khảo sát một số dạng đột biến điểm gen apob trên một số bệnh phẩm máu ở người việt nam

18 Bảng III.1 Bộ dữ liệu phản ánh tính chất đột biến trên gen ApoB xuất hiện trên một số mẫu bệnh phẩm và mẫu lành trong các nghiên cứu đoàn hệ và ca chứng .... Nội dung và kế hoạch thực

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Tổng quan về bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình

I.1.1 Khái niệm về cholesterol và lipoprotein

Cholesterol là lipid không phân cực, là thành phần cơ bản của cấu trúc màng tế bào động vật và tế bào người Cholesterol là tiền thân của các thành phần quan trọng trong cơ thể người: nhóm nội tiết tố steroid và axit mật (Cox et al., 1990)

Hình I.1Cấu trúc của LDL huyết tương và phức hợp của cholesterol và cholesteryl esters (Brown et al., 1984)

Lipoprotein là phức hợp lipid và protein, có chức năng vận chuyển chất béo trong hệ mạch máu và hệ thể dịch đến các tế bào trong các quá trình đồng hóa và tiêu thụ năng lượng (Wasan et al., 1998) Các dạng Lipoprotein gồm có chylomicrons

(lipoprotein lớn nhất về kích thước), lipoprotein mật độ cao (High Density Lipoprotein – HDL), lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein – LDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate Density Lipoprotein – IDL) và lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low Density Lipoprotein – VLDL) (Wasan et al., 1998) Thể phức hợp Apolipoprotein gồm lipoprotein và protein ApoB (Apoprotein B) theo tỷ lệ 1:1 (Carmena et al., 2004) Hình I.1 mô tả cấu trúc của LDL huyết tương và phức hợp của cholesterol và cholesteryl esters Mỗi hạt LDL có khối lượng 3 x l0 6 dalton và đường kính 22 nm, gồm khoảng 1500 phân tử “cholesteryl

4 ester” được bao quanh bởi một lớp ưa nước với khoảng 800 phân tử phospholipid,

500 phân tử cholesterol không ester hóa và 1 phân tử Apoprotein B-100 có trọng lượng 387.000 dalton (Brown et al., 1986)

I.1.2 Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial

Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa lipid, nguyên nhân do khiếm khuyết di truyền xảy ra trên các gen mã hóa protein tham gia chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu (Brown et al., 1986) Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình gồm có: ADH (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia) là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường; ARH (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia) là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Taranto et al., 2015)

Công bố khoa học Austin và cộng sự (2004), Khachadurian và cộng sự (1964) ghi nhận bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) gồm có thể đồng hợp (Homozygous Familial Hypercholesterolemia - HoFH) và thể dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia - HeFH) Theo Brown và cộng sự (1984), tỷ lệ mắc bệnh thể dị hợp HeFH khoảng 1/500 với biểu hiện LDL trong huyết tương cao gấp đôi người bình thường và tỷ lệ mắc bệnh thể đồng hợp HoFH là 1/1.000.000 với biểu hiện LDL trong huyết tương cao gấp sau lần người bình thường Ở bệnh nhân HeFH, nồng độ cholesterol toàn phần và LDL-C trong khoảng 8 - 15 mmol/L (310 – 580 mg/dL) và ở bệnh nhân HoFH, nồng độ cholesterol toàn phần và LDL - C trong khoảng từ 12 - 30 mmol/L (460 – 1160 mg/dL) (Nordestgaard et al., 2013)

I.1.3 Nguyên nhân bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình dạng ADH là do tính chất đột biến trên một số gen khoảng 95% đột biến được phát hiện nằm trong gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), 2 – 11% là đột biến trên gen Apolipoprotein B (ApoB) và 1% trong Proprotein Convertase Subtilisin–Kexin type 9 (PCSK9) (Benn et al., 2016) Chức năng của thụ thể LDL bị khiếm

5 khuyết dẫn đến tích tụ lượng lớn cholesterol trong huyết tương, gây xơ vữa động mạch (Brown et al., 1986) Nồng độ LDL - C tăng cao là kết quả của việc giải phóng không hiệu quả các hạt LDL xuất phát từ các khiếm khuyết trong gen ApoB –

100 (Soria et al., 1989) Sự tích tụ LDL - C trong máu cao dẫn đến nguy cơ mắc bệnh động mạch vành tăng gấp 20 lần (Knowles et al., 2015) Bệnh tăng cholesterol máu thể nặng với chỉ số LDL - C >190 mg/dL (Khera et al., 2016)

Ngoài ra còn có nguyên nhân khác dẫn đến bệnh tăng cholestreol máu như các yếu tố môi trường, giới tính, tuổi tác, thói quen sinh hoạt (hút thuốc lá, ít vận động ) (Soutar et al., 2007)

Thể khiếm khuyết Apolipoprotein B – 100 có tính chất gia đình (Familial defective Apolipoprotein B-100 – FDB) là một dạng bệnh FH, thuộc nhóm ADH (Azian et al., 2006) Nguyên nhân dẫn đến bệnh lý FDB là do các dạng đột biến xuất hiện trên gen ApoB: R3500 (tên gọi khác R3527Q), R3500W, R3531C và R3480P…Những dạng đột biến sai nghĩa dẫn đến sự sai hỏng (khiếm khuyết) trên cấu trúc của protein ApoB - 100, từ đó thay đổi cấu trúc của protein ApoB - 100 cản trở sự tương tác giữa ApoB và với thụ thể LDLR làm giảm sự hấp thu LDL vào trong tế bào, do đó nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (Ejarque et al., 2008; Azian et al., 2006) Theo cụng bố của Tybjổrg-Hansen và cộng sự (1992), tỷ lệ mắc bệnh FDB 1/500 đến 1/700 ở châu Âu và châu Mỹ

I.1.4 Tiêu chí chẩn đoán bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Trên thế giới, bệnh nhân tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình được chẩn đoán dựa vào các tiêu chí đánh giá của: tiêu chuẩn Hà Lan (Dutch Lipid Clinic Network - DLCN), Simon Broome của Vương quốc Anh và tiêu chuẩn của Hoa Kỳ (Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths Program Diagnostic Criteria - MEDPED) (Benn et al., 2016)

Bảng I.1Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức DLCN (Shapiro et al., 2018)

Nhóm 1: Tiểu sử gia đình Người có quan hệ huyết thống mắc bệnh động mạch vành sớm (nam dưới 55 tuổi và nữ dưới 60 tuổi)

Người có quan hệ huyết thống có nồng độ cholesterol LDL trong máu cao hơn 95% theo độ tuổi và giới tính của quốc gia

Người có quan hệ huyết thông có xuất hiện xanthoma trong gân và/hoặc cung giác mạc

Trẻ em dưới 18 tuổi có nồng độ cholesterol LDL trong máu cao hơn 95% theo độ tuổi và giới tính của quốc gia

Nhóm 2: Tiền sử lâm sàng Đối tượng mắc bệnh tim mạch vành sớm (nam dưới

2 Đối tượng mắc bệnh động mạch máu não hoặc động mạch ngoại vi sớm (nam dưới 55 tuổi, nữ dưới 60 tuổi)

Nhóm 3: Kiểm tra thể chất Xuất hiện xanthoma trong gân 6

Xuất hiện xanthoma trong cung giác mạc ở người dưới 45 tuổi 4

Nồng độ cholesterol LDL* (mg/dL)

>8,5 mmol/L (>325 mg/dL) 6,5 – 8,4 mmol/L (251 – 325 mg/dL) 5,0 – 6,4 mmol/L (191 – 259 mg/dL) 4,0 – 4,9 mmol/L (155 – 190 mg/dL)

1 Phân tích DNA: Xuất hiện các đột biến gây bệnh FH trên các gen LDLR, ApoB hay PCSK9

8 Đánh giá Xác định mắc bệnh FH

Rất có khả năng mắc bệnh FH

Có khả năng mắc bệnh FH Không mắc bệnh FH

Bảng I.2Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức MEDPED

Nồng độ Cholesterol toàn phần (mg / dL) Thế hệ thứ nhất mắc bệnh FH

Thế hệ thứ hai mắc bệnh FH

Thế hệ thứ ba mắc bệnh FH

Bảng I.3Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức Simon Broome

Chẩn đoán khẳng định mắc bệnh FH Đối với người trưởng thành: cholesterol >7,5 mmol/dL hoặc LDL-C >

4,9 mmol/dL Đối với trẻ em: cholesterol >6,7 mmol/dL hoặc LDL-C >4,0 mmol/dL

Xuất hiện xanthomas gân ở người bệnh hay thế hệ thứ nhất hoặc thứ hai trong gia đình người bệnh

Chẩn đoán rất có thể mắc bệnh FH Đối với người trưởng thành: cholesterol >7,5 mmol/dL hoặc LDL-C

>4,9 mmol/dL Đối với trẻ em: cholesterol >6,7 mmol/dL hoặc LDL-C >4,0 mmol/dL Trong tiền sử gia đình có người bị nhồi máu cơ tim trước 50 tuổi ở thế hệ thứ nhất hoặc thứ hai, hay trước 60 tuổi ở thế hệ thứ nhất

Trong tiền sử gia đình có người có nồng độ cholesterol toàn phần >7,5 mmol/dL ở thế hệ thứ nhất hay thứ hai

Gen ApoB (Apolipoprotein B) có kích thước khoảng 43 kb, gồm 28 intron và 29 exon, và nằm gần đầu cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể số 2 (NC_000002.12-NCBI) vị trí 2p24.1) (Innerarity et al., 1990)

Gen ApoB (Apolipoprotein B) mã hóa protein ApoB–100 (4536 amino acid) và

ApoB–48 (2152 amino acid) (Knott et al., 1986; Innerarity et al., 1987) Protein

ApoB–100 được tổng hợp ở gan và ApoB–48 hiện diện ở ruột (Chen et al., 1986)

Apolipoprotein B–100 là thành phần apolipoprotein tạo nên cấu trúc lipoprotein mật độ cao (High Density Lipoprotein – HDL), lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein – LDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate Density Lipoprotein – IDL) và lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low Density Lipoprotein – VLDL) (Bell – Quint&Graham, 1981; Kane, 1983; Feingold et al., 2018)

Lipoprotein mật độ thấp (LDL) là chất mang cholesterol chính trong máu (Chung et al., 2004)

Chức năng và con đường chuyển hóa của protein ApoB

Protein ApoB là phối tử (Ligand) giúp thụ thể LDL (LDLR) liên kết đặc hiệu với các LDL-C (LDL - Cholesterol) hình thành phức hợp LDLR – LDL-C và xâm nhập vào bên trong tế bào thông qua các endosome Bên trong endosome, LDL sẽ được giải phóng khỏi LDLR và bị thủy phân trong lysosome thành các cholesterol tự do Đồng thời, LDLR sẽ được vận chuyển trở về màng tế bào để thực hiện chức năng (Brown et al., 1986)

Tính chất đột biến xuất hiện trên gen ApoB dẫn đến thay đổi cấu trúc của protein ApoB ngăn cản protein này gắn với thụ thể LDLR, từ đó làm giảm sự hấp thu LDL-

C vào trong tế bào, hệ quả là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (Innerarity et al.,1990)

Hình I.3 Cơ chế hoạt động của protein ApoB (Soutar et al., 2007)

Tình hình nghiên cứu tính chất đột biến trên gen ApoB và bệnh tăng

Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình phổ biến nhiều ở một số cộng đồng người Canada, Hà Lan, Phần Lan, Israel (Austin et al., 2004) Theo công bố khoa học của Akioyamen và cộng sự (2017) xác định tỷ lệ mắc bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình là 1/250 người trường thành trong dân số thế giới Tỷ lệ xuất hiện bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình ở cả nam và nữ là như nhau nhưng tỷ lệ mắc bệnh khác nhau khi xét theo địa lý (vùng miền: nơi người bệnh sinh sống) và độ tuổi

Công bố khoa học của Soutar và cộng sự (2004) cho thấy hơn 1/3 trẻ em ở Na Uy mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình Các bệnh nhân nhi có nguy cơ mắc bệnh CHD cao khi có lượng cholesterol toàn phần trong máu lớn hơn 8 mmol/L (309 mg/dL)

Trong một nghiên cứu ở Đan Mạch, tỷ lệ đột biến trên gen ApoB xảy ra trên biến thể Arg3500Gln là 1/1000, đây là nguyên nhân gây tăng cholesterol trong máu nghiờm trọng và tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành (Tybjổrg-Hansen et al.,

1998) Công trình nghiên cứu của Kalina và cộng sự (2001) sử dụng phương pháp

AS - PCR xác định tỷ lệ đột biến R3500Q trên exon 26 gen ApoB là 0,01% trong

10 tổng số bệnh nhân 21.000 bệnh nhân FH ở Hungary Đây là dạng đột biến đã được cập nhật tên trên hệ thống LOVD (https://databases.lovd.nl/shared/genes/APOB): R3527Q Ở Việt Nam, công bố khoa học của Truong và cộng sự (2017) đã xác định tỷ lệ đột biến trên gen ApoB do đột biến xảy ra xung quanh codon 3500 là 67,5% trong tổng số 40 bệnh nhân tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự.

Một số phương pháp xác định tính chất đột biến điểm trên gen ApoB 10 II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR – Sequencing) xác định trình tự nucleotide trên gen mục tiêu hoặc bộ gen nhằm phát hiện các đột biến điểm và chỉ ra bản chất của đột biến này là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh di truyền, tiêu biểu là bệnh FH (Jensen et al., 1996)

- Phương pháp Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) kỹ thuật này cho phép phân tích tính đa hình của cấu hình sợi đơn nucleic, là một trong những kỹ thuật thông dụng nhằm phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm chưa biết trên một trình tự khi so sánh với một trình tự chuẩn không mang đột biến (Hayashi et al., 1991)

- Phương pháp Allele Specific PCR (AS - PCR) này có độ nhạy cao dùng để phát hiện các dạng đột biến đã biết bằng cách thực hiện phản ứng PCR khuếch đại allele hoang dại và allele đột biến Sau đó sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide để đọc kết quả (Mahdieh et al., 2013)

- Phương pháp điện di trên gel biến tính (Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis – DGGE) là một kỹ thuật nhanh và nhạy để phát hiện đột biến dựa trên sự khác nhau về thành phần nucleotide Kỹ thuật này dựa trên sự di chuyển của các phân tử DNA sợi đôi thông qua gel polyacrylamide (Fodde et al., 1994)

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Các công cụ tin sinh học:

- NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

- Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)

- BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

- Oligo analyzer IDT phiên bản 3.1

(http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/)

Phương pháp

II.2.1 Khai thác dữ liệu (Data - mining)

Khai thác dữ liệu khoa học trên nguồn dữ liệu PubMed, PubMed central (PMC) thuộc NCBI và các nguồn dữ liệu trực tuyến khác (EMBL, Google …)

Sử dụng một số từ khóa: ApoB, Familial Hypercholesterolemia (FH), Familial defective apolipoprotein B100 (FDB), Autosomal Dominant Hypercholesterolemia (ADH), PCR, giải trình tự …

- Tình hình mắc bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH, FDB) tim mạch do mắc bệnh lý tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam

- Thông tin về phương pháp sinh học phân tử (PCR kết hợp phương pháp giải trình tự, PCR ) phù hợp để xác định đột biến điểm trên gen ApoB trên từng quần thể người bệnh tăng cholestreol máu có tính chất gia đình trên thế giới và ở Việt Nam

- Tổng hợp, chọn lọc thông tin và tỷ lệ của từng dạng đột biến đểm nổi trội thuộc gen ApoB xuất hiện trên nhóm người mắc bệnh FH / người mắc bệnh tim mạch bằng công cụ thống kê phù hợp

II.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)

Phân tích tổng hợp là phương pháp phân tích thống kê của nhiều nghiên cứu độc lập đã được công bố và thường sử dụng thử nghiệm phân bố ngẫu nhiên (Randomised Controlled Trials – RCTs) (Glass, 1976) Dựa vào công bố khoa học của Hunter và Schmidt (1990), phân tích tổng hợp tập trung vào một số tiêu chí: Lực nghiên cứu (Power); chỉ số cỡ mẫu; biến số: biến nhị phân và độ lệch chuẩn (biến liên tục) Các bước để thực hiện phân tích tổng hợp (Basu, 2017):

Bước 1: Xây dựng quy chuẩn để thu thập thông tin dựa trên mẫu trả lời câu hỏi

“PICO - Participant-Intervention-Comparator-Outcomes”, Participant được hiểu theo nghĩa đối tượng nghiên cứu, Intervention là sự tác động đến đối tượng nghiên cứu, tiếp theo Comparator nghĩa là so sánh các đối tượng dưới những tác động khác nhau và cuối cùng là Outcomes – đưa ra kết quả

Bước 2: Thu thập nguồn thông tin qua các ngân hàng dữ lệu như NCBI, Google Scholar…và kết hợp toán tử tìm kiếm: “AND”, “OR”, và “NOT” để giới hạn phạm vi tìm kiếm

Bước 3: Đọc tiêu đề, nội dung tóm tắt và nội dung toàn văn của các công bố nghiên cứu để xác định trọng tâm của nghiên cứu, sử dụng sơ đồ quy trình PRISMA (Preferred Reporting Items of Systematic Reviews and Meta - analyses) để sàng lọc và chọn bài nghiên cứu phù hợp

Hình II.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp

Bước 4: Sau khi chọn được bài nghiên cứu phù hợp, tiến hành đọc và hiểu phần thực nghiệm và tiến hành trích xuất dữ liệu dự kiến bao gồm các phân hạng/ thông tin:

- Tác giả, năm xuất bản

- Thông tin về bệnh nhân: quốc gia, dân tộc, loại mẫu (mẫu máu)

- Dạng công trình nghiên cứu: ca chứng (case - control study), đoàn hệ (cohort study) hoặc tại một thời điểm (cross - sectional)

- Phương pháp xác định tính chất đột biến trên gen mục tiêu

- Tỷ lệ đột biến trên gen mục tiêu cũng như các nguy cơ trên mẫu bệnh (Case samples) và mẫu chứng (Control samples)

Bước 5: Đánh giá sự khác biệt giữa các bài nghiên cứu Hunter và Schmidt (2000) đưa ra khái niệm về mô hình có mẫu ngẫu nhiên (Random effects meta- analysis) và mô hình có mẫu cố định (Fixed - effects Meta - analysis) cho một tiêu

14 chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (CI) nhằm đánh giá tính tương quan giữa yếu tố nguy cơ (tính chất đột biến trên gen ApoB) và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình

Bước 6: Xuất biểu đồ tương ứng với loại mô hình mẫu nghiên cứu thông qua phần mềm thống kê tổng hợp Medcalc (phiên bản v18) được ứng dụng để phân tích tỷ lệ đột biến (Proportion), chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio - OR), chỉ số nguy cơ (Hazard ratio - HR) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - CIs)

Dựa vào thuật toán Chi bình phương, xác định chỉ số bất đồng nhất (Index of Heterogeneity: I 2 ) theo thang giá trị: 0 - 100% (Higgins et al., 2003; Ryan, 2014) và hệ thống Cochrane:

- Tính bất đồng nhất thấp: 0%