Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệm

Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệm

Hà Nội, 2024

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Linh Chi

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG ĐƠN BƯỚC,ĐA BƯỚC VỚI NỒNG ĐỘ OXY KHÁC NHAU TỚI SỰPHÁT TRIỂN CỦA PHÔI VÀ PHÁT SINH CHẤT THẢI

TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

Hà Nội, 2024

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Linh Chi

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG ĐƠN BƯỚC,ĐA BƯỚC VỚI NỒNG ĐỘ OXY KHÁC NHAU TỚI SỰPHÁT TRIỂN CỦA PHÔI VÀ PHÁT SINH CHẤT THẢI

TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Khoa học Môi trườngMã số: 9440301.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:1 PGS.TS Ngô Thị Tường Châu2 GS.TS Nguyễn Đình Tảo

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Linh Chi, nghiên cứu sinh trường Đại học Khoa học Tự nhiên,Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Khoa học Môi trường (Mã số:9440301.01), xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn củaPGS.TS Ngô Thị Tường Châu và GS.TS Nguyễn Đình Tảo;

2 Công trình nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nàokhác đã được công bố tại Việt Nam;

3 Các số liệu và thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực, khách quan và đã được cơ sở nơi nghiên cứu xác nhận và chấp thuận.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết nêu

N

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Môi trường, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHNvà Ban Giám đốc Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông đã cho phép và tạo điều kiệncho tôi thực hiện thành công luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Khải- Trưởng Khoa Môitrường, Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN, TS Trần Văn Sơn- Trưởng bộ môn Côngnghệ Môi trường Cảm ơn các Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Môi trường, KhoaMôi trường đã tạo điều kiện thuận lợi và đóng góp nhiều ý kiến quý giá trong cảchặng đường dài hình thành và triển khai luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Thị Tường Châu, KhoaMôi trường- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, GS.TS Nguyễn Đình Tảo,Nguyên phó giám đốc Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội- HVQY, Giám đốc Trungtâm HTSS Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông, những người thầy trực tiếp, tận tâmhết lòng hướng dẫn, tạo điều kiện và cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốtthời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã đóng góp những ý kiến quýbáu để tôi hoàn thiện luận án này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể cán bộ, nhân viên Trung tâm Hỗtrợ sinh sản Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trongquá trình học tập, thu thập số liệu và hoàn thành luận án.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã độngviên, hỗ trợ tôi về mọi mặt trong cuộc sống, học tập và công tác.

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2024

Tác giả luận án

NGUYỄN LINH CH

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ 5

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN 9

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN 11

MỞ ĐẦU 12

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15

1.1 Một số khái niệm và thuật ngữ được sử dụng trong luận án 15

1.2 Khái quát sự phát triển của phôi trong môi trường tự nhiên 17

1.3 Thụ tinh trong ống nghiệm và quá trình phát triển của phôi trong thụ tinhống nghiệm 22

1.3.1 Quy trình thực hiện IVF 22

1.3.2.Hệ thống nuôi phôi trong thụ tinh ống nghiệm 26

1.3.3 Quá trình phát triển của phôi và các chỉ số đánh giá sự phát triển củaphôi trong IVF 27

1.3.4.Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của phôi trong IVF 32

1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu sử dụng môi trường đơn bước/đa bước vànồng độ oxy 5%/20% trong IVF trên thế giới và tại Việt Nam 41

1.4.1.Môi trường đơn bước/đa bước 41

1.4.2.Nồng độ oxy 5% và 20% 43

1.5 Sơ lược về vấn đề phát sinh và quản lý chất thải trong IVF 45

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50

2.1 Đối tượng nghiên cứu 50

2.1.1.Phôi người 50

2.1.2.Chất thải môi trường nuôi phôi trong IVF 50

2.2 Môi trường nuôi, trang thiết bị, địa điểm và thời gian nghiên cứu 51

2.2.1.Các loại môi trường 51

2.2.2.Trang thiết bị nuôi phôi 52

2.2.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu 53

2.3 Phương pháp nghiên cứu 53

2.3.1 Tính cỡ mẫu cho nghiên cứu 53

2.3.2.Thiết kế nghiên cứu 54

2.3.3.Biến số, chỉ số và phương pháp nuôi phôi trong phòng labo 57

2.3.4.Phương pháp đánh giá phôi 60

2.3.5 Phương pháp thu và phân tích mẫu chất thải môi trường nuôi phôitrong IVF 62

2.3.6.Phương pháp thu thập, quản lý, phân tích và xử lý số liệu 63

2.3.7.Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu 64

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 67

3.1.Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, môi trường đa bước và nồngđộ oxy khác nhau tới các giai đoạn phát triển của phôi trong thụ tinh ống

3.1.3 Đánh giá hiệu quả đồng thời của môi trường đơn bước và đa bước vớicác nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trong IVF 89

3.2 Ảnh hưởng của môi trường đơn và đa bước với các nồng độ oxy khácnhau đến sự phát sinh chất thải trong IVF 102

3.2.1.Thành phần của mẫu thải khi sử dụng môi trường đơn bước trong nuôiphôi trong IVF 104

3.2.2 Thành phần của mẫu thải khi sử dụng môi trường đa bước trong nuôiphôi trong IVF 109

3.2.3.Ảnh hưởng của môi trường đơn bước/đa bước đến thành phần của cácchất thải môi trường nuôi phôi 114

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ oxy (5% và 20%) đến thành phần của các

chất thải môi trường nuôi phôi 119

3.3 Tính chất các chất thải phát sinh từ hoạt động IVF và đề xuất phương ánxử lý 122

3.3.1.Đánh giá chất thải sau 3 ngày nuôi phôi 122

3.3.2.Đánh giá chất thải sau nuôi phôi 5 ngày 125

KẾT LUẬN 128

KIẾN NGHỊ 129

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ 130

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130

TÀI LIỆU THAM KHẢO 131

PHỤ LỤC 143

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ

số nang noãn kích thước từ 2 –10mm (trung bình) đếm đượcqua siêu âm đường âm đạo ởcả 2 bên buồng trứng vào ngày2-3 của vòng kinh.

thận, được sản xuất bởi các tếbào hạt của nang buồng trứng,cho biết số nang noãn non hiệncó trong buồng trứng củangười phụ nữ

lưu trữ trong các nhiễm sắc thểở nhân tế bào và ty thể Ngoạitrừ một số tế bào (tinh trùng, tếbào trứng và hồng cầu), nhântế bào chứa 23 cặp nhiễm sắcthể Một nhiễm sắc thể chứa rấtnhiều gen.

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit etylendiamintetraaxetic [CH₂N(CH₂CO₂H)₂]₂

EEA Essential Amino Acids Axit amin thiết yếu

dựa vào ứng dụng tính đặc hiệucủa các kháng thể và độ nhạycủa các xét nghiệm enzyme.Dựa vào xét nghiệm phân tíchhóa sinh, các bác sĩ có thể pháthiện và định lượng được cácphân tử kháng thể, protein,peptide, hormone

Chuyển đơn phôi có lựa chọn

Reproduction and Embryology

Hiệp hội sinh sản và phôi học người của Châu Âu

GF Growth Factor Yếu tố tăng trưởng

GM-CSF Granulocyte- macrophagecolony- stimulating factor

Nhân tố kích thích hoạt hóabạch cầu đa nhân trung tính-đại thực bào

ICMART International Committee forMonitoring Assisted

morpholino)propanesulfonic sử dụng trong các bộ dụng cụchẩn đoán sinh hóa, bộ táchchiết DNA / RNA Với pKa là7,20, MOPS là chất đệm chonhiều hệ thống sinh học ở độpH gần trung tính.

hCG Human chorionic gonadotropin Đây là hormone có bản chấtpeptid, được tiết ra từ hợp bàonuôi, có vai trò kích hoạt các tếbào mầm của bào thai pháttriển và trưởng thành Đồngthời, hCG còn giúp kích thíchtiết ra hormone sinh dục, hìnhthành giới tính của thai nhi.Hệ thống nuôi

Hệ thống nuôi phôi Hệ thống nuôi phôi bao gồmmôi trường nuôi phôi, dụng cụnuôi, tủ nuôi và hệ thống cáckhí để đảm bảo duy trì sự sốngcho phôi bên ngoài tử cungngười mẹ trong 5-6 ngày đầuphát triển.

Là hệ đệm được sử dụng rộngrãi trong nuôi cấy tế bào, chủyếu là duy trì độ pH sinh lý tốtkhi thay đổi về nồng độ carbondioxide, dung dịch chứaHEPES cần sử dụng trongbóng để ngăn chặn quá trìnhoxy hóa.

được sản xuất trong tế bào ganngười và là thành phần proteinchiếm ưu thế nhất trong máu,chiếm khoảng 50% tổng sốprotein huyết thanh.

Testing for aneuploidy

Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ

ROS Reactive Oxygen Species Các dạng oxy hoạt độngUSP United States Pharmacopeia Dược điển Hoa Kỳ

VINAGOFPA Vietnam Gynaecology andObstetrics Association

Hội Phụ sản khoa và sinh đẻ cókế hoạch của Việt nam

VOC Volatile oragnic compounds Hợp chất hữu cơ dễ bay hơi

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN

Bảng 1.1 Thành phần chính của một số môi trường nuôi phôi 32

Bảng 1.2 Nồng độ các chất dinh dưỡng trong vòi trứng và tử cung 35

Bảng 1.3 Tỷ lệ phôi phát triển lên ngày 3 khi nuôi phôi 44

Bảng 1.4 Tỷ lệ phôi phát triển lên ngày 5 khi nuôi phôi ở 45

Bảng 2.1 Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi ngày 3 60

Bảng 2.2 Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nang (phôi ngày 5) 61

Bảng 2.3 Phân loại phôi nang theo Gardner (1999) 62

Bảng 3.1 Loại vô sinh của các bệnh nhân ở 4 nhóm nghiên cứu 71

Bảng 3.2 Thời gian vô sinh của các bệnh nhân ở bốn nhóm nghiên cứu 71

Bảng 3.3 Đặc điểm dự trữ buồng trứng của các bệnh nhân 73

Bảng 3.4 Đặc điểm kích thích buồng trứng của các bệnh nhân 74

Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) các loại phôi ngày 3 ở các nhóm nghiên cứu nuôi ởmôi trường đơn bước và đa bước 75

Bảng 3.6 Số lượng và chất lượng phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứuđược nuôi ở môi trường đơn bước và đa bước 77

Bảng 3.7 Số lượng và chất lượng phôi nang của các nhóm nghiên cứunuôi ở môi trường đơn bước và đa bước 78

Bảng 3.8 Tỷ lệ hình thành phôi nang của các nhóm nghiên cứu nuôi ở môitrường đơn bước và đa bước 80

Bảng 3.9 Số lượng và chất lượng phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứunuôi ở nồng độ oxy 5% và 20% 83

Bảng 3.10 Tỷ lệ (%) các loại phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứu nuôi ởnồng độ oxy 5% và 20% 84

Bảng 3.11 Số lượng và chất lượng phôi nang của các nhóm nghiên cứunuôi ở nồng độ oxy 5% và 20% 86

Bảng 3.12 Tỷ lệ hình thành phôi nang của các nhóm nghiên cứu nuôi ở

nồng độ oxy 5% và 20% 88

Bảng 3.13 Tỷ lệ hình thành phôi nang giữa 4 nhóm nghiên cứu 90

Bảng 3.14 Kết quả sàng lọc PGT phôi nang 97

Bảng 3.15 So sánh sự bất thường nhiễm sắc thể giữa 99

Bảng 3.16 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi ngày 3 khi sử dụngmôi trường đơn bước 104

Bảng 3.17 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi nang khi sử dụngmôi trường đơn bước 106

Bảng 3.18 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi ngày 3 khi sử dụngmôi trường đa bước 109

Bảng 3.19 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi nang khi sử dụngmôi trường đa bước 112

Bảng 3.20 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 3 ngày của 115

Bảng 3.21 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 5 ngày của 117

Bảng 3.22 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 3 ngày của cácnhóm nghiên cứu nuôi ở cùng môi trường nuôi 120

Bảng 3.23 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 5 ngày của cácnhóm nghiên cứu nuôi ở cùng môi trường nuôi 121

Bảng 3.24: So sánh thành phần của các mẫu chất thải sau nuôi phôi 3 ngày122Bảng 3.25: Sự khác nhau giữa hướng dẫn phân loại chất thải y tế theothông tư 20/2021/TT-BYT và thông tư liên tịch 58/2015/TTLT-BYT-BTNMT 124Bảng 3.26 So sánh thành phần của các mẫu chất thải sau nuôi phôi 5 ngày125

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN

Hình 1.1 Sự phân chia của phôi trong 3 ngày đầu sau thụ tinh 19

Hình 1.2 Phôi nang (hình chụp tại TTHTSS 16A) 20

Hình 1.3 Sơ đồ sự phát triển của phôi tiền làm tổ 21

Hình 1.4 Hệ thống nuôi phôi trong phòng Labo 26

Hình 1.5 Quan điểm về phân loại phôi 30

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 56

Hình 3.1 Hình ảnh phôi ngày 3 (x400) ở các nhóm nghiên cứu 76

Hình 3.2 Hình ảnh phôi nang (x400) của các nhóm nghiên cứu 85

Hình 3.3 Biểu đồ Histogram về tỷ lệ phôi tốt và trung bình của phôi nangngày 5 (bước rộng là 10%) 92

Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện số lượng phôi trung bình của mỗi chu kỳ trongcác giai đoạn phôi phát triển 93

Hình 3.5 Tỷ lệ các loại phôi ngày 3 và ngày 5 của nhóm nghiên cứu I và II 94

Hình 3.6 Tỷ lệ các loại phôi ngày 3 và ngày 5 của nhóm nghiên cứu III và IV 95

Hình 3.7 Biểu đồ Histogram về phân bố tỷ lệ phôi bất thường ở 4 nhómnghiên cứu (bước dao động 10% trục X) 98

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của nghiên cứu

Vấn đề về sức khỏe sinh sản luôn là một trong những ưu tiên hàng đầu củaxã hội Tại Việt Nam, có khoảng 7,7% cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vôsinh, hiếm muộn và tỷ lệ này đang tiếp tục gia tăng, do đó các nghiên cứu khoa họctrong hỗ trợ sinh sản cần được đẩy mạnh Lĩnh vực này đặc biệt quan trọng trongbối cảnh môi trường và điều kiện sinh sống đang thay đổi nhanh chóng, ảnh hưởngđến sức khỏe con người Thực chất, để đạt được một chu kỳ thành công trong kỹthuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó môitrường nuôi phôi và nồng độ oxy là 2 yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triểncủa phôi và đang gây nhiều tranh luận [9, 14, 35, 49, 87, 88].

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, với các điều kiện nuôi phôi khác nhau, đềucó thể mang đến thành công trong nuôi phôi ở môi trường nhân tạo, tuy nhiên có sựkhác nhau về tỷ lệ thành công theo từng giai đoạn phát triển phôi Một số nghiêncứu này sử dụng số lượng mẫu không quá lớn (dưới 1000 mẫu), các nghiên cứukhông sử dụng cùng một loại điều kiện để so sánh, không sử dụng cùng hệ thốngnuôi và ở các quốc gia khác nhau, vì vậy các kết quả nghiên cứu đạt được chỉ mangtính chất tham khảo Điều cần thiết là phải có thêm các nghiên cứu nhằm làm sángtỏ hơn vấn đề này, đặc biệt là nghiên cứu một cách hệ thống và tổng thể đánh giákết hợp các điều kiện khác nhau (về môi trường đơn bước/đa bước và nồng độ oxy5%/20%) đến sự phát triển phôi trong IVF.

Hiện nay, phân loại chất thải đã trở thành một nội dung trọng tâm trong côngtác quản lý chất thải y tế, tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứunào về thành phần, tính chất của chất thải được phát sinh trong quá trình thực hiệnIVF Việc phân loại đúng chất thải sẽ góp phần giảm thiểu nguy cơ phát tán vi sinhvật gây bệnh hoặc các tác nhân có độc tính Đồng thời, kết quả nghiên cứu chất thảicũng giúp cho các TTHTSS có phương án thu gom, vận chuyển và xử lý chất thảisau IVF một cách phù hợp, tuân thủ quy định về quản lý chất thải y tế do Bộ Y tế

ban hành, cũng như hạn chế tối đa kinh phí phải chi trả cho các hoạt động này Trêncơ sở đó NCS triển khai đề tài “Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đabước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thảitrong thụ tinh ống nghiệm” với các mục tiêu sau:

2 Mục tiêu của luận án

- Mục tiêu tổng quát: Lựa chọn được điều kiện môi trường tối ưu cho sự phát triểncủa phôi đồng thời đánh giá ảnh hưởng của việc xả chất thải sau khi thực hiện kỹthuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF).

- Mục tiêu cụ thể:

(i) Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, môi trường đa bước và nồngđộ oxy khác nhau tới các giai đoạn phát triển của phôi trong thụ tinh ốngnghiệm

(ii) Đánh giá sự phát sinh chất thải trong hoạt động IVF từ các nhóm môitrường nghiên cứu.

3 Nội dung nghiên cứu của luận án

(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi (đơn bước và đa bước) tớicác giai đoạn phát triển của phôi trong IVF.

(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy (5% và 20%) tới sự phát triển của phôi trong IVF.

(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của môi trường đơn bước và đa bước với các nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trong IVF

(iv) Nghiên cứu sự phát sinh chất thải trong hoạt động IVF từ các nhóm môi trường nuôi phôi nghiên cứu .

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án góp phần bổ sung cơ sở dữliệu và bằng chứng khoa học về hiệu quả của việc sử dụng các loại môi trường nuôiphôi (đơn bước và đa bước), các nồng độ oxy khác nhau (5% và 20%) của tủ nuôiphôi, cũng như hiệu quả đồng thời của việc kết hợp môi trường nuôi (đơn bước vàđa bước) với các nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trong IVF Bên

cạnh đó, luận án cũng đánh giá về lượng, loại chất thải phát sinh trong quá trìnhthực hiện IVF và đề xuất các giải pháp quản lý loại chất thải này tại các trung tâmhỗ trợ sinh sản.

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án góp phần định hướng lựachọn điều kiện nuôi phôi tối ưu cho từng giai đoạn phát triển của phôi, nhằm cảithiện tỷ lệ thành công trong một chu kỳ IVF Đồng thời, luận án có thể được sửdụng làm tài liệu tham khảo có giá trị cho các TTHTSS, các công ty sản xuất môitrường nuôi phôi và hệ thống tủ nuôi phôi trong việc lựa chọn và đổi mới, nângcao sản phẩm chuyên biệt trong việc nuôi phôi lên giai đoạn phôi nang Ngoài ra,dựa vào kết quả phân tích đặc điểm của chất thải phát sinh trong IVF, các TTHTSScó thể đề xuất thay đổi phương pháp thu gom, lưu giữ, vận chuyển chất thải hiệnđang được áp dụng, phù hợp với Quy định về quản lý chất thải y tế trong phạm vikhuôn viên cơ sở y tế do Bộ Y tế mới ban hành (Thông tư số 20/2021/TT-BYT) vàhạn chế tối đa kinh phí phải trả cho các hoạt động này.

5 Những đóng góp mới của luận án

(i) Là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam đánh giá được hiệu quả đồng thờicủa 2 yếu tố: môi trường nuôi phôi (đơn bước và đa bước) và nồng độ oxytrong tủ nuôi phôi (5% và 20%), từ đó đã lựa chọn được điều kiện nuôi phôitối ưu cho sự phát triển của phôi.

(ii) Là một trong những công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam đánh giá được sựphát sinh chất thải trong IVF, đồng thời đề xuất các giải pháp quản lý loạichất thải này tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản .

- Môi trường đơn bước: chỉ sử dụng một loại môi trường nuôi phôi trong suốt quátrình phát triển của phôi.

- Môi trường đa bước: thay đổi môi trường nuôi ở ngày 3 trong quá trình phát triểncủa phôi.

- Nang noãn: ngay từ khi mới sinh ra, trong buồng trứng bình thường của các bégái đã có khoảng 1-2 triệu nang noãn nguyên thủy Nang noãn trải qua lần lượtcác giai đoạn: sơ cấp, thứ cấp và giai đoạn trưởng thành sẽ giải phóng noãn bào(phóng noãn) [11].

- Kích thích buồng trứng (kích trứng): là phương pháp sử dụng các loại thuốc nộitiết, có thể ở dạng uống hoặc tiêm, nhằm kích thích những nang noãn tại buồngtrứng phát triển Sau khi nang đạt đủ kích thước, bệnh nhân sẽ được tiêm thuốcgây phóng noãn [39].

- Chu kỳ IVF: bao gồm các giai đoạn: chuẩn bị, kích trứng, theo dõi nang noãn,chọc hút trứng, thụ tinh, chuyển phôi, bổ sung nội tiết tố, thử thai và theo dõi.- Thụ tinh: là một quá trình trong đó phôi thai được hình thành từ sự hợp nhất giữa

giao tử đực (tinh trùng) và giao tử cái (noãn) [15].

- Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF): cho tinh trùng thụ tinh với noãn và nuôi thành phôi trong ống nghiệm, sau đó một số phôi sẽ được chuyển trở lại vào tử cung.- Phôi dâu: là giai đoạn phôi chứa 16-32 tế bào liên kết với nhau thành khối giống

quả dâu, thường là giai đoạn phôi khoảng ngày 3 đến ngày 4.

- Phôi nang: là phôi có chứa TE, khoang phôi và ICM, sau đó tạo thành phôi thai, thường là giai đoạn phôi nang đến ngày 5 (hoặc ngày 6).

- Phương pháp bơi lên (swim-up): được xây dựng dựa vào nguyên tắc tinh trùng diđộng tốt có khả năng di chuyển ra khỏi tinh dịch vào môi trường nuôi cấy, vì vậygiúp thu được tinh trùng có độ di động cao, loại bỏ được tinh trùng chết và tinhtrùng bất động.

- Phương pháp ICSI: là kỹ thuật dùng hệ thống vi thao tác xử lý tiêm tinh trùngvào bào tương noãn Đây là kỹ thuật cao nhằm hỗ trợ thụ tinh, tăng khả năng thụtinh giữa noãn và tinh trùng [15].

- Phương pháp IVF cổ điển: sau khi swim-up trong tủ nuôi CO2 ở nhiệt độ 370Ctrong khoảng 30 phút, tinh trùng thu được từ nước nổi lên sẽ được nuôi với noãnở phòng labo Mật độ khoảng 100-150 ngàn tinh trùng/2 noãn/ một giếng môitrường nuôi [15].

- Biểu đồ Histogram: dữ liệu được biểu thị bằng các cột trên biểu đồ có độ caokhác nhau tùy thuộc vào tần suất phạm vi dữ liệu cụ thể xảy ra.

- Chất thải nguy hại: bao gồm chất thải lây nhiễm và chất thải nguy hại không lâynhiễm (thông tư 20/2021/TT-BYT) [5].

- Chất thải lây nhiễm: bao gồm chất thải lây nhiễm sắc nhọn (kim tiêm, đầu sắcnhọn, dao mổ ), chất thải lây nhiễm không sắc nhọn (bông, băng, gạc ) và chấtthải có nguy cơ lây nhiễm cao (mẫu bệnh phẩm, dụng cụ đựng dính mẫu bệnhphẩm ) (Thông tư 20/2021/TT-BYT) [5]

- Chất thải trong quá trình IVF: bao gồm 2 phần là chất thải lỏng (môi trường nuôiphôi) và chất thải rắn là vật tư tiêu hao trong Labo (Đĩa 5 giếng, đĩa 4 giếng,pippet, đầu côn….)

- Luật bảo vệ môi trường: Luật bảo vệ môi trường là một lĩnh vực pháp luật gồmtổng hợp các quy phạm pháp luật điều chỉnh các quan hệ xã hội phát sinh trực

- Phôi bất thường: một tế bào bình thường phải có đủ tổng 46 nhiễm sắc thể nằmtrong 23 cặp nhiễm sắc thể, mọi sự sai lệch với trạng thái nhiễm sắc thể này đượccoi là bất thường về di truyền.

- Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ: Xét nghiệm sàng lọc di truyền trước chuyểnphôi là xét nghiệm di truyền học được thực hiện trên 3 – 5 tế bào của phôi ngày5, với mục đích xác định các bất thường về di truyền ở mức độ nhiễm sắc thể, từđó giúp các chuyên gia lựa chọn phôi có bộ nhiễm sắc thể bình thường trước khitiến hành chuyển phôi.

1.2 Khái quát sự phát triển của phôi trong môi trường tự nhiên

Sự hình thành và phát triển của phôi trong tự nhiên được diễn ra nhờ cáchormone và các cơ quan bên trong của người phụ nữ Đầu tiên trứng được thụ tinhtại vị trí 1/3 ngoài vòi trứng, sau đó hợp tử và phôi được hình thành di chuyển dầnxuống và làm tổ trong buồng tử cung Mỗi giai đoạn phát triển khác nhau, phôi sẽđược tiếp xúc với hệ môi trường khác nhau (dịch vòi trứng, dịch tử cung) [11].

a) Giai đoạn thụ tinh:

Quá trình thụ tinh bao gồm 4 giai đoạn: (i) chọn tinh trùng cho thụ tinh, (ii)tinh trùng xâm nhập vào noãn, (iii) hòa màng tế bào tinh trùng với tế bào noãn, và(iv) sát nhập hai tiền nhân đực và cái để tạo nên bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội mới củaphôi Với cấu trúc của noãn sau phóng noãn, muốn lọt vào bào tương của noãn đểkết hợp với noãn tạo ra hợp tử, tinh trùng phải lần lượt vượt qua 3 chướng ngại vật,từ ngoài vào trong gồm: các lớp tế bào hạt, màng trong suốt, và màng bào tương củanoãn [41].

Chất lượng tinh trùng và chất lượng noãn bình thường là điều kiện tiên quyếtđể đảm bảo sự thụ tinh Có rất nhiều loại noãn bất thường: bất thường cấu trúcmàng trong suốt làm cho tinh trùng bình thường không thể xâm nhập; bất thườngtrong bào tương noãn: bào tương chưa trưởng thành, bào tương có không bào, lướinội bào hoặc mật độ hạt cao đều là những nguyên nhân ảnh hưởng đến thụ tinh[7] Tương tự như vậy, tinh trùng dị dạng hoặc khả năng tiến tới của tinh trùng cũnghạn chế hoặc làm tinh trùng không có khả năng thụ tinh tự nhiên với noãn.

- Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng noãn và tinh trùng:

+ Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng noãn: tuổi mẹ, bất thường về di truyền,suy tuyến yên, suy buồng trứng, buồng trứng đa nang

+ Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tinh trùng: (i) suy dinh dưỡng, (ii) nghềnghiệp: làm việc trong môi trường nhiệt độ cao kéo dài làm nhiệt độ bìu tăng,thường dẫn tới giảm sinh tinh, tinh trùng thoái hóa nhiều; làm việc tiếp xúc với hóachất, tia xạ (iii) các bệnh lý của tinh hoàn: viêm, ứ nước, chấn thương (iv) chế độsinh hoạt: uống rượu bia nhiều, hút thuốc lá nhiều, sinh hoạt tình dục quá nhiều,căng thẳng kéo dài (v) các bệnh lý ảnh hưởng đến tinh hoàn: suy tuyến yên, suythận mạn, ung thư điều trị tia xạ và (vi) một số loại thuốc: Depo-provera, Adjudinvà Gossypol là các thuốc đình sản nam, các thuốc nội tiết như corticoid hoặcandrogens nếu điều trị với liều cao và thời gian kéo dài có thể ức chế tuyến yên dẫntới ức chế quá trình sinh tinh và gây teo tinh hoàn [19]

- Điều kiện cho noãn và tinh trùng gặp nhau để thụ tinh [21]:

+ Các yếu tố tác động đến quá trình di chuyển là dịch ổ bụng, hoạt động cơtrơn của ống dẫn trứng và hoạt động của nhung mao ống dẫn trứng Vòi trứngthông, loa vòi đón được noãn rụng Nhu động vòi trứng sẽ đưa noãn đến 1/3 ngoàivòi trứng để thụ tinh

+ Tinh trùng được xuất tinh trong âm đạo có khả năng ly giải bình thường,khả năng tiến tới tốt, vượt qua được chất nhầy cổ tử cung, tiến vào buồng tử cungđể tới 1/3 ngoài của vòi trứng

- Điều kiện thời gian: ở mọi loài động vật, noãn và tinh trùng nói chung cóđời sống rất ngắn Ở người, trong đường sinh dục nữ, tinh trùng có khả năng sốngvà duy trì chức năng thụ tinh trong vòng 3–4 ngày Nếu không gặp noãn, tinh trùngsẽ tự thoái hóa Noãn khi vào vòi trứng thường có khả năng thụ tinh trong vòng 24giờ Nếu không gặp tinh trùng, noãn sẽ tự thoái hóa.

- Số lượng tinh trùng trong mỗi lần giao hợp, tinh dịch chứa:

+ Bình thường: tinh dịch trong một lần xuất tinh có thể tích > 1,4 ml, mật độtinh trùng > 16 triệu/ml, tổng số lượng tinh trùng trong tinh dịch > 39 triệu, tỷ lệtinh trùng di động > 42%, tỷ lệ tinh trùng hình dạng bình thường > 4% (WHO,2021) [102].

+ Tinh dịch không đạt tiêu chuẩn như trên khó có khả năng thụ tinh tự nhiênvà cần phải có sự giúp đỡ của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản.

b) Giai đoạn phôi phân chia:

Khi hợp tử phân chia thành 2 phôi bào vào khoảng 23–26 giờ sau thụ tinh,phôi tiến hành hàng loạt quá trình nguyên phân nối tiếp nhau liên tục làm cho sốlượng phôi bào tăng lên nhanh chóng (chỉ có nhân đôi rồi phân chia nhiễm sắc thểvà phân cắt mà không có sự lớn lên) Qua mỗi lần nguyên phân, kích thước mỗiphôi bào sinh ra trở nên nhỏ hơn Vào ngày thứ 2, phôi phân chia thường có khoảng3, 4 hoặc 5 phôi bào, ngày thứ 3 có khoảng 6–8 phôi bào (Hình 1.1) Các phôi bàotrong những lần phân chia đầu tiên (phân chia 2–4–8 phôi bào) có tính toàn năng, ítcó sự khác biệt về hình dạng, hoạt động sinh học và khả năng phát triển Càng vềsau, sự biệt hóa giữa các phôi bào ngày càng tăng lên Mỗi phôi bào sẽ thiết lậpchương trình phát triển để biệt hóa các dòng phôi bào đặc hiệu Các phôi bào đượctổ chức theo nhóm, mỗi nhóm có tốc độ phân cắt riêng để làm cơ sở cho sự hìnhthành các cơ quan sau này Vào khoảng cuối ngày thứ 3 hoặc đầu ngày thứ 4 sau thụtinh, phôi phân chia 12–32 phôi bào, gọi là phôi dâu [17, 20].

Hình 1.1 Sự phân chia của phôi trong 3 ngày đầu sau thụ tinh [84]

Sự phân chia phôi xảy ra trong quá trình phôi di chuyển từ vòi trứng đến tửcung Các tế bào hạt vây quanh noãn bị thoái hóa dần dần, màng trong suốt vẫn tồntại trong thời gian phân chia phôi đến khi phôi thoát màng rồi cuối cùng biến mất.

Vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, phôi dâu đã lọt vào khoang tử cung vàbị vùi trong chất dịch do niêm mạc tử cung tiết ra Chất dịch thấm qua màng trong

suốt vào các khoang gian bào của đại phôi bào để nuôi phôi Dần dần các khoanggian bào hợp lại và cuối cùng tạo thành một khoang xen giữa lớp tiểu phôi bào vàkhối đại phôi bào, khoang này dần dần lớn lên và gọi là khoang phôi nang haykhoang dưới mầm vì mầm phôi được tạo ra nằm phía trên nó Khối tế bào trung tâmcủa phôi dâu (các đại phôi bào) bị khoang phôi nang đẩy dần về một cực của phôivà lồi vào khoang dưới mầm được gọi là cúc phôi (hay còn gọi là nụ phôi hoặc khốitế bào nội phôi- ICM) Cúc phôi chính là mầm của phôi và cực đó gọi là cực phôi.Còn cực đối lập gọi là cực đối phôi Nếu ICM phân chia sớm ở giai đoạn này thì sẽtạo nên thai đôi Tiểu phôi bào của lớp ngoại vi của phôi dâu dẹt lại tạo nên thànhcủa khoang phôi nang, phôi ở giai đoạn này giống như một cái túi nên gọi là phôinang và giai đoạn phát triển này của phôi gọi là giai đoạn phôi nang [11, 39].

10 m

1: Nụ phôi2: Khoang dịch 3: Lá nuôi phôi

Hình 1.2 Phôi nang (hình chụp tại TTHTSS 16A, độ phóng đại ×400)

c) Sự làm tổ của phôi

Phôi vào khoang tử cung vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, khi đó phôi ởgiai đoạn cuối phôi dâu hoặc đầu phôi nang Niêm mạc tử cung sẽ cung cấp chophôi nguồn dinh dưỡng như oxy và các chất chuyển hóa.

Khi phôi vào đến khoang tử cung, phôi vẫn tiếp tục phân chia trong môitrường dịch tiết của niêm mạc tử cung vài ngày trước khi làm tổ Đến thời điểm làmtổ, màng nuôi (TE) sẽ tiết ra men tiêu protein làm thủng và tiêu dần màng trongsuốt, nhờ vậy mà phôi có thể “thoát màng” Môi trường niêm mạc tử cung cũng cómen tiêu protein như trên, nhưng cơ chế để giúp phôi thoát màng của niêm mạc tửcung vẫn chưa rõ ràng Sau khi thoát màng, phôi tự vùi mình vào niêm mạc tử cungrồi bám vào đó để phát triển, được nói là phôi làm tổ trong niêm mạc tử cung Phôilàm tổ vào khoảng ngày thứ 6 sau thụ tinh, tương ứng với “cửa sổ làm tổ” của niêmmạc tử cung vào khoảng ngày thứ 18 đến ngày thứ 21 của chu kỳ kinh.

Hình 1.3 Sơ đồ sự phát triển của phôi tiền làm tổ [11]

Lúc bấy giờ phôi đang ở giai đoạn phôi nang và niêm mạc tử cung đang ởgiai đoạn trước kinh và sẽ tiếp tục phát triển Ở cực phôi, lá nuôi được tạo ra từ cáctiểu phôi bào sẽ bám vào niêm mạc tử cung, vượt qua lớp biểu mô tử cung tiến vào

lớp đệm, phá hủy mô tử cung xung quanh để toàn bộ phôi tự vùi mình dần vào niêmmạc tử cung Sự phá hủy mô tử cung là do những enzyme tiêu protein được tiết rabởi những tế bào lá nuôi [99].

1.3 Thụ tinh trong ống nghiệm và quá trình phát triển của phôi trong thụ tinhống nghiệm

1.3.1 Quy trình thực hiện IVFa)Kích thích nang noãn

Quy trình bao gồm kích thích nang noãn, chọc hút noãn, cho tinh trùng thụtinh với noãn và nuôi thành phôi Sau đó, một số phôi sẽ được chuyển trở lại vàobuồng tử cung Quá trình phát triển của phôi và thai sẽ diễn ra hoàn toàn bìnhthường trong tử cung người mẹ Kỹ thuật này được thực hiện thành công trên thếgiới lần đầu tiên năm 1978 và thành công lần đầu tiên ở Việt nam năm 1998 [15].

Mục đích của kích thích nang noãn trong kỹ thuật hỗ trợ sinh sản là có nhiềunoãn phát triển và trưởng thành Ưu điểm của kích thích nang noãn là tạo ra nhiềunoãn để có nhiều phôi; khi có nhiều phôi có thể dễ chọn lựa được một số phôi tốtnhất cho chuyển phôi Nếu chuyển nhiều hơn một phôi thì tỷ lệ thành công của kỹthuật IVF có thể cao hơn Một ưu điểm khác là bác sỹ lâm sàng có thể kiểm soátđược cả chu kỳ, các trung tâm có thể chọn giờ và ngày lấy noãn Tuy nhiên kíchthích nang noãn cũng có những nhược điểm Các nang noãn trong buồng trứng kíchthích có thể trưởng thành không đồng đều, làm chất lượng noãn thu được có thểkhông bằng noãn của các chu kỳ tự nhiên [15].

b) Chọc hút noãn

Bệnh nhân được gây mê và tiêm thuốc giảm đau Chọc hút noãn được thựchiện dưới hướng dẫn của siêu âm đầu dò âm đạo Một cây kim chọc hút dài sẽ đượcđưa vào âm đạo, đâm xuyên qua cùng đồ để đi đến 2 buồng trứng và chọc hút cácnang noãn bằng máy hoặc bằng tay Dịch chọc hút sẽ được soi dưới kính hiển vi soinổi để tìm noãn Noãn thu được sẽ ủ ấm trong tủ CO2, 370C khoảng 3–6 giờ trướckhi được cấy với tinh trùng hoặc cho thụ tinh bằng kỹ thuật ICSI [15].

c) Chuẩn bị tinh trùng

Lấy tinh dịch người chồng bằng cách thủ dâm hoặc sử dụng bao cao suchuyên dụng Tinh dịch sẽ được đánh giá để có kỹ thuật lọc rửa chuẩn bị tinh trùngthích hợp Kỹ thuật lọc rửa tinh trùng trong labo IVF thường được áp dụng hiện naylà lọc bằng phương pháp “thang nồng độ” (gradient) và quay ly tâm để thu được cặngồm các tinh trùng có chất lượng tốt và sạch nhất, cặn bẩn, tinh trùng chết và lớptinh tương sẽ được các lớp thang nồng độ giữ lại Sau đó, lớp cặn thu được sẽ đượcrửa lại bằng môi trường rửa chuyên biệt để loại bỏ môi trường thang nồng độ do cóảnh hưởng không tốt đến tinh trùng và noãn Nếu tinh trùng có chất lượng tốt, cónhiều tinh trùng tiến tới nhanh đạt tiêu chuẩn của WHO (2021) [102], cặn ly tâmsau rửa tinh trùng sẽ được áp dụng kỹ thuật “bơi lên” (swim-up) Các trường hợptinh trùng ít, yếu hoặc hai vợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân sẽ được chỉ địnhlàm ICSI (tiêm tinh trùng vào bào tương noãn) Một số trường hợp khi xuất tinhkhông có tinh trùng thì có thể sử dụng các phương pháp thu tinh trùng từ tinh hoànhay mào tinh [12, 92] Chuẩn bị tinh trùng cho các mẫu tinh trùng ít và yếu này cóthể có nhiều cách khác nhau tùy trung tâm.

d) Tạo phôi và nuôi phôi

Sau khi chọn lọc được tinh trùng tốt, tinh trùng sẽ được tiêm vào bào tươngnoãn để tạo thành phôi, sự phát triển của phôi trong IVF tương tự với sự phát triểncủa phôi trong tự nhiên (trong tử cung người mẹ) Sáng ngày hôm sau ngày chọchút noãn (ngày 1), đánh giá thụ tinh được tiến hành 18–20h sau cấy với tinh trùngtrong kỹ thuật IVF cổ điển, 16–18h sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Đánhgiá thụ tinh bình thường khi thấy hai tiền nhân Trong trường hợp đa thụ tinh (thụtinh bất thường) sẽ thấy ba đến bốn tiền nhân (do có hơn một tinh trùng xâm nhậpvào noãn) Noãn thụ tinh bất thường cần phải được loại bỏ vì chuyển phôi thụ tinhbất thường sẽ gây chửa trứng hoặc sảy thai.

Hiện nay, các TTHTSS luôn cố gắng nuôi phôi lên phôi nang trước khichuyển phôi vào người mẹ vì nhiều lợi ích mà phôi nang mang lại Theo Deng(2020) nuôi phôi đến giai đoạn phôi nang sẽ gần với sinh lý tự nhiên, hơn khi vàobuồng tử cung mẹ, giúp cải thiện tỷ lệ có thai [34] Ngoài ra, chỉ những phôi khỏe

mới sống sót và phát triển đến giai đoạn phôi nang khi nuôi trong ống nghiệm, vàdo đó giúp lựa chọn được phôi tốt để chuyển phôi, làm tăng khả năng có thai TheoMangalraj (2009), chuyển phôi ở giai đoạn phôi nang làm tăng tỷ lệ làm tổ và tỷ lệcó thai [68] Trên thực tế, nhiều nghiên cứu nhận thấy chỉ có 1/3 số phôi phát triểnđến giai đoạn phôi nang Người ta cho rằng, ở giai đoạn phân chia sớm, sự pháttriển của phôi từ chỗ dựa vào hoạt động di truyền của noãn chuyển sang của chínhbản thân phôi Giai đoạn chuyển tiếp này hay còn gọi giai đoạn “embryo block” donhiều phôi ngừng phát triển ở thời điểm này, hay nói cách khác phôi có khả năngphát triển và làm tổ tốt hơn khi vượt qua được giai đoạn “ block” này.

Do chất lượng phôi tốt hơn, tỷ lệ làm tổ cao hơn nên chuyển phôi ở giai đoạnphôi nang có thể hạn chế số lượng phôi chuyển Nhờ vậy, nguy cơ đa thai cũng đượcgiảm thiểu [68] Đa thai là một thai nghén nguy cơ cao, ảnh hưởng lớn đến tàichính và tinh thần của bệnh nhân khi giải quyết đa thai Nếu kỹ thuật giảm thiểu thaikhông tốt, bệnh nhân có thể bị sảy thai hoặc con sinh ra khả năng dị tật sẽ cao hơn.Nếu không giảm thiểu được (ở một số nước trên thế giới pháp luật cấm giảm thiểuthai), khả năng sinh con thiếu tháng và phát triển không bình thường của trẻ sinh racũng rất lớn Nuôi phôi đến giai đoạn phôi nang phải trải qua sự chọn lọc của chínhcác phôi, vì vậy mỗi lần chỉ nên chuyển một phôi nang vào buồng tử cung người mẹ[65].

Hơn nữa, nuôi phôi nang rất cần thiết khi thực hiện kỹ thuật chẩn đoán ditruyền trước làm tổ Nuôi phôi nang giúp sinh thiết được nhiều tế bào hơn so vớigiai đoạn phân cắt trong kỹ thuật chẩn đoán và sàng lọc di truyền tiền làm tổ Gầnđây các phôi nang có chất lượng tốt đóng vai trò quan trọng trong nuôi tế bào gốc(stem cells) của người thông qua sinh thiết các tế bào của nụ phôi giúp cho việc điềutrị một số bệnh trong y học [16].

e) Sinh thiết phôi và PGT

Lựa chọn những phôi nang loại tốt và trung bình (theo đồng thuận Istanbul)để sinh thiết mẫu và tiến hành sàng lọc phôi PGT, so sánh kết quả giữa các nhómnghiên cứu (nếu bệnh nhân được chỉ định sàng lọc phôi).

- Kỹ thuật sinh thiết:

Khởi động máy vi tính và phần mềm laser Gắn kim giữ (bên trái) và kimsinh thiết (bên phải) vào hệ thống vi thao tác Chỉnh áp lực của kim sinh thiết: hút 1đoạn dầu Paraffin vào kim, tiếp theo hút 1 đoạn PVP (môi trường này có độ nhớtcao sẽ giúp cho áp lực của kim ổn định hơn) Tiến hành sinh thiết khi phôi nang có6-10 TE chui qua lỗ thủng trên màng trong suốt.

Đặt từng phôi vào từng giọt môi trường sinh thiết, để tủ ấm 37°C, trong thờigian 10 phút Xoay phôi sao cho vị trí các TE chui qua lỗ thủng màng trong suốttương ứng với điểm 3 giờ Cố định phôi bằng kim giữ tại vị trí 9 giờ Dùng kim sinhthiết MBB-FP XS-35-Origio có đường kính trong 23-27µm, đầu vát 35° vừa hútvừa kéo các TE, kết hợp với laser để tách rời các TE được sinh thiết khỏi phôi.Chuẩn bị đĩa rửa các TE sinh thiết: 3 giọt môi trường rửa phôi với thể tích 30µl mỗigiọt trong đĩa petri kích thước 30x10mm (Falcon) Các TE sinh thiết được rửa qua 3giọt môi trường rửa phôi, rồi chuyển vào tuýp eppendorf cùng với thể tích PBS2,4µl, cất trong hộp chuyên dụng và gửi đến labo sinh học phân tử.

- Kỹ thuật PGT: được sử dụng dựa trên quy trình tách chiết, khuếch đại, chuẩn bịthư viện và giải trình tự ADN của mẫu tế bào phôi bằng bộ Kit VeriSeq PGS trên hệthống Miseq - Illumina Phân tích dữ liệu giải trình tự bằng phần mềm MiseqReporter và BlueFuse Multi để xác định lệch bội NST của mẫu phôi bào Cácphương pháp xử lý mẫu, phân tích dữ liệu tuân thủ các khuyến cáo của Hiệp hộiChẩn đoán di truyền tiền làm tổ quốc tế (PGDIS), Hiệp hội Sản khoa Hoa Kỳ(ASRM), và Hiệp hội Phôi học và Sinh sản Châu Âu (ESHRE).

1.3.2 Hệ thống nuôi phôi trong thụ tinh ống nghiệm

Hình 1.4 Hệ thống nuôi phôi trong phòng Labo [45]

Hệ thống nuôi phôi bao gồm môi trường nuôi phôi, dụng cụ nuôi, tủ nuôi vàhệ thống các khí (Hình 1.4) Hệ thống nuôi phôi bao gồm không chỉ tương tác củaphôi với môi trường vật lý xung quanh nó mà còn giữa các thông số trong labo [45].Nuôi phôi thành công trong labo phụ thuộc chủ yếu vào quản lý chất lượng(QC) và đảm bảo chất lượng (QA) Trước hết, bất cứ vật dụng gì mang vào phòngnuôi phôi đều phải đảm bảo không gây độc cho phôi Ngoài ra, việc quản lý các quytrình kỹ thuật trong phòng nuôi và quản lý các nhân viên phòng nuôi phôi cũng nhưquản lý các trang thiết bị, môi trường nuôi, không khí trong phòng nuôi phôi đềuquan trọng nhằm đảm bảo tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt đồng thời hạn chế tối đa cácsự cố Hơn nữa, cần đào tạo kiến thức chuyên môn cho các nhân viên phòng nuôiphôi để tư vấn, cung cấp thông tin đầy đủ cho bệnh nhân Mục đích của hệ thốngnuôi phôi là:

- Nâng cao tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt và đáp ứng được nhu cầu của các cặpvợ chồng vô sinh là có những em bé khỏe mạnh.

- Cung cấp thông tin đầy đủ về noãn, tinh trùng, phôi cho bệnh nhân Bệnhnhân phải có quyền được giải thích, tư vấn về những kỹ thuật áp dụng trên noãn,tinh trùng, phôi của họ và có quyền tham gia vào các quyết định đối với noãn, tinhtrùng, phôi của họ.

- Tránh nhầm lẫn mẫu noãn, tinh trùng, phôi [70].

Để đạt được mục đích của hệ thống nuôi cần phải có các chính sách đườnglối cụ thể: các luật, các quy định, các pháp chế, các quy trình của phòng nuôi phôiđược tạo thành một hệ thống tài liệu Các tài liệu có thể sử dụng được cho tất cả mọingười và được kiểm soát thông qua các quy trình kiểm tra tài liệu.

1.3.3 Quá trình phát triển của phôi và các chỉ số đánh giá sự phát triển của phôitrong IVF

Sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương noãn, phôi được hình thành và pháttriển lên giai đoạn phôi phân chia: 2 tế bào, 4 tế bào, 8 tế bào, phôi dâu và cuối cùnglà phát triển thành phôi nang Quá trình phát triển của phôi trong IVF thường kéodài khoảng 5 ngày, những phôi phát triển chậm có thể kéo dài đến 6 ngày ở môitrường bên ngoài.

Trong IVF, việc đánh giá chính xác chất lượng phôi là một trong những yếutố quan trọng ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công Trong các hệ thống phân loại nóichung, đối với phôi giai đoạn phân chia, các chỉ tiêu đánh giá bao gồm: số lượngphôi bào, sự phân mảnh, tính đối xứng; có thể ghi nhận thêm sự hiện diện của hiệntượng đa nhân và trạng thái nén chặt của các phôi bào Đối với phôi nang, các đặcđiểm đánh giá bao gồm: độ nở rộng của khoang, đặc điểm ICM và khối tế bào lánuôi (trophoblast) [11].

a) Đánh giá phôi giai đoạn phân chia sớm:

Khoảng 16 giờ sau khi thụ tinh, xuất hiện 2 tiền nhân Ở một số bệnh nhân,tiền nhân có thể xuất hiện sớm 12–14 giờ sau khi thụ tinh hoặc xuất hiện muộn sau20–22 giờ Sự phân chia đầu tiên xảy ra khoảng 20–24 giờ sau khi thụ tinh Bìnhthường cứ mỗi 24 giờ, phôi có số lượng phôi bào phát triển tăng gấp đôi Vào ngày

thứ 2, phôi phát triển bình thường sẽ có 2 đến 4 phôi bào và có khoảng 8 phôi bàovào ngày thứ 3 Trong quá trình phát triển phôi trải qua 3 chu kỳ phân chia Thờiđiểm của 3 chu kỳ phân chia lần lượt là 35,6 giờ; 45,7 giờ và 54,3 giờ sau khi thụtinh Số lượng phôi bào không chẵn có thể gặp ở phôi phát triển bình thường dophôi bào đang trong giai đoạn phân bào hoặc do sự phân chia của các phôi bàokhông đồng bộ Cuối ngày thứ 3 sau khi phát triển thành 8 phôi bào (rất ít trườnghợp phát triển đến 16–32 phôi bào) phôi sẽ kết dính và bắt đầu xuất hiện nhữngnang nhỏ vào cuối ngày thứ tư [11]

Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm dựa vào các tiêu chí sau: sốlượng phôi bào, sự đồng đều về kích thước giữa các phôi bào và các mảnh vỡ bàotương.

- Đánh giá số lượng phôi bào

Giai đoạn phân chia của phôi bắt đầu từ giai đoạn phôi 2 phôi bào đến giaiđoạn nén của phôi dâu gồm 8–16 phôi bào Các nghiên cứu gần đây cho thấy bêncạnh thời điểm phân chia, khoảng cách thời gian giữa các lần phân chia cũng rấtquan trọng Nếu tất cả các phôi bào phân chia đồng bộ một cách chính xác, chúng tachỉ quan sát được các phôi 2, 4, 8 phôi bào Tuy nhiên, trong thực tế, chúng tathường quan sát thấy các phôi 3, 5, 6, 7 hoặc 9 tế bào, điều này cho thấy sự pháttriển không đồng bộ giữa các phôi bào Thời điểm đánh giá phôi được nghiên cứuvà thiết lập nhằm đánh giá chính xác tính động học của phôi Số lượng phôi bào làđặc điểm chính, có giá trị tiên lượng cao nhất trong đánh giá chất lượng phôi Phôichất lượng tốt phải là phôi thể hiện tính động học thích hợp và tính đồng bộ trongcác giai đoạn phân chia Ở phôi có sự phát triển bình thường, sự phân chia phôi bàosẽ diễn ra cách nhau 18–20 giờ Các phôi phân chia quá chậm hoặc quá nhanh cóthể có những khiếm khuyết ở nhiễm sắc thể hoặc ở quá trình trao đổi chất.

Trong đánh giá phôi giai đoạn phân chia, các mốc thời gian quan sát tốt nhấtđược thông qua trong hội thảo đồng thuận Istanbul (Alpha Scientists inReproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011)như sau: Ngày 1: (26 ± 1) giờ sau ICSI, (28 ± 1) giờ sau IVF: 2 phôi bào; Ngày 2:

(44 ± 1) giờ, 4 phôi bào; Ngày 3: (68 ± 1) giờ, 8 phôi bào.

30

- Đánh giá độ đặc hiệu về kích thước giữa các phôi bào theo từng giai

Theo lý thuyết, quá trình nguyên phân sẽ tạo ra 2 phôi bào có kích thướcbằng nhau Kích thước phôi bào trong một phôi phụ thuộc vào số lần phân chia vàđộ đồng đều của mỗi lần phân chia Do đó, để đánh giá chất lượng phôi giai đoạnphân chia một cách chính xác hơn, người ta đưa ra hai khái niệm: phôi “stagespecific” và “non-stage specific” Việc phân loại được thực hiện dựa trên số lượngphôi bào và kích thước phôi bào (Hình 1.5) Theo đó, phôi có các phôi bào đúngkích thước (stage specific) là:

- Phôi có 2, 4, 8 phôi bào: các phôi bào có kích thước giống nhau- Phôi 3 có phôi bào: 1 phôi bào to và 2 phôi bào nhỏ

- Phôi 5 có phôi bào: 3 phôi bào to và 2 phôi bào nhỏ- Phôi 6 có phôi bào: 2 phôi bào to và 4 phôi bào nhỏ- Phôi 7 có phôi bào: 1 phôi bào to và 6 phôi bào nhỏ

Hình 1.5 Quan điểm về phân loại phôi

Màu xanh đậm là các phôi bào đúng kích thước (stage specific), màu xanh nhạt làcác phôi bào không đúng kích thước (non stage specific)

(Nguồn: Fernando, 2012) [82]

- Đánh giá độ phân mảnh bào tương

Ở phôi đang phân chia, quá trình nguyên phân thường tạo ra các mảnh tế bàochất, không chứa nhân được bao quanh bởi một màng plasma, gọi là mảnh vỡ tế bào(fragment) Kích thước và sự phân bố các mảnh vỡ tế bào bên trong khoảng khônggian bao quanh là màng trong suốt (zona pellucida) thường rất khác nhau Người tathường sử dụng lượng mảnh vỡ tế bào để dự đoán khả năng làm tổ của phôi và sựlệch bội Tuy nhiên, nếu mảnh vỡ tế bào chỉ chiếm ít hơn 10% thể tích toàn bộ phôithì không ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển của phôi [11].

Mức độ phân mảnh thường được biểu diễn theo tỉ lệ phần trăm trong tổng thểtích tế bào chất và được chia thành 3 cấp độ:

 Phân mảnh thật: xuất hiện tách hẳn ra khỏi phôi bào và hiện diện trongsuốt quá trình phát triển của phôi.

 Phân mảnh giả: xuất hiện tạm thời trong giai đoạn phân chia của phôi vàkhông hiện diện trong quá trình phát triển sau này của phôi.

b) Đánh giá chất lượng phôi nang

Thời điểm này phôi tiếp tục phân chia, số lượng các phôi bào tăng dần vàphát triển thành phôi nang Phôi nang phát triển hoàn toàn vào ngày thứ 5 Số lượngphôi bào ở thời điểm này vào khoảng 50 đến 150 phôi bào và bao gồm 2 loại:

- Loại phôi bào thứ nhất hình thành ICM sau này sẽ phát triển thành thai,chiếm khoảng từ 20–30% tổng số phôi bào Ngoài ra kích thước ICM còn là tiêuchuẩn quan trọng nhất đối với tỉ lệ thành công làm tổ của phôi Để chi tiết hơn,Gardner và cộng sự (1999) đã phân loại ICM thành 3 loại: loại A khi các tế bàonhiều, gắn kết chặt chẽ; loại B có một vài tế bào, gắn kết lỏng lẻo; và loại C có rất íttế bào [43].

- Loại phôi bào thứ hai là tế bào lá nuôi sẽ phát triển thành các phần phụ củathai Tế bào lá nuôi tạo thành một lớp bao quanh ICM.

Ở giữa là khoang phôi chứa đầy dịch do hai loại tế bào này tiết ra để bảo vệvà nuôi dưỡng thai Vào giai đoạn này, màng trong suốt bị dàn mỏng ra và baoquanh như một màng mỏng, sau đó màng trong suốt vỡ ra để các phôi bào thoát rangoài màng gọi là hiện tượng phôi thoát màng chuẩn bị cho sự làm tổ của phôitrong tử cung.

1.3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của phôi trong IVF

1.3.4.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng

Trước đây, người ta thường sử dụng môi trường nuôi phôi bên ngoài đếnngày thứ 2 hoặc 3 khi phôi đạt đến giai đoạn 4–8 phôi bào Gần đây, nhiều nghiêncứu hơn về sự trao đổi chất của phôi, nhu cầu cụ thể của phôi từng giai đoạn vàphân tích rõ về môi trường ống dẫn trứng và tử cung, các nhà khoa học đã có thểnuôi phôi đến giai đoạn phôi nang, chọn lựa được phôi có tiềm năng phát triển vàgiúp đồng bộ hóa phôi với đường sinh sản người phụ nữ.

Các thành phần trong môi trường nuôi phôi (Bảng 1.1) bị ảnh hưởng bởi hainguyên lý khác nhau cơ bản: (i) tôn trọng sự biến đổi môi trường nuôi phôi tuần tựtrong tự nhiên, hoặc (ii) giảm tối đa sự căng thẳng cho tế bào/tiêu tốn năng lượngcủa phôi trong việc thích nghi với sự thay đổi môi trường liên tục Trước năm 2016,đa số các TTHTSS tại Việt Nam đều chỉ sử dụng môi trường nuôi đa bước Hiệnnay, các TTHTSS tại Việt Nam và thế giới đang sử dụng song song cả hai loại môitrường thương mại là môi trường đơn bước và đa bước.

Bảng 1.1 Thành phần chính của một số môi trường nuôi phôi [47]

Potassium chloride Potassiumchloride

Calcium chloride Calcium chloride Calcium chlorideMonopotassium

Sodium citrate Sodium citrate

Magnesium sulphate Magnesiumsulphate

Magnesiumsulphate

Sodium pyruvate Sodium pyruvate Sodium pyruvate

Môi trường nuôi phôi có thành phần rất phức tạp Những thành phần trongmôi trường nuôi này sẽ hỗ trợ phôi trong quá trình phát triển Một số thành phầnđóng vai trò cung cấp năng lượng, một số thành phần giúp cân bằng nội môi, trongkhi đó một số thành phần tạo ra pH tối ưu cho sự phát triển.

a)Nước: Là thành phần cơ bản của bất kỳ loại môi trường nuôi phôi Nguồn

nước và độ tinh khiết của nước có vai trò rất quan trọng, đảm bảo chất lượng củamôi trường [44] Có thể sử dụng nước cất với hệ thống lọc siêu sạch hoặc nước cấtđã được thương mại Dù sử dụng loại nào, nước trong môi trường nuôi cũng phảiđảm bảo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt, chẳng hạn đạt các tiêu chuẩn vô khuẩn củaDược điển Hoa Kỳ (USP)/Châu Âu (EP) dành cho nước pha tiêm (USP/EPCertified Water) Nước khi kết hợp với các thành phần khác cũng cần được kiểm trachất lượng trước khi dùng trong điều trị [83].

b)Ion và áp suất thẩm thấu: các ion bổ sung trong thành phần nuôi phôi đầu

tiên được mô tả dựa vào môi trường Krebs-Ringer Bicarbonate (KRB) bao gồmNa+, K+, Mg2+, Ca2+, SO42-, PO43- và HCO3- [44] Đây là dung dịch muối ion cơ bảnđược sử dụng cho đến những năm 1980 Sau đó, các thí nghiệm trên chuột sau đóvới môi trường dịch vòi trứng (Human tubal fluid – HTF) cho thấy tỉ lệ dư thừa Na+

và K+ gây ức chế sự phát triển của phôi [83] Tiếp theo, những phát hiện về ảnhhưởng của phosphate và glucose trên phôi chuột gây ngừng phát triển phôi giaiđoạn sớm dẫn đến việc loại bỏ phosphate ra khỏi môi trường nuôi và bổ sung cácacid amin, vitamin, EDTA để loại trừ các ức chế này [44] Mg2+ và Ca2+ đóng vai tròquan trọng trong quá trình nén của phôi Tuy nhiên, nghiên cứu trên phôi chuột ởgiai đoạn 1 đến 2 tế bào cho thấy nồng độ Ca2+ dư thừa làm giảm khả năng pháttriển của phôi [60] Ngoài các ion nói trên, HCO3- là ion có vai trò rất lớn được sửdụng trong hệ đệm của môi trường nuôi nhằm duy trì độ pH sinh lý cho phôi pháttriển [83].

Nồng độ và thành phần các ion khác nhau tùy thuộc vào từng loại môitrường, nồng độ các ion ngoại bào có thể ảnh hưởng đến nồng độ ion nội bào Dovậy, ion đóng vai trò rất lớn trong việc quyết định áp suất thẩm thấu của môi trườngnuôi Cho đến nay, áp suất thẩm thấu tối ưu của môi trường nuôi phôi người vẫnchưa được khẳng định Áp suất thẩm thấu ở một số môi trường nuôi truyền thốngthường được duy trì ở mức 275–295 mOsmols [44].