HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Quá trình cố định carbon được thúc đẩy bởi phân tử hydro dẫn đến sự phát triển tăng cường hóa vô cơ tự dưỡng của Helicobacter pyloriBài báo t
Trang 1GVHD: GS.TS Trần Linh Thước
Tổ 5:
Phạm Thị Thanh Tình 22C64014Lê Võ Bảo Trân 22C64015 Nguyễn Quốc Vủ 22C64016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Quá trình cố định carbon được thúc đẩy bởi phân tử hydro dẫn đến sự phát triển tăng cường hóa vô cơ tự
dưỡng của Helicobacter pylori
Bài báo tham khảo: Carbon fixation driven by molecular hydrogen results in
chemolithoautotrophically enhanced growth of Helicobacter pylori
1
Trang 3• Tác nhân gây loét dạ dày và viêm dạ dày mãn tính • Nguồn: Acid hữu cơ nhỏ, amino acid, peptide.
Trong nghiên cứu này, chỉ ra việc bổ sung H2tăng nồng độ enzyme ACC.
Helicobacter pylori
3
Trang 4Nguyên liệu – Phương pháp
Chủng và điều kiện tăng trưởng.
Nuôi cấy tế bào và phân đoạn dưới tế bào Phân cắt bằng tryptic trong gel.
Phân tích LC-MS/MS.
Phân tích hấp thu [14C] bicarbonate toàn tế bào.Phân tích hoạt tính acetyl-CoA carboxylase.
4
Trang 5Chủng và điều kiện tăng trưởng
H.Pylori:
WT 26695ATCC 43504
26695 ∆ℎ𝑦𝑑ABCDE
Môi trường BHI có 0.4% β-
cyclodextrin- 1 µM NiCl2
Chọn lọc trên môi trường
Tạo huyền phù trong môi trường
BHI-βc-NiỦ 370C, lắc 200 v/p
ĐK: 10% O2, 5% CO2, N2 cân bằngTăng
sinh trên LK1
Thu tế bào+ 10ml khuẩn
vào bình 165 ml
5
Trang 6Chủng và điều kiện tăng trưởng
6
Trang 7Nuôi cấy tế bào và phân đoạn dưới tế bào
H.Pylori
WT 26695
Nuôi cấy BA ở 37°C/36h
ĐK: vi hiếu khí không
đổi
Rửa bằng đệm phosphate pH
7.5 có PMSF
Huyền phù trong 3 ml PBS + French pressure cell 18.000 lb/in2
Loại vụn vỡ TB
Thu dịch nổi
Ly tâm
Thu dịch nổi, phần tế bào màng được huyền phù lại PBS
WT-Ly tâm
Ly tâm
7
Trang 8Alkyl hóa
55 mM iodoacetamideKhử 10 mM DTT
50 mM
NH4HCO3-50% acetonitrile
(ACN)Khử màu
Dịch phân cắt được sấy chân không + bảo quản ở -20°C chờ phân tích khối
Trang 9Tạo huyền phù/2% 0,1% FA
ACN-Agilent 1100 capillary liquid chromatograph (LC)
LTQ linear ion trap mass spectrometer
Phổ khối MS/MS thô mzXML Mascot (MGF)
thông qua Proteomic
Trang 10Phân tích hấp thu [14C] bicarbonate toàn tế bào
Nuôi trong 7h
- Sục khí N2.- Thêm vào: 5mM NaHCO3,
1,3 Ci NaH14CO3
Ủ thêm 12h
(37oC + 200 v/p)
- Lấy 1 ml dịch nuôi, cho vào mỗi:3 lọ chứa chất
nhấp nháy
(0,3 ml TCA 60%)
Lắc + tủ hút 48h
- Mẫu trắng => bỏ.
- Mẫu chứa tế bào.
Lặp lại 3 lần
- Mật độ tế bào
Trang 11Phân tích hoạt tính acetyl-CoA carboxylase
Xác định bằng cách sử dụng enyme kết hợp với pyruvate kinase và lactase dehydrogenase.
0,5 ml hỗn hợp:
+ 10 U pyruvate kinase
+ 9,3 U lactate dehydrogenase+ 0,1 mM NADH
+ 1 mM acetyl-CoA + 50 µM ATP
Phản ứngỞ 340nm
bổ sung 3 µl dịch chiết tế bào/nước
Trang 12Kết quả và thảo luận
2.1 lần
12
Trang 13Điều kiện Vi hiếu khí (Microaerophilic)
13
Trang 1414
Trang 16Acetyl-CoA carboxylase
Trang 17HYDROGENASE [NiFe]
17
Trang 18Hấp thụ [C14]bicarbonate
18
Trang 19Tăng hoạt tính ACC
19
Trang 20Kết luận
- Tăng biểu hiện của hydroase và tiểu đơn vị ACC biotin carboxylase
- Tăng hoạt tính ACC.
- Chuyển hóa và tăng trưởng tổng thể tốt hơn, thể hiện qua năng suất tăng trưởng cao hơn.
- Các vai trò cụ thể của H pylori liên quan đến động lực proton
20
Trang 21Thu hoạch
•Biết được cơ chế hoạt động của hydrogenase trong việc liên kết với co-factor là [Ni-Fe].
•Biết được 1 số protein nằm trên màng và protein trong tế bào chất
21
Trang 22Thank you!
22
Trang 23Cơ chế Beckman LS6000TA scintillation counter
23