Nghiên cứu chế tạo và đánh giá khả năng chống oxy hóa của hệ nano taxifolin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Phan Thị Thủy NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA HỆ NANO TAXIFOLIN Chuyên ngành: Vật lý chất rắn Mã số: 44 01 04 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH VẬT LÝ CHẤT RẮN NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thanh Bình Hà Nội – 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu tơi dựa tài liệu, số liệu tơi tìm hiểu, đo đạc nghiên cứu hướng dẫn TS Nguyễn Thanh Bình Vì vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan nhất, không chép bất hợp pháp từ nguồn Việc tham khảo nguồn tài liệu trích dẫn theo quy định Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, sai, hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Học viên cao học Phan Thị Thủy ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến TS Nguyễn Thanh Bình dành cho định hƣớng khoa học hiệu quả, động viên giúp đỡ tận tình suốt trình thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi sở đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ Viện Vật Lý - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, quan mà tơi cơng tác q trình thực luận văn Luận văn đƣợc thực với hỗ trợ kinh phí Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, mã số: KHCBVL.03/20-21 Công việc thực nghiệm đƣợc thực Trung tâm Vật lý ứng dụng Thiết bị khoa học, Viện Vật Lý Cuối cùng, muốn gửi tới tất ngƣời thân gia đình, đồng nghiệp bạn bè lời cảm ơn chân thành Chính tin yêu mong đợi ngƣời tạo động lực cho thực thành công luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Học viên cao học Phan Thị Thủy iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hoạt chất Taxifolin hoạt tính sinh học bật 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Cấu trúc hóa học 1.1.3 Mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính 1.1.4 Các nghiên cứu giới hoạt tính sinh học Taxifolin 1.2 Một số phƣơng pháp chế tạo nano Taxifolin 1.2.1 β-cyclodextrin phƣơng pháp tạo phức hợp với TAX 1.2.1.1 Cấu trúc β-CD [19] 1.2.1.2 Độc tính -CD 1.2.1.3 Đặc tính tạo phức -CD [19] 1.2.1.4 Phƣơng pháp điều chế nano từ -CD phƣơng pháp phối trộn (nghiền)… … 1.2.2 Hệ nano tự nhũ hóa (Self-nanoemulsifying drug delivery systemSNEDDS) [22] 10 1.2.2.1 Khái niệm hệ nano tự nhũ hóa 10 1.2.2.2 Thành phần hệ nano tự nhũ hóa 11 1.3 Phƣơng pháp đánh giá khả chống gốc tự ABTS 12 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 15 2.1 Tổng hợp hệ nhũ tƣơng nano TAX 15 2.1.1 Hóa chất dụng cụ thực nghiệm 15 2.1.2 Quy trình tổng hợp hệ nhũ tƣơng nano 15 2.2 Tổng hợp chế tạo hệ phức nano TAX – β-CD 16 2.2.1 Hóa chất dụng cụ thực nghiệm 16 2.2.2 Quy trình tổng hợp hệ phức nano rắn 16 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu khảo sát tính chất vật liệu 17 2.3.1 Phƣơng pháp hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HR-TEM) 17 2.3.2 Phƣơng pháp tán xạ ánh sáng động DLS [25] 18 2.3.3 Phƣơng pháp phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) [26] 19 2.3.4 Xác định hàm lƣợng TAX hệ nano 20 2.3.5 Khảo sát độ ổn định hệ nano nƣớc cất 21 iv 2.4 Đánh giá khả chống gốc tự ABTS hệ nano 22 2.4.1 Pha dung dịch thuốc thử mẫu đo hoạt tính 22 2.4.2 Tiến hành phản ứng xác định hoạt tính 23 2.4.3 Cơng thức tính 24 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Khảo sát đặc tính vật lý hệ nano 26 3.1.1 Kết đánh giá hình thái cấu trúc tiểu phân 26 3.1.2 Kết tính toán hàm lƣợng TAX hệ nano 28 3.1.3 Kết độ ổn định hệ nano nƣớc cất 32 3.1.3.1 Nồng độ TAX suy giảm theo thời gian 32 3.1.3.2 Kích thƣớc tiểu phân nano phân tán nƣớc cất 33 3.2 Kết đánh giá khả chống gốc tự ABTS hệ nano 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ABTS BHA BHT DLS ET Tiếng Anh 2,2’-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt Butylated Hydroxyanisole Butylated Hydroxytoluene Dynamic Light Scattering Electron Transfer G1, G2 G1-D10, G2-D10 H1, H2 HAT HLB HPLC-MS/MS Hydrogen Atom Transfer Hydrophilic-Lipophilic Balance High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrum/Mass Spectrum Tiếng Việt Tán xạ ánh sáng động Chuyển điện tử Mẫu nhũ tƣơng nano taxifolin, mẫu nano rắn TAX-β-CD tƣơng ứng Mẫu đo suy giảm nồng độ taxifolin theo thời gian phân tán nƣớc cất mẫu nhũ tƣơng G1, mẫu phức nano rắn G2 tƣơng ứng Hàm lƣợng taxifolin mẫu nhũ tƣơng G1, mẫu phức nano rắn G2 tƣơng ứng Chuyển nguyên tử Hydro Sự cân ƣa nƣớc-kỵ nƣớc Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao – khối phổ HR-TEM High-resolution Transmission Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao IC50 The half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% K2S2O8 Potassium peroxydisulfate Mẫu đo kích thƣớc tiểu phân nano mẫu nhũ tƣơng G1, mẫu phức nano rắn G2 tƣơng ứng Kích thƣớc tiếu phân KT1, KT2 KTTP MDA Malondialdehyde vi NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate O/W Oil in Water Dầu nƣớc OH PDI Hydroxyl Polydispersity index Hệ số đa phân tán PEG Polyethylene Glycol RSD SNEDDS TAX Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối Self-Nanoemulsifying Drug Delivery System Hệ nano lỏng tự tạo nhũ tƣơng Taxifolin TBARS Thiobarbituric acid reactive substances Tween Polysorbate UV-Vis α, β, γ-CD λ Ultra Violet-Visable spectroscopy α, β, γ -Cyclodextrin Wavelength Chất phản ứng axit thiobarbituric Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến Bƣớc sóng vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số đặc tính α, β, γ-CD Bảng 3.1: Giá trị độ hấp thụ λ=289 nm ứng với dải nồng độ TAX bột TAX 95% 30 Bảng 3.2: Giá trị hàm lƣợng TAX hai mẫu chế phẩm nano TAX 31 Bảng 3.3: Số liệu độ hấp thụ nồng độ TAX theo thời gian 32 Bảng 3.4: Kích thƣớc hạt nano số PDI phân tán nƣớc cất hai mẫu 33 Bảng 3.5: Giá trị tỉ lệ ức chế gốc ABTS* tƣơng ứng với nồng độ mẫu thử phản ứng chống gốc ABTS* 37 viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Nguồn gốc từ tự nhiên TAX [2] Hình 1.2: Cấu trúc hóa học TAX [2] Hình 1.3: Những tác dụng sinh hóa quan trọng hợp chất TAX Hình 1.4: Cấu trúc hóa học (trái) kích thƣớc (phải) -CD Hình 1.5: Sơ đồ hình thành nhũ tƣơng nano công thức SNEDDS [22] 11 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình tổng hợp hệ nhũ tƣơng nano TAX 16 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình tổng hợp hệ nano rắn TAX – β-CD 17 Hình 2.3: Máy đo TEM JEM – 2100 hãng JEOL, Nhật Bản 18 Hình 2.4: Máy đo Zetasizer S90 hãng Malvern Instruments (trái) nguyên tắc hoạt động (phải) 19 Hình 2.5: Sơ đồ nguyên lý hệ đo phổ hấp thụ UV-Vis chùm tia UV-Vis AvaSpecULS2048x16 hãng Avantes 20 Hình 2.6: Mẫu đƣợc chuẩn bị đo kích thƣớc tiểu phân: KT1 (phải) KT2 (trái) lần lƣợt mẫu nano G1, G2 phân tán nƣớc cất 21 Hình 2.7: Phản ứng gốc ABTS* chất chống oxy hóa 22 Hình 2.8: Phổ hấp thụ UV-Vis ABTS* 22 Hình 2.9: Dải nồng độ dung dịch mẫu G1(A), G2 (B), Trolox (C) bột DHQ (D) trƣớc cho thuốc thử ABTS* phản ứng 23 Hình 2.10: Dãy nồng độ dung dịch mẫu G1 (A), mẫu G2 (B), Trolox (C) bột DHQ (D) cho thuốc thử ABTS* (mỗi nồng độ lặp lại lần, n=3) 24 Hình 3.1: Ảnh HR-TEM mẫu nhũ tƣơng TAX dạng gel lỏng (G1) với độ phóng đại khác 26 Hình 3.2: Ảnh HR-TEM mẫu phức nano TAX – β-CD (G2) dạng bột với độ phóng đại khác 27 Hình 3.3: Ảnh HR-TEM với độ phóng đại 200k lần (a) vùng phóng đại đỉnh ảnh (b) 27 ix Hình 3.4: Ảnh HR-TEM mẫu phức nano TAX – β-CD (G2) có hạt nano 60-70 nm 28 Hình 3.5: Phổ hấp thụ UV-Vis λ=289 nm dãy nồng độ TAX mẫu bột TAX 95% theo bƣớc sóng 29 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn tuyến tính bột TAX 95% 29 Hình 3.7: Phổ hấp thụ UV-Vis λ=289 nm hai mẫu nano G1, G2 pha loãng nƣớc nồng độ dung dịch 205,8 µg/ml (G1-D10, G2-D10) 31 Hình 3.8: Nồng độ TAX hai mẫu G1, G2 thay đổi theo thời gian 33 Hình 3.9: Sự thay đổi kích thƣớc tiểu phân nano phân tán nƣớc cất hai mẫu KT1, KT2 72 34 Hình 3.10: Phổ hấp thụ UV-Vis λ=734 nm mẫu đo hoạt tính ức chế gốc tự ABTS* theo bƣớc sóng 37 Hình 3.11: Sự phụ thuộc tuyến tính tỉ lệ ức chế gốc tự (%) nồng độ chất ức chế bột TAX 95% (A), mẫu G1 (B), mẫu G2 (C) Trolox (D) 38 Hội nghị Vật lý Chất rắn Khoa học Vật liệu Toàn quốc – SPMS 2019 c) d) Hình 1: Cây Larix Sibirica (1a), flavonoid dạng bột (1b), flavonoid dạng nano (1c) khả phân tán nước mẫu flavonoid dạng bột dạng gel nano (1d) Mẫu flavonoid dạng bột gel nano flavonoid pha lỗng dung mơi cồn ethanol trước đo phổ hấp thụ UV-VIS Sự phụ thuôc cường độ hấp thụ mẫu hình thu đỉnh hấp thụ 289 nm, đỉnh đặc trưng cho hợp chất flavonoid chiết xuất từ Larix Sibirica Kết cho thấy phân tử flavonoid sau nano hóa đặc tính hóa học hợp chất giữ, khơng có xuất đỉnh lạ hay khơng có ảnh hưởng dung mơi, tá dược quy trình thực nghiệm Chúng xây dựng đường phụ thuộc cường độ đỉnh hấp thụ hợp chất flavonoid theo nồng độ, từ tính tốn nồng độ dược chất sau làm (như hình 3) Hình 3: Sự phụ thuộc cường độ hấp thụ 289nm theo nồng độ dung dịch nano flavonoid Kết đo kích thước tiểu phân nano flavonoid Kích thước tiểu phân nano phân tán nước đo hệ Zetasize Malvern S90 cho thấy cấu trúc nano flavonoid chế tạo thành cơng Kết đo hồn toàn phù hợp với kết quan sát từ ảnh quang học với độ suốt dung dịch pha nước (Hình 1d) Kích thước tiểu phân nano flavonoid đo 12.95 nm (Hình 4) nguyên liệu bột flavonoid (dihydroquercetin) có độ tinh khiết cao (98%) thường có kích thước gần 177µm (tương ứng với 80 mesh) Hình 2: Phổ hấp thụ mẫu Flavonoid dạng bột Nano flavonoid Hình 4: Kích thước tiểu phân nano flavonoid phân tán nước Khả chống oxy hóa nano flavonoid Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả bắt gốc tự DPPH phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, nhóm nghiên cứu sử dụng phổ biến DPPH tinh thể màu tím sẫm, tan tốt cồn khó tan nước, bao gồm phân tử gốc tự do, dễ nhận điện tử gốc hydro từ chất khác Chất có dải hấp thụ với đỉnh cực đại bước sóng 517nm Hội nghị Vật lý Chất rắn Khoa học Vật liệu Toàn quốc – SPMS 2019 đỉnh giảm dần biến có mặt chất có khả chống oxy hóa, bắt gốc tự Khi dung dịch DPPH tồn chất có khả bắt gốc tự gốc DPPH tự nhận điện tử chuyển thành gốc DPPH-H, gốc làm cho dung dịch từ màu tím sẫm chuyển dần sang màu vàng [8] kháng oxy hóa mẫu tăng tỉ lệ thuận theo chiều nồng độ Phương trình hồi quy tuyến tính thể mối tương quan tỉ lệ % bắt gốc tự DPPH nồng độ mẫu nano flavonoid, có dạng y= 1.5466x +2.9308, R2=0.9972 Từ phương trình hồi quy trên, giá trị IC50 nano flavonoid 0.1mM (30.425µg/ml) Để xác định khả bắt gốc tự DPPH, mẫu nano flavonoid pha loãng thành dãy nồng độ : 9, 18, 27, 36 45µg/ml Chứng dương sử dụng acid ascorbic nồng độ 33.46µg/ml Lấy 2ml DPPH 100µl EtOH 99.50 tạo mẫu control Mỗi nồng độ lặp lại lần Kết ghi nhận tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH mẫu minh họa bảng hình KẾT LUẬN Sản phẩm nano flavonoid dạng gel chế tạo thành công với kích thước 12.95nm có khả phân tán tốt nước, giữ đặc trưng hóa học hợp chất Khả chống oxy hóa thơng qua việc đánh giá khả phản ứng, bắt gốc tự DPPH cho thấy hiệu mẫu sản phẩm tốt so với acid ascorbic Điều hứa hẹn cho nhiều nghiên cứu khoa học tới việc cải thiện sức khỏe, thúc đẩy khai thác dược chất tự nhiên công nghệ nano sinh học Bảng Tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH nano flavonoid Nồng độ (µg/ml) Lời cảm ơn % bắt gốc tự DPPH 16.58 18 32.85 Cơng trình thực với hỗ trợ tài đề tài Hợp tác quốc tế cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, mã số: QTBY01.06/18-19 27 43.91 Tài liệu tham khảo 36 58.93 45 74.13 Acid ascorbic (33.46µg/ml) 51.69 Phan Thị Thủy, Nguyễn Thị Mai Hương, Lê Thị Thu Hương, Nguyễn Trọng Tĩnh, Nguyễn Thanh Bình, Nghiên cứu chế tạo nano curcumin dạng gel từ tinh nghệ vàng Việt Nam, Hội nghị Vật lý chất rắn khoa học vật liệu toán quốc –SPMS 2017 Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Mai Hữu Phương, Khả bắt gốc tự DPPH lực khủ Nam sâm bò Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, Tạp chí Khoa học ĐHSP TPHCM, số 12 (90), 2016 Lê Quan Nghiệm, Sinh dược học hệ thống trị liệu , NXB Y học, Hồ Chí Minh, trang 5054, 148-174 Hình 5: Sự phụ thuộc tỉ lệ % bắt gốc tự DPPH theo nồng độ dung dịch nano flavonoid Như vậy, theo tăng dần nồng độ tỉ lệ % bắt gốc tự DPPH mẫu nano flavonoid tăng lên Điều chứng tỏ, khả Hội nghị Vật lý Chất rắn Khoa học Vật liệu Toàn quốc – SPMS 2019 Md.Nur Alam, Nusrat Jahan Bristi, Md Rafiquzzaman, Review on in vivo and in vitro methods evalution of antioxidant activity, Saudi Pharmaceutical Jounal (2013) 21, 143-152 Eli Topaloglu, Nurgul Ay, Some mechanical properties of Siberian larch (Larix Sibirica) wood, Research Gate, 2010, pp 1361-1366 Varur Raj Vemula, Venkates Lagishetty, Srikanth Lingala, Solubility enhanced techniques, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and research (1), 2010, pp 41-51 Brand- Williams, W., Cuvelier, M E.& Berset, C (1995), Use of free radical method to evaluate antioxidant activity, LWT, Vol 28, pp 25-30 Fevzi Topal, Meryem Nar et al., Antioxidant activity of taxifolin: an activity-structure relationship, J Enzyme Inhib Medi Chem, 2016, 31(4), pp 674-683 Anita Elaine Weidmann, Dihydroquercetin: More than just an impurity?, European Journal of Pharmacology 684 (2012), pp 19-26 10 ThS Huỳnh Kim Liên, Thống kê hóa học tin học hóa học, Trường Đại học Cần Thơ, 2006