Luận án tiến sĩ hóa học: Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đa siêu vi lượng một số hoá chất bảo vệ thực vật

DANH MUC CAC BANGThời gian lưu của các HCBVTV nghiên cứu Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp D Đường chuẩn Hamilton Pha dung dịch hỗn hợp chuẩn G Đường chuẩn Hamilton Thời gian lưu của các chất

1.1.1 Cac kỹ thuật chiết tach và lam giàu mẫu truyền thống

1.1.2 Cac kỹ thuật chiết tách và làm giàu mẫu tiên tiến1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CONG CU PHAN TÍCH HOÁ CHAT BẢO VỆ

THỰC VẬT (HCBVTV)1.2.1 Một số phương pháp phân tích công cụ tiêu biểu: sắc ký lỏng

cao áp (HPLC), sắc ký khí (GC)

1.2.2 Phương pháp phân tích hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA)

1.3 TONG QUAN VỀ CÁC NHÓM HOA CHẤT BẢO VỆ THỰC VAT

ĐƯỢC ĐỀ CẬP ĐẾN TRONG LUẬN ÁN

1.3.1 Đặc tính chung của các nhóm HCBVTV cơ clo - co clo họ

xyclodien, nhóm cơ phôtpho, nhóm pyrethroit

1.3.2 Dư lượng của các nhóm HCBVTV cơ clo - cơ clo họ xyclodien,

nhóm cơ phôtpho, nhóm pyrethroit trong môi trường

1.4 CÁC ĐÁNH GIA RUT RA TỪ PHAN TONG QUAN

1.4.1 Đánh giá các phương pháp chiết tách làm giàu mẫu 1.4.2 Đánh giá các phương pháp phân tích công cụ xác định

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

2.2.1 Phương pháp lấy mau rau, đất, nước và bao quan mẫu

2.2.2 Phương pháp xây dựng quy trình chiết đa dư lượng HCBVTV

bằng kỹ thuật SPME và LPME 2.2.3 Phương pháp phân tích mau that

2.3.2 Sử dụng phương pháp ELISA phân tích mẫu nước, mẫu rau va 43

mẫu đất

2.3.3 Xây dựng, đánh giá và áp dụng phương pháp SPME kết hợp GC- 50

ECD phân tích mẫu nước và mẫu đất

2.3.4 Xây dựng, đánh giá và áp dụng phương pháp LPME kết hợp 64

GC-ECD phân tích mẫu nước

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1 KẾT QUA SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA PHAN TÍCH MAU 69

NƯỚC, MẪU RAU VÀ MẪU ĐẤT

3.1.1 Phan tích HCBVTV họ xyclodien bằng phương pháp ELISA 69

3.1.2 Đánh giá phương pháp ELISA để3.2 KẾT QUA XÂY DỰNG, ĐÁNH GIA VÀ ÁP DỤNG PHƯƠNG PHAP VỊ 79

CHIẾT PHA RẮN SPME KẾT HỢP GC-ECD PHÂN TÍCH MẪU NƯỚC

VÀ MẪU ĐẤT

3.2.1 Ché tao dụng cụ SPME 79 3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết mẫu nước 81

3.2.3 Xây dựng đường chuẩn hấp thu 86

3.2.4 Đánh giá phương pháp SPME chiết HCBVTV khỏi mau nước va 87

quy trình SPME/GC-ECD phân tích mẫu nước

3.2.5 Kết quả sử dụng quy trình SPME/GC-ECD phân tích mẫu nước 9]

thực tế

3.2.6 Khảo sát va tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết 93

HCBVTV cơ clo, cơ phôtpho, pyrethroit từ mẫu đất bằng

HS-SPME3.2.7 Xây dựng đường chuẩn phân bố phục vụ phân tích mẫu đất 97

3.2.8 Đánh giá phương pháp HS-SPME chiết HCBVTV khỏi mau đất 98

và phương pháp HS-SPME/GC-ECD phân tích mẫu đất

3.29 Áp dụng phương pháp HS-SPME/GC-ECD phân tích mẫu đất 101

thuc té

3.3 KẾT QUA XÂY DUNG, ĐÁNH GIA VA ÁP DUNG PHƯƠNG PHAP 103

LPME KET HOP GC-ECD PHAN TÍCH MAU NƯỚC

3.3.1 Chọn loại dung môi va thể tích giọt dung môi 103

3.3.2 Xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình vi chiết 104

3.3.3 Xây dung đường chuẩn hấp thu dé phân tích mẫu nước 108

3.3.4 Đánh giá phương pháp LPME chiết HCBVTV khỏi mẫu nước 108

3.3.5 Kết quả áp dụng phương pháp LPME/GC-ECD phân tích mẫu 110

nước thực tế

KẾT LUẬN 113

NHUNG CONG TRÌNH ĐÃ CONG BO LIEN QUAN DEN LUẬN AN 115

TAI LIEU THAM KHAO 116.

CAC PHU LUC 132

GC/MS

HCB HCH

TS S-LPME

SPE

SPME

US-EPA WHO

extraction Enzyme linked immuno sorbent

assay

Gas Chromatograph Electro Capture Detector

-Gas chromatograph-Mass Spectrometer

Hexachlorobenzene

Hexachohrocyclohexane (Lindane)

Plant Protection Chemical

High Performance Liquid

Chromatograph Immunoassay

Head space (HS)

Tên tiếng Việt

Điện di mao quản

Khả năng tham gia các

phản ứng chéo

Diclodiphenyldicloetan

Diclodiphenyltricloetan

Vi chiét pha long - dong

Phuong phap hap phumién dich gan enzym

Không gian hơi

Nồng độ thuốc gây chết cho 50% cá thể động vật thí nghiệm

(mg hoạt chat/m* không khí hoặc mg hoạt chất/lít nước)

Liều lượng thuốc gây chết cho 50% cá thể động vật thí nghiệm(mg hoạt chất/kg khối lượng cơ thể)

Liquid phase extraction

Liquid phase micro extraction Polydimetylsiloxan

Polymetylphenylsiloxan Retention time

Chiét pha long

Vi chiét pha long Polydimetylsiloxan

DANH MUC CAC BANG

Thời gian lưu của các HCBVTV nghiên cứu

Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp D Đường chuẩn Hamilton

Pha dung dịch hỗn hợp chuẩn G

Đường chuẩn Hamilton

Thời gian lưu của các chất chuẩn

Nồng độ các chất trong hỗn hợp chuẩn

Đường chuẩn Hamilton

Nong độ các HCBVTV trong mẫu giả Hiệu suất thu hồi của mẫu đất và mẫu rau bằng phương pháp

ELISA

Nong độ của xyclodien trong các mẫu nước tại Vân Nội

Nồng độ xyclodien trong một số mẫu nước bổ sung tại Vân

Nội

Hàm lượng xyclodien trong các mẫu đất tại Vân Nội

Hàm lượng xyclodien trong các mẫu rau lấy tại khu vực trồng

rau Vân Nội

Hàm lượng xyclodien trong các mẫu rau lấy tại chợ Vân Nội

Tiêu chuẩn cho phép của các thuốc trừ sâu cơ clo họ

xyclodien trong môi trường

Hàm lượng xyclodien trong các mẫu rau lấy tại 8 chợ nội

So sánh kết quả phân tích các xyclodien trong một số mẫu

nước, đất và rau bằng các phương pháp ELISA, chiết lỏng —lỏng, lỏng-rắn/ sắc ký khí, SPME/sac ký khí

Kết quả tính độ dày màng theo phương pháp khối lượng

Trang

50 31 51 53

53

64 64 65

65

71

72 Tả

73 74

Đường chuẩn hấp thu phục vụ phân tích mẫu nước bằng

Kết qua phân tích mẫu thật (nồng độ tính theo ng/l)

Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của áp suất

Khảo sát thời gian cân bằng phân bốĐường chuẩn phân bố phục vụ phân tích mẫu đất bằng

HS-SPME kết hợp GC-ECD

Xác định hằng số phân bố Kpb và hệ số làm giàu điều kiện

Xác định độ thu hồi của phương pháp Kết quả xác định các mẫu đất thực tế

Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết

Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chiết

Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu quả chiết Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu quả chiết

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết

Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu quả chiết

Đường chuẩn hấp thu để phân tích mẫu nước bằng

86 87

88 89

09 100 102

103

104 105 106

107 107 108

109

109

111

Sơ đồ dụng cụ vi chiết pha rắn

Quá trình lấy mẫu

Quá trình giải hấp chất vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí

Hệ các pha tồn tại trong quá trình vi chiết pha rắn

Các bước tiến hành của phương pháp ELISA

Sự di chuyển, phân bố của HCBVTVtrong môi trường

Con đường xâm nhập của HCBVTV vào cơ thể con người

Quy trình phân tích HCBVTV cơ clo họ xyclodien trong các

mẫu môi trường bằng phương pháp ELISA

Quy trình phân tích HCBVTV co clo họ xyclodien trong

mẫu nước bằng phương pháp sắc ký khí

Quy trình phân tích HCBVTV co clo họ xyclodien trong

mẫu rau bằng phương pháp sắc ký khí

Quy trình phân tích HCBVTV co clo họ xyclodien trong

Ảnh hưởng của độ dày pha tĩnh đến thời gian cân bằng

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả chiết

Quy trình phân tích đa dư lượng các HCBVTV bằng phương

pháp SPME

Quy trình HS-SPME/GC-ECD phân tích các HCBVTV từ

mẫu đất Quy trình phân tích mẫu nước thực tế bằng phương pháp

28

33

35 +

47

48 49

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp Trong thập kỷ 90, chính sách hỗ trợ phát

triển nông nghiệp của nhà nước đã tạo những tiến bộ rõ rệt, đưa nước ta lên hàng

thứ 3 về xuất khẩu gạo Về rau xanh năng suất bình quân đạt 150 tạ/ha, gần bằng

mức bình quân trung bình của thế giới là 170 tạ/ha Góp phần vào thành công này cần phải nói đến những đóng góp của khoa học kỹ thuật về giống cây trồng và bảo

vệ cây trồng [7, 16, 17].

Theo thống kê của Cục Bảo vệ Thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông

thôn, cho tới nay đã có hon 300 loại hoá chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) có mat trên thị trường với nhiều các hoạt chất khác nhau [2, 3, 4, 5] Tuy nhiên, ngoài tác

động tích cực là giúp vụ mùa bội thu thì cũng chính các HCBVTV gây ra những

tác hại đáng kể tới môi trường sinh thái do tồn dư của các loại hóa chất này và sự

di chuyển của chúng theo các sản phẩm nông nghiệp cũng như nguồn nước được

sử dụng để tưới tiêu [26, 30, 45, 46, 68, 69, 70, 86, 97, 117, 118, 121].

Su đa dạng về chủng loại của các HCBVTV, đòi hỏi rất nhiều phương pháp

khác nhau để phân tích từng loại hợp chất cần quan tâm [20, 31] Vài năm gần đây,nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã chú trọng tới việc phát triển một phương

pháp phân tích nhanh, có khả nang áp dụng cho nhiều đối tượng HCBVTV với kết

quả tương đối chính xác phục vụ việc quan trắc, đánh giá sơ bộ trên diện rộng dư

lượng HCBVTV trong môi trường Trong số đó phải kể đến các phương pháp như

phương pháp hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA-Enzyme Linked Immuno

sorbent assay), vi chiết pha rắn (SPME- Solid Phase Microextraction) và vi chiết

pha lỏng (LPME-Liquid Phase Microextraction) Đây đều là những phương pháp

phân tích nhanh để xác định nồng độ HCBVTV trong nước, đất và rau quả Phương pháp ELISA dựa trên khả năng liên kết chọn lọc của kháng thể đặc hiệu với các

phân tử phân tử thuốc trừ sâu (TTS) [14, 23, 59] Khác với ELISA, phương pháp

SPME sử dụng những hợp chất cao phân tử được phủ lên một sợi silica Khi cho

sợi này tiếp xúc với mau nước hoặc không gian hơi (KGH: Head space -HS) của mẫu, các HCBVTV sẽ bị hấp thu lên lớp polyme nay Quá trình tiếp đến là quá

trình giải hấp nhiệt các chất cần phân tích trong buồng bơm mẫu của máy sac ký

khí (GC) để phân tích [11, 33, 56, 111] Phương pháp LPME sử dụng giọt dungmôi hữu cơ không tan trong nước được giữ ở đầu kim tiêm của xyranh để chiết

chất phân tích từ dung dịch nước hoặc từ KGH của mẫu [85, 149].

Do yêu cầu thực tế, trong đề tài này chúng tôi tập trung nghiên cứu:

1 Thử nghiệm phân tích da dư lượng vết TTS co clo họ xyclodien bằng phương pháp ELISA, nhằm mục đích khẳng định hướng nghiên cứu mới cho những

nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này Sở dĩ chúng tôi không mở rộng phương

pháp cho nhiều TTS vì ELISA yêu cầu các enzym đặc trưng chọn lọc cho từng loại

TTS một [89, 108, 112].

2 Thay thé một số bộ phận của dụng cụ SPME ngoại nhập bằng các nguyên

vật liệu rẻ tiền sắn có trong nước Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trìnhphân tích để tối ưu hóa điều kiện phân tích

3 Xây dựng quy trình phân tích đa dư lượng HCBVTV trong mẫu đất rắn qua

KGH bằng phương pháp SPME (HS-SPME); phát triển và áp dụng phương pháp vi

chiết (SPME, LPME) cho đối tượng là các HCBVTV trong các mẫu nước.

4 Áp dụng phương pháp SPME và LPME kết hợp với sắc ký khí đetectơ cộng

kết điện tử (GC-ECD) phân tích, xác định đa dư lượng HCBVTV trong mẫu nước,

mẫu đất ở một số vùng quanh Hà Nội, Hải Phòng và một số tỉnh thuộc đồng bằng

sông Cửu Long Đánh giá mức độ 6 nhiêm HCBVTYV tại các khu vực đó.

Những kết quả nghiên cứu của đề tài nhằm góp phần phát triển phương

pháp phân tích lượng vết của các HCBVTV được sử dụng trong nông nghiệp ở Việt

Nam với khả năng tiến hành nhanh và áp dụng rộng cho nhiều đối tượng Việc tự

chế dụng cụ SPME góp phần làm giảm chi phí phân tích mau và sự phụ thuộc vào

dụng cụ SPME ngoại nhập Các quy trình phân tích HCBVTV (phương pháp

ELISA, SPME và LPME) đã được đề cập trong đề tài với độ nhạy và độ chính xác

cao từ đó cung cấp những thông tin đáng tin cậy, giúp cơ quan chức năng có cơ sở

để đưa ra các quy định cần thiết cho việc sử dụng các HCBVTV thuộc các ho đã

nghiên cứu.

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CAC PHƯƠNG PHAP CHIET TÁCH LAM GIAU

TRONG PHAN TICH

Lượng tồn du các loại HCBVTV trong môi trường ngày càng tang va đa dạng

với nồng độ thường rất nhỏ, thậm chí dưới cả giới hạn phát hiện của các thiết bị

hiện đại nhất Thêm vào đó thành phần mẫu môi trường thường phức tạp nên càng

khó phân tích [24, 34, 35, 49, 51, 54, 55, 80, 109].

Quá trình phân tích dư lượng HCBVTV gồm 2 bước chính:

- Bước 1: Chiết tach, làm giàu va làm sạch mẫu.

- Bước 2: Dùng các thiết bị phân tích để tách và định lượng các chất

Trong đó chiết tách, làm giàu mẫu là công việc chiếm thời gian dài và đòi hỏi nhiều nhân lực nhất, nhưng đây lại là khâu quan trọng trong quá trình phân tích.

Tuỳ theo đặc tính của mẫu môi trường và tính chất của các HCBVTV, một số kỹ

thuật chiết tách đã được nghiên cứu áp dụng Phần dưới đây sẽ trình bày tổng quan

về một số kỹ thuật chiết tách, làm giàu mẫu theo phương pháp truyền thống và

phương pháp tiên tiến sử dụng dé phân tích đa dư lượng HCBVTV trong mẫu môi

trường.

1.1.1 Các kỹ thuât chiết tách và làm giàu mẫu truyền thống

a Chiết pha long (LPE) a, Chiết long- lỏng: Chiết lỏng- long là một kỹ thuật tách đơn giản, khá

thuận lợi cho việc tách chiết nhờ độ phân cực của các dung môi nằm trong một

khoảng rộng, thường được dùng để tách hoặc làm sạch các chất cần phân tích ra

khỏi nền mẫu [9] Tuy nhiên, phương pháp này cần sử dụng lượng dung môi lớn,

đây là một nhược điểm về chi phí cũng như trên khía cạnh bảo vệ môi trường

Khi chiết các HCBVTV nhóm cơ clo và cơ phôtpho bằng phương pháp LPE

có thể dùng loại dung môi ít phân cực như điclometan để chiết ra cùng lúc, vì phần

lớn chúng có độ phân cực thấp Mẫu sau chiết được đuổi dung môi bằng dòng khí

N, sạch, rồi định mức lại bang các dung môi khác nhau tuỳ theo nhóm chất phantích Ví dụ, nếu phân tích nhóm cơ phôtpho thì thêm 1 ml etylaxetat rồi bơm lên

máy sắc ký khí đetectơ NPD, nếu phân tích nhóm cơ clo PCB, clophenol thì thêm

1 ml n- hexan rồi bơm lên máy sắc ký khí đetectơ ECD [10]

a; Chiết lỏng- rắn (thiết bị Soxhlet): Cơ sở của chiết long- rắn chính là sự

khuếch tán của dung môi chiết trong hỗn hợp rắn [25] Kỹ thuật chiết này thường

được dùng để tách các chất cần tách ra khỏi mẫu rắn bảng dung môi thích hợp.

Muốn tăng hiệu quả chiết, phải tăng diện tích tiếp xúc của dung môi với chất cần

tách bằng cách nghiền nhỏ mẫu Tùy vào độ phân cực của các chất cần tách mà ta

lựa chọn dung môi chiết cho phù hợp, ví dụ đối với các chất có độ phân cực thấp

thì chọn dung môi ít phân cực như n- hexan, xyclohexan, diclometan Kỹ thuật này

thường áp dụng để phân tích dư lượng HCBVTV trong đất, trầm tích

b Chiết pha rắn (SPE) [130]: Phương pháp SPE làm giàu và làm sạch các

chất phân tích từ mẫu lỏng bằng cách hấp phụ vào cột chứa chất hấp phụ ran, rồi

dùng dung môi thích hợp để rửa giải [13, 20] Phương pháp SPE mới xuất hiện từ

giữa những năm 1970, nhưng với những ưu điểm như khả năng làm sạch và làm

giàu chất phân tích lớn, tiết kiệm dung môi, dễ tự động hoá, hiệu suất thu hồi cao,

an toàn va dé sử dụng Phương pháp SPE đã dần dần thay thế phương pháp LPE.

Phương pháp SPE với các pha rắn là cacbopack B (GCB), XAD- 4 đã được sử dụng nhiều để chiết đa dư lượng HCBVTV [12] Ví dụ, cacbopack B được dùng để

chiết các loại chất ô nhiễm hữu cơ như các thuốc trừ sâu cơ clo, triazin, các loại

thuốc diệt có phenoxi axit, các phenol, cloanilin, hidrocacbon thơm có trong

nước XAD- 4 là một chất hấp phụ thông dụng đối với các chất phân cực trong

nước, các chất hoạt động bề mặt, các dược phẩm, các HCBVTV và các chất ônhiễm có tính thơm trong nước.

1.1.2 Các kỹ thuật chiết tách và làm giàu mau tiên tiến [33, 36, 49, 50, 53, 58]

a Vi chiết pha rắn (SPME) [84, 119, 103, 104, 110]:

Kỹ thuật vi chiết pha ran (SPME) được Pawlyszyl va các cộng su đề xuất tạitrường đại hoc Waterloo (Ontrio, Canada, 1989), có nguyên tac dựa trên cơ chế hấp thu của các chất hữu cơ cần phân tích từ pha nước hoặc pha khí lên sợi chiết.

Chất phân tích sau đó sẽ được giải hấp khỏi sợi chiết bằng nhiệt hoặc dung môi và

đưa vào thiết bị phân tích.

a, Gidi thiéu vé dung cu thuc hién SPME [96, 132, 147]:

Sơ đồ dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME được trình bay trong hình 1.1.1

Dụng cụ này bao gồm hai phần: sợi chiết và các bộ phận phụ trợ được bố trí theo

kiểu xyranh Soi chiết ở đây là một đoạn sợi silica dài khoảng Icm, đường kính ngoài cỡ 0,11 mm, được phủ bởi một lớp pha tinh polyme ky nước Lớp pha tinh

polyme thường là polydimetylsiloxan (PDMS), polymetylphenylsiloxan (PMPS), polyacrylat (PA), polyetylenglycol, hay có thể được trộn thêm với các chất hấp phụ

khác như divinylbenzen, nhựa chịu nhiệt hoặc than xốp tùy theo từng đối tượngchất nghiên cứu Sợi chiết được gắn với một cần kim loại, tất cả được đặt trong ống

kim loại bảo vệ Cần kim loại sau đó được gắn với pittông đặt trong xyranh.

Trên thế giới hiện đã có những

Tang dụng cụ SPME thương mại và sợi

vỆny nem tầm pha tinh có thể dùng khoảng

vài chục lần Lord và Pawliszyn

bảo vệ vi chiết đến chuyển mẫu vào cột

Hình 1.1.1: Sơ đồ dụng cụ vi chiết pha rắn DHâN el [7s 8d:

a, Cách tiến hành kỹ thuật vi chiết pha rắn:

Kỹ thuật SPME gồm 2 bước: (1) phân bố chất phân tích giữa mâu và pha

tĩnh của sợi chiết, (2) chất phân tích đã làm giàu được giải hấp từ pha tĩnh của sợi

chiết và chuyển vào thiết bị phân tích

Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nước chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa

chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích được đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có

septum cao su Quá trình chiết được bắt đầu bằng việc lấy mẫu, xuyên ống kim

loại bảo vệ chứa sợi chiết qua nút cao su của lọ đựng mẫu (mẫu nước, mẫu rắn),

đẩy pittông xuống để sợi chiết tiếp xúc trực tiếp với dung dịch hoặc KGH có chất

cần phân tích (hình 1.1.2) Chất phân tích từ mẫu (lỏng, hơi) được đưa lên lớp pha

tĩnh theo ái lực của nó đối với pha tĩnh, để yên cho hấp thu đạt cân bằng trong một

thời gian đã định Sau đó, sợi chiết được kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra

khỏi lọ đựng mẫu Tùy yêu cầu của từng nhóm chất cần phân tích mà sợi vi chiết

sau đó sẽ được tiêm vào GC hoặc HPLC để giải hấp và phân tích.

Quá trình giải hấp nhiệt được thực hiện với thiết bị GC [36, 53, 111, 119,

132] như sau: xuyên ống bảo vệ sợi chiết qua septum của injecto, đẩy pittông xuống cho sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ Sợi được đốt nóng, chất phân tích được

giải hấp đi vào cột sắc ký khí (hình 1.1.3)

Hình a Quá "| lấy mau Hình 1.1.3: Quá trình giải hấp chất

vào bộ phận bơm mâu của sắc ký khí

Quá trình giải hấp bằng dung môi được tiến hành với thiết bị HPLC [52, 57,

94, 95, 103, 138, 148] Quá trình này được thực hiện bằng hai cách: hoặc đưa sợi

đã hấp thu chất cần phân tích vào buồng bơm mâu, tại đây nhờ dòng dung môi pha động di qua mẫu mà chất phan tích được giải hấp hoàn toàn và đi vào cột

tách sắc ký; hoặc giải hấp sợi đã hấp thu chất cần phân tích bằng dung môi từ bên

ngoài sau đó bơm vào máy HPLC [37] Sau khi giải hấp, sợi chiết lại được kéo

vào lòng ống bảo vệ rồi rút ra khỏi bộ phận bơm mẫu và có thể dùng lại nhiều lần.

a; Cơ sở lý thuyết trong quá trình lấy mau của kỹ thuật SPME [33, 109]:

SPME là một kỹ thuật cân bằng, ở đó chất phân tích không được chiết hoàn

toàn khỏi nền mẫu Một cách tổng quát, khi đặt mẫu trong lọ kín, các cân bằng của

chất phân tích tồn tại giữa 3 pha như sau: (1) pha tĩnh tẩm sợi với pha nước, (2)

pha hơi với pha nước, (3) pha tĩnh với pha hơi (hình 1.1.4) (39, 104, 105, 106].

Phân bố của chất phân tích trong 3 pha khi cân bằng đã đạt được có thể biểu

diễn như sau: CoVs = C,°V; + C,”Vị + Cs Vs (1.1.1)

Với, C, là nồng độ ban đầu của chất phân tích trong dung dich mau; C,”,

C,”, va Cs” là nồng độ cân bằng của chất phân tích trong pha tinh của sợi chiết,

trong phân KGH và mẫu; V, , Vụ, và Vs là thể tích pha tĩnh của sợi chiết, phần

KGH và dung dịch mẫu

Nếu lọ chứa day dung dịch, không còn khoảng KGH, bỏ qua C,V, trong

phương trình (1.1.1), khi đó cân bang chi tồn tại giữa 2 pha dung dich mẫu và pha tinh của sợi chiết Như vay, các lý thuyết cơ bản về việc áp dụng kỹ thuật SPME

trong quá trình chiết mẫu với sợi chiết có pha tính ở dạng polyme lỏng (hoặc các

pha tinh là các vật liệu rắn xốp) được xem xét trong 2 trường hợp: kỹ thudt SPME

trực tiếp chiết mâu lỏng, và kỹ thuật SPME chiết mẫu trong khoảng KGH

(HS-SPME) [29, 53, 54, 55, 127] (hình 1.1.4).

* Chiết mẫu lỏng trực tiếp [103]: Phân bố của chất phân tích giữa pha tinh và

BC ` , ` , ba

pha nước được biểu diễn qua hằng số cân bằng phân bố, K,: K,,= = (1.1.2)

với, C, là nồng độ của chất phân tích trong pha tinh của sợi chiết và C là nồng độ của chất phân tích trong pha nước Đây là một thông số đặc trưng, mô tả đặc tính

va độ chọn loc của pha tinh đối với chat phân tích.

z : 7 CV V,

Ty lệ phân bố, k’ được định nghĩa như sau: k` = <2 =-F=K, „` Ula)

ss n, *

Với, n, và n, là số mol của pha tĩnh va pha nước tương ứng; V, và V, là thể

tích của pha tĩnh và dung dịch nước Vì các pha tĩnh sử dụng trong SPME có ái lực

lớn với các chất hữu cơ, nên giá trị K, đối với các chất này thường rất lớn, do đó

kỹ thuật SPME có khả năng làm giàu chất phân tích hay có hiệu quả chiết tốt.

Tuy nhiên, giá trị K,, không đủ lớn để chiết hoàn toàn chất cần phân tích rakhỏi nền Thông qua việc dựng đường chuẩn, có thể xác định nồng độ của chất cần

phân tích trong nền mẫu Có hai phương trình được dùng để định lượng chất hấp

thu trong pha tĩnh của sợi, tùy thuộc vào thể tích mẫu:

- Với thể tích mẫu lớn (>5 ml),

lượng chất phân tích hấp thu vào pha

tĩnh tại trạng thái cân bằng tỷ lệ trực

tiếp với nồng độ C, ban đầu của nó

trong pha nước Nếu thể tích V, của

mẫu nước >> thể tích của pha tĩnh,

Lấy mẫu trực tiếp Lấy mẫu pha hoi thì:n,=K,, V;Cy (1.1.4)

Hình 1.1.4 Hệ các pha tồn tại Trong đó, n; là lượng chất chiết

được bằng pha tĩnh.

trong quá trình vi chiết pha rắn

- Với thể tích mẫu nhỏ (khoảng 2-5 ml), chất phân tích trong mẫu sẽ bị làm

K, V, Cạ Vs

nghèo đi, lượng chất hấp thu sé là: n; =

Nhu vậy, sự xuất hiện số hạng K,,V; ở (1.1.5) làm giảm lượng chất phân tích

hấp thu vào pha tinh Nhưng nếu hằng số phân bố K,, rất lớn, V, nhỏ, mà K,,V,; >> V,, thì hầu như tất cả chất phân tích được chuyển vào pha tĩnh của sợi chiết.

* Chiết mẫu ở KGH: được sử dụng khi phải chiết chất phân tích từ nước thải

chứa dầu hay những mẫu có nền phức tạp như trong đất, bùn [127].

Cân bằng SPME là hệ thống 3 pha, quá trình cân bằng giữa 3 pha như sau:

K = C, ee Ky, là hang số phân bố của chất phân tích giữa pha tĩnh của sợi

" am chiết va phan KGH, C; và C, là nồng độ chất phân tích trong

pha tinh của sợi chiết và phần KGH.

K;; là hằng số phân bố của chất phân tích giữa phần KGH và

K ah, (1.1.7) š _#& " pha mẫu lỏng, C, và C, là nồng độ chất phân tích trong phần

KGH và pha mẫu lỏng.

"C18 + Ẳ tu sử như bểzÖs ghế ahaa Bich cite che Gly clearC ¡ là hang số phân bố cua chất phân tích giữa pha tĩnh của sợi

chiết và pha mẫu lỏng, C; và C, là nồng độ chất phân tích trong

pha tĩnh của sợi chiết và pha mẫu lỏng.

Ba số hang ở mẫu số của công thức (1.1.9) biểu thị cho dung lượng của chất

phân tích trong từng pha: sợi chiết (K;,V;), KGH (K,,V,) và trong mau (V,) Nếu lọ

mẫu chứa đầy mẫu lỏng (không còn KGH), bo qua K,,V,, Phương trình (1.1.9) sẽ chuyển thành (1.1.5) Từ phương trình (1.1.9) cho thấy lượng chất phân tích được

chiết vào pha tinh không phụ thuộc vào việc sợi chiết đặt ở khoảng KGH hay

nhúng trực tiếp vào mẫu, mà chi cần điều kiện giữ thể tích pha tinh, KGH và mẫukhông đổi

Việc lựa chọn kỹ thuật lấy mẫu trực tiếp hay lấy mẫu ở KGH sẽ được quyết

định tuỳ theo nền mẫu có chứa hay không các chất nhiễm bẩn có khả năng gây cản trở quá trình chiết và quá trình tách sắc ký sau này cũng như đặc tính của chất cần

phân tích.

Để đánh giá khả năng sử dụng kỹ thuật SPME tách chiết một đối tượng nào

đó khỏi nền mẫu, người ta cần quan tâm tới hai khía cạnh hiệu quả chiết và tốc độ

chiết Ban chất sợi chiết (thành phần pha tinh, độ day) và các thông số của quá trình thực hiện SPME như nhiệt độ, tốc độ khuấy, thời gian chính là các yếu tố

quyết định hiệu quả và tốc độ chiết Xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố này sẽ được trình bày trong phần tiếp theo.

a, Các phương pháp tăng hiệu quả chiết cua kỹ thuật SPME (33, 103, 106]:

Hiệu quả chiết của kỹ thuật SPME hay nói cách khác lượng chất phân tích

được chiết lên pha tĩnh tam sợi chiết có thé tăng nếu làm thay đổi một số thông số

trong các phương trình (1.1.4), (1.1.5), (1.1.9) Khi tăng độ dày của pha tinh tam

sợi chiết hoặc tăng chiều dài của sợi chiết, lượng chất có khả năng hấp thu vào pha

tinh sẽ tang Tuy nhiên, pha tinh càng dày thi thời gian đạt tới cân bằng càng lâu;

sợi chiết dài sẽ dễ mắc lỗi kỹ thuật như cong, gãy Thay đổi pha tĩnh chọn lọc hơn

với chất cần phân tích (tang K,,) cũng chính là một cách tăng hiệu quả chiết.

Trong trường hop đã chọn được pha tinh đủ chon loc va độ dày thích hợp thi

việc lựa chọn các yếu tố của quá trình thực hiện SPME như nhiệt độ mẫu, thêm các

muối vào dung dịch mẫu dan tới thay đổi hằng số phân bố K,, theo chiều hướng

tăng sẽ góp phần làm cải thiện hiệu quả chiết.

a; Tốc độ chiết và các yếu tố anh hưởng:

Tốc độ chiết là thời gian để chất phân tích chuyển từ nền mẫu vào sợi chiết,

nó phụ thuộc vào: (1) vận tốc giải hấp chất phân tích khỏi bề mặt các hạt rắn (nếu

có), (2) chất phân tích di chuyển qua pha hơi hay pha mẫu lỏng va (3) chất phantích khuếch tán vào trong pha tĩnh của soi chiét Tùy điều kiện lấy mẫu, một hay

một số giai đoạn trên sẽ quy định tốc độ của cả quá trình

* Tốc đô của quá trình chiết truc tiếp: Chiết trực tiếp là quá trình chiết chat phân tích ra khỏi mẫu lỏng và sợi chiết được nhúng trực tiếp vào mẫu Trong quá

trình chiết luôn tồn tại song song hai quá trình trái chiều nhau là chất phân tích từ dung dịch đi vào pha tĩnh, và từ pha tĩnh chất phân tích đi trở vào dung dịch Nếu

chọn pha tính phù hợp thì quá trình chất tan quay lại dung dịch là rất nhỏ Quá

trình chiết trực tiếp có thể thực hiện trong điều kiện dung dịch mẫu ở trạng thái

tĩnh hoặc động Yếu tố này có ảnh hưởng tới thời gian để đạt tới cân bằng chiết mẫu Vì hệ số khuếch tán trong nước nhỏ nên thời gian để đạt tới cân bằng khi

chiết mẫu từ dung dich tinh lâu hơn so với dung dịch động Khi dung dich được

khuấy trộn sẽ làm tăng va chạm của các chất phân tích với pha tĩnh Do đó, sẽ làm

tăng hiệu quả chiết của các chất phân tích có ái lực cao với pha tĩnh và thời gian

chiết sẽ ngắn hơn.

* Tốc đô chiết đối với kỹ thuât chiết mẫu trong KGH:

Thời gian chiết mẫu trong kỹ thuật KGH (HS-SPME) phụ thuộc vào động họccủa quá trình chuyển khối khi chất phân tích vận chuyển từ mẫu (pha nước hoặc

pha rắn) sang pha hơi rồi tới pha tĩnh Sự giải phóng các chất dễ bay hơi vào

khoảng KGH khá dễ vì các chất này có xu hướng hoá hơi khi chúng tách ra khỏi

nền mẫu lỏng hoặc rắn Với các chất kém bay hơi thì sự chuyển khối từ nền mẫu

vào khoảng KGH chậm, thời gian chiết lâu hơn.

Việc chiết mẫu pha hơi từ dung dich tinh cho kết quả rất tốt đối với các chất

dé bay hơi (có giá trị K,, cao) mà không cần tới việc khuấy trộn mẫu Trong trường

hợp này cần chú ý đặc biệt đến nhiệt độ mẫu khi tối ưu hoá quá trình chiết Vì khi

nhiệt độ mẫu đủ cao để chuyển các chất phân tích từ mẫu lên pha hơi, thì thời gian

cân bằng sẽ giảm, điều này hoàn toàn độc lập với việc khuấy trộn.

Nếu thực hiện quá trình chiết mẫu lên pha hơi khi dung dịch được khuấy trộn

liên tục, làm cho lớp nước trên bề mặt luôn được thay mới, giúp các chất kém bay

hơi dễ thoát vào khoảng KGH hơn Như vậy, sự khuấy trộn là có ý nghĩa cho việc

cải thiện cân bằng của các chất có ái lực lớn với pha tinh nhưng kém bay hơi Ngược lại, khuấy trộn ít ảnh hưởng tới các chất dễ bay hơi có hệ số phân bố giữa

pha hơi và pha tĩnh thấp.

es

a, Tinh toán hang số phan bố và hé số lam giàu:

* Trường hop SPME chiết mẫu lỏng truc tiếp: Hằng số phan bố của chất phân tích giữa pha mẫu nước và pha tĩnh sợi chiết được tính bởi biểu thức:

Cra

k= (1.1.10)

Cw

Với, C, „ và C,,, tuong ứng là nồng độ cân bằng của chat phân tích trong pha

tinh va trong pha nước.

Mat khác trong quá trình chiết có phương trình bao toàn vat chất:

CLV 5 =C,„„.V„ + Cy eg V,seq’ §

(1.1.11)

Với, c, , là nồng độ ban đầu của chất phân tích trong pha nước; V„ Vs là thể

tích của pha tĩnh sợi chiết và của mẫu nước.

Gọi E; là hệ số làm giàu chất phân tích từ mẫu nước vào pha tinh sợi chiết, ta

C

+ Hệ số phân bố điều kiện Kpy:

- Hệ số phân bố điều kiện của chất phân tích giữa pha mau rắn và pha hơi

Trong đó C;.„ (gam chất/gam mẫu đất) là nồng độ của chat trong mẫu rắn tại

thời điểm cân bang ran- hơi được thiết lập; Cy (gam chat/ml KGH) là nồng độ

của chất trong KGH mẫu khi cân bằng rắn- hơi thiết lập

- Hệ số phân bố điều kiện của chất phân tích giữa pha hơi và pha tính sợi

chiết được tính bằng biểu thức:

Cin

Ky-y =e 115)

H.ecq

Trong đó C,„„ (gam chat/gam mẫu đất) là nồng độ cân bang của chất trong

pha tinh sợi chiết; Cy, (gam chat/ml KGH) là nồng độ cân bằng của chất trong

KGH.

+ Hệ số làm giàu điều kiện Ey:

Hệ số làm giàu điều kiện E; thể hiện cường độ ái lực của cấu tử cần phân tíchvới pha tĩnh tam trên sợi, có giá trị là:

b Vị chiết pha long (LPME) [74, 85, 102, 149]

Phương pháp LPME dựa trên cân bằng phân bố của chất phân tích trong mẫu

nước và giọt dung môi chiết Việc chọn dung môi tuỳ thuộc bản chất của chất phân

tích và phải đảm bảo: lượng chất phân tích được chiết vào giọt dung môi là tối đa

và cân bằng phân bố nhanh chóng được thiết lập, dung môi phải phù hợp với việc

phân tích sắc ký.

b, Cách tiến hành kỹ thuát LPME: Có hai cách thực hiện LPME là vi chiết pha lỏng tĩnh (Static - Lipuid phase microextraction: S - LPME ) và vi chiết pha lỏng động (Dynamic - Lipuid phase microextraction: D - LPME) đang được ứng

dụng rộng rãi Cả hai đều dùng lượng dung môi hữu cơ không tan trong nước rất

nhỏ (< 2 ul) với một kim tiêm nhỏ (microsyringe) tiêu chuẩn thông thường, sau đó

đưa giọt dung môi chứa chất phân tích vào máy sắc ký.

* Vị chiết pha lỏng tinh (S - LPME): Để thực hiện kỹ thuật S - LPME, dùng

một kim tiêm Hamilton với độ chia nhỏ 0,05 pul lấy chính xác giọt dung môi (khoảng | pl) vào kim tiêm Tiếp đến, đưa đầu kim vào môi trường nước (trong trường hợp chiết trực tiếp) hoặc vào khoảng KGH (trong trường hợp chiết gián tiếp

qua KGH) Đẩy giọt dung môi ra đầu kim và giữ yên giọt dung môi chiết ở đó

(khoảng 2- 30 phút) Chất cần phân tích từ môi trường nước di chuyển trực tiếp

hoặc gián tiếp qua KGH vào giọt dung môi bằng sự khuếch tán cho đến khi cân bang phân bố được thiết lập Khi quá trình phân bố của chất phân tích dat trạng thái cân bằng, kéo giọt dung môi trở lại kim tiêm rồi tiêm trực tiếp vào máy sắc ký.

Tại buồng bơm mẫu, hoặc giọt dung môi đi cùng chất phân tích vào cột tách; hoặc

xảy ra quá trình giải hấp chất phân tích, giọt dung môi sau đó có thể được kéo trở

lại kim tiêm để tái sử dụng (tùy vào tính chất bay hơi hay không bay hơi của dung

môi được chọn).

* Vị chiết pha lỏng đông (D - LPME) [149]:

Kỹ thuật D - LPME cho phép rút ngắn thời gian chiết được thực hiện như sau:

dùng một kim tiêm Hamilton với độ chia nhỏ 0,05 ul lấy chính xác giọt dung môi

(khoảng | pl) vào kim tiêm Tiếp đến, đưa đầu kim vào môi trường nước (trong trường hợp chiết trực tiếp) hoặc vào khoảng KGH (trong trường hợp chiết gián tiếp qua KGH) Hút khoảng 3 ul dung dịch (hoặc hoi) của mẫu phân tích vào kim tiêm trong thời gian 2 giây va đợi khoảng 3 giây, rồi đẩy 3 ul dung dịch (hoặc hơi) đó ra

ngoài cũng với thời gian là 2 giây Thao tác này làm lớp dung môi mới bám bên

trong thành của kim tiêm lần lượt được bão hoà chất phân tích Lặp đi lặp lại quá

trình này khoảng 20 lần (3 phút) Cuối cùng đẩy hết dung dịch hoặc hơi mẫu ra

ngoài, chỉ giữ lai 1 pl dung môi hữu co lấy lúc đầu Sau đó đưa giọt dung môi chứa

chất cần phân tích vào thiết bị sắc ký

So sánh với kỹ thuật chiết tĩnh (S - LPME), trong trường hợp chiết động (D - LPME), | ul dung môi không bi đẩy ra đầu kim, thay vào đó lượng dung môi

lại được chia thành các lớp bão hoà chất phân tích và bám vào thành bên trong của

kim tiêm Toàn bộ lượng dung môi sẽ được bão hoà chất phân tích với thời gian

ngắn hơn nhiều so với việc để yên cho chất phân tích tự khuếch tán Nhưng

D - LPME là một phương pháp phức tạp, có thể mắc sai số và yêu cầu cao về kỹ

thuật thực hiện.

b, Cơ sở lý thuyết [L, 85, 102]:

* Trường hop chiết mẫu trực tiếp: Nguyên tắc của LPME trong trường hop

chiết mẫu trực tiếp (đưa giọt dung môi vào môi trường nước chứa mẫu) là cân bằng

phân bố lỏng- lỏng giữa chất phân tích trong dung dịch mẫu và giọt dung môi.

Nồng độ của chất phân tích trong mẫu được xác định thông qua hàm lượng chiết được vào dung môi và hằng số cân bằng lỏng- lỏng.

* Trường hợp chiết mẫu gián tiếp qua KGH: Nguyên tắc của LPME trong

trường hợp chiết mẫu gián tiếp qua KGH dựa vào cân bằng phân bố của chất phân tích ở trong hệ 3 pha: pha lỏng mau, pha hơi và pha dung môi hữu Nồng độ chất phân tích ở pha lỏng mẫu được xác định qua hàm lượng của chúng chiết được vào

giọt dung môi hữu cơ thông qua pha hơi trung gian.

b; Các yếu tố anh hưởng:

Hiệu quả chiết chất phân tích phụ thuộc vào thể tích giọt dung môi, thời gian chiết, nhiệt độ, pH, hằng số phân bố của chất phân tích trong môi trường phân tích

và dung môi hữu cơ.

* Ảnh hưởng của thể tích giot dung môi: Lượng chất hữu cơ tăng một cáchtuyến tính với thể tích của giọt dung môi trong khoảng từ 0,5 - 3 pl, sau đó lệch

khỏi đường tuyến tính Khi thể tích của giọt dung môi hơn 5 ul, nó nổi lên trên bề

mặt dung dịch và không thu lại vào bơm tiêm được.

* Anh hưởng của thời gian chiết: Khi đưa giọt dung môi hữu co vào trong

dung dịch mẫu nước thì các chất phân tích trong dung dịch được khuếch tán vào

giọt dung môi hữu cơ Lượng chất phân tích tăng nhanh theo thời gian chiết từ |

đến 15 phút Sau 15 phút thì lượng chất phân tích tang chậm lại, nhưng cân bằng

thì không thể biết được thậm chí là sau 35 phút tùy theo bản chất của chất cần

phân tích và dung môi Do đó, khó xác định được thời gian cần thiết để đạt tới

trạng thái cân bằng Trong S - LPME giọt dung môi hữu cơ bị tan vào dung dịch

mẫu khi thời gian chiết tăng Vì vậy, chọn dung môi hữu cơ sao cho độ tan của nó

nhỏ hon 0,1 pl trong suốt quá trình chiết.

b, Xác định hang số phân bố và hệ số làm giàu trong trường hợp chiết

dung môi và trong pha nước.

và Cu tương ứng là nồng độ cân bằng của chất phân tích trong

°,eq

Mặt khác trong quá trình chiết có phương trình bảo toàn vật chất:

CLE, = Cy gg t+ ởag” ä

(1.1.18)

Với, c, là nồng độ ban đầu của chất phân tích trong pha nước; V„, V là thể

tích của giọt dung môi và của mẫu nước.

Gọi E¿ là hệ số làm giàu chất phân tích từ mẫu vào giọt dung môi, ta có:

E - Coed (1.1.19) > È 5 (1.1.20): C le ⁄ vo ls

sate + —

V, K

Phương trình (1.1.20) cho thấy hiệu quả chiết phụ thuộc vào tỷ số V,/V, và hệ

số phân bố K Như vậy một cách gián tiếp, hiệu quả chiết sẽ phụ thuộc vào nồng

độ chất phân tích trong mẫu, nhiệt độ, lượng muối hoà tan vào mẫu

Qua thực nghiệm sẽ tính toán được hang số phân bố K,,, va hệ số làm giàu É;,

từ đó có thể thấy tính vượt trội của phương pháp LPME.

12 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ XÁC ĐỊNH HOÁ

CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

1.2.1 Mot số phương pháp phân tích công cu tiêu biểu: sac ký lỏng cao áp

(HPLC), sắc ký khí (GC) [31, 60, 61, 82, 128]

Đã có nhiều phương pháp phân tích cong cu được sử dung để phan tích, xác

định lượng tồn dư các HCBVTV Phương pháp sac ký dựa vào sự phân bố, hoặc

hấp phụ của các chất ở hai pha khác nhau: pha tính cố định và pha động dịch

chuyển tương đối trên pha tĩnh cố định đó Trong đó HPLC và GC là hai phương

pháp sắc ký tiêu biểu nhất để xác định lượng vết các HCBVTV

a Sắc ký long cao áp (HPLC): HPLC thường được sử dụng cho các hợp

chất không bền nhiệt, không bay hơi và có độ phân cực cao HPLC phù hợp với

việc phân tích đa dư lượng HCBVTV có độ phân cực khác nhau lớn Trên 40

phương pháp xác định HCBVTV của cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (US-EPA)

Các loại pha động được chọn tùy các chất phân tích, kiểu tách, kiểu xác định.

Các HCBVTV thuộc loại bazơ trung tính được phân tích với kiểu pha dong gradien thành phần giữa nước và một dung môi hữu cơ thích hợp như metanol và

axetonitrin Một dung môi hữu cơ thứ ba là tetrahydrofuran cũng được sử dụng

nhưng tương đối ít phổ biến hơn Đôi khi một số muối vô cơ được thêm vào pha

động để cải thiện hình dáng pic Các HCBVTV và các sản phẩm phân hủy của

chúng có tính axit hoặc trung tính phải chọn pH của pha động cao hơn pKa của

HCBVTV bazơ và thấp hon pKa của HCBVTV axit

Để nhận biết, các HCBVTV sau khi đã tách bằng HPLC có nhiều loại

đetectơ, nhưng thường được sử dụng nhất là các đetectơ UV-VIS, huỳnh quang

b Sắc ký khí GC: Phương pháp sắc ký khí có thể áp dụng cho các HCBVTV

dễ bay hơi nhưng lại bền nhiệt, ví dụ như nhóm TTS cơ clo, cơ phôtpho, pyrethroit.

Trong phương pháp sắc ký khí, mẫu phân tích được phân bố vào khí mang và qua

cột chứa pha tĩnh Các quá trình tách chất được thực hiện trên cột khi có cân bằng

xảy ra Mỗi chất phụ thuộc vào các đặc tính lý hóa, khi đi qua cột có thể bị rửa giải

sớm hay muộn Thời gian từ lúc bat đầu bơm mẫu tới khi xuất hiện cực đại của pic tín hiệu, gọi là thời gian lưu của mỗi chất trong cột sắc ký Dựa vào thời gian lưu

của các chất khác nhau có thể xác định định tính thành phần các chất có trong

mẫu Lượng chất có trong mẫu tỷ lệ với diện tích pic của chúng trên sác đồ, do đódựa vào diện tích pic này có thé định lượng các chất có trong mẫu phân tích [27]

Hiện nay, sắc ký khí được sử dụng nhiều nhất để phân tích các HCBVTV

trong nước Nó đã trở thành phương pháp tiêu chuẩn của nhiều nước như Mỹ

(US - EPA), Hà Lan (NPS), Đức (DIN) và quốc tế (ISO) [60, 61, 82].

Trong thiết bị sắc ký khí, hai bộ phận quan trọng nhất là cột tách và đetectơ.

Có rất nhiều loại cột với các pha tĩnh khác nhau được sử dụng trong phân tích

các HCBVTV [27, 128] Cột được chọn theo quy luật tương ứng, ví dụ đối với các

chất phân tích không phân cực thì chọn cột không phân cực Nhưng khi phân tích

nhiều chất có độ phân cực khác xa nhau, thì nên chọn các cột có độ phân cực thấp

bởi vì nó sẽ có độ ổn định chung đối với cả những chất có độ phân cực cao hơn.

Có nhiều loại đetectơ, mỗi loại thích hợp với một dạng chất phân tích khác nhau Detecto cộng kết điện tử (ECD) thường được sử dụng để phân tích các

HCBVTV, vì có độ nhạy cao và rất chọn lọc đối với các hợp chất chứa halogen Dư lượng TTS cơ clo trong các mẫu môi trường đã được xác định bằng GC-ECD [11,

24, 36]; với lượng tối thiểu mà GC-ECD có thể xác định được đối với HCH, HCB

là 3 - 4 pg, DDT và dẫn xuất (DDE, DDD) là 12- 60 pg, các HCBVTV cơ clo họ

xyclodien là dạng vết [93].

Nguyên lý hoạt động của đetectơ ECD dựa trên đặc tính của các chất có khả

năng cộng kết các điện tử tự do trong pha khí [27]: chùm tia B được phát ra từ nguồn phóng xa (` Ni) với vận tốc 10-10” hạt/giây, tác dụng lên phân tử khí mang

(Ar, N,) sinh ra các ion khí mang điện tích dương va các điện tử sơ cấp [8] Dưới

tác dụng của điện trường đặt vào các điện tử được tăng tốc chuyển động về phía

anôt tạo ra dòng điện nền khi chưa có mẫu Nếu khí mang có lẫn các nguyên tử

chất tan, các nguyên tử chất nay bat giữ các điện tử tạo các ion âm gây sụt thé

đường nền, sự sụt thế này cho các pic có độ rộng tương ứng Sau đó các ion này tái hop với các ion dương tạo nguyên tử trung hoà Mức độ suy giảm thế tùy thuộc vào

hàm lượng cấu tử của chất phân tích đi qua và được thể hiện bằng sắc ký đồ đặc

trưng của chất đó.

Ngoài ra máy sắc ký khí còn có khả năng kết nối với đetectơ khối phổ kế

(MS- một loại đetectơ vạn năng) sẽ cho phép xác định đồng thời nhiều HCBVTV

với nồng độ cực nhỏ, chỉ cần đưa vào máy khoảng 10° g đến 10°'° g chất là có thể

định tính và định lượng tốt [150].

1.2.2 Phương pháp phân tích hấp phu miễn dich gắn enzym (ELISA)

a Giới thiêu về phương pháp phân tích miễn dich sử dung cho đối tương

HCBVTY [38, 44, 76, 90, 92, 99, 100, 107, 108, 113, 129]:

Nghiên cứu phát triển các phương pháp phân tích nhanh, đơn giản và có tính

chọn lọc để xác định dư lượng TTS trong môi trường với một số lượng mẫu lớn

đang là một yêu cầu cấp thiết Việc ứng dụng các kỹ thuật xét nghiệm hóa sinh

miễn dich để định lượng nhanh dư lượng HCBVTV [89, 101, 120, 122, 137] là một

bước ngoặt trong phân tích môi trường Giới hạn phát hiện và định lượng của

phương pháp này ở mức độ nhỏ hơn một phần tỷ (ppb) đến một phần ngàn tỷ (ppt)

đối với mẫu nước và từ vài phần triệu (ppm) đến vài phần tỷ đối với các mẫu cây

trồng, mẫu đất và mẫu sinh học.

Phương pháp phân tích miễn dịch (immunoassay- IA) được sử dụng để xác

định những chất độc hại trong thực phẩm từ năm đầu của thập kỷ 80 Nguyên tắc

của phép thử nghiệm miễn dịch dựa trên phản ứng của chất cần phân tích với các

kháng thể đặc hiệu Nhiều nghiên cứu xác định HCBVTV (bao gồm cả họ cơ

phôtpho, cơ clo, cacbamat, triozime, phenylurea hay thuốc diệt cỏ) trong thực

phẩm và môi trường bằng phương pháp phân tích miễn dịch đã lần lượt xuất hiện.

Năm 1987, Newsame va Collin [114] đã xác định được benomyl và thiabendazoletrong 3 loại cây trồng; Van Emon và cộng sự [136] đã phân tích thành công dư

lượng thuốc diệt co trong sữa, thịt bò và khoai tây Bushwayetal [40, 41, 42] da

phát triển phương pháp phân tích miễn dịch cạnh tranh để định lượng methyl

2-benzimidazolecarbamate trong nước trái cay Chất chuyển hoá (trao đổi)

sulfoxide, sulfone của albendazole và thuốc multiple benzimidazole cùng dư lượng

TDCT đã được phát hiện và định lượng ở nồng độ 1-8 ppb [38].

Gần đây, Skerrittet cùng các cộng sự [123] đã phát triển một phương pháp

phân tích miễn dich để định lượng ba loại HCBVTV cơ phôtpho trong thành phần

chiết hạt và bột mì Dư lượng cơ phôtpho, pyrethroit, methopren trong bột lúa mì,

các sản phẩm và bột nghiền đã được định lượng bởi IA [124] Goh và nhóm nghiêncứu [79] đã định lượng atrazine va simazine trong mẫu đất.

Một phương pháp ELISA cạnh tranh để phát hiện

2,3,7,8-triclodibenzo-p-dioxin trong các mẫu nước ô nhiễm được tiến hành bởi Stanker và cộng sự [126]

Năm 1994, EPA đã xuất bản quyển sách hướng dẫn phân tích miễn dịch

trong môi trường với mục đích giúp đọc về kỹ thuật miễn dịch mới và cho dụng cụ

phân tích [75].

Qua đó, có thể thấy các phương pháp phân tích miễn dịch hiện đang được

nghiên cứu rộng rãi và có nhiều tiềm năng phát triển, ứng dụng trong lĩnh vực phân tích dư lượng HCBVTV trong thực phẩm và môi trường.

b Sơ lược về phương pháp miên dich hoc và các khái niêm cơ ban:

Miễn dịch học là phương pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của một kháng thể

với một kháng nguyên để xác định lượng kháng thể hoặc kháng nguyên cần phân

sau đó tác dụng với kháng nguyên làm cho kháng nguyên không còn khả năng gây

hai cho cơ thể Vi trí có sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể được gọi là đầu

paratop Khả năng nhận diện kháng nguyên của các kháng thể hay còn gọi là tính

đặc hiệu của kháng thể chính là cơ sở của phương pháp thử nghiệm miễn dịch

Thông thường một kháng nguyên có thể nhận dạng được nhiều kháng thể có cấu

trúc gần tương tự, tức là có thể sử dụng kháng nguyên này để phát hiện cả họ chất

+ Kháng nguyên: Tất cả những chất lạ xâm nhập từ bên ngoài vào cơ thể,

kích thích để cơ thể đáp ứng miễn dịch (sản xuất kháng thể đặc hiệu tương ứng)

gọi là kháng nguyên Trên mỗi kháng nguyên có những vị trí mà có thể tham gia

phản ứng với đầu liên kết của kháng thể gọi là epitop.

Những phân tử có khối lượng phân tử nhỏ như hóc môn, TTS hoặc các chất

gây nghiện không được coi là kháng nguyên Để có được kháng nguyên trước hết

cần phải điều chế hapten (một kháng nguyên không toàn vẹn, thường có trọng lượng phân tử thấp, không có tính sinh miễn dịch, nhưng có tính đặc hiệu kháng

nguyên) thích hợp Hapten này cần có đặc tính gần giống với chất cần phân tích

(cấu trúc hình học, không gian, phân bố mật độ điện tử, tính phân cực) và có cánh

tay (spacer arm) để gan với chất mang Sau khi các hapten kết hợp với một proteinmang, nó được đưa vào cơ thể động vật như một kháng nguyên Hệ miễn dịch củađộng vật sẽ tự sinh kháng thể để tìm và tiêu diệt kháng nguyên đó Như vậy, khángthể đặc hiệu với kháng nguyên được tổng hợp

+ Chất đánh dấu: Một yếu tố quan trọng nữa trong phương pháp phân tích

miễn dịch là các chất đánh dấu, phục vụ cho việc định lượng các chất cần phân tích

một cách gián tiếp Các chất đánh dấu phổ biến được sử dụng trong phương pháp miễn dịch là các cộng hợp enzym, người ta thường sử dụng cộng hợp enzym

photphataza kiềm hoặc peroxidaza.

c Cơ sở phương pháp ELISA:

c, Nguyên tắc của phương pháp ELISA: ELISA là phương pháp phân tích

miễn dịch, trong đó chất đánh dấu là các cộng hợp enzym Cộng hợp enzym có

một đầu với cấu trúc tương tự như chất cần phân tích để có thể phản ứng với kháng thể, một đầu khác chứa enzym phục vụ cho phản ứng tạo màu Nội dung của

phương pháp này được mô tả bởi cân bằng sau:

Ab + Ag + Agf— AbAg + AbAg* (1.2.1)

Trong đó: Ab là kháng thé, Ag là kháng nguyên (chất phân tích), Ag* là

cộng hợp enzym Ag và Ag* sẽ cạnh tranh để chiếm lấy các vị trí liên kết giới hạn

của kháng thể Mức độ liên kết của cộng hợp enzym với kháng thể phụ thuộc vào

nồng độ của chất phân tích Cộng hợp enzym đã liên kết với kháng thể này có khả

năng chuyển hoá cơ chất thích hợp thành hợp chất có màu Do vậy hàm lượng chất

phân tích có trong mẫu có thể định lượng thông qua độ hấp thụ quang của các hợp

chất có màu này.

c; Mô tả khái quát về kỹ thuật thực hiện ELISA [28, 43, 44, 101, 120]:

Các kháng thể đặc hiệu được gắn cố định trên các khay polystyren, chất

phân tích cùng với một lượng xác định cộng hợp enzym được thêm vào ở dạng

dung dịch Hôn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng từ 10 - 60 phút, tuỳ thuộc vào chat

phân tích để chất phân tích và cộng hợp enzym cạnh tranh với nhau cùng liên kếtvới kháng thể Loại bỏ các phần tử tự do không liên kết với kháng thể Sau đó nếu

thêm vào giếng cơ chất thích hợp với enzym Enzym sẽ xúc tác cho phản ứng từ cơ

chất tạo ra hợp chất có màu Giữa nồng độ chất phân tích và mật độ quang đo được

của các hợp chất có màu này sẽ có mối liên hệ để có thể định lượng được nồng độ

chất phân tích ban đầu [115, 116].

Kháng thể Chất phân tích Cộng hợp enzym Cơchất Chất có màu

Hinh1.2.1: Các bước tiến hành của phương pháp ELISA

c, Phan tích định lượng trong ELISA: Đường cong chuẩn hoá biểu diễn

sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch vào nồng độ chất phân tích có dạng

xichma, va gần như thẳng xung quanh điểm IC:¿ (là nồng độ của chất phân tích khi

%ức chế là 50%) Khoảng đường cong làm việc được xác định bằng các giới hạn

trên và dưới Trong khoảng này, sự thay đổi độ hấp thụ tỷ lệ tuyến tính với nồng độ

chất phân tích.

Để thuận lợi trong quá trình tính toán kết quả, ta quy giá trị độ hấp thụ quang

về phần trăm ức chế theo công thức:

Ax- Ab (1.2.2)

Yo We chế =[l- =——————]Xx 100

Ac - Ab

Trong đó: Ax: Độ hấp thụ quang của mẫu hoặc chất chuẩn;

Ab: Độ hấp thụ quang của mẫu trắng;

Ac: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng.

Đường biểu diễn % ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích cũng có

dạng xichma Đây chính là đường chuẩn được sử dụng khi phân tích định lượngbằng phương pháp ELISA

d Uu va nhược điểm của phương pháp ELISA [59]:

+ Ưu điểm: Những ưu điểm của phương pháp ELISA là thời gian phân tích

nhanh, số lượng mẫu phân tích nhiều hơn với thời gian cho trước, chi phí cho một phép phân tích rẻ hơn, có thể sử dụng ngay tại hiện trường.

+ Nhược điểm: Thông thường, việc định lượng theo phương pháp ELISA chỉ

mang tính chất bán định lượng Do đó, kết quả của phương pháp có thể bị ảnh

hưởng bởi phản ứng chéo và thành phan chất nền [113,114, 115, 116, 122]

Để giảm tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, có thể xử lý sơ bộ bảng cách pha

loãng dịch chiết trước khi phân tích Tuy nhiên, các hợp chất cần được xác địnhluôn ở dạng vết, nên cần xác định hệ số pha loãng để không ảnh hưởng đến giới

hạn phát hiện cũng như độ thu hồi của phương pháp Mặt khác, sự có mặt của dung

môi chiết cũng có thể làm giảm giá trị hấp thụ, dẫn đến đánh giá quá mức nồng độ chất phân tích có trong mẫu Vì vậy, có thể hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu bằng

cách xây dựng đường chuẩn trên chính nền mẫu đó

Một yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích là các phản ứng

chéo Phản ứng chéo là phản ứng trong đó: một kháng thể có khả năng kết hợp với

một kháng nguyên khác với loại kháng nguyên kích thích sự sản xuất kháng thể đó

ở động vật gây miễn dịch Phản ứng này có thể do hai kháng nguyên có một hoặc

nhiều epitop giống nhau hoặc một số epitop của chúng có thể gần giống nhau đủ

để liên kết với cùng một loại kháng thể Để loại bỏ ảnh hưởng này, có thể sử dụng

các kháng thể đơn dòng, có tính đạc hiệu cao Mức độ đặc hiệu của kháng thể được

thể hiện thông qua tính chất đồng nhất về mat vật lý và tính chỉ liên kết với mộtparatop của kháng thể Các tính chất này quy định mức độ tham gia phản ứng chéo

của kháng thể (Cross Reactivity - CR), thể hiện trong phương trình sau:

[C;¿ của chất phân tích

a: =————————_ỷ—EEEE 353

I[C;¿ của chất có phản ứng chéo

Chính vì những yếu tố ảnh hưởng như trên nên độ chính xác và độ chọn lọc

của phương pháp ELISA không cao so với các phương pháp khác Tuy nhiên, với

nhiều ưu điểm vượt trội về thời gian, số lượng, cách sử dụng đơn giản có thể dem

đi hiện trường và chi phí phân tích khá rẻ nên phương pháp nay vẫn được sử dụng

như một công cu đắc lực trong việc đánh giá dư lượng các HCBVTV trong nông

nghiệp.

1.3 TONG QUAN VỀ CÁC NHÓM HCBVTV DUOC ĐỀ CẬP ĐẾN

TRONG LUẬN ÁN [48, 67, 72, 77, 88, 91, 98, 131].

1.3.1 Dac tính chung của các nhóm HCBVTV co clo - co clo ho xyclodien,

nhóm cơ photpho, nhóm pyrethroit [71, 73, 133, 134, 135, 139, 140, 141, 142]

a Dac tinh chung của nhóm HCBVTV cơ clo - cơ clo ho xyclodien

+ Trước đây, các HCBVTV co clo được sử dung phổ biến trên thế giới để diệtnhiều loại côn trùng có hại, nhưng hiện nay hầu hết chúng đã bị cấm sử dụng.

Nhóm HCBVTV cơ clo gồm có 3 loại sau [91, 131]:

- Đồng phân hexacloxyclohexan như lindan ( HCH ) [78, 134, 146]

- Xyclodien như aldrin, diendrin, endrin, endosulfan [93, 98, 125, 144]

- DDT và các chất tương tự như methoxiclo, DDD, [66, 97, 143, 145]

HCBVTV cơ clo có tác dụng qua tiếp xúc và tiêu hoá, khả năng diệt côn

trùng kéo dài nhiều tuần HCBVTV cơ clo thường phân hủy rất chậm, tồn lưu rất

lâu trong môi trường Thời gian bán phân hủy sinh học đối với diendrin trong máu

là 267 ngày và DDT trong mô mỡ là 3- 4 năm Vì vậy, nó có tác động lâu dài và

trầm trọng [21, 22, 86, 87].

Trong tế bào, hợp chất cơ clo chuyển hoá theo nhiều cơ chế như oxi hoá, thủyphân Do tinh chất ưa dau (không phân cực) nên HCBVTV cơ clo được tích luỹ ở

cơ thể động vat tại các mô mỡ, gan, thận và cơ tim Độc tính của HCBVTV cơ clo,

cơ clo họ xyclodien (endosulfan) tác động chủ yếu lên hệ thần kinh trung ương gây

mất cân bằng, khó thở, nôn mửa, tiêu chảy, co giật [144].

Endosulfan gây độc mạnh qua đường miệng, với giá tri LD.) tương ứng đối

với chuột và chó là: 7,36 va 77 mg/kg; đối với cá LD5) = 0,1- 2 mg/l Endosulfan

ít ảnh hưởng qua đường hô hấp, với giá trị LC = 21 mg/l trong vòng lgiờ;

LCs) = 8 mg/l trong 4 giờ Sự hấp thu endosulfan qua da thường chậm, nhưng dung

môi hoà tan endosulfan làm thay đổi khả năng hấp thụ của nó khi vào cơ thể qua

các con đường khác nhau Nếu có mặt các dung môi như rượu hoặc đầu thì sự hấp

thụ diễn ra rất nhanh Tuy nhiên, chỉ có một lượng nhỏ endosulfan hấp thụ ở ruột,

hầu hết lượng endosulfan được đào thải khỏi cơ thể cùng với các hợp chất khác tan

trong nước sau vài ngày hoặc vài tuần

b Dac tính chung của các nhóm HCBVTV nhóm cơ phôtpho [63, 64, 65]

HCBVTV cơ phôtpho là loại dang được sử dụng nhiều nhất để chống sâu

bệnh cho các loại cây trồng, diệt cỏ dại, chống nấm mốc, trừ côn trùng Các

HCBVTV cơ phôtpho có công thức tổng quát là công thức (1) [71, 73]

Trong đó: R- metyl hoặc etyl; R’- alkoxy, ankyl, aryl, amino hoặc nhóm

amino thay thế; X- nhóm hữu cơ thích hợp

RO O(S) RO O(S)

Trên thực tế, ngày nay hầu hết các TTS cơ phôtpho được sử dụng có công

R

thức tổng quát là (2)

Trong đó: R- metyl hoặc etyl; X- nhóm hữu cơ thích hợp

Các HCBVTV cơ phôtpho có áp suất hơi cao, dễ bay hơi, dé hoà tan trong

dung môi hữu cơ, dầu mỡ Chúng dễ bị thuỷ phân bởi các tác nhân sinh hoá hoặc hoá học, tạo thành este đơn giản hơn của axit photphoric và ít độc hơn Các HCBVTV cơ phôtpho không bền trong môi trường, phản ứng hoạt hoá nhân

photpho ức chế enzym cholinesteraza chuyển nhóm (P = S) thành nhóm (P = O), hoặc có thể bị phân huỷ thành dẫn xuất trung gian kém độc hơn ban đầu.

HCBVTV cơ phôtpho xâm nhập vào cơ thể động vat qua đường hô hấp, tiêu hoá vaqua da [87] Quá trình chuyển hoá diễn ra ở gan, hoặc chuyển thành những sảnphẩm kém độc hoà tan trong nước và được thải ra ngoài qua đường tiết niệu, hoặc

có thể tạo ra dạng khác độc hơn, ức chế enzym cholinesteraza mạnh hơn [19]

HCBVTV cơ phôtpho là những chất độc đối với nhiều enzym, nhưng cơ chế nhiễm

độc chủ yếu là do ức chế hoạt động của enzym cholinesteraza, gây tình trạng tích

lũy axetylcholin dẫn đến những rối loạn nghiêm trọng của hệ thần kinh trung

ương Vì vậy chúng còn được gọi là những chất độc thần kinh.

c Nhóm pyrethroit [62]:

Pyrethroit là dẫn xuất este cacboxylat (este pyrethrum hay este pyrethrin).

Pyrethrin có phổ trừ sâu rộng, hiệu lực cao, nhưng dễ bị phân hủy quang hoá nên

chỉ dùng để diệt côn trùng trong nhà Các đồng đẳng của pyrethrin với hiệu lực

cao, độ bền quang hoá tốt hơn đã được tổng hợp và đưa vào sử dụng thay thế cho

những chất diệt côn trùng như cơ clo, cơ phôtpho, hợp chất cacbamat.

Đặc điểm chung của các hoá chất pyrethroit là có tính tác dụng chọn lọc cao,

ít độc đối với sinh vật có ích, diệt được các loại côn trùng và sâu kháng thuốc cơ

clo, cơ phôtpho, hợp chất cacbamat.

Hoà tan trong lipit và lipoprotein nên tác dụng tiếp xúc mạnh, thuốc gây nên

hiện tượng choáng độc nhanh và có tác dụng xua đuổi một số loài côn trùng Độ

độc cấp tính đối với động vật máu nóng thấp hơn nhiều so với các hợp chất cơ

phôtpho, nhanh chóng phân huỷ trong môi trường và cơ thể sống, nhưng rất độc

với cá và động vật thuỷ sinh [6].

d Công thức hoá hoc và mot số đặc điểm vat lý của các HCBVTV duoc phân tích trong luân án [S1]: Cấu tạo hoá học và những đặc điểm vật lý của các

HCBVTV cũng góp phần định hướng tốt cho quá trình nghiên cứu xác định cácchất cần quan tâm Trên cơ sở này, việc tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu đểxây dựng qui trình phân tích sẽ thuận lợi hơn Công thức hoá học và một số đặc

điểm vật lý của các HCBVTV được phân tích trong luận án được ghi ở phụ lục

trang 133-135.

1.3.2 Dư lương HCBY TY cơ clo-cơ clo ho xyclodien, nhóm cơ phôtpho, nhóm

pyrethroit trong môi trường [21, 45, 46, 53, 54, 55, 68, 69, 70, 77, 78, 86, 88]

a Su luân chuyển của HCBVTV trong môi trường:

Ở nước ta, số lượng và chủng loại các HCBVTV được sử dụng càng ngày

càng tăng [21] Ngoài tác động tích cực đảm bảo năng suất cây trồng thì chính nó

lại là nguồn gây ô nhiễm môi trường đáng kể, ảnh hưởng xấu đến cân bằng sinh

thái, sức khoẻ con người và các sinh vật khác

HCBVTV trong quá trình bao quan, sử dung và tiêu hủy luôn để lại dư lượng

trong môi trường Sự di chuyển và phân bố của HCBVTV trong môi trường rất đa

dạng và phức tạp, có thể mô tả theo sơ đồ chung của Fishbei (hình 1.3.1) [34].

HCBVTV được phun lên cây, một phần đã dẫn đến tồn lượng trong nông sản nếu

chúng được thu hoạch

trước thời gian cách ly

trường xung quanh, hấp

Phẩn li, nude lid lút hei

phụ lên các hạt keo đất hoặc hòa tan một phần nhỏ trong nước, chịu

tác động của hàng loạt

quá trình hóa lý và sinh

Hình 1.3.1: Sự di chuyển, phân bố của HCBVTV

trong môi IFường học nên bị biến đổi, di

chuyển và phân bố lại

trong môi trường Dư lượng của HCBVTV trong đất, nước, không khí và nông san

thực phẩm đã được tích lũy với mức độ tăng dần qua các mát xích dinh dưỡng

trong chuối thức an từ thấp tới cao của hệ sinh thái Từ đó, do có tính hòa tan cao

trong lipit, chúng đã xâm nhập vào cơ thể con người và động vật với hàm lượng lớn [78] Vì vậy, từ nhiều nguồn khác nhau mà HCBVTV có thể ảnh hưởng đến sức

khỏe con người và môi trường.

b Du lương HCBVTV trong nước: HCBVTV thâm nhập vào môi trường nước theo nhiều cách như: do dùng thuốc diệt côn trùng (TDCT) trực tiếp trong

nước, do nước chảy qua các khu vực được phun thuốc hay từ nước thải của các nhà

máy sản xuất HCBVTV [45, 46, 117, 118, 135, 143, 145].

Tùy thuộc vào đặc tinh hấp phụ và các lỗ xốp của đất mà nước ngầm có thể bị

nhiễm HCBVTV Theo Cohen, Eiden, Corber [6, 36] hàm lượng một số loại

HCBVTV trong nước như sau (tính theo pg/l): DDT 0,03; HCH 0,001-0,002;

carbofuran 1-50 ; 1,2 dibrometan 0,05-20

Do sử dung trực tiếp HCBVTV hay khả năng thấm sâu hoặc lan truyền trong

đất từ nơi phun xịt thuốc, theo mưa lũ mà nước bề mặt có thể chứa dư lượng

HCBVTV Dư lượng này có thể có mặt ở giữa lớp trầm tích và nước Dư lượng của

một số HCBVTV bền vững thường có hàm lượng ở lớp nước mặt thấp hơn lớp trầm

tích khoảng 10-100 lần [6, 54, 121] Nước chứa dư lượng HCBVTV sẽ gây hại trước hết cho động thực vật sống trong đó, rồi đến con người.

c Du lương HCBVTV trong đất: HCBVTV có thé được sử dụng bằng nhiều

con đường khác nhau, nhưng cuối cùng thuốc cũng tập trung vào đất Trong đất,

HCBVTV bị các yếu tố hữu sinh và vô sinh phân huỷ dần Tốc độ phân huỷ của mỗi loại HCBVTV khác nhau Như vậy, trong đất HCBVTV có khả năng di

chuyển, phân bố lại một cách cơ học qua quá trình làm đất, bị rửa trôi bởi nước

mưa , rồi ngấm sâu xuống đất, gây ô nhiễm mạch nước ngầm Từ đó, theo nước

ngầm có thể đi đến những nơi khác xa khu vực xử lý thuốc

d Du lương HCBVTV trong thực vat và nông san: HCBVTV có thể đi trực

tiếp hoặc gián tiếp vào cây trồng HCBVTV ở trên cây làm ảnh hưởng đến chat lượng và sự tăng trưởng của nông sản, đồng thời gây độc cho con người cũng như các vật nuôi ăn phải loại nông sản này Tốc độ xâm nhập vào và hàm lượng

HCBVTV ở các bộ phận của cây có thể khác nhau Ví dụ, khi phân tích hàm lượng

cypermethrin ở quả táo thì thấy hàm lượng có trong thịt kém 9 lần so với trong vỏ

táo [68] Theo FAO/WHO [88] hàm lượng cypermethrin trong vỏ quả lê nhiều hơn

trong ruột tới 30%.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến su phân bố dư lượng HCBVTV ở các bộ phận

khác nhau của cây trồng Chẳng hạn, mưa và ánh sáng mặt trời tác động rất lớn

đến dư lượng HCBVTV ở phía ngoài của cây [34] Trong khi đó, quá trình bốc hơi

từ đất trồng hoặc quá trình lắng đọng bụi chứa dư lượng HCBVTV lại làm tăng

mức dư lượng HCBVTV trong cây trồng Chính vì vậy, muốn xác định dư lượng

HCBVTV trên cây cần lấy số lượng lớn mẫu phân tích ở mọi bộ phận của cây mới

mong đạt được độ chính xác cần thiết.

e Tác hai chung của HCBVIV

Hầu hết những rủi ro về môi trường, ảnh hưởng sinh thái là kết quả của việc

sử dụng HCBVTV, độc tố của HCBVTV có những ảnh hưởng khác nhau lên các cơ

thể sống Các loại TTS thuộc loại TDCT là độc nhất, sau đó là thuốc diệt cỏ, thuốc

diệt chấy rận và thuốc diệt nấm Tác động ảnh hưởng vào sinh vật có ích phụ thuộc

vào việc TDCT giảm tính độc và và biến đổi của nó trong suốt chu trình thuỷ văn,

đất trồng và những chuổi thức ăn như thé nào Khuynh hướng tác động ảnh hưởng

gián tiếp có hại cho những sinh vật có lợi lớn nhất bat nguồn từ một vài TDCT

khác nhau, đặc biệt là TTS bọ được ứng dung thông thường.

Con người thường bị nhiễm HCBVTV hoặc do tiếp xúc nghề nghiệp, hoặc do

tiếp xúc môi trường (hình

1.3.2) [19, 22, 26, 30, 86,

87, 98] HCBVTV xam nhap vao co thé con ngudi gay

nhiễm độc tức thời gọi là nhiễm độc cấp tính Độ độc

cấp tính của thuốc được biểu

thị qua liều gây chết trungvào cơ thể con người Bình (LD), được tính băng

mg hoạt chất/kg khối lượng cơ thé (LDs¿: liều lượng thuốc gây chết cho 50% cá thể

động vật thí nghiệm) Giá trị LD;, của HCBVTV còn phụ thuộc vào cách thức xâm

nhập của nó vào cơ thể qua đường miệng hay qua da Độ độc cấp tính của thuốc

xông hơi được biểu thị bằng nồng độ gây chết trung bình (LCs¿) và tính theo mghoạt chất/mỶ không khí Giá tri LC.) còn được dùng dé chỉ nồng độ gây chết trung

bình của thuốc đối với động vật thủy sinh, tính bằng mg hoạt chất/lít nước Loại

thuốc có giá trị LD;s hoặc LC;, càng thấp, chứng tỏ có độ độc cấp tính càng cao.

Ngoài gây độc cấp tính, một số loại HCBVTV còn có đặc tính tích lũy lâu dài

trong cơ thể sống, bền vững trong môi trường, nên có thể gây độc mãn tính đối với

sức khỏe con người TTS co clo thường tích lũy trong các mô mỡ, khó bài tiết khỏi

cơ thể nên rất khó điều trị

1.4 CÁC ĐÁNH GIA RUT RA TỪ PHAN TONG QUAN

1.4.1 Đánh giá các phương pháp chiết tach làm giàu mau:

Các kỹ thuật chiết tách truyền thống có mặt hạn chế [20] Theo I H Suffet,

để đạt hiệu suất thu hồi khoảng 90% trong phương pháp chiết lỏng - lỏng thì tỷ lệ dung môi va mẫu phải là 1:5, muốn hiệu suất cao hơn phải tiến hành chiết 2, 3 lần.

Đối với phương pháp SPE, mặc dù có nhiều ưu điểm như đơn giản, an toàn,nhanh và dễ sử dụng, hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm sạch và làm giàu chất

phân tích lớn, dễ tự động hoá, tiết kiệm dung môi [130] Tuy nhiên, SPE cũng chiết lượng mẫu lớn và chỉ một lượng nhỏ (chừng | - 2 °/,)) được đưa vào máy sắc ký.

Trong khi đó, SPME hầu như hoàn toàn không sử dụng dung môi để chiết

tách, lại tách được các chất phân tích với lượng mẫu rất nhỏ (khoảng dưới 10 ml so

với chiết lỏng-lỏng thường là | lít) và đưa hết toàn bộ lượng chất đó vào máy sắc

ký tránh sự dư thừa chất phân tích Giới hạn phát hiện của phương pháp SPME đối

với các chất không bay hơi, bán bay hơi và bay hơi có thể dat tới 15 ng/l (theo cơ

quan bảo vệ môi trường Mỹ US - EPA) [60, 61].

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh kỹ thuật SPME rất phù hợp để

chiết nhiều HCBVTV khỏi mẫu nước [36, 37, 53, 95, 103] Do các HCBVTV rất

đa dạng, lại khác nhau về tính chất hoá lý và cấu trúc nên các điều kiện thực hiện

kỹ thuật SPME cũng khác nhau: thời gian chiết có thể từ vài phút đến vài giờ, vớicác biện pháp khuấy, làm nóng mẫu, làm nguội sợi chiết có thể rút ngắn thời gian

chiết Thời gian xử ly mẫu ngắn, dụng cụ va cách thực hiện đơn giản chính là một

lợi thế lớn của kỹ thuật SPME (phụ luc trang 136 -137).

Cùng với SPME, hiện nay kỹ thuật LPME cũng đang được nghiên cứu và

phát triển LPME có rất nhiều ưu điểm như thao tác đơn giản, thời gian chiết ngắn,

giới hạn phát hiện có thể tới ppt [84], rất tiết kiệm dung môi chiết và mẫu phân

tích, toàn bộ lượng chất phân tích chiết ra đều được bơm vào máy sac ký [102].

LPME cho phép phân tích được hầu hết các hợp chất hữu cơ bay hơi, bán bay

hơi, khó bay hơi, tuỳ thuộc vào phương pháp phân tích sắc ký tiếp theo Ví dụ, khi

kết hợp LPME với công cụ GC, lượng dung môi được dùng thường rất nhỏ (khoảng

0,5 - 3 ul); kết hợp LPME với HPLC, lượng dung môi cần dùng cũng chỉ lên đến

khoảng vài chục pl Lượng mẫu sử dụng cũng rất ít cỡ vài ml (nếu vi chiết trong

dung dịch) hoặc vài gam (nếu vi chiết trong KGH, mẫu rắn) Tuy nhiên để có thể

ứng dụng một cách có hiệu quả kỹ thuật này đòi hỏi thao tác của người làm thí

nghiệm phải thật chuẩn xác

Hiện nay, cả hai kỹ thuật SPME và LPME đang có những bước tiến vững

mạnh trong lĩnh vực phân tích môi trường và có tiềm năng ứng dụng rất lớn

1.4.2 Đánh gia các phương pháp phân tích công cu xác định HCBVTV

Gần đây các phương pháp ELISA để xác định TTS đang xuất hiện ngày càng

tăng có độ nhạy cao, tương đối nhanh và tiết kiệm được chi phí [38, 40, 41, 42, 43,

44, 47, 59, 75, 76, 79, 89, 90, 99, 100, 101].

Kết quả từ một số công trình nghiên cứu [112, 115, 116] cho thấy có trường

hợp : một số mẫu cho kết quả âm tính nhưng vẫn có phân trăm ức chế dương Nhưvậy, phương pháp này có giới hạn phát hiện cao nhưng chỉ đo tổng các TTS Do đó,

các phương pháp phân tích công cụ như sắc ký khí, sắc ký lỏng tuy còn tồn tại

nhiều hạn chế về thời gian cũng như chi phí phân tích, song xác định chính xác dư

lượng HCBVTV nên việc sử dụng các phương pháp này vẫn là cơ bản và cần thiết.

Từ đó, đề tài này bước đầu thử nghiệm phương pháp ELISA (với sự chuyển

giao công nghệ của Giáo sư Ivan R Kennedy thuộc trường Dai học Sydney, NSW

2006, Australia) cho xác định dư lượng tổng số các TTS nhóm endosulfan và các

xyclodien khác có cấu trúc gần giống với endosulfan trong các mẫu môi trường:

đồng thời tiếp tục nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích nhanh, trong đó kếthợp các kỹ thuật chiết tách tiên tiến (SPME và LPME) với phương pháp sắc ký khí

có độ nhạy cao, cho phép xác định chính xác và riêng ré nồng độ từng chất cũng

như từng đồng phân của chất cần phân tích để xây dựng các quy trình phân tích đa

dư lượng HCBVTV họ cơ clo, cơ phôtpho và pyrethroit trong các mau đất, nước

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ QUÁ TRÌNH

THỰC NGHIỆM

2.1 PHAM VI VÀ MỤC TIỂU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Pham vi nghiên cứu

Xây dựng phương pháp phân tích nhanh sử dụng kết hợp sắc ký khí đetectơ ECD nhằm xác định dư lượng HCBVTV cơ clo, co phôtpho tại một số khu vực san

xuất nông nghiệp thuộc đồng bằng sông Cửu Long, vùng nông thôn phụ cận Hà Nội

và Hai Phòng; dư lượng HCBVTV cơ clo họ xyclodien trên một số mẫu rau lấy tại

các chợ nội thành Hà Nội tại thời điểm được cung cấp cho người tiêu dùng.

2.1.2 Muc tiêu nghiên cứu

Trong công trình này, trước hết chúng tôi thử nghiệm áp dụng phương pháp

ELISA cho phân tích tổng dư lượng HCBVTV cơ clo họ xyclodien trong các mẫu

đất, nước, rau Một số mẫu cho kết quả âm tính về tổng dư lượng HCBVTV cơ clo

họ xyclodien (tín hiệu dưới giới hạn phát hiện) và mẫu dương tính được kiểm tra

chéo qua việc định lượng chính xác từng cấu tử xyclodien bằng phương pháp sắc ký

khí để khẳng định ưu điểm sàng lọc của phương pháp ELISA

Với mục tiêu xây dựng phương pháp phân tích định lượng đa dư lượng

HCBVTV họ cơ clo (trong đó có co clo họ xyclodien), cơ phôtpho, pyrethroit, với

khả năng tiến hành nhanh giai đoạn chiết mẫu, công trình này tập trung vào việc tìm

các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết mẫu bằng kỹ thuật LPME và SPME (với

dụng cụ SPME tự chế) Phương pháp phân tích SPME/GC-ECD, LPME/GC-ECD đã

phát triển trong nghiên cứu này còn được áp dụng để xác định dư lượng các

HCBVTV cơ clo, cơ phôtpho trong các mẫu nước, mẫu đất lấy tại một số khu vực

nông nghiệp ở Việt Nam.

Các hoạt động nghiên cứu được tiến hành theo trình tự tóm tắt như sau:

a Nghiên cứu ứng dung phương pháp ELISA phán tích sàng loc tổng du

lương HCBVTV cơ clo ho xyclodien mẫu đất, mẫu nước và mâu rau qua

+ Áp dụng phương pháp ELISA xác định dư lượng HCBVTV co clo họ

-xyclodien trong các mẫu đất, nước, rau quả.

+ Đánh giá phương pháp ELISA: Xác định hiệu suất thu hồi, kiểm tra chéo kết

quả phân tích một số mẫu that bằng phương pháp truyền thống (chiết lỏng - lỏng,

lỏng-rắn/sắc ký khí) và phương pháp tiên tiến (chiết SPME/sác ký khí).

b Nghiên cứu xdy dung phương pháp SPMEIGC phán tích da dư lương

HCBVTV ho cơ clo, cơ phôtpho và pyrethroit trong mâu nước và mau đất

+ Chế tạo công cụ thực hiện kỹ thuật SPME

+ Xây dựng phương pháp: Khảo sát lần lượt các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quảchiết để tìm điều kiện tối ưu (bản chất pha tĩnh, độ dày màng, độ dài sợi chiết, nhiệt

độ, áp suất, thời gian cân bảng, các loại muối, nồng độ muối và tốc độ khuấy)

+ Đánh giá phương pháp chiết và quy trình phân tích: Xây dựng đường chuẩn

hấp thu, khảo sát sự hấp thu cạnh tranh, xác định hệ số phân bố K, hệ số làm giàu E,

và xác định độ thu hồi của phương pháp.

+ Áp dung phương pháp đã xây dung để phân tích một số mẫu đất, mẫu nước ở

một số khu vực thuộc đồng bằng sông Cửu Long và các vùng nông thôn phụ cận Hà

Nội, Hải Phòng Quy trình phân tích SPME/GC đã xây dựng được sử dụng để phân

tích chi tiết một số mẫu nước đã phân tích sàng lọc bằng phương pháp ELISA.

c Nghiên cứu xây dưng phương pháp LPME/GC phán tích da dư lương HCBVTV ho cơ clo, cơ phôtpho trong mâu nước

+ Xây dựng phương pháp: Khảo sát một số dung môi dùng để vi chiết và cácyếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết (pH, thời gian, muối, nồng độ muối, tốc độkhuấy và nhiệt độ dung dịch mẫu) để tìm điều kiện tối ưu

+ Đánh giá phương pháp chiết: Tính toán hiệu suất chiết, hệ số phân bố, hệ số làm giàu.

+ Áp dụng phương pháp LPME/GC đã xây dựng để phân tích một số mẫu nước

tại ruộng lúa và ruộng hoa màu ở một số khu vực thuộc đồng bằng sông Cửu Long

và vùng nông thôn phụ cận Hà Nội.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu rau, dat, nước và bảo quản mau

Mẫu nước được lấy tại các ruộng lúa, ruộng rau và kênh thoát nước của vùng

trồng rau Nhanh chóng bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4°C Mẫu đất được lấy ở tầng đất

canh tác bề mặt (độ sâu từ 0 - 20 cm), tại các ruộng lúa và rau theo sơ đồ lấy mẫu

chéo góc Các mẫu đất được lấy riêng ở nhiều điểm khác nhau (5 - 10 điểm), rồi hỗn

hợp lại và lấy mẫu trung bình Mau đất được hong khô va ray qua ray 63 um, trộn

đều và ban quản lạnh ở nhiệt độ -20°C Mẫu rau được lấy theo sơ đồ lấy mẫu chéo

góc (như đối với mẫu đất), rồi cắt nhỏ, trộn đều và bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4°C.

2.2.2 Phương pháp xây dưng quy trình chiết đa dư lương HCBVTV bang kỹ

thuât SPME và LPME

Sau khi đã lựa chọn pha tĩnh, chế tạo được sợi chiết SPME và chọn dung môi

cho LPME; các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả chiết như nhiệt độ, áp suất, pH, thời

gian cân bằng, các loại muối và nồng độ muối và tốc độ khuấy sẽ lần lượt được khảo

sát đơn tuyến (chỉ có một yếu tố thay đổi, các yếu tố khác cố định) để tìm ra điều

kiện tối ưu cho quá trình chiết.

2.2.3 Phương pháp phân tích mau that

a Phương pháp ELISA:

Tổng dư lượng HCBVTV cơ clo họ xyclodien trong mẫu đất, mẫu nước, mẫu

rau quả được phân tích bằng phương pháp ELISA, đây là phương pháp thử nghiệm

miễn dịch dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tín hiệu

phân tích được thể hiện qua phép đo độ hấp thụ quang ở bước sóng vùng khả kiến.

b Phương pháp sắc ký khí - kết hop các kỹ thuát xử lý mâu tiến tiến SPME hoặc LPME:

Da dư lượng HCBVTV họ co clo, cơ phôtpho và pyrethroit có trong mau nước

và mẫu đất được chiết bằng các kỹ thuật xử lý mau tiến tiến SPME hoặc LPME sau

đó phân tích bằng phương pháp sắc ký khí.

b, Phan tích định tính trong sắc ký khí:

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào một yếu tố đặc trưng của tín hiệu

tương ứng với mỗi chất để nhận diện chúng Chính thời gian lưu của các cấu tử là

yếu tố định tính để nhận diện chúng, bằng cách so sánh thời gian của cấu tử xác

định với chất chuẩn hoặc bằng phương pháp thêm Việc nhận diện một cấu tử chính