 Click vào nút “Search”
Bước 4 Kết quả hiện ra, chọn vào loài VSV cần tìm – FASTA (hiện ra nucleotides), Genebank (các thông tin về từng đoạn gene) Sau khi vào FASTA và tìm ra bộ gene ta có thể bắt đầu tiến hành thiết kế primers
Thiết kế primers trên website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi https://www.nlm.nih.gov/oet/ed/ncbi/2022_03_primer.html (chi tiết về cach tạo primers) Bước 1: Copy đoạn gene của VSV hoặc FASTA đã tìm bên trên xuống ô “Enter accession, gi, or FASTA sequence”Hoặc từ màn hình chính của FASTA, chọn chức năng
Bước 2: Điều chỉnh các thông số tạo primers.
Bước 3: Click vào thanh “Get Primers”.
Bước 4: Lưu ra file word cặp primers hoàn chỉnh.
(sau đó sẽ gửi cho các công ty sinh học phân tử tạo đoạn mồi)
Forward primer ACACATGCAAGTCGAACGGTReverse primer AGGGCCATGATGACTTGACG
Kiểm tra độ tương thích của đoạn mồi trên phản ứng PCR (software)
Bước 1: Vào website: http://insilico.ehu.eus/
Bước 2: Chọn công cụ “PCR Amplification”
Bước 3: Chọn tên VSV mình muốn kiểm tra bằng đoạn mồi/primers.
Bước 4: Nhập đoạn mồi/primers của mình vào thanh công cụ.
Bước 5: Ở thanh Microorganism chọn dòng cuối: “Apply to all….”
Bước 6: Ở cửa sổ: “Maximum length of bands” không cần điều chỉnh, do 3000 base pairs (đơn vị chiều dài gene) là đủ lớn.
Bước 7: Chọn “Amplify” và chờ xem kết quả.
Kết quả trả ra sẽ cho ta biết đoạn primers/mồi của chúng ta đã thiết kế có công hiệu để xác định các dòng VSV chúng ta mong muốn không Kết quả mô phỏng trước hình ảnh khi chúng ta chạy PCR và gel thành công.
2.Giải thích từng chức năng công cụ ?
Enter the PCR template here (multiple templates are currently not supported) It is highly recommended to use refseq accession or GI (rather than the raw DNA sequence) whenever possible as this allows Primer-BLAST to better identify the template and thus perform betterprimer specificity checking.
A template is not required if both forward and reverse primers are entered below.
The template length is limited to 50,000 bps If your template is longer than that, you need to use primer range to limit the length (i.e., set forward primer "From" and reverse primer "To" fields but leave forward primer "To" and reverse primer "From" fields empty).
Nhập mẫu PCR vào đây (nhiều mẫu hiện không được hỗ trợ) Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng refseq hoặc GI (thay vì trình tự DNA thô) bất cứ khi nào có thể vì điều này cho phép Primer-BLAST xác định mẫu tốt hơn và do đó thực hiện kiểm tra độ đặc hiệu của mồi tốt hơn.
Không cần phải có mẫu nếu cả hai đoạn mồi xuôi và ngược đều được nhập bên dưới. Độ dài mẫu được giới hạn ở 50.000 bps Nếu mẫu của bạn dài hơn thế, bạn cần sử dụng phạm vi đoạn mồi để giới hạn độ dài (tức là đặt các trường "Từ" của đoạn mồi chuyển tiếp và các trường "To" của đoạn mồi đảo ngược nhưng để trống các trường "To" của đoạn mồi chuyển tiếp và các trường "Từ" của đoạn mồi đảo ngược)
Enter the position ranges if you want the primers to be located on the specific sites The positions refer to the base numbers on the plus strand of your template (i.e., the "From" position should always be smaller than the "To" position for a given primer) Partial ranges are allowed For example, if you want the PCR product to be located between position 100 and position 1000 on the template, you can set forward primer "From" to 100 and reverse primer "To" to 1000 (but leave the forward primer "To" and reverse primer "From" empty).
Note that the position range of forward primer may not overlap with that of reverse primer.
Nhập mẫu PCR vào đây (nhiều mẫu hiện không được hỗ trợ) Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng refseq hoặc GI (thay vì trình tự DNA thô) bất cứ khi nào có thể vì điều này cho phép Primer-BLAST xác định mẫu tốt hơn và do đó thực hiện kiểm tra độ đặc hiệu của mồi tốt hơn.
THỰC HÀNH TRÍCH LY DNA Ở VI KHUẨN
Quy trình thực hiện
1 Mô tả cụ thể 3 bước đầu tiên trong quy trình - Chuẩn bị mẫu – Trích ly DNA
+ Bước đầu tiên lấy khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy và thả vào ống lý tâm.Thêm enzymes tiêu hoá vào ống lý tâm và để yên ống ly tâm trong vài giờ
+ Sau vài giờ tiêu hoá bằng enzymes ống lý tâm được cho vào bồn nước để làm bất hoạt enzymes tiêu hoá bằng nhiệt.Ống lý tâm được đun nóng ở 100 độ, các enzymes tiêu hoá bây giờ bị biến tính và bất hoạt
+ Đặt ống ly tâm vào máy ly tâm thêm một đối trọng cho máy, đóng nắp máy và quay các mãnh vụng tế bào để loại bỏ khỏi mẫu, sau khi ly tâm các mãnh vụng không mong muốn xuất hiện dưới dạng cặn rắn ở đáy ống.DNA được chứa trong phần nổi phía trên ( chất lỏng).
+ Pipet chuyển phần nổi phía trên vào ống PCR màu đỏ.
Bước 1: Thêm bản phối chính
+ Để chuẩn bị phản ứng chuỗi polymerase (PCR), chúng tôi sẽ thêm dung dịch PCR Master Mix vào mẫu DNA của mình Dung dịch PCR Master Mix (trong chai có nắp màu đỏ) chứa các thành phần sau: nước; chất đệm để giữ hỗn hợp ở độ pH chính xác cho phản ứng PCR; số lượng lớn bốn nucleotide adenine, cytosine, guanine và thymine; số lượng lớn mồi DNA oligonucleotide liên kết vùng 16S rDNA để bắt đầu quá trình sao chép (Mồi là gì?); và DNA polymerase ổn định nhiệt giúp kéo dài chuỗi DNA sao chép.
+ Đồng thời với phản ứng thử nghiệm, chúng ta sẽ chuẩn bị các phản ứng đối chứng âm tính và dương tính Thay vì DNA mẫu, phản ứng đối chứng dương tính chứa DNA đối chứng dương tính (dung dịch 16S rDNA trong chai có nắp màu xanh lá cây) trong khi phản ứng đối chứng âm tính chứa nước khử ion vô trùng Cả hai phản ứng đều chứa dung dịch PCR Master Mix.
Bước 2: Chạy PCR Sau khi các ống phản ứng được nạp vào máy điều nhiệt ("máy PCR"), quá trình sao chép DNA tự động sẽ bắt đầu (tham khảo hình ảnh động) Máy được sử dụng trong phòng thí nghiệm này có các chỉ số mô tả những gì đang xảy ra:
+ Kết quả máy PCR (từ trái sang phải: nhiệt độ, thời gian còn lại, số chu kỳ, nấu chảy, ủ và kéo dài)
+ Việc kiểm soát nhiệt độ được thiết lập như sau:
Bước ủ ban đầu: 95°C trong 10 phút 30 chu kỳ theo trình tự các bước sau:
Bước kéo dài cuối cùng: 72°C 10 phút
Bước cuối cùng: Bảo quản ở nhiệt độ này ở 4°C
Trong mỗi chu kỳ, bước đầu tiên (làm tan chảy) là tách hai chuỗi DNA trong chuỗi xoắn kép bằng cách đun nóng lọ chứa hỗn hợp phản ứng PCR đến 95°C trong 30 giây Các mồi không thể liên kết với các sợi DNA ở nhiệt độ cao như vậy, do đó lọ được làm lạnh đến 60°C Ở nhiệt độ này, mồi liên kết (ủ) với DNA sợi đơn (Lý do hai sợi DNA tách biệt không gắn lại là do có quá nhiều mồi trong dung dịch; do đó, các sợi DNA có nhiều khả năng liên kết với các mồi thay vì với nhau.) Bước cuối cùng ( Extend) là cho phép DNA polymerase kéo dài chuỗi DNA sao chép bằng cách tăng nhiệt độ lên 70°C trong 45 giây.
Ba bước—tách các sợi, ủ lớp sơn lót vào khuôn và tổng hợp các sợi mới—mất chưa đầy hai phút Mỗi lần được thực hiện trong cùng một lọ Vào cuối chu kỳ, mỗi đoạn DNA trong lọ đã được nhân đôi Chu trình này có thể được lặp lại 30 lần hoặc hơn và mỗi đoạn DNA mới được tổng hợp sẽ đóng vai trò như một khuôn mẫu mới Sau 30 chu kỳ, 1 triệu bản sao của đoạn DNA ban đầu có thể được tạo ra
- Tinh sạch PCR – PCR Purification
TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR
Thuyết minh quy trình
Ống này bây giờ sẽ chứa nhiều bản sao của rDNA 16s, mỗi bản dài khoảng 1.500 cặp bazơ (bp) Tại thời điểm này, nên chạy gel để xác nhận rằng phản ứng PCR đã hoạt động.
Gel phải chứa ba làn: một làn dành cho đối chứng âm (tức là nước), không nên có sản phẩm trừ khi nước bị ô nhiễm; một loại khác để kiểm soát dương tính (sản phẩm PCR của trình tự DNA đã biết) để đảm bảo rằng bản thân PCR hoạt động; và làn đường cuối cùng cho mẫu của bạn.
Nếu bạn tin tưởng rằng PCR hoạt động, bạn có thể tiến hành tinh chế sản phẩm PCR.
Chạy gel thực sự là một phương pháp thanh lọc Khi sản phẩm PCR đã ở trong gel, bạn có thể cắt dải tương ứng với sản phẩm PCR và tách DNA khỏi gel Ngày nay, bạn có thể mua bộ vi lọc nhỏ gọn để lọc DNA từ ống PCR mà không cần chạy gel Chúng tôi sẽ sử dụng các cột vi tập trung như vậy trong quy trình của mình:
- Chèn cột vi tập trung có kích thước phù hợp vào ống thu thập.
- Thờm 400 àL đệm vào cột.
- Thờm toàn bộ hàm lượng PCR (~100 àL) vào cột.
- Quay cột ở tốc độ 3.000 vòng/phút trong máy ly tâm góc cố định trong 15 phút.
- Sản phẩm PCR phải được giữ lại trong cột trong khi ống thu thập phải chứa tất cả các mồi, nucleotide và các hợp chất nhỏ khác mà chúng ta không cần nữa Tháo ống thu thập và loại bỏ nó.
- Đảo ngược cột và gắn nó vào ống thu thập mới.
- Thờm 50 àL đệm vào cột đảo ngược Bước này sẽ làm lỏng DNA từ cột vào ống thu thập.
- Quay cột đảo ngược với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 2 phút để thu mẫu vào ống thu.
- Ống thu thập cuối cùng bây giờ phải có nhiều đoạn 16S rDNA dài 1.500 bp, với một lượng rất nhỏ chuỗi DNA dài hơn (là chất gây ô nhiễm) So sánh cụ thể các bước làm với bộ kit trích ly trong phòng LAB sau đó.
CHẠY ĐIỆN DI
Dịch nội dung
1.Mô tả điện di gel
Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose và gửi mẫu để tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA
- Lấy 1Oul hỗn hợp phản ứng PCR và thêm vào 2ul thuốc nhuộm tải 6x.
Thuốc nhuộm tải (dung dịch đậm đặc 6x) bao gồm 30% glycerol với 0,25% xanh bromophenol (tức là 25mg xanh bromophenol trong 1Oml glycerol 30%)
Glycerol làm cho mẫu đặc hơn đệm đang chạy (để chúng chìm vào giếng) và xanh bromophenol là thuốc nhuộm theo dõi cho phép theo dõi chuyển động của DNA qua gel - Nạp mẫu vào giếng agarose 1% gel cùng với chất đánh dấu trọng lượng phân tử DNA để ước tính kích thước
- Đặt điện áp vào gel ở mức 100V và chạy trong khoảng 1 giờ - Tắt nguồn điện và lấy gel ra khỏi bể
- Đặt gel vào tài liệu gel và chụp ảnh các dải DNA Chúng tôi sử dụng SYBR safe làm chất nhuộm màu (do đó không cần nhuộm ethidium bromide), chất này được trộn sẵn vào gel agarose (không cần nhuộm sau).
-Phân tích gel và xác định các mẫu phù hợp có thể được tinh chế và giải trình tự.
2.Trả lời câu hỏi 2.1.Sẽ ra sao nếu chúng ta sử dụng hiệu điện thế quá lớn hay thời gian điện di quá lâu?
- Khi điện di với điện thế cao (hơn 175 volt) nên cẩn thận vì nhiệt lượng hình thành có thể gây ra hiện tượng đường chạy hình chữ S, không thể lấy được kết quả Ngoài ra, chạy điện di với điện thế cao trong thời gian dài có thế gây chảy miếng gel.
2.2.Yếu tố nào quyết định thời gian điện di ?
- Nồng độ gel: Gel agarose với nồng độ cao sẽ làm chậm tốc độ di chuyển của DNA, do đó kéo dài thời gian điện di.
- Dung dịch đệm: Dung dịch đệm là một hóa chất vô cùng cần thiết trong quá trình điện di, giúp hỗ trợ điện di nhanh chóng, dễ dàng và cho kết quả phân tích chuẩn xác hơn.Có 2 loại dung dịch đệm là TAE và TBE.
- Điện áp: Điện áp cao sẽ tạo ra lực đẩy mạnh hơn và làm cho thời gian điện di ngắn hơn.
2.3.Các thuốc nhuộm nào được sử dụng để nhuộm: (1) DNA (2) gel trong chạy điện di?
- SYBR Gold - SYBR Safe- SYBR Green
ĐỊNH DANH VSV
Dịch thông tin hướng dẫn sang tiếng việt
Truy cập trang web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi và nhấp vào "nucleotide BLAST" Cắt và dán chuỗi DNA của bạn vào hộp "Nhập chuỗi truy vấn" và trong phần
"Chọn bộ tìm kiếm, nhấp vào dấu chấm"Khác (nr, v.v.)" (các dấu chấm khác chỉ dành cho tìm kiếm dựa trên cơ sở dữ liệu chuỗi DNA của con người hoặc chuột ) Sau đó nhấp vào nút "BLAST" màu xanh nhạt ở cuối trang để bắt đầu tìm kiếm Khi kết quả của bạn được xử lý, hãy cuộn xuống trang để tìm chuỗi giống nhất trình tự để tìm hiểu thêm chi tiết về nguồn gốc của nó
1.Trả lời các câu hỏi sau:
1.1.Theo kết quả định danh trên BLAST , 4 loài vi khuẩn kia là ?
- Lactococcus lactis Subsp Cremoris - Lactobacillus paracasei
1.2.Kết quả % cao nhất mô tả sự giống nhau giữa đoạn DNA và loài VSV tìm ra được là bao nhiêu?
1.3.Các loài vi khuẩn tìm ra được theo phần trăm cao nhất này thường hiện diện ở loại sản phẩm nào?
- Sản phấm sữa lên men: Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei và Leuconostoc mesenteroides thường được sử dụng trong quá trình lên men sữa để sản xuất các sản phẩm như sữa chua, phô mai, kem chua, và nhiều sản phấm lên men khác.
- Thực phẩm chế biến từ sữa:
Lactococcus lactis và Lactobacillus paracasei cüng có thể được tìm thấy trong các sản phẩm chế biến từ sữa, bao gồm sữa đặc, sữa bột, sữa có hương vị và một số loại kem.
Thực phẩm đóng hộp và đồ hộp: Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn có thể xuất hiện trong thực phẩm đóng hộp và đồ hộp không được chế biến đúng cách hoặc không được tiệt trùng đúng cách Điều này đặc biệt quan trọng đối với sản phẩm có thể được tiếp xúc với môi trường có nhiệt độ thấp như thịt đóng hộp, hải sản đóng hộp và các sản phẩm có chứa gia vị.
1.4.Nếu kết quả định danh của bạn đạt 90% mức độ giống với 1 loài nào đó thì có đáng tin cậy không? Tại sao?
Mức độ giống nhau 90% trong kết quả định danh của một mẫu với một loài vi khuẩn cụ thế thì không đáng tin cậy Mức độ giống nhau trong phân tích chuỗi DNA được sử dụng để xác định loài vi khuẩn là từ 97% trở lên
Mức độ giống 90% có thể được coi là khả cao đối với việc định danh vi sinh vật, nhưng đáng tin cậy của kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm cả phương pháp thử nghiệm được sử dụng và mục đích của việc định danh Mặc dù kết quả định danh ở90% là khá cao nhưng cần tiếp tục phân tích để định danh vi sinh vật một cách chính xác.
THỰC HÀNH TRÍCH LY DNA Ở VI KHUẨN
Quy trình trích ly DNA ở vi khuẩn
Bỏ dịch lỏng, lấy cặn mẫu
Cho 200àl PBS và 20 àl Pro.K
Cho 200 àl CL rồi Vortex
Hút sang Silica gel rồi ly tâm 13000rpm/1p
500 àl WB1 rồi ly tõm 13000rpm/1p
Giữ cột ( bỏ chất lỏng)
500 àl WB2 rồi ly tõm 13000rpm/1p
Ly tâm ông khô 13000rpm/1p
Chuyển cột silica sang ống 1.5ml mới
Cho vào 30 àl EB => Ủ 1 phỳt ở nhiệt độ phũng
Giữ dịch( bỏ ống silica)
Giải thích quy trình
- 25g dưa chua cắt nhỏ - 225ml dung dịch Buffer Peptone Water - Cho 25g dưa chua vào 225ml dung dịch Buffer Peptone Water Lắc đều để dưa chua trộn đều với môi trường sau đó đem đi ủ ở 37oC trong 24h
- Hút 1ml dịch mẫu sau khi đem ủ cho vào ống Eppendorf 1,5ml tiến hành đem ống Eppendorf đi ly tâm ở máy ly tâm 13000rpm trong 5 phút (Lưu ý: Cần phải chuẩn bị 1 ống Eppendorf tương tự thay 1ml mẫu bằng 1ml nước cất để bỏ vào máy ly tâm chung với ống Eppendorf chứa mẫu Khi bỏ 2 ống Eppendorf vào máy ly tâm cần kiểm tra xem 2 ống đã đối xứng với nhau hay chưa, tránh hiện tượng 2 ống không đối xứng nhau gây hư hỏng máy trong lúc máy hoạt động)
- Sau khi máy ly tâm xong tiến hành lấy 2 ống Eppendorf ra khỏi máy Ống Eppendorf có chứa mẫu thì đổ bỏ phần lỏng có trong ống chỉ giữ lại phần cặn dưới đáy ống tiến hành các bước tiếp theo
- Sau khi đó đổ bỏ phần lỏng chỉ giữ lại phần cặn tiến hành cho 200àl dung dịch PBS và20àl dung dịch Pro.K vào ống Eppendorf
- Hỳt 200àl dung dịch CL cho vào ống Eppendorf đó làm ở bước 2 Sử dụng mỏy Vortex để đồng nhất ống Eppendorf, đồng nhất cho đến khi dưới đáy ống cặn tan hết thì dừng lại.
- Tiến hành đem ống Eppendorf đi ủ ở máy ủ nhiệt khô với nhiệt độ 72oC trong 10 phút.
Kết quả quan sát
Hình 1: DNA của vi khuẩn Nhận xét: Sau khi tiến hành trích ly được DNA của vi khuẩn, ta thấy sợi DNA còn chưa rõ, khó nhìn, có thể là do trích ly DNA với số lượng mẫu dưa chua hơi ít hoặc sai số nhỏ trong thao tác, thiết bị,…
So sánh các bước làm giữa bộ kit trích ly trong phòng LAB thực tế và trên máy trả lời
Bộ kit trích ly trong phòng LAB và trang web online là hai phương pháp khác nhau để trích ly dữ liệu từ các mẫu Dưới đây là sự so sánh các bước cụ thể giữa hai phương pháp này
Bộ kit trích ly trong phòng LAB bao gồm các thiết bị, hóa chất và các bước thực hiện như sau:
