MỤC LỤC
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm: Điểm nhiệt độ này được định nghĩa là điểm nhiệt mà tại đó 50% sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo sợi đơn. Điểm nhiệt này rất quan trọng ở pha gắn mồi, Tm nên nằm trong khoảng 50-65oC. Nhiệt độ nóng của mồi trên 65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không chính xác.
Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm. Thay đổi độ dài của primers: Độ dài của đoạn mồi cũng ảnh hưởng đến Tm. Vì vậy, tăng độ dài của đoạn mồi có thể làm tăng Tm và ngược lại, giảm độ dài của đoạn mồi có thể làm giảm Tm.
Điều chỉnh nồng độ muối: Thay đổi nồng độ muối trong dung dịch PCR có thể ảnh hưởng đến Tm. Thông thường, tăng nồng độ muối như KCl có thể làm tăng Tm, trong khi giảm nồng độ muối có thể làm giảm Tm. Ngoài chỉ số Tm thì khi chọn đoạn mồi chúng ta cần phải chú ý tới thông tin.
- Đầu 3 và 5' của câu trả lời: Đầu 3 của các câu trả lời sẽ mở rộng theo chiều ngược lại và ngược lại, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm PCR1. - Nội dung GC: Nội dung GC (nội dung của các cặp nucleotide guanine và cytosine) của đoạn mồi cũng là một yếu tố quan trọng. GC nội dung có thể ảnh hưởng đến độ bền và độ ổn định của các đoạn mã trong phản ứng PCR.
- Môi trường đoạn có nội dung GC tương đối cao có thể có nhiệt độ phân tích bản bản cao hơn một nửa, trong khi đoạn mã có nội dung GC thấp có thể có nhiệt độ phân ly bán thấp hơn. Hãy cho biết chiều dài/ độ lớn và chức năng của đoạn gen 16S rRNA và 23S.
+ Để chuẩn bị phản ứng chuỗi polymerase (PCR), chúng tôi sẽ thêm dung dịch PCR Master Mix vào mẫu DNA của mình. Dung dịch PCR Master Mix (trong chai có nắp màu đỏ) chứa các thành phần sau: nước; chất đệm để giữ hỗn hợp ở độ pH chính xác cho phản ứng PCR; số lượng lớn bốn nucleotide adenine, cytosine, guanine và thymine; số lượng lớn mồi DNA oligonucleotide liên kết vùng 16S rDNA để bắt đầu quá trình sao chép (Mồi là gì?); và DNA polymerase ổn định nhiệt giúp kéo dài chuỗi DNA sao chép. + Đồng thời với phản ứng thử nghiệm, chúng ta sẽ chuẩn bị các phản ứng đối chứng âm tính và dương tính.
Thay vì DNA mẫu, phản ứng đối chứng dương tính chứa DNA đối chứng dương tính (dung dịch 16S rDNA trong chai có nắp màu xanh lá cây) trong khi phản ứng đối chứng âm tính chứa nước khử ion vô trùng. Trong mỗi chu kỳ, bước đầu tiên (làm tan chảy) là tách hai chuỗi DNA trong chuỗi xoắn kép bằng cách đun nóng lọ chứa hỗn hợp phản ứng PCR đến 95°C trong 30 giây. Các mồi không thể liên kết với các sợi DNA ở nhiệt độ cao như vậy, do đó lọ được làm lạnh đến 60°C.
(Lý do hai sợi DNA tách biệt không gắn lại là do có quá nhiều mồi trong dung dịch; do đó, các sợi DNA có nhiều khả năng liên kết với các mồi thay vì với nhau.) Bước cuối cùng ( Extend) là cho phép DNA polymerase kéo dài chuỗi DNA sao chép bằng cách tăng nhiệt độ lên 70°C trong 45 giây. Ba bước—tách các sợi, ủ lớp sơn lót vào khuôn và tổng hợp các sợi mới—mất chưa đầy hai phút. Chu trình này có thể được lặp lại 30 lần hoặc hơn và mỗi đoạn DNA mới được tổng hợp sẽ đóng vai trò như một khuôn mẫu mới.
Tại thời điểm này, nên chạy gel để xác nhận rằng phản ứng PCR đã hoạt động. Gel phải chứa ba làn: một làn dành cho đối chứng âm (tức là nước), không nên có sản phẩm trừ khi nước bị ô nhiễm; một loại khác để kiểm soát dương tính (sản phẩm PCR của trình tự DNA đã biết) để đảm bảo rằng bản thân PCR hoạt động; và làn đường cuối cùng cho mẫu của bạn. Nếu bạn tin tưởng rằng PCR hoạt động, bạn có thể tiến hành tinh chế sản phẩm PCR.
Khi sản phẩm PCR đã ở trong gel, bạn có thể cắt dải tương ứng với sản phẩm PCR và tách DNA khỏi gel. Ngày nay, bạn có thể mua bộ vi lọc nhỏ gọn để lọc DNA từ ống PCR mà không cần chạy gel. - Sản phẩm PCR phải được giữ lại trong cột trong khi ống thu thập phải chứa tất cả các mồi, nucleotide và các hợp chất nhỏ khác mà chúng ta không cần nữa.
So sánh cụ thể các bước làm với bộ kit trích ly trong phòng LAB sau đó.
- Khi điện di với điện thế cao (hơn 175 volt) nên cẩn thận vì nhiệt lượng hình thành có thể gây ra hiện tượng đường chạy hình chữ S, không thể lấy được kết quả. Ngoài ra, chạy điện di với điện thế cao trong thời gian dài có thế gây chảy miếng gel.
- Sản phấm sữa lên men: Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei và Leuconostoc mesenteroides thường được sử dụng trong quá trình lên men sữa để sản xuất các sản phẩm như sữa chua, phô mai, kem chua, và nhiều sản phấm lên men khác. Lactococcus lactis và Lactobacillus paracasei cüng có thể được tìm thấy trong các sản phẩm chế biến từ sữa, bao gồm sữa đặc, sữa bột, sữa có hương vị và một số loại kem. Thực phẩm đóng hộp và đồ hộp: Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn có thể xuất hiện trong thực phẩm đóng hộp và đồ hộp không được chế biến đúng cách hoặc không được tiệt trùng đúng cách.
Điều này đặc biệt quan trọng đối với sản phẩm có thể được tiếp xúc với môi trường có nhiệt độ thấp như thịt đóng hộp, hải sản đóng hộp và các sản phẩm có chứa gia vị. Mức độ giống nhau 90% trong kết quả định danh của một mẫu với một loài vi khuẩn cụ thế thì không đáng tin cậy. Mức độ giống nhau trong phân tích chuỗi DNA được sử dụng để xác định loài vi khuẩn là từ 97% trở lên.
Mức độ giống 90% có thể được coi là khả cao đối với việc định danh vi sinh vật, nhưng đáng tin cậy của kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm cả phương pháp thử nghiệm được sử dụng và mục đích của việc định danh. Mặc dù kết quả định danh ở 90% là khá cao nhưng cần tiếp tục phân tích để định danh vi sinh vật một cách chính xác.
Lắc đều để dưa chua trộn đều với môi trường sau đó đem đi ủ ở 37oC trong 24h. - Hút 1ml dịch mẫu sau khi đem ủ cho vào ống Eppendorf 1,5ml tiến hành đem ống Eppendorf đi ly tâm ở máy ly tâm 13000rpm trong 5 phút (Lưu ý: Cần phải chuẩn bị 1 ống Eppendorf tương tự thay 1ml mẫu bằng 1ml nước cất để bỏ vào máy ly tâm chung với ống Eppendorf chứa mẫu. Khi bỏ 2 ống Eppendorf vào máy ly tâm cần kiểm tra xem 2 ống đã đối xứng với nhau hay chưa, tránh hiện tượng 2 ống không đối xứng nhau gây hư hỏng máy trong lúc máy hoạt động). Ống Eppendorf có chứa mẫu thì đổ bỏ phần lỏng có trong ống chỉ giữ lại phần cặn dưới đáy ống tiến hành các bước tiếp theo.
- Sau khi đó đổ bỏ phần lỏng chỉ giữ lại phần cặn tiến hành cho 200àl dung dịch PBS và 20àl dung dịch Pro.K vào ống Eppendorf. Sử dụng mỏy Vortex để đồng nhất ống Eppendorf, đồng nhất cho đến khi dưới đáy ống cặn tan hết thì dừng lại. - Tiến hành đem ống Eppendorf đi ủ ở máy ủ nhiệt khô với nhiệt độ 72oC trong 10 phút.