Nghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin

Nghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin Nghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin

TỔNG QUAN

Tổng quan về dược chất

1.1.1 Tổng quan về paclitaxel (PTX)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của PTX [171], [2]

- Tên khoa học: (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-1,2a,3,4,4a,6,9,10,11,12, 12a, 12b-Dodecahydro-4,6,9,11,12,12b-hexahydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-7,11- methano-5H-cyclodeca[100]-benz[1,2-b]oxet-5-on 6,12b-diacetat, 12-benzoat, 9-ester with (2R,3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserin

- Tên khác: 5b, 20-Epoxy-1,7b-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2a,4,10b,13a-tetrayl 4,10-diacetat 2- benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropa noat]

- Công thức phân tử: C47H51NO14

- Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [171], [2]

Hình thức: Dạng tinh thể, màu trắng hoặc gần như trắng Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và dễ tan trong methylen clorid [25]

Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/mL trong methanol có góc quay cực từ - 49,0° đến

- 55,0° ở dạng khan [25], [171] Độ ổn định

Trong dung dịch nước, độ ổn định của PTX bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, nồng độ dược chất và pH do xảy ra phản ứng thủy phân ở C10-acetat [162], [46]

Do PTX có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 230 nm, nên sử dụng được phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại [84] hoặc HPLC [171] để định lượng PTX trong các mẫu nghiên cứu xây dựng công thức.

Dược động học và cơ chế tác dụng

Sau khi truyền, thuốc phân bố rộng vào các mô và dịch cơ thể, có thể bị ảnh hưởng bởi liều và thời gian truyền Tỷ lệ gắn với protein là 89% đến 98% và không bị thay đổi khi dùng cùng với cimetidin, ranitidin, dexamethason hoặc diphenhydramin Paclitaxel được chuyển hóa tại gan thông qua cytochrom P450; isoenzym CYP2C8 và CYP3A4, và tạo ra chất chuyển hóa chủ yếu là 6α-hydroxypaclitaxel Độ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0 - 15,6 lít/giờ/m 2 ) Độ thanh thải khi thời gian truyền từ 1 đến 6 giờ là 5,8 đến 16,3 lít/giờ/m 2 và trong trường hợp tiêm truyền trong 24 giờ là 14,2 đến 17,2 lít/giờ/m 2 [1]

Paclitaxel là một thuốc chống ung thư PTX làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các ống vi thể và làm ổn định các ống vi thể sẵn có do ức chế quá trình giải trùng hợp Do đó, ức chế sự tái cấu trúc bình thường của mạng ống vi thể rất quan trọng ở gian kỳ của quá trình phân bào và cả với hoạt động của ty lạp thể PTX cũng gây tạo thành các cấu trúc bất thường trong các ống vi thể trong quá trình phân bào, kết quả là phá vỡ các nhiễm sắc thể Tuy chưa được nghiên cứu kỹ nhưng do cơ chế tác dụng của nó, PTX được coi là chất gây ung thư và độc đối với gen PTX có thể ức chế sự tăng sinh tế bào và điều hòa đáp ứng miễn dịch [1], [162]

Tác dụng không mong muốn

Hầu hết các người bệnh dùng paclitaxel đều bị rụng tóc Gần 90% bệnh nhân bị suy tủy, khi liều càng cao, tần suất tiêm truyền càng lớn và thời gian tiêm truyền càng dài thì nguy cơ càng cao Tuy nhiên, khi dừng thuốc, bệnh nhân nhanh chóng phục hồi [1], [162]

Chỉ định, liều dùng, chống chỉ định và độc tính cấp

Chỉ định Ðiều trị ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường bằng các muối anthracyclin và muối platinum đã thất bại hay bị chống chỉ định [1], [162] Ðiều trị ung thư vú di căn khi liệu pháp thông thường với các anthracyclin đã thất bại hoặc không thích hợp [1], [162] Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [2], [148]

Dạng paclitaxel thông thường: Truyền tĩnh mạch với liều 175 mg/m 2 trong 3 giờ Có thể lặp lại sau một khoảng thời gian ít nhất là 3 tuần [1], [162]

Chống chỉ định và thận trọng

Không dùng cho người bệnh quá mẫn với paclitaxel hay với bất kỳ thành phần nào của chế phẩm, đặc biệt là quá mẫn với Cremophor EL

Không dùng cho người bệnh có số lượng bạch cầu trung tính < 1500/mm 3 (1,5 x

10 9 /lít) hoặc có biểu hiện rõ bệnh lý thần kinh vận động [1], [162]

Thận trọng ở người bệnh có rối loạn hoặc suy chức năng gan và ở người bệnh có bệnh tim [1], [162] Độc tính cấp và xử lý

Tất cả phương tiện và thuốc men cần thiết cho cấp cứu hồi sức (adrenalin, corticoid, oxygen, dịch truyền, máy trợ tim - hô hấp ) cần phải sẵn sàng

Trong trường hợp có bệnh thần kinh gây rối loạn vận động thì phải ngừng thuốc

Có thể tiếp tục dùng thuốc cho người bệnh bị blốc nhĩ - thất cấp I và phải theo dõi điện tâm đồ Ở người bệnh có rối loạn dẫn truyền nặng hơn thì phải ngừng dùng paclitaxel và cần điều trị trợ tim thích hợp [1], [162]

Việc pha thuốc để truyền tĩnh mạch phải do người có kinh nghiệm tiến hành, ở một phòng pha chế thích hợp, tuân thủ quy trình pha chế thuốc độc tế bào Khi pha thuốc cần phải mang găng tay và tiến hành thận trọng để tránh thuốc tiếp xúc với da và niêm mạc Nếu da bị tiếp xúc với thuốc thì phải cọ rửa kỹ da bằng nước và xà phòng; nếu niêm mạc bị tiếp xúc với thuốc thì phải dùng nước súc rửa thật kỹ [1]

1.1.2 Tổng quan về dihydroartemisinin (DHA)

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của DHA [14]

Công thức phân tử của DHA: C15H24O5

Tên khoa học (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimetyl-3,12- epoxy-12H-pyrano[4,3,-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol

Khối lượng phân tử của DHA: 284,35 g/mol [29]

DHA là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi, rất ít tan trong nước và trong dầu DHA tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether, cloroform

Năng suất quay cực của DHA trong dung môi cloroform [α] = 140-146° (C = 1,0026)

C12 là một carbon bất đối tạo ra 2 đồng phân quang học α và β Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta chứng minh được DHA tồn tại chủ yếu dạng α, nhưng trong dạng dung dịch thì tồn tại cả 2 dạng

Nhiệt độ nóng chảy : 145 – 150°C [29] Độ ổn định

Các dẫn chất của artemisinin đều rất không ổn định hóa học, bị thủy phân dưới sự có mặt của ion sắt, chất khử sinh học Trong 3 dẫn chất chính của artemisinin (gồm: artemether, artesunate và dihydroartemisinin), DHA là dẫn chất kém ổn định nhất [172] DHA ổn định ở pH 2 – 6; môi trường pH < 2 hoặc pH > 6 thúc đẩy sự thủy phân của DHA [131] Tạo phức với β-cyclodextrin cải thiện độ ổn định của DHA [17]

Theo Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển quốc tế 2020, DHA nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột C18 (100 × 4,6 mm, 3 àm), pha động là hỗn hợp ACN và nước theo tỷ lệ 60:40 (tt/tt), bước súng phỏt hiện

216 nm [29], [179] Trên thế giới, các tác giả định lượng DHA theo phương pháp HPLC trong các điệu kiện sau:

Bảng 1.1 Các nghiên cứu định lượng DHA theo phương pháp HPLC

Nghiên cứu Đối tượng định lượng Điều kiện định lượng

Nghiên cứu của Wang và cộng sự

Hệ 3 thành phần DHA với hydroxypropyl-β- cyclodextrin và lecithin

- Pha động: ACN : H2O 65:35 (tt/tt)

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 210 nm

Nghiên cứu của Wang và cộng sự

Nano PLGA chứa phức hợp của DHA và phospholipid

- Hệ thống HPLC Agilent 1200 với detector DAD

- Cột Agilent XDB – C18 (150×4,6 mm, 5 àm)

- Pha động: ACN: đệm phosphate pH 3, 50:50 (tt/tt) (dung dịch NaH2PO4 điều chỉnh đến pH 3 bằng H3PO4)

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 210 nm

Nano 8arm-PEG-DHA và TF-8arm-PEG- DHA

- Hệ thống HPLC Agilent 1200, USA

- Pha động: ACN : H2O 60:40 (tt/tt)

- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 210 nm

Dược động học và cơ chế tác dụng

DHA có khả năng liên kết với protein huyết tương 44-93 % Thời gian bán thải của DHA xấp xỉ 45 phút đến 1 giờ qua con đường glucuronyl hóa ở ruột và gan Thuốc được thải hoàn toàn khỏi vòng tuần hoàn trong 8-10 giờ [3] Không có sự khác biệt về các thông số dược động học theo giới tính [124]

DHA chưa được chỉ định để điều trị ung thư, tuy nhiên trong các nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng DHA có tác dụng ức chế đáng kể trên nhiều loại khối u với cơ chế dược lý như ức chế sự tăng sinh và di căn của tế bào, cảm ứng quá trình tự chết, quá trình chết tế bào theo chương trình Ngoài ra, DHA có tác dụng mạnh trong việc thúc đẩy khả năng miễn dịch chống khối u và không gây độc cho tế bào bình thường [35], [187]

Tác dụng không mong muốn

Một số tác dụng phụ được báo cáo sau khi uống gồm: chóng mặt, ù tai, giảm hồng cầu lưới, giảm bạch cầu trung tính, tăng enzyme gan và hiếm gặp một số bất thường về điện tim

Hiếm gặp phản ứng quá mẫn nghiêm trọng typ 1 (tỷ lệ xấp xỉ 1/3000 trường hợp) khi dùng dihydroartemisinin hay các dẫn xuất nhóm artemisinin [3]

1.1.3 Cơ chế tác dụng hiệp đồng chống ung thư khi phối hợp PTX và DHA

Phối hợp thuốc đã được sử dụng rộng rãi và trở thành lựa chọn hàng đầu để điều trị nhiều căn bệnh nguy hiểm như ung thư Cơ sở lý luận của liệu pháp phối hợp là sử dụng

Tổng quan về tiểu phân nano lipid – polyme

1.1.4 Khái niệm tiểu phân nano lipid – polyme

Trong vài thập kỷ gần đây, ngày càng có nhiều chế phẩm hệ nano được thử nghiệm lâm sàng – bao gồm: liposome, nano polyme, nanolipid rắn, dendrimers, nano kim loại (vàng, bạc, silica), trong đó một số lượng nhỏ đã được chấp nhận sử dụng trong lâm sàng Trong số các hệ tiểu phân đó, hệ tiểu phân nano thể hiện tính ưu việt nhất là liposome và nano polyme [123]

Năm 1986, Dior giới thiệu liposome làm mỹ phẩm trên thị trường nhưng vài năm sau liposome đã được mở rộng ra thị trường dược phẩm Liposome là những vi cầu hoặc nano cầu có hai lớp lipid lưỡng cực, mang cả thuốc kỵ nước và ưa nước, giúp bảo vệ dược chất khỏi môi trường bên ngoài Liposome được ứng dụng rộng rãi trong vận chuyển thuốc vì tính tương thích sinh học và an toàn thuận lợi của chúng Một số công thức liposome được đưa ra thị trường như liposome daunorubicin (DaunoXome), liposome amphotericin B (Ambisome), liposome morphine (DepotDur) Nhưng việc ứng dụng của liposome bị hạn chế vì hiệu suất thấp đối với các thuốc ít tan trong nước Trong khi đó nano polyme có khả năng mang các thuốc kỵ nước cao hơn so với liposome, đồng thời việc giải phóng thuốc và kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu có thể được kiểm soát bằng cách chọn polyme thích hợp Tuy nhiên, nano polyme vẫn gặp phải vấn đề về thời gian tuần hoàn cũng như tính tương thích sinh học

Do các hạn chế của liposome và nano polyme, nano lipid-polyme có nhiều ưu điểm hơn so với liposome và nano polyme được ra đời Nano lipid-polyme là một hệ vận chuyển thuốc với hiệu suất mang thuốc cao, khả năng kiểm soát giải phóng thuốc tốt, ổn định khi phân phối trong hệ tuần hoàn, phân bố đến mô, tế bào, phân tử đích [123] Nano lipid-polyme là hệ nano chứa đồng thời 2 thành phần polyme và lipid chứa dược chất ở kích thước nano, kết hợp các tính năng của nano polyme và liposome Cấu trúc của nano polyme-lipid được thể hiện ở Hình 1.3

Hình 1.3 Cấu trúc lõi polyme vỏ lipid ngoài cùng gắn PEG của tiểu phân nano lipid – polyme [26]

Loại hệ nano này thường bao gồm ba thành phần chức năng riêng biệt: (i) lõi polyme kỵ nước, nơi thuốc ít tan trong nước kém được bao gói; (ii) lớp lipid bao quanh lõi hoạt động như một lớp vỏ có tương thích sinh học cao, đóng vai trò là hàng rào phân tử để lưu giữ thuốc bên trong lõi; và (iii) lớp tàng hình polyme ưa nước bên ngoài vỏ lipid để tăng cường độ ổn định của hệ nano, tránh nhận diện đại thực bào và tăng thời gian tuần hoàn trong máu [123]

1.1.5 Phân loại tiểu phân nano lipid – polyme

Dựa trên sự sắp xếp của lipid và polyme, hệ nano này được phân loại thành các nhóm khác nhau Trong đó lipid và polyme có thể tồn tại theo các cấu trúc:

- Lõi polyme ở trong, lớp vỏ lipid ở ngoài

- Lõi lipid ở trong, lớp vỏ polyme ở ngoài

Hình 1.4 Phân loại nano lipid – polyme gồm: (A) Hệ lipid phân tán trong cốt polyme; (B) hệ lõi polyme, vỏ lipid; (C) hệ lipid – polyme – lipid; (D) hệ bao màng sinh học; và (E) hệ polyme bao liposome [134] i Hệ lõi polyme, vỏ lipid Đây là loại nano được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm Cấu trúc của hệ gồm phần lõi là polyme được bao phủ bởi lớp lipid đơn hoặc lipid kép Khả năng mô phỏng sinh học của lipid và lợi thế cấu trúc của lõi polyme phân hủy sinh học cùng tạo ra hệ mang thuốc tiên tiến Hệ được ứng dụng đầu tiên trong thiết bị y sinh và chế phẩm sinh học [161] Tiếp theo đó hệ cũng được ứng dụng để vận chuyển thuốc, protein, gen, kháng thể và vaccin với liều lượng giảm, độc tính thấp và sinh khả dụng tăng Khả năng duy trì giải phóng dược chất phụ thuộc vào nồng độ, loại và độ dày của polyme ở lõi và lipid ở vỏ được sử dụng [79]

Thuốc có độ tan thấp có thể dễ dàng đưa vào trong hệ nhưng khó kết hợp với những thuốc dạng ion tan trong nước Có thể gắn kết thuốc dạng ion với polyme ngược dấu để

15 cải thiện khả năng tải thuốc ion này Tính ổn định của hệ được tăng cường hơn nữa bởi lớp vỏ lipid bên ngoài [153] ii Hệ bao màng sinh học

Phương pháp tiếp cận khác đã được nghiên cứu trong trường hợp hệ nano lõi polyme vỏ lipid không đảm bảo độ ổn định in vivo đó là sử dụng màng tế bào hồng cầu (RBC) để bao gói thêm lớp lipid bên ngoài Việc bao gói này làm cho hệ nano có tính tương thích sinh học tốt, đảm bảo độ ổn định in vivo tối đa, đồng thời hàng rào lipid dày đặc giúp kéo dài giải phóng dược chất Tuy nhiên, do hồng cầu từ các nguồn máu khác nhau chứa các kháng nguyên khác nhau, nên có thể xảy ra phản ứng chéo [153] iii Hệ vỏ polyme bao lõi liposome Để bảo vệ liposome cũng như cải thiện độ ổn định, giảm rò rỉ thuốc, tăng cường giải phóng thuốc tới đích, liposome được bao phủ polyme ở bên ngoài Đầu tiên liposome được hình thành, sau đó chúng được bao phủ lớp polyme ở ngoài bề mặt, do đó sự giải phóng thuốc có thể được biến đổi Lee và cộng sự đã gói doxorubicin và cisplatin trong cùng tiểu phân nano nhằm đưa thuốc tới tế bào ung thư [95] Đầu tiên Doxorubicin được gói trong liposome, tiếp đó acid polyacrylic và liên kết diamine liên kết chéo để tạo thành lớp lưới polyme bao quanh liposome doxorubicin Nhóm carboxylic tự do bên ngoài lớp vỏ được gắn với cisplatin Hệ nano tạo thành ít gặp các vấn đề về độ ổn định, đồng thời giảm liều dùng cũng như tác dụng không mong muốn cũng được giảm đáng kể [95] iv Hệ lipid phân tán trong cốt polyme

Hệ nano này có cốt polyme trong đó các phân tử lipid được phân bố ngẫu nhiên trong cốt polyme [134] v Hệ lipid – polyme – lipid

Loại hệ nano này có lớp lipid bao gồm PEG-lipid và lipid trung tính bao quanh một lớp polyme bên trong, lớp polyme này có thể tương tác với lớp lipid cation So với nano polyme, do lớp lipid cation bên trong chứa các thuốc anion nên nano này có thể mang được đồng thời hai loại thuốc Ví dụ, việc đồng phân phối cả si-RNA và thuốc phân tử nhỏ vào trong cùng một hệ nano được thực hiện để gây độc tế bào ung thư kháng thuốc [134]

1.1.6 Các tá dược hay sử dụng trong tiểu phân nano lipid – polyme

Polyme được sử dụng nhiều nhất là polyme tương thích sinh học bao gồm: acid poly(lactic-co-glycolic) (PLGA), dextran sulfat, polyethylenimin, polyme có nguồn gốc từ dầu đậu nành,… Còn lipid được sử dụng là những lipid đã được phép sử dụng trong dược phẩm như phospholipid, polyethylen glycol (PEG)–lipid, lipid chiết xuất từ sản phẩm thực phẩm (lecithin) hoặc được tìm thấy trong cơ thể (acid béo nội sinh) [189] Sau đây là 2 tá dược PLGA đại diện cho nhóm tá dược polyme và lecithin đại diện nhóm tá dược lipid

Vài nét sơ lược về acid poly(lactic-co-glycolic) (PLGA) i Cấu trúc và tính chất của PLGA

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp và cấu trúc hóa học của PLGA [59]

PLGA là một copolyme được tổng hợp từ hai monome khác nhau đó là acid lactic (LA) và acid glycolic (GA) với tỷ lệ hai acid này khác nhau (Hình 1.5)

Tỷ lệ của poly (acid lactid) (PLA) và poly (acid glycolid) (PGA) sử dụng cho quá trình tổng hợp polyme khác nhau sẽ thu được các PLGA khác nhau; ví dụ PLGA 75:25 thì sẽ dùng 75% acid lactic và 25 % acid glycolic trong quá trình tổng hợp Cơ chế tổng hợp khác nhau và các thông số kiểm soát trong quá trình tổng hợp ảnh hưởng mạnh đến tính chất lý-hóa của PLGA thu được sau quá trình tổng hợp [59] PLGA thừa hưởng các đặc tính nội tại của các monome cấu thành, cùng với khối lượng phân tử polyme, ảnh hưởng đến độ tan, độ kết tinh, tính chất cơ học, kích thước và tốc độ phân hủy sinh học

17 của chúng PGA là polyme ưa nước dạng tinh thể, trong khi đó PLA cứng hơn và kỵ nước; do đó PLGA trùng hợp với tỷ lệ PLA cao hơn ít ưa nước hơn, hấp thụ ít nước hơn và do đó thời gian phân hủy dài hơn [146] Trong nước, PLGA phân hủy sinh học bằng cách thủy phân liên kết ester giải phóng ra acid lactic và acid glycolic Acid lactic và acid glycolic đều được chuyển hóa qua chu trình Kreb’s cho sản phẩm cuối cùng là khí carbonic và nước, riêng acid glycolic một phần được đào thải nguyên dạng qua thận, nên hai acid này ít gây độc tính đối với cơ thể [112] Thời gian phân hủy của PLGA thay đổi tùy thuộc vào khối lượng phân tử và tỷ lệ đồng trùng hợp PLGA hòa tan trong một số dung môi phổ biến như: các dẫn chất clorid, tetrahydofuran, aceton, dicloromethan hoặc ethyl acetat Tất cả những đặc tính của PLGA đã được khai thác trong một số ứng dụng trong việc tăng độ tan, tăng thời gian lưu, tăng hiệu quả đưa thuốc nói chung, và trong hệ phân phối thuốc nói riêng PLGA được FDA Hoa Kỳ và cơ quan y tế Châu Âu (EMA) chấp thuận cho việc bào chế các dạng thuốc ứng dụng trên cơ thể con người [38]

PLGA là một trong những polyme được nghiên cứu nhiều nhất trong thiết kế và xây dựng hệ mang thuốc do khả năng phân hủy sinh học, tính an toàn sinh học, tương thích sinh học cũng như linh hoạt trong thiết kế công thức PLGA có thể bào chế tạo ra các hình dạng, kích thước và bao gói các phân tử với kích thước khác nhau Kích thước của tiểu phân nano có thể được xác định ở một mức độ nhất định bởi nồng độ polyme được sử dụng để tổng hợp chúng [59] Đặc biệt, PLGA làm chất mang trong tiểu phân nano giúp tối ưu hóa sinh khả dụng của thuốc được bao gói do bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy nhanh chóng trong dịch sinh học, giúp vận chuyển thuốc tới đích hoặc tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập nội bào, dẫn đến giảm tác dụng không mong muốn của thuốc [38]

Một số nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa paclitaxel và dẫn xuất artemisinin sử dụng chất mang PLGA

ElNaga và cộng sự (2017) đã bào chế tiểu phân nano PTX-PLGA gắn acid folic bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và nghiên cứu hiệu quả chống ung thư của tiểu phân nano trên khối u của chuột in vivo Kết quả thu được tiểu phân nano có KTTP khoảng 294,7 nm, có tác dụng tăng hiệu quả ức chế khối u so với PTX nguyên liệu Kiểm tra các mô bệnh học trong khối u cho thấy giảm thiểu độc tính trên các mô khỏe mạnh, điều này chứng minh tính hướng đích và hiệu quả sinh học của nano PTX-PLGA gắn acid folic [14]

Yang và cộng sự (2009) sử dụng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương bào chế tiểu phân nano PLGA chứa paclitaxel, sau đó tiểu phân nano được thay đổi đặc tính bề mặt bằng cách hấp phụ vật lý chitosan KTTP khoảng 200-300nm và tăng đáng kể trong môi trường huyết tương chuột (CDF1) nhưng dễ dàng phân tán về kích thước ban đầu sau 5 phút lắc nhẹ Thế zeta của tiểu phân nano PLGA chuyển từ âm sang dương khi có mặt chitosan và tăng khi pH môi trường acid hơn Đặc biệt, tiểu phân nano PLGA gắn CS tăng vận chuyển đặc hiệu paclitaxel đến đích tác dụng nguyên nhân là do tương tác tĩnh điện của tiểu phân nano cation với tế bào khối u trong vi môi trường acid xung quanh khối u [184]

Cristiba Fonseca và cộng sự (2002) đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano Paclitaxel sử dụng PLGA làm chất mang thuốc Trong nghiên cứu, tiểu phân nano được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi Pha hữu cơ gồm PLGA và paclitaxel trong aceton, pha nước chứa chất diện hoạt poloxamer 188 Sau đó nhỏ dần pha hữu cơ vào pha nước kèm khuấy từ ở nhiệt độ phòng Sau đó khuấy tiếp 15 phút ở điều kiện áp suất giảm để bay hơi aceton Để loại bỏ dược chất tự do và chất diện hoạt dư, nhóm nghiên cứu sử dụng màng lọc 1 micromet sau đó ly tâm 2 lần 61 700 g trong vòng 1h ở 4 0 C Sản phẩm cuối cùng được đông khô trong 24 h [55]

Năm 2014, Shihua Jin và cộng sự đã sử dụng PLGA để bào chế nano PTX có gắn hoặc không gắn transferrin với mục đích tăng khả năng gây độc tế bào của PTX trên tế bào ung thư bàng quang bằng cách tăng khả năng lưu giữ nội bào của tiểu phân nano Kết quả thu được tiểu phân nano PLGA gắn transferrin với kích thước tiểu phân là 206 nm, thế zeta −23,5 mV và tỷ lệ thuốc nano LC = 6,5% Đối với PLGA không gắn transferrin, kích thước tiểu phân thu được 278 nm, thế zeta -24,3 mV và tỷ lệ thuốc nano

LC = 6,7% Tiến hành đánh giá khả năng gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư bàng quang MBT-2, J-82, và TCC Sup Kết quả cho thấy tiểu phân nano PLGA-PTX làm tăng khả năng gây độc tế bào so với dung dịch tiêm paclitaxel Khi sử dụng tiểu phân nano PLGA-PTX gắn transferrin đã làm tăng khả năng gây độc tế bào so với tiểu phân nano PLGA -PTX không gắn transferrin trên hai dòng tế bào ung thư bàng quang MBT-2 và TCC Sup [78]

Năm 2014, Muzamil Yaqub Want và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artemisinin sử dụng PLGA làm chất mang bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương sử dụng thiết kế thí nghiệm kiểu Box–Behnken trên phần mềm Design- Expert Kết quả thu được tiểu phân nano công thức tối ưu có KTTP trung bình 221 nm, PDI = 0,1, thế zeta -9,07 mV với tỷ lệ thuốc nano %LC = 28,03 % và hiệu suất mang thuốc là 68,48 % Độc tính nano được xác định trên đại thực bào ở chuột thông qua thử nghiệm MTT Kết quả cho thấy nano không gây độc trên tế bào so với artemisinin dạng tự do [178]

Năm 2014 Nguyễn Hạnh Thủy và cộng sự bắt đầu nghiên cứu về bào chế hệ nano chứa ART sử dụng chất mang là PLGA và đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro trên một số dòng tế bào ung thư người Trong đó, phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước đã được sử dụng cho kết quả KTTP nano khoảng 170 nm, hiệu suất nano hóa 83,4%, kéo dài thời gian giải phóng đến 48 giờ Công thức nano ART-PLGA có tác dụng làm giảm đáng kể sự sống sót của một số dòng tế bào ung thư người như A549, SCC-7 và MCF-7 so với ART dạng tự do [126] Để cải thiện khả năng kiểm soát giải phóng dược chất và hướng đích tác dụng trong việc chống lại các tế bào ung thư biểu hiện qua thụ thể CD44, Trần Tuấn Hiệp, Nguyễn Đức Tuấn và cộng sự (năm 2016) đã tiến hành bào chế và đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-HA Trong nghiên cứu này, các tiểu phân nano ART-PLGA được bào chế sau đó được bao acid hyaluronic (HA) sau khi đổi ngược điện tích bằng cách sử dụng một chất hoạt động bề mặt cation hóa didodecyldimethylammonium bromid (DDAB) Tiểu phân nano ART-PLGA-HA khắc phục được độ tan kém và độ ổn định kém của ART, hơn nữa còn giúp cải thiện tác dụng so với ART ở dạng tự do Độc tính trên các dòng tế bào SCC-7, MCF-7 cho thấy tiểu phân nano ART-PLGA-HA có độc tính trên tế bào ung thư mạnh hơn so với ART-PLGA Tiểu phân nano ART-PLGA-

HA cho thấy khả năng chống lại sự phát triển của tế bào ung thư cũng như cảm ứng gây chết tế bào theo chương trình tăng lên so với ART tự do và nano ART-PLGA Qua nghiên cứu giải phóng in vitro có tới 60% dược chất ART được giải phóng ra khỏi hệ trong vòng 48 giờ Điều đó cho thấy tiềm năng lớn trong việc sử dụng nano ART-PLGA-HA hướng đích điều trị ung thư [169]

Năm 2017, Trần Ngọc Bảo và các cộng sự đã tiến hành bào chế tiểu phân nano chứa ART phối hợp với PTX Phương pháp bào chế: Tiểu phân nano ART-PTX bao gói với polyme PLGA bằng phương pháp bay hơi dung môi từ nhũ tương dầu trong nước, sử dụng chất diện hoạt là Tween 80 Tiếp đến là đánh giá sự hấp thu nội bào, xác định độc tính tế bào và oposonin hóa của tiểu phân nano tối ưu trên Kết quả thu được tiểu phân nano cuối cùng có kích thước nhỏ (khoảng 120 nm) với chỉ số phân bố kích thước hẹp (PDI 2 Độ đặc hiệu

Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký gồm có: dung dịch chuẩn DHA – PTX, dung dịch thử DHA-PTX, mẫu trắng tá dược, mẫu dung môi

Tiến hành chạy sắc ký các dụng dịch trên theo các điều kiện đã chọn và ghi lại các sắc ký đồ Yêu cầu pic của PTX và DHA được nhận diện rõ trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của PTX và DHA trên sắc ký đồ của mẫu trắng Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ DHA là 5, 10, 20, 50, 100 μg/ml và PTX là 1, 5, 10, 20, 50 μg/ml bằng cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc bằng pha động với các hệ số pha loãng khác nhau Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA và PTX Khoảng tuyến tính phải có hệ số tương quan R > 0,998 Độ đúng

Tiến hành bào chế mẫu trắng không chứa dược chất tương tự như quy trình bào chế mẫu chứa dược chất Bổ sung một lượng PTX và DHA chuẩn vào các mẫu trắng trên để thu được 03 mẫu cú hàm lượng DHA và PTX tương ứng là 15,0 àg/mL, 25,0 àg/mL, 35,0 àg/mL và 7,5 àg/mL, 12,5 àg/mL, 17,5 àg/mL Tiờm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Yêu cầu phần trăm tìm lại của các mẫu ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng từ 98-102% Độ chính xác

- Tiến hành: Định lượng PTX-DHA được thực hiện trên 06 mẫu thử độc lập

- Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng dược chất có trong các mẫu

≤ 2,0% ii Độ chính xác trung gian

- Tiến hành: Tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày, khác người thực hiện Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng dược chất có trong các mẫu của mỗi kiểm nghiệm viên tiến hành và giữa hai kiểm nghiệm viên

- Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên (n=6) ≤ 2,0% và của cả hai kiểm nghiệm viên (n) phải ≤ 3,0%

2.4.2 Phương pháp bào chế và tối ưu hóa công thức tiểu phân nano PTX-DHA

Phương pháp bào chế tiểu phân nano PTX-DHA

Tiểu phân nano chứa PTX và DHA được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi sử dụng chất mang polyme (PLGA) và một chất mang lipid Quy trình bào chế được mô tả như sau:

- Pha dầu: PTX, DHA, PLGA, lipid (Lecithin, Compritol 888 ATO, Precirol ATO 5) hòa tan trong dicloromethan

- Pha nước: Chất diện hoạt (Tween 80, Acrysol EL 135, poloxamer 407, PVA) hòa tan trong nước cất

- Phối hợp pha dầu vào pha nước ở điều kiện 5-10°C, đồng nhất bằng siêu âm kết hợp khuấy từ với tốc độ 1200 rpm Sau đó tiến hành bốc hơi dung môi hữu cơ bằng khuấy từ với tốc độ 1000 rpm trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng, thu được hỗn dịch nano PTX-DHA Ly tâm sử dụng ống ly tâm sử dụng màng siêu lọc (MWCO 10 kDa) ở 4500 vòng/phút, 30 phút ở 20°C để thu được nano, sau đó rửa cắn nano 3 lần bằng nước cất (mỗi lần 2 mL), ly tâm như trên để loại bỏ dịch rửa Hỗn dịch thu được sau khi phân tán lại cắn trong nước cất được sử dụng để đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano [15]

Phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức i Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

Các yếu tố thuộc về quy trình (năng lượng siêu âm, thời gian siêu âm) và các yếu tố thuộc về công thức (tỷ lệ dược chất PTX/DHA, loại chất mang lipid, loại chất diện hoạt, nồng độ chất diện hoạt, tỷ lệ chất mang polyme/dược chất (tỷ lệ PLGA/DC), tỷ lệ chất mang lipid/chất mang polyme, tỷ lệ pha dầu/pha nước) được khảo sát ii Thiết kế thí nghiệm

Các thí nghiệm được thiết kế thường quy hoặc dựa vào mô hình thích hợp nhờ việc sử dụng phần mềm MODDE 12.1 (Umetrics Inc, USA) iii Phân tích và tối ưu hóa

Tiến hành xác định các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa công thức tiểu phân nano chứa PTX-DHA bằng phương pháp phân tích mặt đáp

Nồng độ Acrysol EL 135 (X1), tỷ lệ PLGA/dược chất (X2), tỷ lệ lecithin/PLGA (X3) và tỷ lệ dầu/nước (X4) là các biến độc lập Các biến phụ thuộc là KTTP (Y1), PDI (Y2),

LC của DHA (Y3) và LC của PTX (Y4) Phương trình đa thức bậc hai được sử dụng để thể hiện mối quan hệ giữa các biến đầu ra (Yi) và các biến đầu vào (Xi), và xác định công thức tối ưu Đánh giá đặc tính của tiểu phân nano PTX-DHA

KẾT QUẢ

Kết quả thẩm định phương pháp định lượng PTX và DHA

3.1.1 Độ phù hợp hệ thống

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn DHA – PTX cú nồng độ DHA và PTX lần lượt là 100 àg/mL và 50 àg/mL như mục 2.4.1.2

- Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn DHA-PTX theo các điều kiện sắc ký ở mục 2.4.1.1 Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá độ tương thích hệ thống

DHA PTX Đồng phân 𝛂 Đồng phân 𝛃 Tổng S

Nhận xét: Kết quả cho độ lệch chuẩn tương đối về diện tích pic: %RSD = 1,29% đối với α-DHA; 1,61% đối với β-DHA và 0,25% đối với PTX thỏa mãn yêu cầu chung về độ lệch chuẩn tương đối khi định lượng bằng HPLC với %RSD ≤ 2% Về thời gian lưu, kết quả độ lệch chuẩn tương đối %RSD = 0,08% đối với α-DHA; 0,12% đối với β- DHA và 0,25% đối với PTX Cả ba giá trị %RSD đều nhỏ hơn 1% đáp ứng được yêu cầu phân tích

Chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng, mẫu placebo, mẫu chuẩn chứa PTX-DHA, mẫu thử chứa nano PTX-DHA và tiến hành chạy sắc ký như chương trình đã lựa chọn Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.1 và phụ lục 1.1

(C) Mẫu chuẩn hỗn hợp PTX-DHA

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn đơn thành phần, chuẩn hỗn hợp

- Trên sắc kí đồ của mẫu trắng không xuất hiện các pic lạ trong khoảng thời gian lưu của DHA, PTX Trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn đơn DHA không xuất hiện pic lạ trong khoảng thời gian lưu của PTX Trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn đơn PTX không xuất hiện các pic lạ trong khoảng thời gian lưu của DHA

- Trên các sắc kí đồ, thời gian lưu của dược chất ở mẫu thử tương ứng với ở mẫu chuẩn, các pic rõ nét, tách biệt rõ ràng

Như vậy, có thể kết luận phương pháp HPLC có độ đặc hiệu tốt với hai dược chất

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 5, 10, 20, 50 và 100 μg/ml đối với DHA, dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 1, 5, 10, 25 và 50 μg/ml đối với PTX Tiến hành chạy sắc kí như mục 2.4.1.1 và ghi lại kết quả đáp ứng pic của dãy dung dịch chuẩn trên, từ đó xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dược chất Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp được trình bày ở PL-1.2, Hình 3.2 và 3.3

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ PTX

Nhận xét: Kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của DHA trong khoảng nồng độ từ 5,0 đến 100,0 μg/ml và sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của PTX trong khoảng nồng độ từ 1,0 đến 50,0 μg/ml, với hệ số tương quan R ≥ 0,998

Các kết quả trên cho thấy phương pháp HPLC với điều kiện sắc kí ở mục 2.4.1.1 có thể sử dụng để định lượng đồng thời DHA và PTX trong tiểu phân nano

Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng HPLC cho DHA và PTX được trình bày trong Bảng 3.2 và Bảng 3.3 y = 2,7821x + 1,6767 R² = 0,9999

Bảng 3.2 Độ đúng của phương pháp HPLC đối với DHA

Nồng độ mẫu pha (àg/ml)

Nồng độ thu hồi (àg/ml)

Bảng 3.3 Độ đúng của phương pháp HPLC đối với PTX

Nồng độ mẫu pha (àg/ml)

Nồng độ thu hồi (àg/ml)

Kết quả ở bảng cho thấy các mẫu đều có phần trăm tìm lại nằm trong khoảng từ 98,0% đến 102,0%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, phù hợp cho phép phân tích xác định hàm lượng PTX và DHA trong chế phẩm

Chuẩn bị 6 mẫu dung dịch thử cú nồng độ DHA và PTX lần lượt khoảng 25 àg/ml và 12,5 àg/ml Kết quả đỏnh giỏ độ chớnh xỏc được thể hiện ở Bảng 3.4 và phụ lục 1.4

Bảng 3.4 Độ chính xác của phương pháp HPLC

Kết quả Giới hạn chấp nhận

Kết quả Giới hạn chấp nhận Độ lặp lại Đạt RSD ≤ 2,0%

(n = 6) Độ chính xác trung gian Đạt RSD ≤ 3,0%

Giá trị RSD (%) kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên (n = 6) nhỏ hơn 2,0% và của cả 2 kiểm nghiệm viên (n = 12) nhỏ hơn 3,0% Như vậy, quy trình định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại và độ chính xác trung gian

Như vậy, qua đánh giá các tiêu chí trên, phương pháp HPLC đạt yêu cầu về thẩm định và có thể sử dụng trong phân tích hàm luợng PTX và DHA.

Kết quả bào chế tiểu phân nano PTX-DHA

Các yếu tố thuộc về quy trình và công thưc được khảo sát để lựa chọn các biến đầu vào cho thiết kế thử nghiệm tối ưu hóa

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về quy trình bào chế Đối với việc bào chế tiểu phân nano phối hợp DHA và PTX bằng phương pháp nhũ hóa, bốc hơi dung môi từ nhũ tương thì năng lượng và thời gian siêu âm là hai yếu tố quan trọng

63 ảnh hưởng đến đặc tính của tiểu phân nano như kích thước tiểu phân trung bình và phân bố kích thước tiểu phân [59] Do đó, ảnh hưởng của 2 yếu tố này được khảo sát Ảnh hưởng của năng lượng siêu âm

Năng lượng siêu âm có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình phân tán pha dầu vào pha nước, giúp tạo ra những giọt có kích thước nhỏ và đồng nhất để từ đó cho ra những tiểu phân phân tán có KTTP và PDI thấp trong hỗn dịch nano bào chế được Cố định các thành phần: Pha dầu (chứa 10 mg DHA, 5 mg PTX, 15 mg PLGA và 9 mg LEC), pha nước (dung dịch Acrysol EL135 2,0% trong 30 ml nước cất) Điều kiện siêu âm được khảo sát: Tần số 20 kHz, thời gian siêu âm 5 phút, cường độ siêu âm 0%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100% công suất tối đa (130W) Kết quả đặc tính của hệ tiểu phân DHA và PTX được thể hiện trong bảng PL-2.1.1 và Hình 3.4

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của năng lượng siêu âm đến đặc tính của tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD)

Khi không có tác dụng của năng lượng siêu âm, chỉ có biện pháp khuấy từ đơn giản, sự tách pha có thể được quan sát rõ ràng sau khi phối hợp pha dầu và pha nước Kết quả là hệ tạo thành tồn tại dưới dạng hỗn dịch với tiểu phân phân tán có kích thước lớn, quan sát được bằng mắt thường Khi tăng cường độ siêu âm từ 20% đến 100%, hệ tiểu phân tạo thành có kích thước nano với KTTP và PDI có xu hướng giảm dần Khi cường độ

64 siêu âm đạt 100%, KTTP của hệ giảm xuống còn 113,50 nm, giá trị PDI thấp hơn 0,25 và thế zeta của hệ có trị tuyệt đối lớn hơn 30 mV, đảm bảo độ ổn định vật lý của hệ [49], [85] Do đó, lựa chọn cường độ siêu âm là 100% tương ứng công suất siêu âm 130W để khảo sát yếu tố tiếp theo Ảnh hưởng của thời gian siêu âm

Cùng với năng lượng siêu âm thì thời gian siêu âm là một yếu tố quan trọng tác động đến đặc tính vật lý của tiểu phân nano DHA-PTX Do đó tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm như sau: Bào chế tiểu phân nano theo CT6 như ở phụ lục 2.1 với thời gian siêu âm 1,5 phút, 3 phút, 5 phút, 7 phút, 9 phút Kết quả được thể hiện qua bảng phụ lục 2.1.2 và Hình 3.5

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến đặc tính của tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD)

Khi tăng thời gian siêu âm từ 1,5 phút đến 5 phút, KTTP có xu hướng giảm dần Tuy nhiên khi tăng thời gian siêu âm từ 5 phút đến 9 phút, KTTP có khuynh hướng tăng Trong khi đó, PDI của tiểu phân nano giảm dần khi tăng thời gian siêu âm từ 1,5 phút đến 9 phút Hỗn dịch nano bào chế được với thời gian siêu âm 5 phút có KTTP nhỏ nhất, giá trị PDI thấp (nhỏ hơn 0,25) và trị tuyệt đối thế zeta trên 30 mV Từ các giá trị này có thể thấy tiểu phân nano bào chế được có độ ổn định cao trong môi trường phân tán

Vì vậy, thời gian siêu âm 5 phút được lựa chọn để tiếp tục khảo sát các yếu tố thuộc về công thức

3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về thành phần công thức

Các yếu tố thuộc về thành phần công thức bao gồm: (1) tỷ lệ dược chất PTX/DHA, (2) loại chất mang lipid, (3) loại chất diện hoạt, (4) nồng độ chất diện hoạt, (5) tỷ lệ chất mang polyme so với dược chất (tỷ lệ PLGA/DC); (6) tỷ lệ chất mang lipid/chất mang polyme (tỷ lệ LEC/PLGA), và (7) tỷ lệ pha dầu/pha nước Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất PTX/DHA

Trước khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các tá dược đến việc bào chế tiểu phân nano DHA-PTX, luận án tiến hành lựa chọn tỷ lệ tối ưu phối hợp hai dược chất Tiến hành đánh giá độc tính tế bào từ dung dịch DHA và PTX riêng lẻ, dung dịch hỗn hợp DHA-PTX, sau đó xử lí dữ liệu bằng phần mềm CompuSyn để tính chỉ số phối hợp CI (Combination Index) Kết quả đánh giá độc tính trên dòng tế bào NCI-H23 được thể hiện ở bảng phụ lục 2.2.1, Hình 3.6 và Bảng 3.5

Hình 3.6 Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào ung thư NCI-H23 (A) và LLC (B) khi được ủ với PTX, hỗn hợp PTX-DHA ở các tý lệ khác nhau (*p< 0,05, ***p< 0,001)

Bảng 3.5 Chỉ số phối hợp của PTX và DHA trên tế bào ung thư NCI-H23 và LLC xử lý bằng phần mềm CompuSyn

Chỉ số kết hợp (CI)

Khi tăng dần nồng độ thuốc hoặc phức hợp, khả năng sống sót của tế bào giảm Khả năng ức chế sự phát triển của tế bào NCI-H23 và LLC đều tăng dần khi sử dụng phức hợp DHA, PTX Bên cạnh đó, kết quả Bảng 3.5 cho thấy chỉ số phối hợp CI < 1 ở tỷ lệ PTX:DHA từ 1:1 đến 1:4 chứng tỏ 2 thuốc có tác dụng hiệp đồng trên dòng tế bào NCI-H23 và LLC Trong đó, tỷ lệ PTX:DHA (kl/kl) trong khoảng từ 1:1 đến 1:2 thể hiện tác

67 dụng ức chế tế bào NCI-H23 cao nhất với giá trị CI nhỏ nhất Kết quả cũng tương tự trên dòng tế bào ung thư HT-29 theo Phùng Cao Đại và cộng sự [71] Ảnh hưởng của loại chất mang lipid Để đánh giá ảnh hưởng của loại chất mang lipid, tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano PTX và DHA có thành phần pha dầu gồm 10mg DHA, 5mg PTX, 10 mg PLGA và 10 mg lipid (Lecithin, Compritol 888 ATO, hoặc Precirol ATO 5) hòa tan trong 3 mL dicloromethan; pha nước là dung dịch có nồng độ 1,5% (kl/tt) của Tween 80 Kết quả được trình bày như Bảng 3.6

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của loại chất mang lipid đến một số đặc tính tiểu phân nano

Chất mang lipid sử dụng

PDI Độ ổn định ở 2-8 o C sau 8 giờ

11 Lecithin 160,2 + 5,22 0,205 + 0,013 Không bị kết tinh lại

ATO 237,4 + 6,99 0,19 + 0,013 Bị kết tinh lại

Trong đó, (-) có nghĩa là không tiến hành

Khi sử dụng Precirol ATO 5, tiểu phân nano bị tụ ngay sau khi bốc hơi dung môi xong Compritol 888 ATO cho hệ có kích thước tiểu phân lớn hơn 200 nm, đồng thời tiểu phân nano bị kết tinh lại sau khi để qua đêm khi bảo quản ở 2-8 o C Lecithin cho hệ có kích thước tiểu phân nhỏ hơn 200 nm, và độ ổn định tốt sau khi để qua đêm khi bảo quản ở 2-8 o C Nhằm đảm bảo kích thước và độ ổn định cho tiểu phân nano, chúng tôi sử dụng lecithin (LEC) làm tá dược mang lipid cho các khảo sát tiếp theo Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt Để đánh giá ảnh hưởng của loại chất ổn định pha nước, tiến hành bào chế tiểu phân nano PTX và DHA có thành phần pha dầu gồm 10mg DHA, 5mg PTX, 15 mg PLGA

68 và 15mg LEC hòa tan trong 3 mL dicloromethan; pha nước là dung dịch có nồng độ 1,5% (kl/tt) của chất diện hoạt (poloxamer 407, Tween 80, Acrysol EL 135 hoặc PVA) Kết quả được trình bày như Bảng 3.7

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt đến đặc tính tiểu phân nano

Công thức Chất diện hoạt sử dụng KTTP TB (nm) PDI

Khi sử dụng Poloxamer 407, tiểu phân nano bị tụ ngay sau khi bốc hơi dung môi xong PVA cho hệ có kích thước tiểu phân lớn hơn 200 nm Tween 80 và Acrysol EL

135 cho hệ có kích thước tiểu phân nhỏ hơn 200 nm, tuy nhiên Acrysol cho PDI thấp hơn Nhằm đảm bảo kích thước và phân bố kích thước tiểu phân, chúng tôi sử dụng Acrysol EL 135 làm chất ổn định pha nước cho các khảo sát tiếp theo Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt Để đánh giá ảnh hưởng của loại chất ổn định pha nước, tiến hành bào chế tiểu phân nano PTX và DHA có thành phần pha dầu gồm 10 mg DHA, 5 mg PTX, 15 mg PLGA và 15mg lecithin hòa tan trong 3 ml dicloromethan; pha nước là dung dịch của Acrysol

EL 135 với nồng độ từ 0,5% đến 2,5% Kết quả được trình bày như Bảng 3.8

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt đến một số đặc tính tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD)

Công thức Tỷ lệ Acrysol EL 135 KTTP TB PDI

Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA

Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh Đánh giá ảnh hưởng của các tá dược tạo bánh khác nhau đến chất lượng sản phẩm đông khô gồm: Fructose, Sorbitol, Glucose, Lactose, Saccarose, Manitol với nồng độ cuối trước khi đông khô là 5% và 10% (kl/tt) Bột đông khô được phân tán lại với nước cất Kết quả được trình bày trong Bảng 3.19 và Hình 3.13

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô

Tá dược tạo bánh Hình thức của bánh Hình thức mẫu sau khi pha lại

Không sử dụng Bánh không hình thành, co ngót nhiều

Không phân tán lại trong nước

Glucose Bánh không hình thành, co ngót nhiều

Không phân tán lại trong nước

Fructose Bánh phồng rộp Các tiểu phân có kích thước lớn bám lên thành lọ

Sorbitol Bánh co ngót nhiều Các tiểu phân có kích thước lớn bám lên thành lọ

Lactose Bánh co ngót Các tiểu phân có kích thước lớn bám lên thành lọ

Saccarose Bánh co ngót Các tiểu phân có kích thước lớn bám lên thành lọ

Manitol Bánh màu trắng, xốp, mịn Hỗn dịch màu trắng đục, không lắng cặn, đồng nhất

(K o : Không sử dụng tá dược)

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô với tỷ lệ tá dược tạo bánh 5% (A) và 10% (B), sau khi phân tán lại tại nồng độ tá dược tạo bánh 10%(C)

Dựa vào kết quả thu được, để đảm bảo hình thức bánh xốp, mịn và khả năng phân tán tốt, manitol được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo Ảnh hưởng của nồng độ tá dược tạo bánh

Tiến hành bào chế bột đông khô với nồng độ tá dược tạo bánh manitol thay đổi từ 5% đến 15% (kl/tt), thể tích hỗn dịch trước khi đông khô là 10 ml Bột đông khô được phân tán lại với 10 ml nước cất Kết quả ảnh hưởng của nồng độ manitol đến KTTP và PDI của hỗn dịch nano trước và sau khi đông khô được trình bày trong hình Bảng 3.20 và Hình 3.14

Bảng 3.20 KTTP và PDI của mẫu đông khô sử dụng các nồng độ manitol khác nhau (n = 3, TB ± SD)

(Sf/Si, Pf/Pi: lần lượt là tỉ lệ giữa KTTP TB, PDI sau và trước đông khô; Man: manitol)

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ manitol đến sự thay đổi KTTP và PDI trước và sau khi đông khô m an 5% m an 7 5% m an 10 % m an 12 5% m an 15 %

Như được hiển thị trong Hình 3.14, nồng độ manitol ảnh hưởng đáng kể đến giá trị Sf/Si Công thức chứa 15% manitol cung cấp giá trị Sf/Si tối ưu (gần bằng 1) Trong đó, tăng nồng độ manitol (từ 5 lên 15%), kích thước tiểu phân giảm đáng kể (p 0,05) về KTTP của bột đông khô chứa tiểu phân nano sau khi phân tán lại giữa các thời điểm KTTP và PDI của bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX- DHA bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C ở các thời điểm sau khi phân tán lại lần lượt đều dưới 200 nm và 0,300 Trong khi đó, sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thực, mẫu bột đông khô tuy đạt về mặt cảm quan nhưng không đạt về chỉ tiêu KTTP do có KTTP 215,4 ± 7,3 nm (> 200 nm) Về hàm ẩm, các mẫu bảo quản sau 12 tháng ở điều kiện 5 ± 3 o C và 6 tháng ở điều kiện thực đều dưới giới hạn quy định (< 5%)

Về trạng thái kết tinh Đặc tính kết tinh của bột đông khô pha tiêm sau thời gian theo dõi ở điều kiện 5 ± 3°C được đánh giá bằng phổ nhiễu xạ tia X Kết quả được trình bày ở Hình 3.23

Hình 3.23 Phổ XRD của PTX, DHA, hỗn hợp vật lý (PTX,DHA, HHVL) và bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ở các thời điểm bảo quản khác nhau ở 5 ± 3°C sau 3, 6, 12 tháng (T3, T6, T12)

Sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C, bột đông khô pha tiêm vẫn giữ được trạng thái của các thành phần trong công thức như ban đầu

Về hàm lượng dược chất

Kết quả theo dõi hàm lượng dược chất trong bột đông khô trên 3 lô được trình bày ở Bảng 3.26, với các sắc ký đồ được trình bày ở hình phụ lục 3.8

Bảng 3.26 Hàm lượng PTX và DHA trong bột đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ±

3 o C và điều kiện thực ĐK bảo quản

% hàm lượng so với ban đầu

Kết quả cho thấy hàm lượng PTX và DHA trong của bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA ở 3 lô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C đến 12 tháng và điều kiện thực ở

3 tháng nằm trong khoảng từ 95,52% đến 101,09% Do vậy, các mẫu bột đông khô đều đạt yêu cầu về hàm lượng dược chất theo yêu cầu đề ra

Về hình thái tiểu phân

Sau 12 tháng ở điều kiện 5 ± 3°C, bột đông khô chứa nano PTX-DHA được phân tán lại, rửa loại tá dược và chụp hình ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Kết quả được thể hiện ở Hình 3.24

Hình 3.24 Hình ảnh TEM của tiểu phân nano PTX-DHA trong bột đông khô sau

12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C

Hình thái tiểu phân không thay đổi đáng kể Tiểu phân nano hình cầu, KTTP nhỏ, phân bố KTTP hẹp và không có sự khác biệt đáng kể so với thời điểm ban đầu (T0)

Về khả năng giải phóng thuốc

Sau thời gian bảo quản 12 tháng ở điều kiện 5 ± 3°C, tiến hành đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ mẫu bột đông khô dung dịch đệm phosphat pH 5,0 hoặc đệm salin phosphat pH 7,4 Kết quả được thể hiện qua bảng phụ lục 3.9 và Hình 3.25

Hình 3.25 Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C

Dựa vào bảng phụ lục 3.9 và Hình 3.25, có thể nhận thấy phần trăm giải phóng dược chất từ bột đông khô chứa nano PTX-DHA sau 12 tháng bảo quản ở 5 ± 3°C, khi phân tán lại trong môi trường đệm phosphat pH 5,0 cao hơn so với trong môi trường đệm phosphat pH 7,4, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

3.6.2 Kết quả độ ổn định của hỗn dịch thu được sau khi phân tán bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC

Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào in vitro

Khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-153 vào tế bào được đánh giá in vitro trên 2 dòng tế bào: NCI-H23 và LLC

3.7.1 Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào NCI-H23

Hình 3.26 Đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-

153 trên dòng tế bào NCI-H23 bằng (A) Kính hiển vi quét laser đồng tiêu cự, (B) Hệ thống dòng chảy (Flow cytometry)

Nhận xét: Ở Hình 3.26 (A), vùng màu xanh lá cây thể hiện sự hấp thu của các tiểu phân nano vào tế bào Kết quả quan sát trên kính hiển vị điện tử quét laser đồng tiêu cự cho thấy trên tế bào NCI-H23, tiểu phân nano có khả năng hấp thu vào tế bào cao hơn so với dung dịch coumarin-153 Đồng thời sự hấp thu tiểu phân nano vào tế bào NCI-H23 phụ thuộc vào nồng độ, cụ thể ở nồng độ 0,75 ppm, coumarin 153 xâm nhập vào tế bào cao nhất

3.7.2 Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào LLC

Khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-153 trên dòng tế bào LLC được thể hiện ở Hình 3.27 và phụ lục 3.12

Hình 3.27 Đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-

153 trên dòng tế bào LLC bằng hệ thống dòng chảy (Flow cytometry)

(A) theo nồng độ và (B) theo thời gian

Kết quả cho thấy tiểu phân nano hấp thu vào tế bào LLC phụ thuộc vào nồng độ Ở nồng độ coumarin 153 là 0,75 àg/mL, mẫu xõm nhập vào tế bào mạnh nhất, cao hơn so với cỏc nồng độ thấp hơn Ở nồng độ 0,25 àg/mL, sự hấp thu của tiểu phõn nano theo thời gian chưa rõ ràng Tuy nhiên ở thời điểm 0,5 giờ, tín hiệu huỳnh quang của các mẫu trong tế bào yếu hơn so với thời điểm 1 giờ và 1,5 giờ và ở 2 thời điểm 1h và 1,5h, mức độ tín hiệu huỳnh quang của các mẫu là tương đương nhau Kết quả này chỉ ra rằng coumarin 153 trong mẫu thí nghiệm xâm nhập vào tế bào mạnh dần trong khoảng thời gian 60 phút đầu

3.8 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro được tiến hành trên 2 dòng tế bào: NCI-H23 và LLC

3.8.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên tế bào NCI-H23 (A)

Hình 3.28 Ảnh hưởng của PTX, DHA, dung dịch hỗn hợp PTX-DHA và tiểu phân nano ở các nồng độ PTX khác nhau lên (A) tỷ lệ sống sót (%), (B) biểu hiện của p-

H2AX và (C) sự kết tụ α-tubulin tương ứng của tế bào NCI-H23

Tất cả các mẫu đánh giá đều thể hiện khả năng ức chế tế bào NCI-H23 phụ thuộc vào nồng độ Khi tăng dần nồng độ thuốc PTX hoặc tiểu phân nano, khả năng sống sót của tế bào giảm, đặc biệt khi dùng ở các nồng độ cao Dung dịch hỗn hợp PTX-DHA và hỗn dịch tiểu phân nano PTX-DHA thể hiện khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư NCI-H23 tốt hơn so với dung dịch PTX Trong đó, khả năng ức chế tế bào NCI-H23 của tiểu phân nano PTX-DHA là tốt nhất, thể hiện ở tỷ lệ sống sót của NCI-H23 thấp nhất so với 2 nhóm còn lại ở tất cả các nồng độ đánh giá Kết quả tương đồng với dữ liệu thu được từ hình ảnh thu được bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu cự

3.8.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên tế bào LLC

Hình 3.29 Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào LLC khi được ủ với PTX, dung dịch hỗn hợp PTX-DHA và tiểu phân nano ở các nồng độ PTX khác nhau (n = 6)

Mẫu nguyên liệu PTX, dung dịch hỗn hợp PTX-DHA, hỗn dịch tiểu phân nano PTX- DHA thể hiện rất tốt khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư LLC Khi tăng dần nồng độ thuốc PTX hoặc tiểu phân nano, khả năng sống sót của tế bào giảm, đặc biệt khi dùng ở các nồng độ cao

3.9 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo Để đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo, các chỉ số sau được khảo sát: sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm, khả năng ức chế khối u, khối lượng khối u tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, khả năng kéo dài tuổi thọ của chuột bị gây u, và các chỉ số huyết học và hóa sinh tại thời điểm kết thúc thí nghiệm

3.9.1 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm

Kết quả sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm theo thời gian thể hiện ở Hình 3.30:

Hình 3.30 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm (g/con) của (A) lô thử với liều PTX là 2,5 mg/kg và 5 mg/kg và (B) lô thử với liều PTX là 7,5 mg/kg (nano:hỗn dịch nano PTX-DHA, free: dung dịch hỗn hợp PTX/DHA) theo thời gian

Qua bảng trên chúng tôi nhận thấy khối lượng cơ thể chuột tiêm mẫu thí nghiệm tại các thời điểm 0, 7, 14, 21 và 28 ngày có sự thay đổi nhỏ so với đối chứng âm, nhưng chưa ở mức có ý nghĩa thống kê (p > 0.05)

111 Ở lô thử với liều PTX 7,5 mg/kg, trên lô dung dịch hỗn hợp PTX-DHA, chuột chết ngay sau khi tiêm: lần 1 chết 2 con, lần 2 chết 3 con, lần 3 chết 1 con Tổng số chuột trong lô này đã chết hết sau 6 ngày (3 lần tiêm) Hiện tượng này không ghi nhận với lô tiêm hỗn dịch nano liều PTX 7,5 mg/kg Như vậy, việc nano hóa PTX-DHA đã cho thấy rõ tính an toàn, cải thiện độc tính đáng kể so với dạng chưa nano hóa

3.9.2 Khả năng ức chế khối u phát triển

Kết quả sự phát triển của khối u và khả năng ức chế khối u được thể hiện ở Hình 3.32:

Hình 3.31 Thể tích khối u theo thời gian của (A) lô thử với liều 2,5 mg PTX/kg và

5 mg PTX/kg và (B) lô thử với liều 7,5 mg PTX /kg (nano:hỗn dịch nano PTX-DHA, free: dung dịch hỗn hợp PTX/DHA); (C) phần trăm ức chế khối u của tất cả các lô thử nghiệm (n = 6)

- Thể tích khối u ở chuột được tiêm hỗn dịch nano PTX-DHA (5 mgPTX/kg) tại các thời điểm 14, 21 và 28 ngày giảm so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (p