Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp)

Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).Nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do Streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis spp).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢCNÂNG CAO KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH DO

Streptococcus agalactiaeGÂY RA TRÊN

CÁ RÔ PHI (Oreochromisspp.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh họcMã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024

NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢCNÂNG CAO KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH DO

Streptococcus agalactiaeGÂY RA TRÊN

CÁ RÔ PHI (Oreochromisspp.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh họcMã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Ngọc TĩnhPGS TS Từ Thanh Dung

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS Nguyễn Thị NgọcTĩnh và PGS.TS Từ Thanh Dung vì sự tận tình hướng dẫn, hỗ trợ, truyền đạt kiếnthức cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin được chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Ban ch nhiệm c ng tập thểKhoa Khoa học Sinh học và Ph ng Sau đại học thuộc Trường Đại học Nông LâmTP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong quátrình thực hiện luậnán.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo cùng các cán bộ tại Trungtâm Quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản Nam Bộ, Phòng Sinh học thực nghiệm,Trại Nghiên cứu Thực nghiệm Th y sản G Vấp thuộc Viện Nghi n cứu Nuôi trồngTh y sản II đã hỗ trợ và tạo mọi điều iện về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quátrình thực hiện nghiên cứu Đồng thời tôi xin cám ơn anh Đoàn Văn Cường - ngườiđã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi xin được gửi ời cám ơn đến Ban Giám đốc c ng các đồng nghiệp SởNông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai đã ng hộ, tạo điều kiện về thờigian để tôi có thể học tập và hoàn thành luậnán.

Xin chân thành cám ơn những Thầy/Cô, anh chị Khoa Th y sảnca Trường Đạihọc Nông Lâm TP Hồ Chí Minh cùng các anh chị em Nghiên cứu sinh ngành Côngnghệ sinh học khóa 2016, các em sinh viên đã hỗ trợ động viên tôi hoàn thành cácnội dung c a luậnán.

Tôi vô cùng biết ơn gia đình Chồng và Các con tôi - những người đã luôn yêuthương ở bên cạnh để động viên, hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho tôi trong suốtthời gian học tập và thực hiện Luận án.

Xin chân thành cám ơn.

Tác giả luận án

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và mộtphần kết quả thuộc nhiệm vụ khoa học và công nghệ “Nghi n cứu phòng trị bệnh do

liên cầu khuẩnStreptococcus agalactiaebằng thảo dược trên cá rô phi giống(Oreochromisspp.) nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh” được tài trợ kinh phí bởi Quỹ

Phát triển khoa học và công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (thuộc Sở Khoa học vàCông nghệ Thành phố Hồ Chí Minh) cho Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnhthuỷ sản Nam Bộ theo Hợp đồng số 26/2018/HĐ-QKHCN Những số liệu, kết quảtrong luận án được phép công bố với sự đồng ý c a ch nhiệm đề tài, nhóm tác giả,cộng tác vi n và chưa từng được công bố bởi tác giảkhác.

Tác giả luận án

NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 12 năm 2022 với

các nội dung gồm:(1)Xác định khả năng kháng vi khuẩn gâybệnhStreptococcusagalactiaeở điều kiệnin vitroc a cao chiết vỏ quế và cao chiếtgừng;(2)Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rôphi kháng lại vi khuẩn gây bệnhS agalactiaetrong điều kiện phòng thí nghiệm;

(3)Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên chỉ tiêu máu, một số chỉ tiêu miễn dịch và

hình thái ruột c a cá rô phi; và(4)Khảo sát khả năng kháng khuẩn c a cao chiết vỏ

quế và cao chiết gừng dựa tr n hàm ượng hoạt chấtchính.

Cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng được chiết xuất trong dung môi ethanol

kiệninvivochothấy,caochiếtgừngvàcaochiếtvỏquếvớicáchàmư ợ n g 102 0

v à 40g/kgđượcbổsungvàothứcăntrong8tuầnh ô n g à m ảnhhưởngđếnsựsinh

trưởngvàpháttriểncacárôphigiống.Bncạnhđóv ớ i thờigianbổsung28ngày và tiếp tục trong

10 ngày sau hi cá được cảm nhiễm vớiS agalactiae, các cao chiết tr n đã cho thấyhiệu quả hỗ trợ nâng cao khả năng háng bệnh doS.agalactiaegây ra; đồng thời

cao chiết vỏ quế còn giúp gia tăng hả năng hấp thu chất dinh dưỡng trên cá rôphi giống Hiệu quả bảo vệ cao nhất với vi

huẩnS.agalatiae(RPSđạt514%)trêncáđượcchoănh ẩ u phầncóbổsungcaochiếtvỏ quế

với hàm ượng 20 g/ g thức ăn Nghi n cứu cho thấy, hoạt chất cinnamic aldehydevới hàm ượng 100 µg/g thức ăn và 200 µg/g thức ăn có khả năng háng

S agalactiaemang các yếu tố độc lực quan trọng và thuộc CC283, kiểu trình tự

ST283 tại huyện C Chi, Thành phố Hồ Chí Minh.

Các kết quả trong nghiên cứu này đã giúp hẳng định tiềm năng ứng dụng c acao chiết vỏ quế và cao chiết gừng trong việc nâng cao khả năng háng bệnh do vi

khuẩnS agalactiaegây ra trên cá rô phi giống.

The study was conducted from November 2017 to December 2022, with the

contents included:(1)Determination of the ability to antagonize pathogenic bacteria

S agalactiaeunderin vitroconditions of cinnamon bark(Cinnamomum verum) and

ginger (Zingiber officinale) extracts;(2)Determination of the effect of extract ongrowth and ability to protect tilapia against pathogenic bacteriaS agalactiaeunderexperimental conditions;(3)Determination of the effect of the extract on blood and

immune parameters, and morphological parameters of tilapia intestine;

and(4)Investigation of antibacterial properties of cinnamon bark and ginger extracts

based on the content of main activeingredients.

Ginger and cinnamon bark extracts in ethanol 96% and methanol 99.8% have

ability to against two strains ofS agalatiaeunderin vitroconditions among 6 tested

herbs The study under in vivo conditions confirmed that, the addition of ginger andcinnamon extracts with concentrations of 10, 20 and 40 g/kg to the feed gave noeffect for the growth and development of tilapia at fingerling stage At the sametime, in the period of 28 days and continuing to supplement for 10 days after fish

injected intraperitoneally toS agalactiae, the ginger and cinnamon extractsprovided the protective effect in enhancing the fish against toS agalactiae; besides,

cinnamon extract also increased nutrient absorption ability in tilapia fingerlings.The addition of cinnamon extract with the concentration of 20 g/kg of feed had the

highest protective effect withS agalatiae(with the RPS value being 51.4%) Theresults have determined theS agalactiaebactericidal ability of cinnamic aldehyde

with the content of 100 µg/g feed and 200 µg/g feed Moreover, this study has

shown the presence of bacteriaS agalactiaeCC283, ST283 sequence bringing

important virulence factors in Cu Chi district, Ho Chi Minh city,Vietnam.

The results in the study confirmed the potential of cinnamon and ginger

extracts in enhancing the resistance toS agalactiaein tilapia fingerlings.

1.2.4.1 Đối với động vậtthủysản……….… 13

1.2.4.2 Đối với cárô phi……… 14

1.3 Sử dụng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩnStreptococcussp vàS.agalactiaegây ra trên thy sản… 15

1.3.1 Nghiên cứu khả năng hángStreptococcus sp.c at h ả o dược……… 161.3.2 Nghiêncứuảnhhưởngcathảodược n tăngtrưởng,sứckhỏe

cá… 18

1.4 Đápứngmiễndịchtrêncáxươngvàtácđộngca thảodượclênhìnhtháibiểu mô ca cá… 20

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch tr ncá xương……… 20

1.4.2 Tác động c a thảo dược lên hình thái biểu mô ca cá……… 20

1.5 Giới thiệu các loại thảo dược sử dụng trongnghiêncứu 21

1.6 Phương pháp chiết xuất thảo dược dùng trongnghiên cứu……… 24

1.6.1 Chiết xuấtngấmkiệt……… 24

1.6.2 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở nhiệtđộcao……… 25

1.7 Cơ sở lựa chọn các nội dungnghiêncứu……… 26

2.4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn S.agalactiae……… 30

2.4.1.2 Khảo sát khả năng kháng S agalactiae của cao chiếtdạng thô… 32

2.4.1.3 Xác định giá trị MIC và MBC của cao chiếtdạngthô……… 36

2.4.2 Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩngâybệnhS.agalactiae………. 37

2.4.2.1 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lêntăngtrưởng……… 37

2.4.2.2 Xác định giá trị LD50và các yếu tốđộc lực……… 39

2.4.2.3 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng bảo vệ cárôphi……. 41

2.4.3 Nộidung3:Xácđịnhảnhhưởngca caochiếtlêncácchỉtiêumáu,chỉtiêu miễn dịch và hình thái ruột c a cárôphi……… 44

2.4.3.1 Bố tríthínghiệm……… 44

2.4.3.2 Thumẫu……… 45

2.4.3.3 Phân tích tế bào máu và các chỉ tiêumiễndịch……….… 46

2.4.3.4 Phân tích chỉ tiêu hình thái môruột cá……… 47

2.4.4 Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và hảo sát tínhh á n ghuẩn c a cao chiết thảo dược dựa tr n hàm ượng hoạtchấtchính… 48

2.4.4.1 Xác định hàm lượng hoạt chất 6-gingerol vàcinnamicaldehyde…… 48

2.4.4.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của các hoạtchấtchính………. 51

2.4.4.3 Xác định MIC và MBC của cao chiết theo hàm lượngchất chính……. 51

2.5 Xử lýsốliệu……… 52

Chương 3 KẾT QUẢ VÀTHẢOLUẬN……… 53

3.1 Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gâybệnhS.agalactiaeở điềukiệnin vitroc a một số dịch chiết và cao chiết thảodược……… ……… 53

3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn sử dụng trongnghiêncứu……… 53

3.1.2 Sàng lọc khả năng hángS agalactiaec ad ị c h chiết……… 54

3.1.3 Khảo sát khả năng hángS agalactiaec a các cao chiếtdạngthô… 57

3.1.4 Xác định giá trị MIC và MBC c a cao chiết gừngvà quế……… 61

3.1.5 Xác định loại thảo dược và dung môiphùhợp……… 63

3.2 Nộidung2:Xácđịnhảnhhưởngca caochiếtlêntăngtrưởngvàkhảnăngbảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnhS.agalactiae……… 64

3.2.1 Xác định ảnh hưởng c a cao chiết n tăng trưởng ca cá………… 64

3.2.3.1 Tỷ lệ sống và các chỉ tiêutăngtrưởng……… 77

3.2.3.2 Biểu hiện bệnh lý của cá sau khicảmnhiễm……… 78

3.3 Nộidung3:Xácđịnhảnhhưởngca caochiếtlêncácchỉtiêumáu,miễndịch và hình thái ruột c a cárô phi……… 84

3.3.1 Xác định ảnh hưởng lên chỉ tiêu máu và các chỉ tiêumiễn dịch………… 84

3.3.1.1 Mật độ hồng cầu vàbạchcầu……… 84

3.3.1.2 Hoạt tínhthựcbào……… 93

3.3.2 Xác định ảnh hưởng lên hình thái môruộtcá……… 95

3.4 Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và khảo sát tính kháng khuẩn c a cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính… 105

3.4.1 Xác định hàm ượng hoạt chấtchính… 105

3.4.1.1 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong caochiếtgừng 106

3.4.1.2 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong cao chiếtvỏquế………. 109

3.4.1.3 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong thức ănthínghiệm 113

3.4.2 Khả năng hángS agalactiaec a cao chiết theo hoạtchấtchính……… 114

3.5 Hiệu quả nâng cao khả năng hángS agalactiaec acaochiết 116

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BHIA Brain Heart Infusion Agar BHIB Brain Heart InfusionBrothCAMP Christie–Atkins–Munch-

EDTA Ethylene diamine tetraaceticacid

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổchức Lương thực và Nông nghiệp Liên HợpQuốc)FCR Feed Conversion Ratio (hệ số biến đổi thức ăn)

HBSS Hank's Balanced SaltSolution

LD Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% vật thí nghiệm, liều vikhuẩn gây chếtcá)

MBC Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tốithiểu)MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)MLST Multi-locus sequence typing (Giải trình tự gen đađiểm)

MP/ME Muscularis propria/ Muscu aris externa (Độ dày lớp đệm niêmmạc)

PA Phagocytic activity (Hoạt tính thựcbào)

PBS Phosphate Buffered Saline (Nước muối đệm photphat)RBC Red Blood Cell (Tế bào hồngcầu)

RES Respiratory burst (Hoạt tính chống oxy hóa)RPMI Roswell Park MemorialInstitute

RPS Relative percentage survival (Tỷ lệ sống tươngđối)

SGR Specific Growth Rate (Tốc độ tăng trưởng tương đối theokhốiượng)ST Sequence Types (Loại trìnhtự)

VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers (Hiệphội Chế biến và Xuất khẩu Th y sản ViệtNam)VH Villus height (Chiều cao nhung mao)

VW Villus width (Chiều rộng nhung mao) WBC White Blood Cell (Tế bào bạch cầu) WG Weight Gain (Tăng trọng

khốiư ợ n g )

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1Các nhóm gen độc lực c a vi khuẩnS agalactiae……… 12Bảng

2.1Các loại thảo dược được dùng trong nghiên cứu 28Bảng

2.2Các ch ng vi khuẩnS agalactiaedùng trong nghiên cứu 29Bảng

2.3Thành phần dinh dưỡng c a thức ăn d ng trong thí nghiệm ……… 29Bảng2.4Hàm ượng ẩm (%) c a các loại bột thảo dược thí nghiệm………… 33

Bảng 2.5Các nghiệm thức c a thí nghiệm xác định ảnh hưởng c a việc bổ

sung cao chiết vào thức ăn n tăng trưởng c a cá rô phi……… 39

Bảng 2.6Bố trí thí nghiệm xác định liều gâychếtLD50……… 40

Bảng 2.7Số ượng và thời điểm thu mẫu ruột cá làm tiêu bảnmô học……… 47

Bảng 3.1Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các

Bảng 3.2Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa

giấy tẩm cao chiết thảo dược sau 48 giờ tiếp xúc vớivi khuẩn 58

Bảng 3.3Kết quả xác định giá trị MIC và MBC ca c a o c h i ế t g ừ n g v à v ỏ q u ế

dạng thô đối với các ch ng vi khuẩn trong dung môi ethanolvà methanol…… 62

Bảng 3.4Các giá trị chất ượng nước trong thí nghiệm xác định tính an toàn

cacaochiếtthảodượch i bổsungvàothứcăn……… 64

Bảng 3.5Tăng trưởng c a cá trongt h í nghiệm……… 65

Bảng 3.6Kết quả xác định LD50c a các ch ngv i h u ẩ n … 69

Bảng 3.7Trình tự gen các ocus để xác định iểu trình tự c a ch ng

Bảng 3.8Các gen độc lực tìm thấy trong ch ngS.agalactiaeSA-2.1-CC…… 76

Bảng 3.9Các giá trị chất ượng nước trong thí nghiệm xác định hiệu quả bảo

vệ cá rô phi c a cao chiết thảo dược hi bổ sung vàot h ứ c ăn……… 77

Bảng 3.10Khối ượng và tỷ ệ sống c a cá sau 28 ngày thín g h i ệ m ………… 78

Bảng 3.11Tỷ ệ chết tích ũy c a cá sau hi cảm nhiễm với vi huẩnS.agalctiae………

…81Bảng 3.12Hiệu quả bảo vệ ca c a o c h i ế t g ừ n g v à c a o c h i ế t v ỏ q u ế v ớ i c á r ôphi hi được cảm nhiễm vi khuẩnS.agalactiae……… 82

Bảng 3.13Diện tích nhung mao (103µm2) ca r u ộ t c á c h o ă n t h ứ c ă n b ổ s u n gcao chiếtvỏquế 103

Bảng3.14Kếtquảtiuchuẩnhóanguyniệugừng……… 106

Bảng 3.15Kết quả phân tích hàmư ợ n g 6-Gingero 109

Bảng 3.16Kết quả tiêu chuẩn hóa nguyênliệu quế 110

Bảng 3.17Kết quả phân tích hàm ượng cinnamica dehyde……… 112

Bảng 3.18Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo dược theo hàm ượng hợp chất chính sau 48 giờ tiếpxúc với vikhuẩnSA-2.1-CC 115

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1Cá rô phi vằn(O.niloticus)……… 7

Hình 1.2Vi huẩnS t r e p t o c o c c u s agalactiae……… 9

Hình 1.3Quá trình tách chiết thảo dược bằng phương pháp ngấmi ệ t …… 25

Hình 2.1Quy trình chiết xuất thảo dược thí nghiệminvitro………. 31

Hình 2.2Dịch chiết gốc thu được sau quá trìnhtáchchiết……… 33

Hình 2.3Cao chiết thảo dược sử dụng trongthínghiệm……… 33

Hình 2.4Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng bảo vệ cá rôphi……… 42

Hình 2.5Các giai đoạn c a thí nghiệm xác định khả năng bảo vệ cárôphi… 43

Hình 2.6Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉ tiêu miễn dịch và môhọc ruột… 44

Hình 2.7Các chỉ tiêu khảo sát hình thái mô học ruột c a cáthínghiệm…… 48

Hình 2.8Quy trình chiết xuất thảo dược để khảo sát tỷ lệ dung môi chiết xuấttốiưu……… 50

Hình 3.1Xác định đặc tính sinh hóa c a ch ng SA-12.1 với test kit API 32 Strep……… 54

Hình 3.2Vòng kháng khuẩn tạo ra bởi các dịch chiết đối với chn g S A - 1 2 1 56Hình 3.3V ng háng huẩn tạo ra bởi cao chiết vỏ quế trong methanol và bởi kháng sinh Doxycycline đối với chn g SA-12.1……… 59

Hình3.4Tăngtrưởngh ố i ư ợ n g c acásau8tuầnthínghiệm……… 66

Hình 3.5Cá bình thường và cá có biểu hiện bệnhý ……… 79

Hình 3.6Tỷ ệ cá chết tích ũy theo ngày saucảmnhiễm………. 80

Hình 3.7Mật độ hồng cầu và bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiếtgừng ở các thời điểm cảm nhiễmh á c nhau……… 85

Hình 3.8Tỷ lệ các loại bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừngở các thời điểm cảm nhiễmh á c nhau……… 86

Hình 3.9Mật độ hồng cầu và bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết

vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễmh á c nhau……… 88

Hình 3.10Tỷ lệ các loại bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ

quế ở các thời điểm cảmnhiễmh á c … … … 89

Hình 3.11Chỉ số hoạt tính thực bào c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết

gừng và cao chiết vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễmhácnhau……… 93

Hình 3.12Diện tích nhung mao ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết

gừng ở các thời điểm cảm nhiễmhácnhau……… 97

Hình 3.13Độ dày ớp cơ ni m mạc ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết

gừng ở các thời điểm cảm nhiễmh á c nhau……… 98

Hình 3.14Diện tích nhung mao ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ

quế ở các thời điểm cảm nhiễmh á c nhau……… 99

Hình 3.15Độ dày ớp cơ ni m mạc ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết

vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễmhá c nhau……… 100

Hình 3.16Hình ảnh mô học ruột cá trongnghiêncứu……… 102

Hình 3.17Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính các cao ỏng gừng với tỷ ệ

hác nhau đối chiếu nguy n iệu và chuẩn6- gingero 107

Hình 3.18Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính cao đặc gừng tỷệ1:20… 108Hình3.19Sắcíđồdịchchiếtcaogừngtỷlệ1:20bằngHPLC 109Hình 3.20Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính các cao ỏng vỏ quế với tỷệ

hác nhau đối chiếu nguy n iệu và chuẩn cinnamicadehyde……… 111

Hình 3.21Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính cao đặc vỏ quế tỷệ1:30…… 112

Hình 3.22Sắc ý đồ dịch chiết cao quế và dịch chiết thức ănbằngHPLC… 112

-1-Tính cấp thiết

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng th y sản được xác định à mộttrong những ĩnh vực phát triển nhanh nhất trongngành sản xuất thực phẩm (Bondad-Reantaso vàctv, 2005) Việt Nam cũng đã xác định th y sảnlà ngành kinh tế mũi nhọn từ những năm đầuthập niên 90 và trong giai đoạn 2015-2022, mặcd đối mặt với hông ít hó hăn thách thức nhưngsản ượng nuôi th y sản vẫn không ngừng tăngn, từ 3,53 triệu tấn (năm 2015) lên 5,19 triệu tấn(năm 2022) (VASEP, 2023a) Trong các oài cá

nước ngọt, cá rô phi (Oreochromisspp.) à oài

được nuôi phổ biến thứ hai trên thế giới, chỉ saunhững loài cá chép (Fitzsimmons, 2005) Cá rôphi được nuôi thương mại tr n hơn 100 quốc giavà trở thành loài mang lại giá trị kinh tế caotrong nuôi trồng th y sản (Webster và Lim,2006) Sản ượng cá rô phi nuôi trên thế giới tăngtừ 5,67 triệu tấn năm 2015 (FAO 2017) lên 6,4triệu tấn vào năm 2022 (VASEP, 2023b) Ở ViệtNam, cá rô phi là một trong những đối tượngnuôi phổ biến và đã được xác định là sản phẩmth y sản ch lực c a nước ta sau tôm nước mặn, lợvà cá tra (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nôngthôn, 2016) Theo đó định hướng đến năm 2030,diệnt í c h n u ô i c á r ô p h i c ả n ư ớ c đ ạ t 3 3 0 0 0 h a( t ă n g 1 5ầ n s o v ớ i n ă m 2 0 1 5 à

- 60% sản ượng đ tiêu chuẩn xuất khẩu).

-2-ongnuôitrồng thy sản,dịchbệnh làkết quảc a mộtquátrìnhtươngtácphứctạp giữamầmbệnh,các yếutố môitrườngđiềukiện vậtch , thóiquenchămsóc vậtnuôi …(Boerlage vàctv,2017).Bệnh

tococcussp gây

ra được báo cáo lần đầu tiên trên cá hồi nuôi tạiNhật Bản vào năm 1958 (Hoshina và ctv 1958)và là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tếđáng ể cho ngành nuôi trồng th y sản (Abrahamvà ctv, 2019) Cá rô phi có thể bị

nhiễmStreptococcussp do một số lý do, bao gồmcả tình trạng căng thẳng (stress) (Liao và ctv,2020) Vi khuẩnStreptococcus agalactiaelà tác

nhân gây ra bệnh lồi mắt, xuất huyết trênc á

rô phi - một bệnhgâychết nhanh, tỷ lệ chết cao ở tất cả các giai đoạn phát triển c acá, gây thiệt hại kinh tế rất nghiêm trọng cho người nuôi; và là một trong hai loài vikhuẩn chính ảnh hưởng đến việc sản xuất cá rô phi trên thế giới (loài còn lại

làS.iniae) (Lingam và ctv, 2021) Sử dụng kháng sinh là giải pháp phổ biến để kiểmsoát bệnh doS agalactiaegây trên cá rô phi, tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh có

thể dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh c a các ch ng vi khuẩn (Zhang và ctv,2018, 2020) àm tăng tỷ lệ mầm bệnh kháng kháng sinh Bên cạnh đó do vi khuẩncó thể phát triển khả năng đề kháng với bất kỳ loại kháng sinh nào nên điều quantrọng là phải sử dụng kháng sinh và các chất thay thế đúng phương pháp Mặt khác,tình trạng sử dụng kháng sinh hông chính xác ( hông ph hợp với ch ng vi huẩngâybệnhh o ặ c h ô n g đ ú n g i ề u ư ợ n g i ệ u t r ì n h ) c ó t h ể ả n h h ư ở n g x ấ u đ ế n c h ất

ượng và an toàn thực phẩm (Zhang, 2021) Do đó hiện nay, một trong những xuhướng được xem là bền vững và hợp lý về mặt kinh tế (Maulu và ctv, 2021) trongviệc kiểm soát dịch bệnh trên th y sản là sử dụng thảo dược có nguồn gốc từ thiên

nhiên để phòng trị bệnh do vi khuẩn trong đó có vi khuẩnS agalactiaetrên cá rô

phi Việc bổ sung 0 5% tỏi vào hẩu phần ăn cho cá rô phi ai trong 4 tuần có tácdụng nâng cao miễn dịch c a cá thí nghiệm (Ndong và ctv 2007) Tr n cárôphi vằnthực hiện bổ sung kim ngân và nấm linh chi vào chế độ ăn trong vòng ba tuần, vớiba khẩu phần gồm: 1% kim ngân, 1% nấm linh chi và hỗn hợp chứa 0,5% mỗi loạicho thấy giúp cải thiện tình trạng miễn dịch và khả năng háng bệnh c a cá thí

nghiệm khi tiếp xúc với vi khuẩnAeromonas hydrophila(Yin và ctv, 2008); tinh dầuc a hương nhu trắng (Ocimum gratissimum) and gừng (Zingiber officinale) giúp cảithiện phản ứng miễn dịch chống ạiS agalactiae(Brum và ctv,2017).

Các loại thảo dược hứa hẹn tiềm năng trở thành nguồn cung cấp các liệu phápchữa bệnh trong nuôi trồng th y sản do có nhiều ưu điểm như: phổ biến, giá thànhthấp, hoạt tính kháng khuẩn cao, có khả năng ích thích hệ miễn dịch tự nhiên c avật ch (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2009), khả năng phân h y sinhhọc và an toàn hơn so với kháng sinh, thân thiện với môi trường và không gây nênhiệntượngđềkhángthuốc(Jeneyvàctv,2015).Trongcácphươngphápsửdụng

thảo dược trên th y sản gồm bổ sung vào thức ăn ngâm cá trong dịch chiết, tiêmdịch chiết vào xoang bụng cá (Stratev và ctv, 2018) thì phương pháp bổ sung chiếtxuất thảo dược vào thức ăn cho cá có nhiều ưu điểm (tính kinh tế cao, không gâystress cho th y sản nuôi, sử dụng được trên bất kỳ giai đoạn nuôi nào c a th ysản …) và là cách hiệu quả nhất (Galindo-Villegas và Hosokawa, 2004; Isnani vàctv, 2021) Tuy nhiên không phải lúc nào việc bổ sung này cũng giúp đối tượngnuôi nâng cao hệ miễn dịch hoặc đạt được sự tăng trưởng tốt nhất (Galindo-Villegasvà Hosokawa, 2004; Ndong và ctv,2007).

Tại Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng thảo dược để phòng trị bệnh nói chung và

do vi khuẩnS agalactiaenói ri ng đang dần được quan tâm, tuy nhiên công trình

nghiên cứu sử dụng thảo dược như à một giải pháp để nâng cao sức đề kháng, khảnăng ph ng bệnh trên cá rô phi ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốn về số ượng.Nghiên cứu này được tiến hành nhằm chọn ra loại cao chiết thảo dược có hiệu quả

kháng vi khuẩnS agalactiaegây bệnh trên cá rô phi và đánh giá ảnh hưởng c a thảo

dược n tăng trưởng, khả năng nâng cao miễn dịch … hi được bổ sung vào khẩuphần ăn c acá.

Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu giải pháp sử dụng cao chiết từ thảo dược bổ sung vào thức ăn nhưlà giải pháp hiệu quả phòng, trị bệnh trên cá rô phi, thay thế cho việc sử dụng hóachất, kháng sinh.

Mục tiêu cụthể

Xác định được loại thảo dược và loại dung môi phù hợp để tạo ra cao chiết có

khả năng háng hiệu quả với vi khuẩnS agalactiaeở điều kiệnin vitro.

Đánh giá hiệu quả bổ sung cao chiết thảo dược vào thức ăn n tăng trưởng,tăng cường một số chỉ tiêu miễn dịch hông đặc hiệu và khả năng háng bệnh do vi

khuẩnS.agalactiaegây ra trên cá rô phigiống.

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gây bệnhS agalactiaeở điều kiệnin vitroc a một số dịch chiết và cao chiết thảo dược.

Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng

bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnhS agalactiaeở điều kiệninvivo.

Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, chỉ tiêu miễn dịch và hình thái biểu mô ruột c a cá rô phi.

Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và khảo sát tính kháng khuẩn c a cao chiết thảo dược dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính.

Ý nghĩa

Kết quả c a nghiên cứu đóng góp thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho hướngnghiên cứu sử dụng thảo dược trong phòng trị bệnh cho động vật th y sản Nghiêncứu có tính ứng dụng thực tiễn cao, cung cấp một giải pháp phòng trị bệnh trên cárô phi hiệu quả thay thế cho việc sử dụng hóa chất, khángsinh.

Đối tƣợng nghiên cứu

Dịch chiết và cao chiết từ các loại thảo dược gồm: cây diếp cá

(Houttuyniacordata), c hành tím (Allium ascalonicum), lá kinh giới (Elsholtzia

ciliata), vỏ thân quế (Cinnamomum verum), c gừng (Z officinale) và c riềng

Ch ng vi khuẩnS agalactiaeđược phân lập từ cá rô phi (Oreochromisspp.) có

dấu hiệu bệnh lý thu tại huyện Định Quán, tỉnh Đồng Nai và huyện C Chi, thànhphố Hồ Chí Minh (được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng th y sản II).

Những đóng góp mới của luận án

Nghiên cứu đã hẳng định được hiệu quả c a hai loại nguyên liệu thảo dược

gồm vỏ quế (C verum) và gừng (Z officinale) khi bổ sung vào thức ăn dưới dạngcao chiết trong việc hỗ trợ nâng cao khả năng kháng bệnh do vi khuẩnS.

agalactiaegây ra trên cá rô phigiống.

Nghiên cứu đã xác định hàm ượng hoạt chất cinnamic aldehyde chứa trong vỏ

quế (100 µg và 200 µg) có khả năng háng vi huẩnS.a g a l a c t i a e

Nghiên cứu đã xác định sự hiện diện tại huyện C Chi, Thành phố Hồ Chí

Minh c a ch ng vi khuẩnS agalactiaegây bệnh trên cá rô phi, thuộc CC283, kiểu

trình tự ST283 và mang các yếu tố độc lực quan trọng; đóng góp th m cơ sở dữ liệuvề kiểu trình tự c a các ch ng vi khuẩn phân lập được tại ViệtNam.

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cá rôphi

1.1.1 Phân loại khoa học và nguồngốc

Cá rô phi (Oreochromisspp.) thuộc bộ Perciformes, họ Cichlidae và là tên

chung được dùng cho ba chi cá được phân loại dựa trên tập tính sinh sản và nuôi giữ

con (Beveridge và McAndrew, 2012) gồm:Oreochromis,SarotherodonvàTilapia;

bao gồm hơn 70 oài trong đó có ít nhất tám oài được đưa vào nuôi (GISD, 2023).Hiện nay, cá rô phi chiếm khoảng 3,5% tổng sản ượng nuôi trồng th y sản toàn

cầu Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) à oài được nuôi phổ biến nhất (Gupta

và Acosta 2004), thịnh hành nhất vào năm 1960 - 1980 Cá rô phi vằn từ Nhật Bảnđược du nhập vào Thái Lan năm 1965 và từ Thái Lan chúng được đưa đếnPhilippines; được đưa vào Brazi vào năm 1971 và từ Brazi được đưa đến Hoa Kỳvào năm 1974 Năm 1978 cá rô phi vằn được đưa vào Trung Quốc (FAO, 2009) Ở

Việt Nam cá rô phi sẻ (Oreochromis mossambicus) à oài rô phi đầu ti n được

người Pháp mang đến vào năm 1953 đến năm 1973 thì cá rô phi vằn được nhập vàotừ Đài Loan và trở thành oài rô phi nuôi chính tại Việt Nam hiện nay (Đỗ Đoàn

Hiệp và L Đình Xuân, 2006) Bên cạnh cá rô phi vằn, cá rô phi đỏ (Oreochromissp.)

cũng à đối tượng nuôi phổ biến ở khu vực Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu

Long sau khi được nhập từ Ma aysia vào năm 1985 (Phạm Hồng Quân,2013).

hông xương sống nhỏ động vật đáy mảnh vụn và màng vi huẩn i n quanđến mảnh vụn Cá nuôi ao thành thục sinh dục sau 5-6 tháng và sinh sản bắtđầu hi nhiệt độ nước đạt 24°C Con cái trưởng thành đẻ trứng trong ổ, sauhi được con đực thụ tinh con cái ập tức thu trứng vào miệng để ấp cho đến

ệthuậnvớitrọngư ợ n g cơthểcaconcáivàíthơnsovớihầuhếtcáco à i cánuôi trong aokhác Nếu quá trình sinh sản không bị ìmhãm (do thời tiết ạnh), con cái có thể sinh sản i n tục Cá rô phi có thểsống âu hơn 10 năm và đạt trọng ượng trên 5 kg (FAO,2009).

Hình 1.1Cá rô phi vằn (O niloticus) (Linnaeus, 1758) (Nguồn: FAO, 2009)

1.1.3 Tình hình sản xuất cá rô phi trên thế giới và ở ViệtNam

Cá rô phi thích nghi tốt với môi trường nuôi nhân tạo tăng trọng nhanh ở điềukiện tối ưu và sinh sản trong trang trại mà không cần quản lý hoặc cơ sở hạ tầng đặcbiệt (Meyer, 2002) Nuôi cá rô phi à oại hình phổ biến nhất trong nuôi trồng th ysản tr n thế giới với sản ượng hoảng 3 5 triệu tấn và được báo cáo trong ít nhất135 quốc gia và v ng ãnh thổ tr n tất cả các châu ục (FAO, 2014) Hơn 90% cá rôphi nuôi được sản xuất ở các nước đang phát triển ch yếu ở châu Á với hai oài

chính là cá rô phi vằn (O niloticus) và cá rô phi đỏ (Oreochromissp.) aigiữaO.mossambicusvàO niloticus(Boerlage và ctv, 2017) Một số quốc gia có sản

ượng nuôi cá rô phi lớn có thể kể đến như: Trung Quốc (quốc gia nuôi trồng vàchiếm

hơn30%sảnượngcárôphitoàncầunăm2015)IndonesiaAiCậpPhiippines

Thái Lan và Việt Nam (FAO, 2017) Cá rô phi là một trong 15 loài nuôi th y sảnchính trên toàn thế giới cả trong nước ngọt và nước mặn/lợ; sản ượng nuôi nướcngọttoàncầutăngtừ1.001,5ngàntấn(2000)lên 4.407,2ngàntấn(2020)vàsản

ượngnuôinướcmặn/lợtăngtừ1,6ngàntấn(2000)lên107,4ngàntấn(2020),lầnượt chiếm 9% và 1,3% trong tổng sản ượng năm 2020 (FAO2 0 2 2 )

Việt Nam à nước sản xuất nuôi trồng th y sản ớn thứ 4 thế giới, sau TrungQuốc Ấn Độ và Indonesia Tại Việt Nam diện tích nuôi cá rô phi ngày càng mởrộng và gia tăng về sản ượng Năm 2015 diện tích nuôi cá rô phi hoảng 25.400 havới sản ượng 182.000 tấn sản phẩm (Boerlage và ctv, 2017) Theo quy hoạch pháttriển nuôi cá rô phi định hướng đến năm 2030, cá rô phi được xác định là sản phẩmch lực sau tôm nước mặn, lợ và cá tra (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2016) với diệntích nuôi cá rô phi cả nước đạt 40.000 ha (tăng 1 6 lần so với năm 2015 à 25.400ha)v à 1 , 8 t r i ệ u m3l ồ n g n u ô i t r ê n h ệ t h ố n g s ô n g v à h ồ c h ứ a l ớ n ; s ả n ư ợ n g đạ t

400.000tấn(tăng2,2lầnsovớinăm2015là182.000tấn)trongđó45-50%sảnượng đ tiêu chuẩn xuất khẩu B n cạnh đó Việt Nam à nước xuất hẩu th ysảnớn thứ ba thế giới ể từ năm 2014 (FAO, 2018 và 2022) Năm 2020 giá trị hànghóa th y sản xuất hẩu c a Việt Nam đạt 8 5 tỷ USD, chiếm 5 6% tổng giá trị toàncầu (FAO, 2022) Thời gian qua từ một oài cá ch yếu ti u thụ nội địa cá rô phiđãtrở thành một trong các đối tượng xuất hẩu với số ượng thị trường tăng từ 8n 68 nước ch yếu gồm Mỹ Co ombiavà EU (Boerlage và ctv,2017).

1.2 Tổng quan về vi khuẩnS agalactiae

1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinhhóa

Streptococcus agalactiae(hay i n cầu nhóm B – Group BStreptococcus,

GBS) à một oài thuộc chiStreptococcus, ần đầu ti n được phân biệt với các i n

cầu huẩn hác bởi Lancefie d (1933) sau hi được phân ập từ sữa và b bị vi mvú Đây à một oại vi huẩn Gram dương, có dạng hình cầu hoặc hình trứngv ớ i

ích thước đường ính từ 0 5 đến 2,0 µm, hông di động hông sinh nhabàoỵ

híty tiện âm tính với oxidase và catalase (Amal và Zamri-Saad, 2011).

Hình 1.2Vi khuẩnS agalactiae

(Nguồn: https://www.cdc.gov/streplab/groupb-strep/index.html)

1.2.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnhtích

Vi huẩnS agalactiaeđược truyền từ cá bệnh sang cá hỏe thông qua con đường

hấp thụ ại qua đường miệng phân có chứa vi huẩn được cá bệnh thải ra môi trường(Ama và Zamri-Saad 2011) hoặc tiếp xúc trực tiếp với cá bệnh hoặc cá chết cũngnhư tiếp xúc gián tiếp qua nước trong các hệ thống nuôi (Boerlage và ctv, 2017).

Bệnh i n cầu huẩn ở cá doS agalactiaegây ra có đặc điểm à nhiễm tr ng huyếtvà viêm màng não (Mian và ctv, 2009) Khi cá bị nhiễm vi huẩnS.agalactiaesẽ xuất

hiện một số dấu hiệu như: cơ thể sẫm màu giảm ăn hả năng bắt mồi kém, phản ứngchậm với tiếng động bơi mất phương hướng, bất thường (xoắn ốc xoay v ng) và tậptrung trên mặt nước, tuy nhiên không phải tất cả cá bị nhiễm bệnh đều có biểu hiệnbất thường (Yanong, 2002); mắt lồi đục và xuất huyết, những trường hợp bệnhnặng mắt có thể bị rơi ra hỏi hốc mắt, bên trong có chứa dịch màu vàng; xuất huyếttr n thân hoặc ở gốc vây, xương nắp mang; các nội quan gan, thận vàtỳtạng sưng tomềm nhũng và xuất huyết; bụng trương to (Musa và ctv,2009).

Streptococcusspp sản sinh các loại enzyme ngoại bào (fibrinolysin,

hyaluronidase, DNase, ) và các độc tố ngoại bào (streptolysine O, streptolysineS, ) giúp vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống máu và các cơ quan b n trong cơ thể.

Trên bề mặtStreptococcusspp tồn tại chất gọi à protein M i n quan đến sự đề kháng

quá trình thực bào c a bạch cầu trung tính (Phạm Hồng Sơn 2008) Ở giai đoạn cấptính, vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống máu và tất cả các cơ quan nội tạng (Chang vàP umb 1996) do đó hi tiến hành mổ cá bệnh sẽ thấy b n trong cơ thể xuất hiệnnhiều vùng bị hoại tử,tỳtạng tăng n về thể tích, gan nhạt, xuất huyết não (Wanman

và ctv, 2005) Trên cá rô phi vằn nhiễmS agalactiaemãn tính, quan sát trong phần

cơ nằm sát phần xương sống thấy có sự xuất hiện c a các khối u (màu vàng nâuhoặc màu đỏ sẫm) (Siti-Zahrah và ctv,2004).

1.2.3 Phân nhóm và độc lực của vi khuẩnS.agalactiae1.2.3.1 Phân nhóm

Phương pháp phân tích kiểu hình (kiểu huyết thanh, serotype) bằng cách dựavào cấu trúc lớp vỏ capsular polysaccharide (CPS) được d ng để phân nhóm và

đánh giá độc lực c a vi khuẩnS agalactiae(Imperi và ctv, 2010; Kannika và ctv,2017) Cho đến nay, vi khuẩnS agalactiaecó tổng số 10 kiểu huyết thanh được công

nhận gồm Ia Ib và II đến IX (Delannoy và ctv, 2021), mỗi kiểu huyết thanh có đặctính độc lực khác nhau (Imperi và ctv 2010) Tr n động vật th y sản, hiện có 6 kiểuhuyết thanh được xác định gồm: Ia, Ib, II, III, IX (Zhang và ctv, 2018) và IV(Delannoy và ctv 2021); trong đó các iểu Ia Ib II và III à phổ biến nhất trongnhiễm tr ng trên cá rô phi (Zhang, 2021) và iểu huyết thanh IX có hả năng trởthành một ch ng truyền nhiễm chính đối với cá rô phi (Zhang, 2018) Bên cạnh đó

vi khuẩnS agalactiaecòn có thể phân nhóm theo kiểu gen (sequence types, ST, kiểu

trình tự gen), bằng cách xác định phân loại nhỏ hơn dưới loài bằng giải trình tựgenđađiểm(multi-locussequencetyping,MLST)(Kannikavàctv,2017).Mặcdù

S agalactiae có 1.349 oại trình tự tr n toàn thế giới (PubMLST, 2019) nhưng các

ST được tìm thấy từS agalactiae được phân ập từ cá chỉ bao gồm sáu oại: ST7,

ST260, ST261, ST283, ST491 và ST500 (Delannoy và ctv, 2013; Kayansamruaj vàctv, 2019) Cho đến nay các ch ng phân ập được từ cá uôn được phát hiện thuộcvề ba phức hợp ch ng ri ng biệt (c ona comp ex CC) mỗi phức hợp c n i n ếtvớim ộ t i ể u h u y ế t t h a n h h á c n h a u g ồ m C C 7 v ớ i i ể u h u y ế t t h a n h I a ( C C 7 /I a )

CC283 với iểu huyết thanh III (CC283/III) và CC552 với iểu huyết thanh Ib(CC552/Ib) (Delannoy và ctv, 2021) Ch ng có iểu huyết thanh Ia (thuộc CC7) cóthể được tìm thấy ở cá và ếch với phạm vi phân bố từ Tây Châu Á đến Đông NamÁ và Trung Quốc; trong hi đó ch ng có iểu huyết thanh Ib (thuộc CC552) cũngđược tìm thấy ở cá và ếch nhưng phân bố rộng rãi tr n toàn cầu và xuất hiện ở châuMỹ Châu Phi Trung Đông Châu Âu và Úc Kiểu huyết thanh III à duy nhất liênquan đến CC283 tìm thấy cả ở người và các oài biến nhiệt ch yếu xảy ra ở ĐôngNam Á (Phuoc và ctv, 2021) Ngoài ra năm 2021 Delannoy và ctv đã ghi nhận

nhiều đợt bùng phát bệnh doS agalactiaeCC2/IV ở cá rô phi nuôi tại BắcPhi.

Tại Việt Nam, hiện chỉ mới xác định được kiểu huyết thanh c a các ch ng vi

khuẩnS agalactiaeđược phân lập từ các mẫu cá rô phi có dấu hiệu xuất huyết và

phù mắt tại khu vực miền Nam (tỉnh An Giang Đồng Tháp) là kiểu huyết thanh III,ST283 (thuộc CC283) và tại Trung Bộ (tỉnh Thừa Thiên – Huế) là Ib, ST1395(ST1395 là một biến thể c a ST261 và được phân oại à một phần c a CC552)(Phuoc và ctv, 2021) Tại miền Bắc, hoàn toàn chưa nghi n cứu và xác định được

kiểu huyết thanh c a các ch ng vi khuẩnS agalactiaegây bệnh (Đoàn Thị Nhinh và

1.2.3.2 Các yếu tố độclực

Vi huẩnS agalactiaecũng giống như nhiều oài gây bệnh hác sở hữu nhiều

yếu tố độc ực yếu tố sinh học phân tử thúc đẩy hả năng ây nhiễm và/hoặc gây

hại cho vật ch Các yếu tố quan trọng tạo n n độc ực c aS agalactiaecó thể ể

đến gồm: cấu trúc ớp vỏ CPS ( i n quan đến iểu huyết thanh) yếu tố

(2011)chothấy,cấuhìnhgenđộclực(virulencegeneprofiles)caS.agalactiaecó thể được xác định

bằng đặc điểm iểu gen dựa tr n 14 gen độc ực được tìm thấyở các ch ng phân ập từ con người và

được phân oại thành ba nhóm dựa theo cấu hình (cụ thể ở Bảng 1.1) Trong đó nhóm xâm ấnđóng vai tr quan trọng trong yếu tố sinh bệnh tạo điềuiện cho vi huẩn xâm nhập tế bào

vật ch ; phổ biến nhất làgencfb(CAMPfactor)vàcylE(β-hemolysin/cytolysin)

(Zhang,2021).

Bảng 1.1Các nhóm gen độc lực c a vi khuẩnS agalactiae(Lin và ctv, 2011)

1 Bámdính

Chịu tráchnhiệm cho sựxâm nhập cơ

fbsA fibrinogen-binding proteinA

Khángmiễn3 dịch/Né

Chịu tráchnhiệm antruyền thànhcông mầmbệnh

Chịu tráchnhiệmẩntránhhệmiễndịch ca cá

Ghi chú *: gen scpB được xếp vào cả hai nhóm bám dính và né tránh miễn dịch

 Cấu trúc ớp vỏ CPS: mỗi iểu huyết thanh c a ch ng vi huẩn mang cácgen độc ực hác nhau (Kanni a và ctv 2017) và sự hiện diện c a các gen độcựcà một trong hai cơ sở để xác định mức độ độc ực c a một vi huẩn b n cạnh hảnănggâybệnhchocáthínghiệmsauh i cảmnhiễmvớivih u ẩ n (ĐoànThịNhinh

 HAase (hyaluronidase): được mã hóa bởi gencylB, thúc đẩy sự xâm ấn c a

vih u ẩ n v à o v ậ t c h b ằ n g c á c h t i ế t r a H A a s e đ ể t h yphâna x i t h y a uronict h à nh

axit không bão hòa Vi huẩnS agalactiaesử dụng HAase để chống ại phản ứng

miễn dịch c a vật ch (Zhang, 2021).

đến sự sống sót c aS agalactiaetrong đại thực bào (Sagar và ctv, 2013) và thúc đẩy

sự lây nhiễm c a các ch ng ít hoặc không tan huyết nhờ khả năng trốn tránh hệ miễndịch c a vật ch và không hoạt động bên trong đại thực bào cho đến khi điều kiện

thích hợp để chúng hoạt động trở lại Sự hiện diện c acyIEtrong chngS.agalactiaehuyết thanh Ia được cho à thúc đẩy sự xâm lấn (Chu và ctv, 2016),

hỗ trợ lây lan nhanh trong máu và các cơ quan c a vật ch bị nhiễm bệnh Trên cá, sự

vắng mặt c acyIEđược coi là một yếu tố tạo nên sự phát triển c a nhiễm trùng mãntính (Li và ctv 2014) Đối với các ch ngS agalactiaehuyết thanh Ib (không gây tan

huyết), dấu hiệu c a một nhiễm trùng mãn tính được thể hiện qua việc quan sát thấynhiều tế bào đại thực bào chứa vi khuẩn trong não (Legario và ctv,2020).

1.2.4 Tình hình dịch bệnh do vi khuẩnS agalactiaegâyra

1.2.4.1 Đối với động vật thủysản

Sự bùng phát bệnh doStreptococcusspp gây ra xảy ra ở nhiều loài cá nuôi và

trên toàn cầu (Mishra và ctv, 2018), làm tổn thất hoảng 250 triệu USD trên toàn

thế giới mỗi năm (Amal và Zamri-Saad, 2011) Bệnh doStreptococcusspp.(Streptococcal disease)gây ra trên cá được báo cáo lần đầu ti n vào năm 1957 tr n cá

hồi cầu vồng tại Nhật Bản (Hoshina và ctv, 1958) Kể từ đó Streptococcosis là mộtbệnh phổ biến ảnh hưởng đến nhiều oài cá hác nhau tr n toàn thế giới bao gồm cánước ngọt nước ợ và nước mặn: cá hồi, cá trích, cá rô phi, cá basa, cá chẽm cá múcá bơn Nhật Bản cá tráp, cá chim bạc (Roberts, 2012) Ở một số loài cá

cảnh,Streptococcusspp cũng đã được tìm thấy từ mẫu phân lập BệnhdoStreptococcusspp gây tỷ ệ chết cao (trên 50%) trong hoảng thời gian từ 3 đến 7

ngày Tuy nhi n một số đợtbng phát có tính chất mãn tính hơn và tỷ ệ tử vong có thểéo dài trong hoảng thời gian vài tuần chỉ có một vài con cá chết mỗingày(Yanong,2002).

Vi huẩnS agalactiaevàS iniaelà hai loài trong nhómStreptococcusgâyảnh

hưởng chính đến ngành nuôi trồng th y sản (Evans và ctv,

2002).Streptococcusagalactiaeđược báo cáo đầu ti n tr n cá nuôi nước ngọt vào năm1966 (Robinson và Meyer, 1966), cònS iniaelần đầu ti n được phân lập từ một tổnthương da c a cá thể cá nuôi sông Amazon (Inia geoffrenis) (Pier và Madin, 1976).Nhiều nghiên cứu đã phát hiện và khẳng địnhS agalactiaelà nguyên nhân gây bệnh

cho cá đặc biệt à cá nước ngọt (Plumb, 1999) Các quốc gia Đông Nam Á (Ansharyvà ctv, 2014; Jantrakajorn và ctv, 2014; Barkham và ctv, 2019; Kayansamruaj vàctv, 2019; Syuhada và ctv, 2020) và Trung Quốc (Li và ctv, 2014; Su và ctv, 2019)

ghi nhậnS.agalactiaeà oài chính i n quan đến dịch bệnh doStreptococcusgâyra.Tỷlệ quan sát được c aS agalactiaeso vớiS iniaeở các quốc gia này là tương tự

như các báo cáo trên toàn thế giới đặc biệt là ở các vùng sản xuất cá rô phi chínhkhu vực Châu Á và ChâuMỹLatinh (Liu và ctv,2016).

1.2.4.2 Đối với cá rôphi

So với nhiều oài cá hác trong c ng môi trường nuôi, cá rô phi đã được xemlà có khả năng đề kháng tốt với các mầm bệnh Tuy nhiên, các nghiên cứu thời gianqua đã cho thấy nghề nuôi cá rô phi đang phải đối mặt với những thách thức ớn từ

columnare,Aeromonashydrophyla,Edwarsiella tardagây ra (Abraham và ctv, 2019).

Các đợt dịch bệnh bùng phát ở các v ng nước ngọt nuôi cá rô phi tiếp tục đe dọa sảnxuất toàn cầu và làm thiệt hại kinh tế trầm trọng trên toàn thế giới (Mishra vàctv,2018).

Streptococcusà một trong những nhóm vi huẩn đe dọa đáng ể đến nghề

nuôicárôphi(Lingamvàctv,2021),vàStreptococcosisđãđượccôngnhậnàmột trong những bệnhvi huẩn nghi m trọng nhất trong nuôi cá rô phi, bao gồm khu vực Đông Nam Á (Kayansamruaj

và ctv, 2020), thường gây tỷ ệ tử vong cao và kéo dài (Yang và Li, 2009) LoàiS agalactiaelà

vi huẩn chính ảnh hưởng đến việc sản xuất cá rô phi trên thế giới (Zamri-saad

điểmthu)trongcácmẫunhiễmvikhuẩntrncárôphiđượcthuthậptạicácquốc

gia Đông Nam Á gồm: Indonesia, Singapore, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Trung

Quốc và Việt Nam, tiếp theo làS iniae(75 mẫu tại 14 điểm thu) Trong tổng số 500

mẫu phân lập từ 13 nước Châu Á và Châu Mỹ La tinh trong 8 năm thì có đến 82%

số mẫu được xác định làS agalactiae(Sheehanvà ctv, 2009), trong khi tại Thái Lan,tỷ lệS.agalactiaeđược tìm thấy là 93% (112/120 mẫu) trong tổng số mẫu phân lậpđược trên cá rô phi vằn (O niloticus)(Wongtavatchai và Maisak,2008).

Nhiều trang trại nuôi cá rô phi trên thế giới đặc biệt là các trang trại ở châu Á,

đã ghi nhận được nhiều đợt dịch bệnh do nhiễmS agalactiae(Musa và ctv, 2009).

Năm 2001 tại Thái Lan xuất hiện dịch bệnh làm chết khoảng 40-60% số ượng cánuôi sau hai tuần nhiễm bệnh; tiếp đó trong năm 2002 và 2003 tại Indonesia cũngđã xảy ra hiện tượng cá rô phi nuôi lồng bị chết; năm 2005 tiếp tục xuất hiện hiệntượng cá rô phi nuôi lồng ở một số hồ chứa bị chết tại Malaysia Vi khuẩn phân lậpđược từ những con cá rô phi bị nhiễm bệnh tại các địa điểm trên đều xác định hầu

hết làS agalactiae(Yuasa, 2008) Năm 2011 bệnh i n cầu huẩn gây thiệt hại 40 triệu

đô a Mỹ cho ngành công nghiệp cá rô phi ở Trung Quốc do tỷ ệ mắc bệnh và tửvong cao có thể n tới 80% (Zhang,2021).

Tại Việt Nam, bệnh doS agalactiaeđược ghi nhận xuất hiện lần đầu tiên ở một

số cơ sở nuôi bè tại An Giang vào năm 2004 và àm chết cá rải rác (Đặng Thị HoàngOanh và Nguyễn Thanh Phương 2012b) Đợt dịch bệnh lớn nhất kể từ trước đến nayđối với nghề nuôi cá rô phi xảy ra vào năm 2009 tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam(Hà Nội Hưng Y n Hải Dương Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Ninh và Hà Giang)(Đồng Thanh Hà và ctv., 2010), gây chết vớitỷlệ cao (90-100%) trên cá rô phi giốngvà thương phẩm (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản I, 2017) Một số đợt bệnh

doS agalactiaegây ra đã được báo cáo xảy ra tại một số tỉnh khu vực Đồng bằng

sông Cửu Long, một số tỉnh miền Bắc và tỉnh Thừa Thiên – Huế (Đặng Thị HoàngOanh và Nguyễn Thanh Phương 2012b; Trương Đình Hoài và ctv 2014; NguyễnNgọc Phước và ctv.,2019).

1.3 Sử dụng thảo dƣợc phòng trị bệnh do vi khuẩnStreptococcussp.và

S.agalactiaegây ra trên thủysản

Tr n thế giới nhiều oại thảo dược và dung môi chiết xuất đã được hảo

sátinvitrođể tìm ra oại có hiệu quả hángStreptococcussp vàS agalactiae Tại Việt

Nam nghi n cứu ứng dụng thảo dược để trị bệnh tr n động vật th y sản mới đượcphát triển thời gian gần đây và đang dần được quan tâm; tuy nhi n các nghi n cứusửdụngthảodượcđểphngtrịbệnhnângcaotỷệsốngvàmiễndịchdovihuẩn

S.agalactiaegâyratrnđộngvậtthysảnnóichungvàtrncárôphinóiringvẫn c n há hi m tốn các ết

quả nghi n cứu chỉ mới dừng ại ở quy mô ph ng thí nghiệm Một số ết quả nghi n cứu bước

đầu tìm ra được oại thảo dược có hả năng hángStreptococcusspp vàS.agalactiae.

1.3.1 Nghiên cứu khả năng khángStreptococcussp của thảodƣợc

Mộtsốthảodượcđãđượcdngđểkhảosátkhảnăngh á n g Streptococcussp Nghincứuca

Wei(2008)tiếnhànhtrên mộtsốloàithựcvậtnhiệtđớichothấy, chiết xuất methanol thô

từ thân và lá rau má (Centella asiatica), lá tắc(Citrusmicrocarpa),tráinhàu(Morindacitrifolia)vàchiếtxuấtnướcthôcalátắccótácdụngkhángStreptococcus;tuynhiên,hiệuquảkhángkhuẩncacácchiếtxuấtnày

khôngcao(vòngkhángkhuẩn7mm).Dịchchiếtcg ừ n g (Z.officinale)đượcchiết xuất với dungmôi nước và ethano 95% (200 mg/m ) tr n vi huẩnStreptococcussp cho thấy tiềm năng

háng huẩn với đường ính v ng háng huẩn ầnượt1 4 , 1 1 mmvà28mm(Nader,2010).TạiViệtNam,TrươngThịMỹHạnh(2008)đã xác định

dịch chiết lá hẹ(Allium tuberosum)có khả năng háng vi huẩnStreptococcussp.cao,

với đường ính v ng háng huẩn đạt tr n 25mm tuy nhi n hiệu quả tính háng huẩnc a hẹ giảm mạnh hi có tác động c a nhiệt độ ở 150°C đường ính v ng háng huẩnchỉ đạt 5mm; Trần Ngọc H ng và Trương Thành

trêlai(ClariasmacrocephalusfemalexClariasgariepinusmale)cadịchépcalá ổi (Psidium

guajava) và cây cỏ mực (Eclipta prostrataL.), với đường ính vn g

háng huẩn ần ượt à 20 63 mm và 12 44 mm.

Đối với vi khuẩnS agalactiae, nhiều ết quả nghi n cứu dịch chiết thảo dược

bằng dung môi nước đã được công bố Dịch chiết ca l á x u y ê n t â m l i ê n

(Andrographis paniculata)và c a cây duối nhám (Streblusasper) cho đường kính

vòng kháng khuẩn lần ượt là 27,5 mm và 23,1 mm, giá trị MIC đạt 31,25 µg/ml vàvà 125 µg/ml (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010); dịch chiết từ vỏ quế

(C verum) cho đường kính vòng kháng khuẩn đạt 18 mm, giá trị MIC đạt 150

2014) Gần đây nhất ết quả nghi n cứu c a Guo (2019) thực hiện tr n 115 oại

thảodượcchiếtxuấtvớidungmôinướcchothấydịchchiếtcaásâmHànQuốc (Panax ginseng),nụ hoa im ngân (Lonicera japonica) trái c a cây mã đậuinh (câynhạcngựa)(Aristolochiadebilis)hạtcau(Arecacatechu)vỏthâncâyhuyếtđằnghoatrắng(Spatholobussube

B n cạnh dung môi nước một số dung môi hác cũng bước đầu được hảosát Trong dung môi ethanol, dịch chiết c a trái ổi cho đường kính vòng khángkhuẩn là 25,4 mm, giá trị MIC đạt 62,5 µg/ml (Rattanachaikunsopon vàPhumkhachorn, 2010); dịch chiết từ các loại thảo dược đặc hữu c a Trung Quốc

gồm hoàng liên chân gà (Coptis chinensis), hoàng cầm (Scutellaria baicalensis),cốthí c (Polygonum cuspidatum) và địa du (Sanguisorba officinalis) cho thấy tiềm

năng trong ức chế vi huẩnS agalactiaeở điều iệnin vitro(Peng và ctv, 2014);

ứcchếvikhuẩnS.agalactiaemạnhnhấtởđiềui ệ n invitrokhichiếtxuấtvớidung môi ethanol

(Trịnh Thị Trang và Nguyễn Thanh Hải, 2016) Trong dung môimethanol,nghiêncứucaCastrovàctv(2008)sửdụnglácamộtsốthảodượcđặc hữu c a Brazil

quảcho thấy đường kính vòng kháng khuẩn đạt khoảng 7-8 mm Trong một số dungmôi

hữu cơ hác dịch chiết bằng dung môi chloroform c a lá sầu đâu (Azadirachtaindica)

cho đường kính vòng vô khuẩn đạt 12,2 mm (Kamble và ctv,2014).

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy nước và ethanol là các dung môi cho dịch

chiết có tác dụng khángS.agalactiaetrong đó dịch chiết với ethanol cho kết quả

đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn Bên cạnh đó dung môi methanochloroform chưa được khảo sát nhiều trên vi khuẩnS.agalactiae.

1.3.2 Nghiêncứuảnhhưởngcủathảodượclêntăngtrưởng,sứckhỏecủacá

Đối với th y sản, bên cạnh khả năng háng huẩn, các chiết xuất thảo dượccòn có tác dụng kích thích ăn ngon giúp tăng trưởng, cải thiện sức khỏe và hệ miễndịch, giảm căng thẳng (Reverter và ctv, 2014; Jeney và ctv, 2015) Theo Stratev vàctv (2018), các phương pháp sử dụng chiết xuất thảo dược trên cá gồm bổ sung vàothức ăn ngâm cá trong dịch chiết, tiêm dịch chiết vào xoang bụng cá; trong đóphương pháp bổ sung chiết xuất thảo dược vào thức ăn cho cá là cách hiệu quả nhất(Isnani và ctv,2021).

Hệ miễn dịch là một mạng ưới gồm nhiều tế bào mô cơ quan và các chấtgiúp chống lại nhiễm trùng (Kordon và ctv, 2018); bao gồm miễn dịch hông đặchiệu và miễn dịch đặc hiệu Ngày càng có nhiều nghiên cứu về hiệu quả c a thảodượctrongviệcgiúpcảithiệntăngtrọng,kíchthíchmiễndịchtrênthy sảnđược tiến hành.Thí nghiệm c a Yin và ctv (2006) cho thấy một chế độ ăn có bổ sung 0,1% và 0,5%

hoàngỳ (Radix astragalus) tr n cá rô phi vằn ba tháng tuổi đãlàmtăng hàm ượng

lysozyme sau 1 tuần àm tăng hoạt động thực bào sau 3 tuần,còn hoạt động hô hấp c acác tế bào thực bào hông tăngn.Tuy nhi n hi được cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng

cầm (Radix scutellariae) vớitỷlệ 0,5% và 1,0%thì cho thấy lysozyme, hoạt tính thực bào và hoạt tính

Mộtsốnghiêncứukháctrêncárôphichokếtquảcảithiệntăngtrưởngm i ễ n dịch tương tự nghi ncứu bổ sung hoàng ỳ c a Yin và ctv (2006) như: cá rô phi lai

(O.niloticusxO.aureus)đượcchoănh ẩ u phầnăncóbổsung05%tỏitrong4tuần(Ndongvàctv,2007);cárôphiđỏ(Oreochromissp.)ănthứcănbổsungtỏitrong

14ngày(MaiThanhThanhvàBùiThịBíchHằng,2018);cárôphivằnănthứcăn

có bổ sung các oại tinh dầu c a húng quế (Ocimum basilicum) và gừng (Brum vàctv, 2017), chiết xuất từ á trà m (Excoecaria agallocha) (Abdul và ctv, 2020) Bên

cạnh hả năng cải thiện một số chỉ ti u miễn dịch thảo dược c n được ghi nhậngiúp làm nâng caotỷlệ sống, có tác dụng phòng bệnh hi được bổ sung vào thức ănnhư ết quả thí nghiệm trên một số thảo dược như: bột lá xuyên tâm liên, dịch chiết

vỏ quế,chiết xuất từ lá trà m,tỏi (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2009;

Alsaid và ctv, 2010; Mai Thanh Thanh và Bùi Thị Bích Hằng, 2018; Abdul

vàctv,2020); một số tinh dầu (tỏi cô đơn trầu không, gừng), cây khổ sâm (S.

flavescens) và cây hương thảo (R officinalis) (Ataguba và ctv, 2018; Brum và ctv,

2017; Wu và ctv, 2013; Zilberg và ctv, 2010).

Nghiên cứu c a Emmanuel và ctv (2018) sử dụng hỗn hợp gồm

hoàngkỳ(Astragalus membranaceus) đương quy (Angelica sinensis)vàCrataegushupehensis(một loại thực vật gần với táo mèo) được phối trộn theotỷlệ

1:1:1 và được bổ sung vào thức ăn (10g/ g thức ăn) cho cá rô phi vằn trong 4 tuần.Kết quả đã ghi nhận sự gia tăng đáng ể trọng ượng, tốc độ tăng trưởng, giảm FCR,gia tăng các thông số miễn dịch so với nhóm ăn thức ăn hông bổ sung hỗn hợp.Nhóm nghiên cứu c a Doan (2019) đã tiến hành một số nghiên cứu về ảnh hưởng c athảo dược lên cá rô phi vằn Các thảo dược được bổ sung vào chế độ ăn c a cá gồm:

bột c a cây ưỡi cọp (Boesenbergia rotunda) với cáctỷlệ 5, 10, 20 và 40 g/kg thức ăn(Doan và ctv, 2019a); chiết xuất c a cúc chỉ thiên (Elephantopus scaber) với các

mức 0, 2, 5, 10 và 20 g/kg thức ăn (Doan và ctv, 2019b); chiết xuất c a trà xanh

(chè xanh) (Camellia sinensis) với các mức 1, 2, 4 và 8 g/kg thức ăn (Doan và ctv,2019c) Sau thời gian thí nghiệm đã cho thấy hiệu quả kháng bệnh doS agalactiae,

có sự tăng đáng ể ở nhóm ăn thức ăn bổ sung các loại thảo dược đối với một sốthông số miễn dịch (lysozyme, hoạt tính chống chất oxy hóa, hoạt tính thựcbào …) thúc đẩy tăng trưởng (trong đó mức bổ sung 5 g/kg thức ăn đối với chiếtxuất c a cúc chỉ thiên, 10 g/kg thức ăn đối với bột ưỡi cọp, 2 g/kg thức ăn đối vớichiết xuất trà xanh cho hiệu quả caonhất).

Tuy nhiên, việc bổ sung vào thức ăn các chất kích thích miễn dịch hoặc cácthành phần đã được chứng minh có vai trò giúp kháng bệnh tốt nhất không phải lúcnào cũng giúp đối tượng nuôi nâng cao hệ miễn dịch hoặc đạt được sự tăng trưởngtốt nhất (Galindo-Villegas và Hosokawa, 2004) Nghiên cứu c a Ndong và ctv(2007) đã thí nghiệm trên cá rô phi lai trong 4 tuần với khẩu phần ăn có 0 5% tỏicho thấy có tác dụng nâng cao miễn dịch nhưng hông cải thiện tăng trưởng Một

nghiên cứu hác cũng cho thấy, sự có mặt c a đinh hương (Syzgium aromaticum)

trong thức ăn ảnh hưởng đến tăng trọng c a nhiều loài th y sản (Mohan,2004).

1.4 Đáp ứng miễn dịch trên cá xương và tác động của thảo dược lên hình tháibiểu mô củacá

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch trên cáxương

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương (2007) đáp ứng miễn dịchtr n cá xương gồm:

- Cơ chế bảo vệ hông đặc hiệu, gồm: các hàng rào bề mặt (dịch nhờn, da,mang) và các yếu tố miễn dịch hông đặc hiệu (các nhân tố ức chế sinh trưởng như:transferin, interferon, lysine trong bổ thể, protein phản ứng C và lectin) Bên cạnhđó hàng rào tế bào (đại thực bào, bạch cầu trung tính) cũng đóng vai tr quan trọngtrong miễn dịch hông đặc hiệu trên cá, tuy nhiên so với ở người và động vật bậccao thì chức năng và cơ chế hoạt hóaca các tế bào này ở cá c n chưa được nghiêncứusâu.

- Cơ chế bảo vệ đặc hiệu, gồm: cơ quan ympho (với thận à nơi xảy ra quátrình bắt giữ, xử lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống đáp ứng miễn dịch),đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào đáp ứng miễn dịch cụcbộ ở mang đáp ứng miễn dịch cục bộ ở da, và đáp ứng miễn dịch cục bộ ở dịchnhầy.

1.4.2 Tác động của thảo dược lên hình thái biểu mô củacá

Hình thái mô học c a ruột phản ánh sức hỏe c a cá do i n quan đến hảnăng hấp thu chất dinh dưỡng và chức năng miễn dịch (Nicholson và ctv, 2012).Chỉ số nhung mao dài biểu thị cho hả năng hấp thụ hiệu quả và đường ruộth ỏ e

mạnh (Va adao ctv, 2017) trong hi đó ớp cơ ni m mạc có vai tr thúc đẩy nhuđộng ruột (Liu và ctv, 2018) Các nghi n cứu đã công bố đều cho rằng hầu hết cácsản phẩm thảo dược được bổ sung vào chế độ ăn c a cá hông gây ra bất ỳ sự thayđổi bất ợi nào đến hình thái ruột c a cá được quan sát (Agbebi và ctv, 2013; Lewisvà ctv, 2019) Các nghi n cứu gần đây đều chứng minh rằng thảo dược giúp cảithiện sức khỏe đường ruột trên cá rô phi như: bổ sung bột lá táo ta

(Ziziphusmauritiana) vào thức ăn trong 12 tuần (Amin và ctv., 2019); bổ sung chiếtxuất lá cúc mai (Tridax procumbens) trong hẩu phần ăn trong 8 tuần (Adeshina vàctv., 2021); bổ sung chiết xuất bột quả me (Tamarindus indicaL.) vào thức ăn trong

84 ngày (Adeniyi và ctv.,2022).

1.5 Giới thiệu các loại thảo dƣợc sử dụng trong nghiêncứu

Cây diếp cá (H.cordata)

Diếp cá là loại cây thảo, cao 20-40cm Thân ngầm mọc bò ngang trong lòngđất, màu trắng hơi có ông bén rễ ở các mấu Thân đứng nhẵn, màu lục hoặc tímđỏ Lá mọc so e hình tim đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu tím,cuống lá dài, có bẹ Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành bông dài 2-2,5 cm, mangnhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt, bao bởi 4 lá bắc màu trắng Quả nở ở đỉnh, hạt hìnhtrái xoan, nhẵn Diếp cá phân bố ch yếu ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới c a châuÁ như Ấn Độ, Nhật Bản, Việt Nam, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á hác.Diếp cá có tác lợi tiểu do tác dụng c a chất quercitrin, làm chắc thành mao mạch;lọc máu, giải độc, giải nhiệt, kháng viêm, tang miễn dịch c a cơ thể (Đỗ Tất Lợi,2004) Cây diếp cá có hoạt chất chính là decanoyl acetaldehyde (houttuynin),

(Streptococcus,StaphylococcusaureusvàSarcina ureae), chốngoxyhóa (Zhang và

ctv, 2008; Sekita và ctv,2016).

Củ hành tím (A.ascalonicum)

Hành tím thuộc loại cây thảo sống nhiều năm cao tới 50cm, có thân hành nhỏ,trắng hay nâu, chỉ hơi phồng, rộng 0,7-1,5cm Lá màu xanh mốc, hình trụ rỗng, có 3cạnh ở dưới dài đến 30cm, có bẹ lá dài bằng 1/4 phiến Cán hoa (trục mang cụm

cácmảnhhìnhtráixoannhọnmàutrắngcósọcxanh;bầuxanhđợt.Thườngtrồngở rẫy và ở v ng đồngbằng Cây chịu được lạnh vàoma đông C hành tím đượcdngđểtrịcảmlạnh,giảmnhiễmtrngđườngtiếtniệu,ổnđịnhhuyếtáp,giảmsốt, tăng cường hệmiễn dịch (Đỗ Tất Lợi, 2004) C hành tím có hoạt chất chính làflavonoid,polyphenol;cóhoạttínhkhángkhuẩnrộng(Hendrich,2006).

Lá kinh giới (E.ciliata)

Kinh giới là loại cỏ sống hằng nămmi hương rất thơm, thuộc họ thân thảo, cao0,3-0,45m, thân nhẵn, mọc thẳng đứng Lá mọc đối, phiến lá thuôn nhọn, dài 5- 8cm, rộng 3 cm mép có răng cưa cuống gãy dài 2-3 cm Hoa nhỏ, không cuốn, màutím nhạt, mọc thành bông ở đầu cành Quả gồm 4 hạch nhỏ, nhẵn, dài 0,5 cm Kinhgiới được trồng ch yếu ở các tỉnh phía Bắc Lâm Đồng, Thành phố Hồ Chí Minh.Kinh giới được d ng để chữa cảm mạo, sốt, cúm, nhức đầu, hoa mắt, phong thấp đauxương đau mình vi m họng, nôn mửa, sởi, lở ngứa, mụn nhọt; sao đen chữa bănghuyết, rong huyết, thổ huyết, chảy máu cam đại tiểu tiện ra máu (Đỗ Tất Lợi, 2004).Lá kinh giới có hoạt chất chính là thymol, carvacrol; có tác dụng kháng một số vikhuẩngâybệnh trên th y sản (Guo và ctv,2012).

Củ riềng (A.officinarum)

C riềng thuộc loại cây thân thảo sống nhiều năm thích nghi nơi bóng râmnhưng ỵ ngập nước, có thể cao đến 1 2mra hoa tháng 4 đến tháng 9 Thân rễ mọc bòngang, dài, hình trụ có phân nhánh, vỏ màu đỏ nâu, ruột màu vàng sáng được gọi làc riềng Có dạng rễ chùm, mọc từ các đốt ở dưới gốc và từ thân rễ Lá không cuốnghình mũi mác hẹp, dài 20 - 30cm, rộng 1,2 - 2 5cm; hai đầu đều nhọn, bẹ lá dạngvẩy, lưỡi bẹ dạng vẩy nhọn Cụm hoa hình chùy, mọc ở ngọn, dài 6 - 10cm, có lôngmềm Quả hình cầu, có lông, rộng 1cm, màu hồng C riềng được trồng phổ biến ởnhiều nơi.Criềng dùng làm gia vị và làm thuốc ích thích ti u hóa ăn ngon cơm chữađầy hơi đau bụng đau dạ dày, sốt rét đi ỏng, trúng hàn nôn mửa (ĐỗTấtLợi,2004).Criềngcóhoạtchấtchínhlàterpinen-4-o;đượcchứngminhcó

phổ hoạt tính rộng từ kháng khuẩn đến nấm men, ký sinh trùng (Oonmetta-Aree vàctv, 2006).

Vỏ thân quế (C.verum)

Quế là một loại cây cao từ 12-20cm Cành mọc trong năm có 4 cánh dẹt,nhẵn Lá hơi hình trứng 2 đầu hẹp lại hơi nhọn, có ba gân rất rõ chạy từ cuống đếnđầu lá, mặt dưới ph những vẩy nhỏ Phiến lá dài 12-15cm, rộng 5cm Cuống dàichừng 15mm Hoa màu trắng mọc thành chùy ở kẽ áhayđầu cành Quả hạch hìnhtrứng dài chừng 1cm úc đầu xanh lục, khi chín ngả màu nâu tím, mặt quả bóng.Quế phân bố rộng rãi khắp lãnh thổ Việt Nam từ biên giới phía Bắc đến tận miềnNam Quế có tác dụng tăng tiết nước bọt và dịch vị tăng cường chức năng ti u hóalàm giảm co thắt cơ trơn nội tạng, làm dịu cơn đau bụng do co thắt ruột.Cinnamaldehyde còn có tác dụng ức chế sự hình thành loét bao tử ở chuột do kíchthích Nước sắc nhục quế àm tăng ưu ượng máu động mạch vành tim cô lập c achuột lang, cải thiện được thiếu máu cơ tim cấp c a thỏ do pituitrin gây nên (Đỗ TấtLợi, 2004) Vỏ thân quế có hoạt chất chính là cinnamic aldehyde; có hoạt tínhkháng khuẩn và điều hòa chức năng miễn dịch (Faikoh và ctv, 2014) đồng thời cókhả năng háng mạnh với một số loài vi khuẩn gây bệnh trên th y sản (Dương NhậtLinh và ctv,2010).

Củ gừng (Z.officinale)

Gừng là cây thân thảo, cao 0,6-1 m Lá mọc so le, không cuống, hình mác dài,cómithơm Trục hoa xuất phát từ gốc, dài khoảng 20 cm Hoa màu vàng, thân rễmập, phồng lên thành c C có màu vàng, mặt ngoài c có màu trắng tro hay màunâu nhạt, trên thân c có đốt tròn và vết nhăn dọc rõ rệt C gừng cómithơm vị caynóng Gừng được trồng ở Việt Nam và một số nước như: Trung Quốc, Ấn Độ,Austra ia các nước Đông Nam Á Gừng có nhiều công dụng đối với con người như:chữa cảm mạo phong hàn, trị chứng khó tiêu, chân tay lạnh, khí huyết ngưng trệ …(Đỗ Tất Lợi, 2004) Đối với th y sản, c gừng có hoạt chất chính là 6-gingerol, cótác dụng kháng cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Ekwenye và ctv,2005).