Nghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin

Nghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin Nghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisininNghiên cứu bào chế và Đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI **********

NINH THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ CỦA HỆ

TIỂU PHÂN NANO PHỐI HỢP

PACLITAXEL VÀ DIHYDROARTEMISININ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI **********

NINH THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ CỦA

HỆ TIỂU PHÂN NANO PHỐI HỢP

PACLITAXEL VÀ DIHYDROARTEMISININ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 9720202

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Ngọc Chiến GS.TS Chi-Ying F Huang

HÀ NỘI 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai khác công bố trong bất kỳ công trình nào

Ninh Thị Kim Thu

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai người thầy của tôi là:

GS TS Nguyễn Ngọc Chiến GS TS Chi-Ying F Huang

Hai thầy đã chỉ bảo tận tình và hướng dẫn tôi một cách cụ thể, tâm huyết nhất trong suốt quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tuy nhiên, kiến thức của tôi còn những hạn chế nhất định nên đã không thể tránh khỏi những thiếu sót và tôi đã nhận được những nhận xét, góp ý quý báu của PGS TS Nguyễn Đăng Hòa, GS TS Phạm Thị Minh Huệ, PGS TS Vũ Thị Thu Giang, PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Nguyễn Trần Linh, TS Nguyễn Thị Mai Anh, PGS TS Trần Thị Hải Yến, PGS TS Nguyễn Thạch Tùng, PGS TS Nguyễn Thị Thanh Duyên, TS Phạm Bảo Tùng, TS Dương Thị Hồng Ánh, TS Võ Quốc Ánh, TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh, TS Đào Văn Nam, TS Nguyễn Thị Trinh Lan, PGS TS Vũ Thùy Dương v v để luận án hoàn thiện hơn

Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị nghiên cứu viên, kỹ thuật viên của Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường đại học Dược Hà Nội, khoa Bào chế - Công nghệ Dược phẩm - Trường đại học Dược Hà Nội, khoa Y Sinh - Trường đại học Quốc gia Yang-Ming Chiao Tung - Đài Loan, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án vừa qua

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp đang công tác tại Khoa Dược và Ban Giám hiệu - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, nơi tôi công tác, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về thời gian để tôi tập trung học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội cùng các thầy cô phòng Đào tạo Sau đại học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Luận án này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano hướng đích chứa kết hợp paclitaxel và dihydroartemisinin, tác dụng hiệp đồng tăng cường trong điều trị ung thư ” có mã số 108.05- 2017.300

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã là động lực không nhỏ giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 24 tháng 1 năm 2024

Ninh Thị Kim Thu

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG

1.1.2 Tổng quan về dihydroartemisinin (DHA) 6

1.1.3 Cơ chế tác dụng hiệp đồng chống ung thư khi phối hợp PTX và DHA 8

1.2 Tổng quan về tiểu phân nano lipid – polyme 12

1.1.4 Khái niệm tiểu phân nano lipid – polyme 12

1.1.5 Phân loại tiểu phân nano lipid – polyme 13

1.1.6 Các tá dược hay sử dụng trong tiểu phân nano lipid – polyme 16

1.1.7 Phương pháp bào chế tiểu phân nano lipid – polyme 21

1.1.8 Phương pháp tinh chế nano bằng cột lọc tiếp tuyến 24

1.1.9 Tính chất và một số chỉ tiêu đánh giá tiểu phân nano 25

1.3 Một số nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa paclitaxel và dẫn xuất artemisinin sử dụng chất mang PLGA 29

1.3.1 Nghiên cứu ngoài nước 29

1.1.10 Nghiên cứu trong nước 32

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 34

2.1.1 Nguyên vật liệu 34

2.1.2 Thiết bị 36

2.2 Địa điểm nghiên cứu 37

2.3 Nội dung nghiên cứu 37

2.4.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng PTX và DHA 38

2.4.2 Phương pháp bào chế và tối ưu hóa công thức tiểu phân nano PTX-DHA 40

2.4.3 Phương pháp bào chế và đánh giá bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA 45

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định 51

2.4.5 Phương pháp đánh giá khả năng xâm nhập vào tế bào in vitro 52

2.4.6 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro 53

2.4.7 Phương pháp đánh giá tác dụng chống ung thư in vivo 55

3.2 Kết quả bào chế tiểu phân nano PTX-DHA 62

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về quy trình bào chế 62

3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về thành phần công thức653.2.3 Kết quả tối ưu hóa công thức bào chế tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 71

3.2.4 Kết quả đánh giá đặc tính của tiểu phân nano PTX-DHA 79

3.4 Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA 82

3.4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA 82

3.4.2 Quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano DHA/PLGA-LEC 88

PTX-3.4.3 Kết quả đánh giá đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 90

3.5 Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở đề xuất 96

3.6 Kết quả đánh giá độ ổn định 97

3.6.1 Kết quả độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano DHA/PLGA-LEC 97

PTX-3.6.2 Kết quả độ ổn định của hỗn dịch thu được sau khi phân tán bột đông khô

pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 103

3.7 Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào in vitro 104

3.7.1 Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào H23 104

NCI-3.7.2 Kết quả đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano vào tế bào LLC 1053.8 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro 106

3.8.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên tế bào H23 107

NCI-3.8.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên tế bào LLC 1093.9 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo 109

3.9.1 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm 109

3.9.2 Khả năng ức chế khối u phát triển 111

3.9.3 Khối lượng khối u tại thời điểm kết thúc thí nghiệm 113

3.9.4 Khả năng kéo dài tuổi thọ của chuột gây u 114

3.9.5 Các chỉ số huyết học và hóa sinh tại thời điểm kết thúc thí nghiệm 115

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 119

4.1 Về bào chế tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 119

4.1.1 Ảnh hưởng của yếu tố thuộc về quy trình 119

4.1.2 Ảnh hưởng của yếu tố thuộc về công thức 122

4.2 Về bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 128

4.3 Về đánh giá đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đông khô 133

4.4 Về độ ổn định của bột đông khô pha tiêm 137

4.5 Về tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 138

4.5.1 Tác dụng hiệp đồng ức chế tế bào ung thư của PTX và DHA 138

4.5.2 Tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 141

4.6 Đóng góp mới của luận án 145

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril ART Artesunat

CI Chỉ số phối hợp (Combination index) CrEL Cremophor EL

DCM Dicloromethan DHA Dihydroartemisinin DMSO Dimethyl sulfoxid

DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differentiel scanning calorimetry) EE Hiệu suất nano hóa dược chất (Encapsulation efficiency) EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Food and Drug Administration)

HL-60 Ung thư tế bào bạch cầu cấp ở người (human acute leukemia)

KB Ung thư biểu mô miệng ở người (human carcinoma in the mouth) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) ICH Hội đồng quốc tế về hài hòa hóa các yêu cầu kỹ thuật đối với dược phẩm

sử dụng cho con người (International Conference on Harmonization) KLPT Khối lượng phân tử

KTTP Kích thước tiểu phân trung bình

Lewis lung carcinoma

Nanoparticle (Tiểu phân nano, gọi tắt là nano) PBS Muối đệm phosphat (Phosphate buffer saline) PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) PEG Polyethylen glycol

PLGA Poly (acid lactic-co-glycolic)

PVA Polyvinyl alcol PTX Paclitaxel

SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) TB Trung bình

TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TT Thể tích

TEM Hiển vi điện từ truyền qua (Transmission electron microscopy)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các hệ vi tiểu phân PLGA trên thị trường 18

Bảng 2.1 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá độ tương thích hệ thống 57

Bảng 3.2 Độ đúng của phương pháp HPLC đối với DHA 61

Bảng 3.3 Độ đúng của phương pháp HPLC đối với PTX 61

Bảng 3.4 Độ chính xác của phương pháp HPLC 62

Bảng 3.5 Chỉ số phối hợp của PTX và DHA trên tế bào ung thư NCI-H23 và LLC xử lý bằng phần mềm CompuSyn 66

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của loại chất mang lipid đến một số đặc tính tiểu phân nano 67

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt đến đặc tính tiểu phân nano 68

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt đến một số đặc tính tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD) 68

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA/DC đến một số đặc tính tiểu phân nano 69

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ LEC/PLGA đến một số đặc tính tiểu phân nano 70

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/pha nước đến một số đặc tính tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD) 70

Bảng 3.12 Ký hiệu và các mức của các biến độc lập 71

Bảng 3.13 Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa 71

Bảng 3.14 Các công thức bào chế tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 72

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano PTX-DHA/PGLA-LEC 73

Bảng 3.16 Công thức tối ưu theo phần mềm MODDE 12.1 78

Bảng 3.17 Kết quả một số đặc tính của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC công thức tối ưu 78

Bảng 3.18 Một số đặc tính hóa lý của công thức PTX-DHA/PLGA-LEC tối ưu 79

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô 82

Bảng 3.20 KTTP và PDI của mẫu đông khô sử dụng các nồng độ manitol khác nhau (n = 3, TB ± SD) 84

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của thời gian đông khô đến chất lượng sản phẩm 86

Bảng 3.22 Một số đặc tính bột đông khô pha tiêm chứa nano PTX-DHA/PLGA-LEC trước và sau khi phân tán trong nước 91

Bảng 3.23 Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 97

Bảng 3.25 Hàm ẩm, KTTP và phân bố KTTP sau khi phân tán lại của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA bảo quản ở 5 ± 3°C và điều kiện thực 99 Bảng 3.26 Hàm lượng PTX và DHA trong bột đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực 101 Bảng 3.27 Độ ổn định của hỗn dịch nano PTX-DHA sau khi phân tán lại 103 Bảng 3.28 Khối lượng khối u tại thời điểm kết thúc thí nghiệm của (A) lô thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg, và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6) 113 Bảng 3.29 Thời gian sống sót của chuột bị gây u của (A) lô thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg, và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6) 114 Bảng 3.30 Các chỉ số huyết học tại thời điểm kết thúc thí nghiệm của (A) lô thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6) 115 Bảng 3.31 Các chỉ số hóa sinh tại thời điểm kết thúc thí nghiệm của (A) lô thử với liều PTX 2,5 mg/kg và 5 mg/kg và (B) lô thử với liều 7,5 mg/kg (n = 6) 117

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của PTX [171], [2] 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của DHA [14] 6

Hình 1.3 Cấu trúc lõi polyme vỏ lipid ngoài cùng gắn PEG của tiểu phân nano lipid – polyme [26] 13

Hình 1.4 Phân loại nano lipid – polyme gồm: (A) Hệ lipid phân tán trong cốt polyme; (B) hệ lõi polyme, vỏ lipid; (C) hệ lipid – polyme – lipid; (D) hệ bao màng sinh học; và (E) hệ polyme bao liposome [134] 14

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp và cấu trúc hóa học của PLGA [59] 16

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của PC trong lecithin 21

Hình 2.1 Thiết bị lọc tiếp tuyến 46

Hình 2.2 Sơ đồ xử lý lọ thủy tinh, nút cao su, nắp nhôm 47

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 48

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn đơn thành phần, chuẩn hỗn hợp 59

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA 60

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ PTX 60

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của năng lượng siêu âm đến đặc tính của tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD) 63

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến đặc tính của tiểu phân nano (n = 3, TB ± SD) 64

Hình 3.6 Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào ung thư NCI-H23 (A) và LLC (B) khi được ủ với PTX, hỗn hợp PTX-DHA ở các tý lệ khác nhau (*p< 0,05, ***p< 0,001) 66

Hình 3.7 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Acrysol EL 135 và tỷ lệ PLGA/DC đến KTTP của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 75

Hình 3.8 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Acrysol EL 135 và tỷ lệ PLGA/DC đến PDI của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 76

Hình 3.9 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ lệ PLGA/DC và tỷ lệ dầu/nước đến KTTP nano PTX-DHA/PLGA-LEC 76

Hình 3.10 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ dầu/nước và tỷ lệ PLGA/DC đến LC của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC 77

Hình 3.11 Hình ảnh TEM của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC công thức tối ưu 79 Hình 3.12 Đồ thị giải phóng DHA và PTX từ hệ tiểu phân nano theo thời gian ở 2 môi

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô với tỷ lệ tá dược tạo bánh 5% (A) và 10% (B), sau khi phân tán lại tại nồng độ tá dược tạo bánh 10%(C) 83 Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ manitol đến sự thay đổi KTTP và PDI trước và sau khi đông khô 84 Hình 3.15 Ảnh hưởng của việc kết hợp các tá dược tạo bánh khác nhau đến sự thay đổi KTTP trước và sau khi đông khô (n = 3, TB ± SD) 85 Hình 3.16 Sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán (B) của các mẫu bột đông khô ở các thời gian sấy sơ cấp 24, 36, và 48 giờ 87 Hình 3.17 Hình ảnh bột đông khô pha tiêm trước (A) và sau khi phân tán lại (B) 90 Hình 3.18 Hình ảnh TEM của tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC sau đông khô 92 Hình 3.19 Giản đồ nhiệt vi sai của nguyên liệu (PTX, DHA, LEC, PLGA, manitol (MAN)), hỗn hợp vật lý (PM), và bột đông khô (NANO) 93 Hình 3.20 Phổ XRPD của nguyên liệu (PTX, DHA, PLGA, MAN), hỗn hợp vật lý chứa PTX, DHA, PLGA, LEC (HHVL), HHVL + MAN, và bột đông khô chứa nano PTX-DHA/PLGA-LEC (NANO) 94 Hình 3.21 Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (PTX, DHA), hỗn hợp vật lý (HHVL), bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC (NANO) 95 Hình 3.22 Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA sau khi phân tán lại trong môi trường đệm pH 5,0 và đệm pH 7,4 (n = 3, TB ± SD) 96 Hình 3.23 Phổ XRD của PTX, DHA, hỗn hợp vật lý (PTX,DHA, HHVL) và bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA/PLGA-LEC ở các thời điểm bảo quản khác nhau ở 5 ± 3°C sau 3, 6, 12 tháng (T3, T6, T12) 100 Hình 3.24 Hình ảnh TEM của tiểu phân nano PTX-DHA trong bột đông khô sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C 102 Hình 3.25 Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3°C 102 Hình 3.26 Đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-153 trên dòng tế bào NCI-H23 bằng (A) Kính hiển vi quét laser đồng tiêu cự, (B) Hệ thống dòng chảy (Flow cytometry) 105 Hình 3.27 Đánh giá khả năng xâm nhập của tiểu phân nano PTX-DHA coumarin-153 trên dòng tế bào LLC bằng hệ thống dòng chảy (Flow cytometry) 106 Hình 3.28 Ảnh hưởng của PTX, DHA, dung dịch hỗn hợp PTX-DHA và tiểu phân nano ở các nồng độ PTX khác nhau lên (A) tỷ lệ sống sót (%), (B) biểu hiện của p-H2AX và (C) sự kết tụ α-tubulin tương ứng của tế bào NCI-H23 108

Hình 3.29 Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào LLC khi được ủ với PTX, dung dịch hỗn hợp PTX-DHA và tiểu phân nano ở các nồng độ PTX khác nhau (n = 6) 109 Hình 3.30 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm (g/con) của (A) lô thử với liều PTX là 2,5 mg/kg và 5 mg/kg và (B) lô thử với liều PTX là 7,5 mg/kg (nano:hỗn dịch nano PTX-DHA, free: dung dịch hỗn hợp PTX/DHA) theo thời gian 110 Hình 3.31 Thể tích khối u theo thời gian của (A) lô thử với liều 2,5 mg PTX/kg và 5 mg PTX/kg và (B) lô thử với liều 7,5 mg PTX /kg (nano:hỗn dịch nano PTX-DHA, free: dung dịch hỗn hợp PTX/DHA); (C) phần trăm ức chế khối u của tất cả các lô thử nghiệm (n = 6) 112

ĐẶT VẤN ĐỀ

Paclitaxel (PTX) là một hoạt chất thu được từ dịch chiết cây thông đỏ (tên khoa học Taxus wallichiana Zucc., họ Thông đỏ Taxaceae) có tác dụng độc tế bào Năm 1992, PTX đã được FDA phê duyệt để điều trị ung thư buồng trứng, sau đó là nhiều bệnh ung thư khác như ung thư vú, ung thư phổi [62] Mặc dù vậy, việc sử dụng PTX bị hạn chế mạnh mẽ do độc tính cao và chỉ tồn tại trong thời gian ngắn Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng những thất bại này chủ yếu là độc tính không chọn lọc trên tế bào ung thư và tính không đồng nhất của các tế bào khối u, dẫn đến tình trạng kháng thuốc [143] Hiện tại, liệu pháp phối hợp thuốc đang thể hiện là biện pháp linh hoạt để giải quyết các vấn đề nêu trên nhằm ngăn chặn sự phát triển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư hiệu quả hơn Các tác nhân chống ung thư khó có thể đạt được lợi ích tối đa trong điều trị ung thư Chúng được đi kèm với các loại thuốc bổ sung theo cách nhắm mục tiêu khác chống lại các tế bào ung thư Cụ thể, sự kết hợp giữa PTX và carboplatin hoặc vinorelbine, được áp dụng trên lâm sàng để điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, cho thấy hiệu quả điều trị đáng kể so với liệu pháp đơn trị liệu [182]

Trong khi đó, dihydroartemisinin bên cạnh tác dụng chống sốt rét được chứng minh, còn có tác dụng chống lại nhiều loại tế bào ung thư vú, ung thư buồng trứng và ung thư khối u ác tính Đáng chú ý, nó sở hữu đặc tính chọn lọc thuận lợi là gây độc cho tế bào ung thư nhưng lại an toàn đối với các tế bào bình thường, đặc biệt trong trường hợp hóa

trị liệu kết hợp, điều này sẽ có lợi cho khả năng tương thích sinh học sau khi dùng in

vivo [188], [158], [77] Dựa trên lý do này, sự phối hợp giữa paclitaxel và

dihydroartemisinin có thể nâng cao hiệu quả điều trị, giảm tác dụng phụ và tránh hiện tượng kháng thuốc khi sử dụng PTX đơn thuần

Tuy nhiên, PTX thực tế không tan trong nước (< 0,5 mg/l) với đặc tính thấm kém (thuốc BCS loại IV), dẫn đến chỉ số điều trị thấp [47], [89], [156] Hiện nay, các công thức PTX được bán trên thị trường thường xuyên được sử dụng là Taxol® Taxol® sử dụng hỗn hợp dung môi ethanol và Cremophor EL (tỷ lệ 50:50) [81] Các dung môi được sử dụng để hòa tan loại thuốc này làm cho PTX khó dung nạp khi sử dụng và bệnh nhân thường cần dùng thêm với thuốc chống viêm trước khi điều trị để giảm thiểu phản ứng với dung môi Hơn nữa, nó còn gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng như giảm

bạch cầu, dễ bị nhiễm trùng, phản ứng dị ứng, rụng tóc, nôn mửa và tiêu chảy, cùng nhiều tác dụng phụ khác [58], [149] Để tránh những nhược điểm này, các công thức bào chế mới không chứa hoặc chứa lượng nhỏ tối thiểu Cremophor EL đang được quan tâm Hệ mang thuốc kích thước nano có thể khắc phục được hạn chế tan kém của PTX đồng thời tránh những tác động bất lợi do sử dụng Cremophor EL với lượng lớn Trên thế giới đã có hỗn dịch tiêm Abraxane™ chứa tiểu phân nano paclitaxel albumin, được FDA cấp phép lưu hành vào năm 2005 và châu Âu cấp phép sau đó vào năm 2008 [107], nhưng vẫn chưa có thuốc tiêm nano PTX với chất mang PLGA, cũng chưa có thuốc tiêm phối hợp PTX với thuốc khác

Hệ nano được coi là hệ thống phân phối thuốc đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư do kéo dài thời gian lưu thông trong máu, tích lũy thuốc ở các vị trí khối u và giảm độc tính phụ thông qua hiệu ứng tăng cường tính thấm và lưu giữ (EPR) Đồng thời, hệ nano có thể tối đa hóa tác dụng chống ung thư và giảm tác dụng phụ Bên cạnh đó, hệ nano đã được phát triển như một phương pháp sáng tạo bao gói nhiều dược chất kết hợp vào một hệ duy nhất [80], [119], [54]

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng chống ung thư của hệ tiểu phân nano phối hợp paclitaxel và dihydroartemisinin” với mục tiêu sau:

1 Bào chế được tiểu phân nano PTX-DHA

2 Bào chế được bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano PTX-DHA quy mô phòng thí nghiệm

3 Đánh giá được tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro và thăm dò tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm của bột đông khô chứa tiểu phân nano PTX-DHA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về dược chất

1.1.1 Tổng quan về paclitaxel (PTX) Công thức cấu tạo

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của PTX [171], [2]

- Tên khoa học: (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-1,2a,3,4,4a,6,9,10,11,12, 12a, 12b-Dodecahydro-4,6,9,11,12,12b-hexahydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-7,11-methano-5H-cyclodeca[100]-benz[1,2-b]oxet-5-on 6,12b-diacetat, 12-benzoat, 9-ester with (2R,3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserin

- Tên khác: 5b, 20-Epoxy-1,7b-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2a,4,10b,13a-tetrayl 4,10-diacetat 2- benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropa noat]

- Công thức phân tử: C47H51NO14

- Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [171], [2]

Tính chất lý hóa

Hình thức: Dạng tinh thể, màu trắng hoặc gần như trắng

Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và dễ tan trong methylen clorid [25]

Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/mL trong methanol có góc quay cực từ - 49,0° đến - 55,0° ở dạng khan [25], [171]

Độ ổn định

Trong dung dịch nước, độ ổn định của PTX bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, nồng độ dược chất và pH do xảy ra phản ứng thủy phân ở C10-acetat [162], [46]

Phương pháp định lượng

Do PTX có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 230 nm, nên sử dụng được phương pháp

đo quang phổ hấp thụ tử ngoại [84] hoặc HPLC [171] để định lượng PTX trong các mẫu

nghiên cứu xây dựng công thức

Dược động học và cơ chế tác dụng Dược động học

Sau khi truyền, thuốc phân bố rộng vào các mô và dịch cơ thể, có thể bị ảnh hưởng bởi liều và thời gian truyền Tỷ lệ gắn với protein là 89% đến 98% và không bị thay đổi khi dùng cùng với cimetidin, ranitidin, dexamethason hoặc diphenhydramin Paclitaxel được chuyển hóa tại gan thông qua cytochrom P450; isoenzym CYP2C8 và CYP3A4, và tạo ra chất chuyển hóa chủ yếu là 6α-hydroxypaclitaxel Độ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0 - 15,6 lít/giờ/m2) Độ thanh thải khi thời gian truyền từ 1 đến 6 giờ là 5,8 đến 16,3 lít/giờ/m2 và trong trường hợp tiêm truyền trong 24 giờ là 14,2 đến 17,2 lít/giờ/m2 [1]

Cơ chế tác dụng

Paclitaxel là một thuốc chống ung thư PTX làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các ống vi thể và làm ổn định các ống vi thể sẵn có do ức chế quá trình giải trùng hợp Do đó, ức chế sự tái cấu trúc bình thường của mạng ống vi thể rất quan trọng ở gian kỳ của quá trình phân bào và cả với hoạt động của ty lạp thể PTX cũng gây tạo thành các cấu trúc bất thường trong các ống vi thể trong quá trình phân bào, kết quả là phá vỡ các nhiễm sắc thể Tuy chưa được nghiên cứu kỹ nhưng do cơ chế tác dụng của nó, PTX được coi là chất gây ung thư và độc đối với gen PTX có thể ức chế sự tăng sinh tế bào và điều hòa đáp ứng miễn dịch [1], [162]

Tác dụng không mong muốn

Hầu hết các người bệnh dùng paclitaxel đều bị rụng tóc Gần 90% bệnh nhân bị suy tủy, khi liều càng cao, tần suất tiêm truyền càng lớn và thời gian tiêm truyền càng dài thì nguy cơ càng cao Tuy nhiên, khi dừng thuốc, bệnh nhân nhanh chóng phục hồi [1], [162]

Chỉ định, liều dùng, chống chỉ định và độc tính cấp Chỉ định

Ðiều trị ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường bằng các muối anthracyclin và muối platinum đã thất bại hay bị chống chỉ định [1], [162] Ðiều trị ung thư vú di căn khi liệu pháp thông thường với các anthracyclin đã thất bại hoặc không thích hợp [1], [162]

Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [2], [148]

Có thể tiếp tục dùng thuốc cho người bệnh bị blốc nhĩ - thất cấp I và phải theo dõi điện tâm đồ Ở người bệnh có rối loạn dẫn truyền nặng hơn thì phải ngừng dùng paclitaxel và cần điều trị trợ tim thích hợp [1], [162]

Chú ý khi pha chế

Việc pha thuốc để truyền tĩnh mạch phải do người có kinh nghiệm tiến hành, ở một phòng pha chế thích hợp, tuân thủ quy trình pha chế thuốc độc tế bào Khi pha thuốc cần phải mang găng tay và tiến hành thận trọng để tránh thuốc tiếp xúc với da và niêm mạc Nếu da bị tiếp xúc với thuốc thì phải cọ rửa kỹ da bằng nước và xà phòng; nếu niêm mạc bị tiếp xúc với thuốc thì phải dùng nước súc rửa thật kỹ [1]

1.1.2 Tổng quan về dihydroartemisinin (DHA) Công thức cấu tạo

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của DHA [14]

Công thức phân tử của DHA: C15H24O5

Tên khoa học epoxy-12H-pyrano[4,3,-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol

Khối lượng phân tử của DHA: 284,35 g/mol [29]

Tính chất lý hóa

DHA là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi, rất ít tan trong nước và trong dầu DHA tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether, cloroform

Năng suất quay cực của DHA trong dung môi cloroform [α] = 140-146° (C = 1,0026) C12 là một carbon bất đối tạo ra 2 đồng phân quang học α và β Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta chứng minh được DHA tồn tại chủ yếu dạng α, nhưng trong dạng dung dịch thì tồn tại cả 2 dạng

Nhiệt độ nóng chảy : 145 – 150°C [29]

Độ ổn định

Các dẫn chất của artemisinin đều rất không ổn định hóa học, bị thủy phân dưới sự có mặt của ion sắt, chất khử sinh học Trong 3 dẫn chất chính của artemisinin (gồm: artemether, artesunate và dihydroartemisinin), DHA là dẫn chất kém ổn định nhất [172] DHA ổn định ở pH 2 – 6; môi trường pH < 2 hoặc pH > 6 thúc đẩy sự thủy phân của DHA [131] Tạo phức với β-cyclodextrin cải thiện độ ổn định của DHA [17]

Phương pháp định lượng

Theo Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển quốc tế 2020, DHA nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột C18 (100 × 4,6 mm, 3 µm), pha động là hỗn hợp ACN và nước theo tỷ lệ 60:40 (tt/tt), bước sóng phát hiện 216 nm [29], [179] Trên thế giới, các tác giả định lượng DHA theo phương pháp HPLC trong các điệu kiện sau:

Bảng 1.1 Các nghiên cứu định lượng DHA theo phương pháp HPLC

Nghiên cứu Đối tượng định lượng Điều kiện định lượng

Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2013) [175]

Hệ 3 thành phần DHA với hydroxypropyl-β-cyclodextrin và lecithin

- Cột C18 (150×4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ 20oC

- Pha động: ACN : H2O 65:35 (tt/tt) - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 210 nm Nghiên cứu

của Wang và cộng sự (2016) [176]

Nano PLGA chứa phức hợp của DHA và phospholipid

- Hệ thống HPLC Agilent 1200 với detector DAD

- Cột Agilent XDB – C18 (150×4,6 mm, 5 µm)

- Pha động: ACN: đệm phosphate pH 3, 50:50 (tt/tt) (dung dịch NaH2PO4 điều chỉnh đến pH 3 bằng H3PO4)

- Thể tích tiêm: V=20 ml - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Bước sóng phát hiện: 210 nm Nghiên cứu

của Kefeng Liu và cộng sự (2016) [102]

Nano 8arm-PEG-DHA và TF-8arm-PEG-DHA

- Hệ thống HPLC Agilent 1200, USA - Cột C18 (250×4,6 mm, 5 µm) - Pha động: ACN : H2O 60:40 (tt/tt) - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 210 nm

Dược động học và cơ chế tác dụng Dược động học

DHA có khả năng liên kết với protein huyết tương 44-93 % Thời gian bán thải của DHA xấp xỉ 45 phút đến 1 giờ qua con đường glucuronyl hóa ở ruột và gan Thuốc được thải hoàn toàn khỏi vòng tuần hoàn trong 8-10 giờ [3] Không có sự khác biệt về các thông số dược động học theo giới tính [124]

Tác dụng không mong muốn

Một số tác dụng phụ được báo cáo sau khi uống gồm: chóng mặt, ù tai, giảm hồng cầu lưới, giảm bạch cầu trung tính, tăng enzyme gan và hiếm gặp một số bất thường về điện tim

Hiếm gặp phản ứng quá mẫn nghiêm trọng typ 1 (tỷ lệ xấp xỉ 1/3000 trường hợp) khi dùng dihydroartemisinin hay các dẫn xuất nhóm artemisinin [3]

1.1.3 Cơ chế tác dụng hiệp đồng chống ung thư khi phối hợp PTX và DHA

Phối hợp thuốc đã được sử dụng rộng rãi và trở thành lựa chọn hàng đầu để điều trị

các loại thuốc có các cơ chế tác dụng khác nhau, do đó làm giảm khả năng phát triển của các tế bào ung thư kháng thuốc Khi kết hợp các loại thuốc có tác dụng khác nhau, mỗi loại thuốc có thể được sử dụng với liều lượng tối ưu mà không gây ra tác dụng phụ không thể dung nạp Đặc biệt, điều trị kết hợp thuốc hữu ích cho những người mắc bệnh ung thư giai đoạn muộn không phù hợp với xạ trị hoặc điều trị bằng phẫu thuật (ví dụ, những người mắc bệnh ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, ung thư thực quản hoặc ung thư bàng quang không thể loại bỏ hoàn toàn bằng phẫu thuật) [147]

PTX làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các ống vi thể và làm ổn định các ống vi thể sẵn có do ức chế quá trình giải trùng hợp Trong khi đó DHA được chứng minh có tác dụng chống khối u với hai cơ chế tiêu diệt tế bào ung thư Cơ chế thứ nhất nhờ vào việc tạo ra các gốc tự do oxy hoạt tính thông qua sự phân cắt đồng nhất của cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R’) Cơ chế thứ hai thông qua sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid và sự thu lấy nước xảy ra sau đó, dẫn đến sự hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton Hai cơ chế chống ung thư trên đều cho thấy tác dụng dược lý của DHA có liên quan và phụ thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể Các gốc tự do có thể oxy hóa lipid, gây tổn thương màng tế bào, protein và ADN, gây ra sự tự chết của tế bào ung thư [35], [187] Với cơ chế tác động như trên, khi phối hợp PTX và DHA có thể giúp tăng cường tác dụng chống ung thư hơn so với dùng từng dược chất đơn lẻ

Một trong những cơ chế nữa được xem xét khi phối hợp thuốc là phối hợp các thuốc tác động lên giai đoạn phát triển khác nhau của tế bào ung thư Tế bào có 4 giai đoạn phát triển chính gồm: G0 = giai đoạn nghỉ (không tăng sinh tế bào); G1 = giai đoạn tổng hợp tiền DNA; S = tổng hợp DNA; G2 = sau tổng hợp DNA; M1 = phân bào có tơ Thời gian nhân đôi là thời gian cần thiết để một tế bào hoàn thành một chu kỳ phân chia và tạo ra 2 tế bào mới Các tế bào ung thư, đặc biệt là những tế bào có nguồn gốc từ tủy xương hay hệ bạch huyết có thể có thời gian nhân đôi ngắn hơn và thường có tỷ lệ tế bào ở pha G0 (pha nghỉ) ít hơn Tế bào u ban đầu tăng sinh theo quy luật hàm số mũ sau đó đạt đến giới hạn khi số tế bào chết đi gần như tương đương với số tế bào mới sinh ra Tốc độ tăng sinh tế bào chậm dần có thể liên quan tới sự cạn kiệt chất dinh dưỡng và oxy vốn cần thiết cho sự tăng trưởng nhanh của khối u Nhiều loại thuốc chống ung thư,

chẳng hạn như thuốc chống chuyển hóa như PTX, có hiệu quả nhất khi các tế bào đang ở giai đoạn phân chia mạnh Một số loại thuốc chỉ có tác dụng trong một giai đoạn cụ thể của chu kỳ tế bào và cần duy trì sử dụng trong thời gian dài để ngăn các tế bào phân chia trong giai đoạn nhạy cảm tối đa như artemisinin và dẫn xuất Artemisinin và dẫn chất được biết làm ngăn chặn sự phân chia tế bào ở giai đoạn sớm, cụ thể là giai đoạn G1/G2, trong khi PTX lại tác động ở pha trung gian Đây là cơ sở quan trọng để thiết lập thử nghiệm đánh giá tác dụng chống ung thư khi phối hợp hai thuốc với nhau [71] Những nỗ lực đã được thực hiện trong thế kỷ qua để phát triển chiến lược đánh giá tác dụng hiệp đồng khi nghiên cứu phối hợp thuốc Trong đó phần mềm Compusyn của Chou và Talalay cho chỉ số CI thống nhất, tin cậy và được trích dẫn nhiều nhất Tác dụng hiệp đồng của các thuốc đã được xác định bằng chỉ số phối hợp (CI) theo phương pháp Chou và Talalay (CI < 1,0 hiệp đồng tăng cường, CI = 1,0 là hiệp đồng cộng và CI > 1,0 đối kháng)

Trong nước và trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về việc phối hợp PTX và DHA Cụ thế, vào năm 2014, Yi Chen và các cộng sự nghiên cứu cho kết quả DHA tác dụng hiệp đồng với paclitaxel trong ức chế tế bào ung thư buồng trứng do cùng tác dụng tại kháng thể FOXM1 thông qua con đường truyền tin Raf/MEK/MAPK [26] Yin Chen và các cộng sự đã chứng minh DHA làm tăng khả năng ức chế của PTX và cisplatin trên các tế bào ung thư buồng trứng SKOV3 và OVCAR3 Tế bào được ủ với riêng từng hoạt chất paclitaxel/cisplatin/DHA hoặc kết hợp trong 72 giờ, sau đó độc tính trên tế bào được đánh giá bởi thử nghiệm sulfarodamin B Kết quả nghiên cứu cho thấy DHA có tác dụng hiệp đồng tăng cường với PTX (giá trị CI từ 0,6 đến 0,73) và có tác dụng hiệp đồng cộng cùng với cisplatinum (giá trị CI từ 0,98 đến 1,11) trên tế bào SKOV3 Ngoài ra liều thấp DHA (0,5 µM) làm tăng đáng kể tác dụng hiệp đồng tăng cường của sự kết hợp paclitaxel và cisplatinum trên tế bào SKOV3 (giá trị CI từ 0,4 đến 0,83) [26] Năm 2017, Trần Ngọc Bảo và các cộng sự đã tiến hành bào chế nano chứa artesunat (ART) phối hợp với PTX và nghiên cứu tác dụng hiệp đồng của 2 hoạt chất đó trên dòng tế bào ung thư vú Tác dụng hiệp đồng của hai thuốc được xác định bằng chỉ số phối hợp (CI), dựa vào đó để lựa chọn tỷ lệ ART và PTX tốt ưu nhất Kết quả cho thấy tất cả

giữa 2 hoạt chất Nghiên cứu cũng thấy tiểu phân nano ART-PTX có độc tính tế bào mạnh trên ba dòng tế bào ung thư vú Sự kết hợp của ART và PTX cho kết quả đầy hứa hẹn đối với liệu pháp chống ung thư, đặc biệt là điều trị ung thư vú [165]

Năm 2018, Zin Tao và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống di căn của docetaxel

(DTX) phối hợp với DHA Tác giả tiến hành xác định độc tính in vitro với DTX và DTX

phối hợp với DHA ở dạng tự do với nồng độ DTX thay đổi từ 0,001 đến 100 µg/mL Kết quả cho thấy ở nồng độ dưới 10 µg/mL, DTX gây độc tế bào 4T1 nhẹ sau 48h, trong khi đó DTX phối hợp với DHA làm tăng đáng kể tác dụng độc trên dòng tế bào 4T1 Giá trị IC50 của DTX và của DTX phối hợp DHA trên dòng tế bào 4T1 lần lượt là 86,7; 56,7 µg/mL Kết quả này cho thấy sự phối hợp giữa DTX và DHA gây ra tác dụng hiệp đồng trên tế bào 4T1 Cơ chế của tác dụng hiệp đồng này liên quan tới việc giảm biểu hiện của p-AKT, NF-kB và MMP-2 [165]

Năm 2020, Zhe Li và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của artesunat đối với chức năng của lysosome và mối quan hệ của nó với việc kháng thuốc ở các tế bào ung thư Kết quả cho thấy chức năng của lysosome được tăng cường đáng kể ở tế bào kháng thuốc paclitaxel (A549/TAX) Khi ủ A549/TAX với artesunat (2,5 – 50 µM) cho thấy chức năng lysosome của tế bào bị ức chế và mức độ ức chế phụ thuộc vào liều artesunat, từ đó gây ra quá trình chết tế bào Đồng thời tế bào A549/TAX có chức năng lysosome càng được tăng cường thì artesunat càng gây ức chế mạnh hơn Kết quả trên cho thấy artesunat hoặc các chất có khả năng ức chế chức năng lysosome khác có tiềm năng tác dụng trên tế bào ung thư đã kháng thuốc gây ra bởi chức năng lysosome tăng cường [97]

Dựa trên những dữ liệu thực nghiệm được công bố, DHA và dẫn xuất cho thấy tác dụng hiệp đồng chống ung thư với nhóm taxol DHA có độc tính thấp và sự kết hợp của chúng với thuốc hóa trị cổ điển như PTX có thể làm giảm tác dụng không mong muốn ở các mô bình thường, nhưng lại tăng hiệu quả điều trị tế bào ung thư

1.2 Tổng quan về tiểu phân nano lipid – polyme 1.1.4 Khái niệm tiểu phân nano lipid – polyme

Trong vài thập kỷ gần đây, ngày càng có nhiều chế phẩm hệ nano được thử nghiệm lâm sàng – bao gồm: liposome, nano polyme, nanolipid rắn, dendrimers, nano kim loại (vàng, bạc, silica), trong đó một số lượng nhỏ đã được chấp nhận sử dụng trong lâm sàng Trong số các hệ tiểu phân đó, hệ tiểu phân nano thể hiện tính ưu việt nhất là liposome và nano polyme [123]

Năm 1986, Dior giới thiệu liposome làm mỹ phẩm trên thị trường nhưng vài năm sau liposome đã được mở rộng ra thị trường dược phẩm Liposome là những vi cầu hoặc nano cầu có hai lớp lipid lưỡng cực, mang cả thuốc kỵ nước và ưa nước, giúp bảo vệ dược chất khỏi môi trường bên ngoài Liposome được ứng dụng rộng rãi trong vận chuyển thuốc vì tính tương thích sinh học và an toàn thuận lợi của chúng Một số công thức liposome được đưa ra thị trường như liposome daunorubicin (DaunoXome), liposome amphotericin B (Ambisome), liposome morphine (DepotDur) Nhưng việc ứng dụng của liposome bị hạn chế vì hiệu suất thấp đối với các thuốc ít tan trong nước Trong khi đó nano polyme có khả năng mang các thuốc kỵ nước cao hơn so với liposome, đồng thời việc giải phóng thuốc và kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu có thể được kiểm soát bằng cách chọn polyme thích hợp Tuy nhiên, nano polyme vẫn gặp phải vấn đề về thời gian tuần hoàn cũng như tính tương thích sinh học

Do các hạn chế của liposome và nano polyme, nano lipid-polyme có nhiều ưu điểm hơn so với liposome và nano polyme được ra đời Nano lipid-polyme là một hệ vận chuyển thuốc với hiệu suất mang thuốc cao, khả năng kiểm soát giải phóng thuốc tốt, ổn định khi phân phối trong hệ tuần hoàn, phân bố đến mô, tế bào, phân tử đích [123] Nano lipid-polyme là hệ nano chứa đồng thời 2 thành phần polyme và lipid chứa dược chất ở kích thước nano, kết hợp các tính năng của nano polyme và liposome Cấu trúc của nano polyme-lipid được thể hiện ở Hình 1.3

Hình 1.3 Cấu trúc lõi polyme vỏ lipid ngoài cùng gắn PEG của tiểu phân nano lipid – polyme [26]

Loại hệ nano này thường bao gồm ba thành phần chức năng riêng biệt: (i) lõi polyme kỵ nước, nơi thuốc ít tan trong nước kém được bao gói; (ii) lớp lipid bao quanh lõi hoạt động như một lớp vỏ có tương thích sinh học cao, đóng vai trò là hàng rào phân tử để lưu giữ thuốc bên trong lõi; và (iii) lớp tàng hình polyme ưa nước bên ngoài vỏ lipid để tăng cường độ ổn định của hệ nano, tránh nhận diện đại thực bào và tăng thời gian tuần hoàn trong máu [123]

1.1.5 Phân loại tiểu phân nano lipid – polyme

Dựa trên sự sắp xếp của lipid và polyme, hệ nano này được phân loại thành các nhóm khác nhau Trong đó lipid và polyme có thể tồn tại theo các cấu trúc:

- Lõi polyme ở trong, lớp vỏ lipid ở ngoài - Lõi lipid ở trong, lớp vỏ polyme ở ngoài - Phân tán đồng thời

Hình 1.4 Phân loại nano lipid – polyme gồm: (A) Hệ lipid phân tán trong cốt polyme; (B) hệ lõi polyme, vỏ lipid; (C) hệ lipid – polyme – lipid; (D) hệ bao màng

sinh học; và (E) hệ polyme bao liposome [134] i Hệ lõi polyme, vỏ lipid

Đây là loại nano được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm Cấu trúc của hệ gồm phần lõi là polyme được bao phủ bởi lớp lipid đơn hoặc lipid kép Khả năng mô phỏng sinh học của lipid và lợi thế cấu trúc của lõi polyme phân hủy sinh học cùng tạo ra hệ mang thuốc tiên tiến Hệ được ứng dụng đầu tiên trong thiết bị y sinh và chế phẩm sinh học [161] Tiếp theo đó hệ cũng được ứng dụng để vận chuyển thuốc, protein, gen, kháng thể và vaccin với liều lượng giảm, độc tính thấp và sinh khả dụng tăng Khả năng duy trì giải phóng dược chất phụ thuộc vào nồng độ, loại và độ dày của polyme ở lõi và lipid ở vỏ được sử dụng [79]

cải thiện khả năng tải thuốc ion này Tính ổn định của hệ được tăng cường hơn nữa bởi lớp vỏ lipid bên ngoài [153]

ii Hệ bao màng sinh học

Phương pháp tiếp cận khác đã được nghiên cứu trong trường hợp hệ nano lõi polyme

vỏ lipid không đảm bảo độ ổn định in vivo đó là sử dụng màng tế bào hồng cầu (RBC)

để bao gói thêm lớp lipid bên ngoài Việc bao gói này làm cho hệ nano có tính tương

thích sinh học tốt, đảm bảo độ ổn định in vivo tối đa, đồng thời hàng rào lipid dày đặc

giúp kéo dài giải phóng dược chất Tuy nhiên, do hồng cầu từ các nguồn máu khác nhau chứa các kháng nguyên khác nhau, nên có thể xảy ra phản ứng chéo [153]

iii Hệ vỏ polyme bao lõi liposome

Để bảo vệ liposome cũng như cải thiện độ ổn định, giảm rò rỉ thuốc, tăng cường giải phóng thuốc tới đích, liposome được bao phủ polyme ở bên ngoài Đầu tiên liposome được hình thành, sau đó chúng được bao phủ lớp polyme ở ngoài bề mặt, do đó sự giải phóng thuốc có thể được biến đổi Lee và cộng sự đã gói doxorubicin và cisplatin trong cùng tiểu phân nano nhằm đưa thuốc tới tế bào ung thư [95] Đầu tiên Doxorubicin được gói trong liposome, tiếp đó acid polyacrylic và liên kết diamine liên kết chéo để tạo thành lớp lưới polyme bao quanh liposome doxorubicin Nhóm carboxylic tự do bên ngoài lớp vỏ được gắn với cisplatin Hệ nano tạo thành ít gặp các vấn đề về độ ổn định, đồng thời giảm liều dùng cũng như tác dụng không mong muốn cũng được giảm đáng kể [95]

iv Hệ lipid phân tán trong cốt polyme

Hệ nano này có cốt polyme trong đó các phân tử lipid được phân bố ngẫu nhiên trong cốt polyme [134]

v Hệ lipid – polyme – lipid

Loại hệ nano này có lớp lipid bao gồm PEG-lipid và lipid trung tính bao quanh một lớp polyme bên trong, lớp polyme này có thể tương tác với lớp lipid cation So với nano polyme, do lớp lipid cation bên trong chứa các thuốc anion nên nano này có thể mang được đồng thời hai loại thuốc Ví dụ, việc đồng phân phối cả si-RNA và thuốc phân tử nhỏ vào trong cùng một hệ nano được thực hiện để gây độc tế bào ung thư kháng thuốc [134]

1.1.6 Các tá dược hay sử dụng trong tiểu phân nano lipid – polyme

Polyme được sử dụng nhiều nhất là polyme tương thích sinh học bao gồm: acid poly(lactic-co-glycolic) (PLGA), dextran sulfat, polyethylenimin, polyme có nguồn gốc từ dầu đậu nành,… Còn lipid được sử dụng là những lipid đã được phép sử dụng trong dược phẩm như phospholipid, polyethylen glycol (PEG)–lipid, lipid chiết xuất từ sản phẩm thực phẩm (lecithin) hoặc được tìm thấy trong cơ thể (acid béo nội sinh) [189] Sau đây là 2 tá dược PLGA đại diện cho nhóm tá dược polyme và lecithin đại diện nhóm tá dược lipid

Vài nét sơ lược về acid poly(lactic-co-glycolic) (PLGA)

i Cấu trúc và tính chất của PLGA

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp và cấu trúc hóa học của PLGA [59]

PLGA là một copolyme được tổng hợp từ hai monome khác nhau đó là acid lactic (LA) và acid glycolic (GA) với tỷ lệ hai acid này khác nhau (Hình 1.5)

Tỷ lệ của poly (acid lactid) (PLA) và poly (acid glycolid) (PGA) sử dụng cho quá trình tổng hợp polyme khác nhau sẽ thu được các PLGA khác nhau; ví dụ PLGA 75:25 thì sẽ dùng 75% acid lactic và 25 % acid glycolic trong quá trình tổng hợp Cơ chế tổng hợp khác nhau và các thông số kiểm soát trong quá trình tổng hợp ảnh hưởng mạnh đến tính chất lý-hóa của PLGA thu được sau quá trình tổng hợp [59] PLGA thừa hưởng các đặc tính nội tại của các monome cấu thành, cùng với khối lượng phân tử polyme, ảnh

của chúng PGA là polyme ưa nước dạng tinh thể, trong khi đó PLA cứng hơn và kỵ nước; do đó PLGA trùng hợp với tỷ lệ PLA cao hơn ít ưa nước hơn, hấp thụ ít nước hơn và do đó thời gian phân hủy dài hơn [146] Trong nước, PLGA phân hủy sinh học bằng cách thủy phân liên kết ester giải phóng ra acid lactic và acid glycolic Acid lactic và acid glycolic đều được chuyển hóa qua chu trình Kreb’s cho sản phẩm cuối cùng là khí carbonic và nước, riêng acid glycolic một phần được đào thải nguyên dạng qua thận, nên hai acid này ít gây độc tính đối với cơ thể [112] Thời gian phân hủy của PLGA thay đổi tùy thuộc vào khối lượng phân tử và tỷ lệ đồng trùng hợp PLGA hòa tan trong một số dung môi phổ biến như: các dẫn chất clorid, tetrahydofuran, aceton, dicloromethan hoặc ethyl acetat Tất cả những đặc tính của PLGA đã được khai thác trong một số ứng dụng trong việc tăng độ tan, tăng thời gian lưu, tăng hiệu quả đưa thuốc nói chung, và trong hệ phân phối thuốc nói riêng PLGA được FDA Hoa Kỳ và cơ quan y tế Châu Âu (EMA) chấp thuận cho việc bào chế các dạng thuốc ứng dụng trên cơ thể con người [38]

PLGA là một trong những polyme được nghiên cứu nhiều nhất trong thiết kế và xây dựng hệ mang thuốc do khả năng phân hủy sinh học, tính an toàn sinh học, tương thích sinh học cũng như linh hoạt trong thiết kế công thức PLGA có thể bào chế tạo ra các hình dạng, kích thước và bao gói các phân tử với kích thước khác nhau Kích thước của tiểu phân nano có thể được xác định ở một mức độ nhất định bởi nồng độ polyme được sử dụng để tổng hợp chúng [59] Đặc biệt, PLGA làm chất mang trong tiểu phân nano giúp tối ưu hóa sinh khả dụng của thuốc được bao gói do bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy nhanh chóng trong dịch sinh học, giúp vận chuyển thuốc tới đích hoặc tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập nội bào, dẫn đến giảm tác dụng không mong muốn của thuốc [38]

Tiểu phân nano PLGA (PNP) được ứng dụng cho nhiều nhóm thuốc như: rối loạn tế thần kinh, ung thư, chống viêm, tác động lên hệ thống miễn dịch, tim mạch, thuốc có nguồn gốc sinh học như protein, vaccine, acid nucleic Hơn nữa, PNP có thể dùng được qua đường tiêm, đường uống [121], đường hít [49], tạo sự đa dạng trong việc lựa chọn đường dùng để đảm bảo sinh khả dụng tối ưu của thuốc Sự phát triển của PNP được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu được trình bày trong các tài liệu chuyên ngành,

đồng thời được phát triển tiếp tục trên thử nghiệm lâm sàng hoặc được FDA chấp thuận đưa ra thị trường Các PNP được FDA chấp thuận được liệt kê trong bảng dưới đây:

Bảng 1.2 Các hệ vi tiểu phân PLGA trên thị trường

Biệt dược

Chất mang/ hệ

Hoạt chất Chỉ định phê duyệt

Nhà sản xuất

Năm phê duyệt

TLTK

Lupron Depot®

Abbot Laboratorie,

Takeda

1989

[18]

Sandostatin Lar®

PLGA/ vi cầu

Octreotide

acetate To đầu chi Novartis 1998 [190]

PLGA/ vi cầu

Triptorelin pamoate

Ung thư tuyến

tiền liệt Allergen 1998

[190]

PLGA/ vi cầu

Minocycline HCl

Hỗ trợ trong viêm nha chu

methyl-2-Leuprolide acetate

Ung thư tuyến

tiền liệt Tolmar 2002

[23]

Risperdal Consta®

PLGA/ vi

cầu Risperidone

Tâm thần phân liệt

Janssen Pharmaceuti

PLGA/ vi cầu

Exenatide synthetic

Tiểu đường tuyp 2

AstraZeneca

[190]

Signifor Lar®

PLGA/ vi cầu

Pasireotide

pamoate To đầu chi Novartis 2014 [190]

PLGA/ vi cầu

Triamcinolone

Viêm xương khớp

Flexion therapeutics

Inc

2017

[122]

Bydureon Bcise®

PLGA/ vi

cầu Exenatide

Tiểu đường tuyp 2

AstraZeneca

[190]

Triptodur Kit®

PLGA/ vi cầu

Triptorelin

pamoate Dậy thì sớm Arbor 2017

[190]

PLGA/ tiểu phân

nano

Buprenorphine

Nghiện các chất dạng thuốc phiện

Với các nhược điểm đó của PLGA, các nhà khoa học đã nghiên cứu nhiều biện pháp, trong đó có biện pháp phối hợp với lipid, tạo hệ nano với đặc điểm hóa lý linh hoạt giảm bớt những hạn chế của nano polyme PLGA, tăng tác dụng điều trị và giảm thiểu tác dụng không mong muốn [111], [114] Nhiều loại lipid đã được xác định để cải thiện đáng kể tiềm năng điều trị của PNP [75] Hệ nano PLGA-lipid thể hiện sự kết hợp giữa đặc tính sinh học của lipid và lợi thế cấu trúc của các hạt nano Hệ nano có tính ổn định

tốt, hiệu suất mang thuốc cao, đồng thời lớp lipid phủ bên ngoài làm chậm sự phân hủy PLGA bằng cách hạn chế sự thấm của nước vào trong, do đó tạo điều kiện cho sự giải phóng thuốc đồng đều và liên tục Ngoài ra, lớp bao lipid bên ngoài lớp polyme mô phỏng giống như giao diện của lớp bề mặt sinh học, giúp tăng khả năng nhập bào và tăng nồng độ thuốc tại mô đích [6]

Liu và các cộng sự đã chứng minh rằng nano lipid-polyme với lõi PLGA và vỏ được hình thành từ 1,2-dilauryl phosphatidylcholin khi được nạp coumarin cho khả năng nhập bào hiệu quả hơn khi so sánh với nano polyme chỉ sử dụng PLGA [104] Trong số các lipid khác nhau, lecithin đã nhận được nhiều quan tâm của các nhà khoa học vì nó hiện diện nhiều trong cơ thể như một thành phần thiết yếu của màng tế bào Nó được nghiên cứu rộng rãi trong nghiên cứu phân phối thuốc vì tính tương thích sinh học và đã được chấp nhận sử dụng trong các đường dùng thuốc chính như tiêm, uống, trên da Năm 2016, Seby Elsy Varghese và cộng sự đã bào chế nano polyme lipid (Lecithmer®) sử dụng chất mang là PLGA và lecithin Cấu trúc vỏ lõi của Lecithmer được thể hiện rõ ràng từ hình ảnh cryo-TEM Lecithmer làm hệ mang hai dược chất là Daunorubicin (DNR) và lornoxicam (LNX) đã được đánh giá về hoạt tính chống ung thư và chống viêm Lecithmer mang DNR và LNX có KTTP trung bình lần lượt là ∼335 nm và

∼282,7 nm Quá trình giải phóng DNR in vitro từ Lecithmer chậm hơn so với nano

PLGA, đồng thời DNR giải phóng ở pH 5,5 (80,96 %) cao hơn đáng kể so với pH 7,4 (55,95%) DNR Lecithmer cho thấy khả năng gây độc tế bào vượt trội trên các tế bào K562 hồng cầu ở người Nghiên cứu dược động học ở chuột Wistar khi sử dụng DNR-Lecithmer đường tiêm cho thể tích phân bố cao hơn, tốc độ thải trừ thấp hơn và thời gian bán thải dài hơn (81,68 L, 0,3535 giờ-1, 1,96 giờ tương ứng) so với DNR ở dạng dung dịch (57,46 L, 0,4237 giờ-1, 1,635 giờ) Với những kết quả thu được, Lecithmer được coi là một hệ nano đầy hứa hẹn để vận chuyển thuốc qua đường tiêm [174]

Vài nét sơ lược về lecithin (LEC)

Lecithin là một từ phổ biến để chỉ phospholipid (PL) tự nhiên [135] Lecithin là một hỗn hợp các phosphatid không tan trong aceton, bao gồm chủ yếu là phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylinositol (PI),

Thành phần của lecithin thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của lecithin và mức độ tinh chế Ví dụ, lecithin lòng đỏ trứng chứa 80,5% phosphatidylcholin và 11,7% phosphatidylethanolamin, trong khi lecithin đậu nành chứa 21% phosphatidylcholin, 22% phosphatidylethanolamin và 19% phosphatidylinositol, cùng với các thành phần khác [171], [152]

Trong đó, R1, R2 là các gốc acid béo

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của PC trong lecithin

Lecithin tan trong các dung môi ether, cloroform và các acid béo, tan ít trong benzen, không tan trong các dung môi phân cực [152]

Lecithin được ứng dụng rỗng rãi với vai trò nhũ hóa, gây phân tán, ổn định trong các chế phẩm bôi ngoài da, uống hoặc tiêm Ngoài ra, lecithin còn thường được sử dụng trong các hệ nano vận chuyển thuốc khác nhau như liposome, micell, nano lipid rắn, nano lipid-polyme và nhũ tương nano [152], [174]

1.1.7 Phương pháp bào chế tiểu phân nano lipid – polyme

Phương pháp bào chế tiểu phân nano lipid – polyme bao gồm: phương pháp bào chế hai bước và phương pháp bào chế một bước

Phương pháp bào chế hai bước

Phương pháp bào chế hai bước là phương pháp đầu tiên được sử dụng đề bào chế nano lipid-polyme Khi bào chế nano lipid-polyme, các nano polyme đã được tạo ra sẵn sẽ được phối hợp, bao bọc bởi các lớp lipid thông qua tương tác tĩnh điện hoặc hấp phụ bề mặt

Phương pháp bào chế hai bước được phân thành hai loại:

A) Phối hợp nano polyme trực tiếp vào màng lipid đã được làm khô

B) Phối hợp nano polyme với các liposome đã được tạo sẵn trước đó bằng phương pháp hydrat hóa màng film

Trong cả hai loại này, nano được tạo thành nhờ năng lượng bên ngoài tạo thành từ quá trình xoáy lắc và/hoặc siêu âm hoặc gia nhiệt ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của thành phần lipid Trên thực tế, do lipid có bản chất sơ nước hay các chất mang có bản chất lipid thường không có thế zeta cao nên cần phối hợp thêm các chất diện hoạt ion hóa để thuận lợi cho quá trình hình thành các tương tác tĩnh điện, tạo cấu trúc nano polyme-lipid [6]

Mặc dù phương pháp bào chế hai bước thiết kế được hệ mang PLGA-lipid thông minh để vận chuyển các loại thuốc khác nhau nhưng có một số nhược điểm không thể tránh khỏi Việc yêu cầu chuẩn bị riêng biệt bước tạo hạt nano PLGA và bước hình thành sẵn liposome/nanocapsule, dẫn tới mất nhiều thời gian và tốn năng lượng, tăng chi phí sản xuất Trong bối cảnh này, việc điều chỉnh phương pháp hai bước thành phương pháp một bước không cần phải có tiểu phân nano polyme tạo sẵn là phương pháp thay thế phổ biến và hiệu quả nhất [60] Ngoài ra, trong quá trình bào chế, dược chất có thể bị rò rỉ ra môi trường bên ngoài (đặc biệt là các dược chất tan trong nước) trước khi lớp vỏ lipid được hình thành, nên thời gian bào chế kéo dài sẽ dẫn đến sự giảm hiệu suất nano hóa [28]

Ngoài hai phương pháp quy ước đã đề cập ở trên, một số phương pháp khác cũng đã được thực hiện để bào chế nano Ví dụ, nano polyme có kích thước khoảng 400 – 500 nm bào chế bằng phương pháp phun sấy, được phân tán trong DCM chứa lipid (như tripalmitin, tristearin, cetyl alcol) Hỗn dịch này sau đó được phun sấy lại để tạo các tiểu phân có kích thước trung bình 0,9 – 1,2 µm [69]

Phương pháp bào chế một bước

Phương pháp bào chế một bước chỉ yêu cầu phối hợp lipid và polyme, sau đó các phân tử tự định hình để hình thành cấu trúc nano, không đòi hỏi nano polyme và/hoặc liposome có sẵn như phương pháp bào chế hai bước

Phương pháp sử dụng phổ biến nhất là phương pháp kết tủa nano và nhũ hóa bốc hơi

diện hoạt ion hoặc không ion (PVA, DMAB, poloxamer, Tween 80…) làm chất ổn định trong quá trình bào chế nano giống như vai trò của chúng trong nano polyme thông thường [123]

Đối với phương pháp kết tủa nano, polyme và dược chất được hòa tan trong dung môi đồng tan với nước (ví dụ aceton, EtOH), còn lipid/lipid-PEG được phân tán trong nước Phải làm nóng pha nước cao hơn nhiệt độ chuyển từ gel sang lỏng để lipid phân tán đồng nhất Sau đó dung dịch polyme được thêm từ từ vào pha nước, kết hợp với đồng nhất hóa Do quá trình khuếch tán dung môi, polyme bị kết tủa lại, lipid sẽ tự động kết tập quanh các nano polyme Đầu sơ nước của các lipid sẽ kết tập với tiểu phân polyme, ngược lại, đầu thân nước sẽ hướng ra phía pha nước, tạo ra nano lipid-polyme Lipid sử dụng trong phương pháp này thường là lipid-PEG, khi đó phần lipid sẽ hướng vào trong cấu trúc nano, phần đầu PEG sẽ hướng ra phía pha nước Chỉ tiêu quan trọng nhất trong công thức là tỷ lệ khối lượng lipid và polyme

Đối với phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi, được chia thành 2 cách là phương pháp nhũ hóa đơn và phương pháp nhũ hóa kép

Phương pháp nhũ hóa đơn được sử dụng cho những dược chất không hòa tan trong nước Trong phương pháp này, pha dầu có chứa polyme/lipid và dược chất được nhũ hóa trong pha nước chứa lipid hoặc dung dịch chất diện hoạt trong điều kiện siêu âm hoặc khuấy liên lục, một nhũ tương D/N được hình thành với lipid tự kết tập quanh lõi polyme tương tự như trong phương pháp kết tủa nano Tiếp theo, lõi polyme được hình thành do sự bay hơi của dung môi hữu cơ và lipid bao quanh lõi polyme đó [123], [28], [22]

Phương pháp nhũ hóa kép được sử dụng cho các loại dược chất hòa tan trong nước Đầu tiên, pha nước chứa dược chất được nhũ hóa trong pha dầu chứa polyme và lipid để tạo nhũ tương nước/dầu Nhũ tương nước/dầu tiếp tục được nhũ hóa trong pha nước chứa lipid-PEG, nhũ tương kép nước/dầu/nước được hình thành Sau đó, dung môi pha dầu được bay hơi để tạo ra nano [123]

1.1.8 Phương pháp tinh chế nano bằng cột lọc tiếp tuyến

Bất kể phương pháp bào chế, sản phẩm nano vẫn bị lẫn một lượng tạp chất nhất định, một số trong đó có thể gây độc và có thể xuất hiện trong thành phẩm cuối cùng Các tạp chất này bao gồm dung môi hữu cơ như dichloromethane, chất hoạt động bề mặt, chất nhũ hóa hoặc chất ổn định, dư lượng monome, muối và phân tử polymer khối lượng phân tử lớn [100].Sự hiện diện của các tạp chất này không chỉ gây ra hiện tượng không dung nạp mà còn cũng có thể làm thay đổi các đặc tính hóa lý và giải phóng của nano Do đó, việc tinh chế nano là một bước cần thiết để kiểm soát chất lượng và đặc tính của nano

Một loạt các phương pháp đã được sử dụng để tinh chế nano Kỹ thuật ly tâm hoặc siêu ly tâm thường được sử dụng để loại bỏ các dung môi hữu cơ, thuốc tự do hoặc chất ổn định tự do như polyvinyl (PVA) và chất điện giải Ly tâm hoặc siêu ly tâm, kết hợp với rửa các hạt nano bằng môi trường thích hợp như nước khử ion, là phương pháp phổ biến nhất để loại bỏ một lượng lớn tạp chất trong quá trình [88], [137] Tuy nhiên, tác động của lực ly tâm có thể gây ra hiện tượng vón cục và nano khó phân tán lại Đồng thời, nano nổi trên bề mặt cũng bị thất thoát nếu lực ly tâm không đủ, dẫn đến hiệu suất thu được thấp [96].Kỹ thuật lọc tiếp tuyến là một phương pháp lọc mới khắc phục được nhược điểm của các phương pháp lọc trên Mặc dù nghiên cứu về quy trình này còn hạn chế nhưng kỹ thuật này có tiềm năng trở thành một kỹ thuật tinh chế hiệu quả với tác động bất lợi tối thiểu lên kích thước hạt nano và khả năng nạp thuốc

Lọc tiếp tuyến là một kỹ thuật lọc trong đó dung dịch ban đầu đi dọc theo bề mặt của cột lọc Sự chênh lệch áp suất giữa hai bên màng lọc sẽ đẩy các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn lỗ lọc đi qua cột lọc Các tiểu phân có kích thước lớn hơn lỗ lọc được giữ lại và đi dọc theo cột, chảy ngược trở lại bình chứa nguyên liệu

(a) (b)

Hình 1.7 Cơ chế lọc của cột lọc tiếp tuyến (a) Nguyên tắc hoạt động của thiết bị lọc tiếp tuyến,

(b) Nguyên tắc lọc của màng lọc tiếp tuyến

Các thông số trong quá trình lọc tiếp tuyến gồm: thông số của màng lọc (vật liệu tạo màng, kích thước lỗ lọc, chiều dài cột…), áp suất lọc…

1.1.9 Tính chất và một số chỉ tiêu đánh giá tiểu phân nano

Hệ tiểu phân nano là hệ siêu vi tiểu phân, mắt thường không nhìn thấy được Trong khi đó thì các tính chất và đặc điểm của tiểu phân lại gắn rất chặt với sự phân bố và tác dụng của tiểu phân trong cơ thể Vì vậy kiểm soát, đánh giá được tính chất của hệ tiểu phân trong quá trình bào chế và sử dụng là hết sức quan trọng [9]

Hình thái

Đây là thông số quan trọng ảnh hưởng đến đặc tính lý học của hệ như hình dạng, bề mặt và phân bố không gian Hình dạng bên ngoài của tiểu phân nano được quan sát bằng các kính hiển vi điện tử và quang phổ hiện đại như sau [9]:

Kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning electron microscopy) là một phương pháp để quan sát trực tiếp các tiểu phân nano, chụp được ảnh tiểu phân có kích thước 10 nm,