Lao Đức Thuận Học viên thực hiện: Phạm Thị Phương Trinh Lớp: DH18YD01 Ngày sinh: 10/07/2000 Nơi sinh: Đồng Nai Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SI
TỔNG QUAN
Vài nét lịch sử về nấm
Nấm đã bắt đầu xuất hiện trên Trái Đất cách đây hàng tỉ năm trước (Bruns et al., 2006) Nấm được ghi nhận có sự tồn tại trước cả thực vật, chúng bắt đầu phổ biến trên mặt đất trong kỷ Cambri (Brundrett, 2002) Nấm có môi trường sống đa dạng, có thể phân bố trên cạn, dưới nước hay trên cơ thể sinh vật khác Nấm đóng vai trò là sinh vật phân hủy trong tự nhiên ở nhiều lưới thức ăn, từ đó tạo thành các chất vô cơ - nguồn nguyên liệu cho quá trình đồng hóa của thực vật hay các sinh vật khác Qua đó, có thể thấy rằng trong tự nhiên nấm tuy nhỏ bé nhưng lại là mắt xích quan trọng kết nối với các sinh vật khác, góp phần giúp duy trì và cân bằng hệ sinh thái
Năm 1753, Linnaeus xếp Nấm vào bộ Thallophyta, giới Plantae (Thực vật) do đặc điểm không di động, thành tế bào giống thực vật hơn động vật Đến năm 1969, Whitaker đề xuất hệ thống phân loại 5 giới, trong đó giới Fungi (Nấm) tách biệt với giới Plantae, phản ánh sự khác biệt về cấu trúc tế bào và lối sống dinh dưỡng.
Plantae (Thực vật) và giới Animalia (Động vật) Năm 1990, C Woese đã sắp xếp lại sinh giới thành 3 lãnh giới dựa vào trình tự nucleotide 16S rRNA là Archaea (Cổ khuẩn),
Bacteria (Vi khuẩn) và Eukarya (Sinh vật nhân thực) Trong đó, Nguyên sinh, Nấm, Thực vật và Động vật được xếp chung vào lãnh giới Eukarya Qua đó, Nấm đã được xác nhận là một giới riêng cùng với các giới còn lại được xếp trong lãnh giới Eukarya
Nấm sở hữu các đặc tính riêng biệt không có ở thực vật hay động vật Thành tế bào nấm cấu tạo từ kitin, còn dinh dưỡng theo kiểu thẩm thấu, không tiêu hóa giống động vật Những đặc điểm khác biệt này đủ để phân loại nấm vào một giới riêng biệt, được gọi là Giới Nấm.
Nấm (Miles et al., 2004; Bruns et al., 2006) Giới Nấm bao gồm các sinh vật nhân thực
6 và phần lớn chúng phát triển dưới dạng sợi nấm (hyphae) hay còn gọi là các sợi đa bào, phần còn lại thì phát triển theo dạng đơn bào, thành tế bào của nấm chứa phần lớn là chitin (kitin), không có chứa lục lạp, lông hay roi, sinh sản của nấm là hữu tính và vô tính bằng bào tử Chúng lấy các chất dinh dưỡng bằng cách hấp thụ thông qua bề mặt của tế bào, kiểu dinh dưỡng của nấm chủ yếu là kí sinh, hoại sinh; khác với tự dưỡng ở thực vật và nội tiêu hoá bằng ống tiêu hoá ở động vật
Theo hệ thống phân loại của Ainsworth năm 1973, giới nấm được chia thành 2 ngành chính là ngành Myxomycota và ngành Eumycota Trong đó ngành Myxomycota gồm những loài giả nấm (plasmodia và pseudoplasmodia), ngành Eumycota gồm chủ yếu là nấm sợi Đa số nấm ăn được xếp vào ngành phụ Basidiomycota và Ascomycotina (Nguyễn Lân Dũng, 2001) thuộc ngành chính Eumycota.
Tổng quan chi nấm Pleurotus
1.2.1 Đặc điểm chung của chi Pleurotus
Pleurotus (Jacq Fr.) P Kumm là một chi nấm thuộc về họ Pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Agaricomycetes, ngành Eumycota (Nấm thật) Chi nấm này ghi nhận có khoảng 70 loài (Nguyen et al., 2019) Các loài Pleurotus thích hợp sinh trưởng ở vùng có khí hậu cận và nhiệt đới (Barh et al., 2019; Cohen et al., 2002) nên tại những khu vực này chúng có sự phát triển tốt nhất, hình thức dinh dưỡng chủ yếu của các loài nấm này chủ yếu là hoại sinh trên các cây thân gỗ (Karim et al., 2016) Phần lớn các loài Pleurotus được xếp vào nhóm nấm ăn ngon mang lại giá trị thương mại cao, được liệt kê vào một trong số các loại nấm được trồng (canh tác) làm thực phẩm nhiều nhất trên toàn thế giới (Zhao et al., 2021) Các loài Pleurotus có nguồn gốc tiến hóa tách biệt (Zevakis et al., 2004), được áp dụng trong những mục đích khác nhau về lĩnh vực y dược, lĩnh vực môi trường và lĩnh vực công nghệ sinh học (Kirk et al., 2008; Cohen et al., 2002) Nấm Bào ngư còn được gọi là nấm Sò hay Hirakate, Houbikate, Houbiko (theo tiếng Nhật) là tên gọi chung của các loài Pleurotus Nổi bật trong chi nấm này là các loài Pleurotus ostreatus, P eryngii, P pulmonarius, P citrinopileatus, P cornucopiae – đây là những
7 loài nấm đặc trưng, nổi tiếng nhờ hương thơm cùng với vị đặc trưng và hàm lượng dinh dưỡng cao (dồi dào protein, carbohydrate, khoáng chất, chất xơ, vitamin) (Khan et al., 2012; Feeney, 2014), được trồng làm thực phẩm ở nhiều khu vực và nghiên cứu ở nhiều quốc gia (Zadrazil, 1978; Sibel Yildiz et al., 2002; Chang, 2006)
Hiện nay, các loài Pleurotus đứng thứ 3 trong số những loài nấm ăn ngon được canh tác phổ biến nhất thế giới, chỉ xếp sau nấm mỡ (button mushroom) và nấm hương hay nấm đông cô (shiitake mushroom) (Fernandes et al., 2015) Ba Lan là quốc gia sản xuất thương mại nấm Bào ngư dẫn đầu ở Châu Âu với sản lượng nấm mỗi năm đạt đến 80,000 tấn Trong đó, P ostreatus và P pulmonarius là 2 loài được đánh giá là kinh tế nhất (dos Santos Bazanella et al., 2013; Golak-Siwulska et al., 2018) Việc sản xuất thương mại các loài Pleurotus chiếm khoảng 30%, đạt 15 triệu tấn về sản lượng, có giá trị hơn 50 tỉ đô la (Chang, 2008) Số tiền thống kê này đã tăng lên đến con số 63 tỉ đô la vào năm 2013 (Roy et al., 2017) Từ đó, trong tương lai thị trường về các loài Pleurotus rất có tiềm năng và sẽ còn được phát triển rộng rãi Đặc điểm chung của các loài Pleurotus là thường mọc thành cụm, tai nấm có dạng hình phễu lệch, cấu tạo gồm 3 phần: mũ nấm, phiến nấm và cuống nấm Đến một giai đoạn thích hợp của quá trình trưởng thành, nấm sẽ phân tán bào tử ra môi trường, khi tiếp xúc với điều kiện thuận lợi, ở các bào tử này sẽ diễn ra quá trình nảy mầm và phát triển tạo nên hệ sợi sơ cấp (Lê Duy Thắng, 2001; Nguyễn Lân Dũng, 2002) Pleurotus ostreatus là một loài nấm điển hình có mức độ phổ biến rộng ở cả Châu Âu, Châu Á
Loài nấm này có màu từ xám đến nâu (Zervakis et al., 1996; Bao et al., 2004; Stanley et al., 2017) hoặc có màu trắng đến trắng kem, thường mọc thành cụm trên thân cây ẩm ướt (Wilson, 2020), mũ nấm có hình bán nguyệt, cuống lệch tâm, bào tử có màu từ trắng đến xám (Zervakis et al., 1996) Các loài Pleurotus thường được gọi là nấm thối gỗ do hình thức dinh dưỡng của chúng chủ yếu là hoại sinh trên các cây thân gỗ (Karim et al., 2016)
Hình 1.1 Hình ảnh Pleurotus ostreatus ngoài tự nhiên (Zervakis et al., 2015) 1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chi nấm Pleurotus
Hệ thống phân loại của Pleurotus là vấn đề đã từng gây nên nhiều tranh cãi trong nhiều năm giữa các nhà nấm học Cụ thể, năm 1981, Julich đã xếp chi Pleurotus (Jacq Fr.) P Kumm thuộc họ Pleurotaceae, bộ Polyporales (Gauman, 1926) Nhưng theo hệ thống học của Singer, 1986 thì ông lại xếp chi Pleurotus vào họ Polyporaceae (Fr.), bộ
Agaricales (Clements, 1909) Ông cho rằng Agaricales phát sinh từ Aphyllophorales
(trong đó đã bao gồm cả Polyporales) trong khi đó Julich cũng cho rằng họ Pleurotaceae là dạng trung gian chuyển tiếp giữa Polyporales và Agaricales Các tác giả trên thống nhất xem Pleurotus nằm ở miền ranh giới giữa nhóm nấm lỗ (polyporoid) và nấm tán (agaricoid) Tên chi đã trải qua nhiều lần hiệu chỉnh và sau cùng các nhà nấm học quyết định giữ lại tên Pleurotus (Guzmán et al., 2000; Lê Xuân Thám., 2010) Đến năm 1982, Hilber công bố công trình mà trong đó ông tập trung, nhấn mạnh mô tả về đặc điểm hình thái của “Pleurotus eryngii complex” Khái niệm “species complex” thường dùng để định nghĩa các loài nấm có mối quan hệ gần nhau, giữa chúng có khả năng tương thích giao phối với nhau hoàn toàn hoặc một phần (Vilgalys et al., 1994; Zervakis et al., 2001; Bao et al., 2004; Estrada et al., 2010) Dựa trên cơ sở mà
9 ông phân tích, ông đã đề nghị phát sinh 3 phân chi trong hệ thống phát sinh chủng loại đó là: Lentodiopsis (Bubák) O Hilber, Coremiopleurotus O Hilber và Pleurotus
Theo Guzmán et al., 2000 và Lê Xuân Thám, 2010, các loài nấm lim có khả năng sinh sản vô tính được phân loại vào phân chi Coremiopleurotus thuộc chi Pleurotus.
Several species belong to the Coremiopleurotus subgenus, including Pleurotus abalonus, P cystidiosus var formosensis, P smithii, and P fuscosquamulosus Species lacking the ability to produce asexual fruiting bodies and with monomitic (generative hyphae) or dimitic (generative and binding hyphae) hyphal systems are classified in the Pleurotus subgenus, including P ostreatus and P enrygii Notably, species with dimitic hyphal systems are placed in the Lentodiopsis subgenus, such as Pleurotus dryinus.
(Pers.: Fr.) P Kumm 1871 (St, L 2001); Pleurotus calpyptratus (Lindblad ex Fr.) Sacc
1.2.3 Khóa phân loại của chi nấm Pleurotus
Pleurotus là một chi nấm thuộc ngành Eumycota có khóa phân loại như sau:
Thành phần dinh dưỡng chi Pleurotus
1.3.1 Thành phần dinh dưỡng chung
Các loài P ostreatus, P sajor-caju, P eryngii,… đã được khẳng định qua nhiều công bố khoa học về những giá trị dinh dưỡng Cụ thể, các công trình này đã chứng minh chúng chứa nhiều axit amin, protein, carbonhydrate, nguyên tố vi lượng, đa lượng (Cu,
Fe, Mg, Na, K, Zn, P,…) (Khan et al., 2012; Josiance et al., 2018; Herndndez et al., 2003; Kalmis et al., 2008) Pleurotus ostreatus là một trong số các loài Nấm Bào ngư được chọn để nghiên cứu nhiều nhất vì nó rất giàu dinh dưỡng như: vitamin, chất xơ, axit amin và khoáng chất, các phức hợp polysaccharides, proteins, sterols, nucleosides, axit gallic, flavonoid, axit chlorogenic, lycopene, β –carotene, v.v (Reis et al., 2011;
1.3.2 Thành phần hóa học chính
Lovastatin thuộc nhóm chất statin có cấu trúc chung gồm một vòng hexahydronaphthalene và một vòng β-hydroxyl lactone (Pandey et al., 2019) Chất này còn có tên gọi là mevinolin hay monacolin K Đây là một polyketide có chức năng ức chế cạnh tranh làm giảm cholesterol (Krukemyer et al., 1987) thông qua việc ức chế 3- hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase – một enzyme xúc tác quá trình khử HMG-CoA để hình thành nên mevalonate trong quá trình tổng hợp nên cholesterol (Singer et al., 1988) giúp ngăn cản quá trình tổng hợp cholesterol trong cơ thể (Sumarmi et al 2004) Lovastatin được Endo và cộng sự, 1978 phân lập thành công đầu tiên từ
Aspergillus terreus Sau đó, chất này được Alberts và cộng sự, 1979 nghiên cứu và thu nhận từ Monascus ruber Lovastatin còn được tìm thấy trong quả thể của nấm Pleurotus ostreatus (Cimerman et al., 1995); Pleurotus eryngii (Lee et al., 2006); Pleurotus sajor- caju, Pleurotus florida (Khan et al., 2011; Golak-Siwulska et al., 2018), Lovastatin có rất nhiều tác dụng, ngoài việc giảm cholesterol trong máu, lovastatin còn ngăn ngừa ung thư ruột kết, bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính và những rối loạn về thần kinh như bệnh Parkinson (Zixiao Xiong et al.,2019), kháng ung thư (Chen et al., 2015; Klawitter et al., 2010; Lin et al., 2006), bảo vệ thần kinh (Divsalar et al., 2018; Lin et al., 2015; Ghanizadeh et al., 2014), kháng khuẩn và kháng viêm (Zhou et al., 2018) Hàm lượng Lovastatin trung bình có trong mẫu nấm Pleurotus khô chiếm khoảng 0,7 – 2,8%
(Alarcon et al., 2003) và dao động tùy theo loài: khoảng 101 mg/kg trọng lượng khô ở
P cystidiosus, 216 mg/kg trọng lượng khô của quả thể ở P ostreatus (Chen et al., 2012)
Ngoài ra, tuy là cùng một loài nhưng hàm lượng lovastatin lại khác nhau vì chúng được thu lấy từ những nơi khác nhau như Pleurotus ostreatus thu nhận từ Nhật Bản có lượng lovastatin là 606,5 àg/g trọng lượng khụ, ở Đài Loan là 216,4 àg/g nhưng ở Hàn Quốc chỉ đạt 165,3 àg/g (Piska et al., 2017) Chất này đó được Alam và cộng sự nghiờn cứu trên chuột và chứng minh Lovastatin hiện diện trong quả thể P ostreatus và P sajor- caju có kết quả ảnh hưởng tích cực đến thành phần lipid cũng như chức năng của gan và thận, tổng mức cholesterol và triglyceride trong máu chuột giảm (Alam et al., 2009)
Polysaccharide thuộc về nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học rất nổi bật vì nhờ vào tác dụng kháng oxi hóa (Liu et al., 2010; Ruthes et al., 2015; Zhang et al., 2016; Seedevir et al., 2019), kháng khuẩn (Staphylococcus aureus; E coli; Bacillus cereus;…) (Gbolagade et al., 2007; Mehment and Sevda, 2009; Adebayo et al., 2012), kháng viêm (Jose et al., 2002; Adebayo et al., 2012), kháng u (Yang et al., 2013) Polysaccharide chứa hàm lượng cao trong quả thể nấm Pleurotus (Wasser, 2002) dao động từ 36 g đến 60 g/100 g quả thể khô (Alam et al., 2008; Khan et al., 2008; Mshandete et al., 2007; Akindahunsi et al., 2006) Polysaccharide gồm có β-glucan và α-glucan tham gia cấu thành nên vách tế bào Pleurotus là nguồn cung cấp β-glucan dồi dào (Rop et al., 2009) Tổng lượng glucan gồm α-glucan và β-glucan có sự khác nhau giữa các loài
Pleurotus (Golak-Siwulska et al., 2018) Cụ thể, tổng lượng glucan đạt 18,260 g/100 g
Hình 1.2Cấu trúc hóa học của Lovastatin (Grabarczyk et al., 2019)
12 trọng lượng khô ở P citrinopileatus và đạt 25,636 g/100 g trọng lượng khô ở P ostreatus (Sari et al., 2017) Lượng β-glucan có trong P eryngii và P ostreatus đạt lần lượt là
15,321 g/100 g trọng lượng khô và 24,230 g/100 g trọng lượng khô Theo Synytsya et al (2009) nghiên cứu về lượng β-glucan ở P ostreatus, tác giả nhận thấy lượng β-glucan có trong thân nấm đạt 32,5-50% trọng lượng khô cao hơn trong mũ nấm (27,4-39,2%)
P eryngii có lượng glucan trong thân nấm đạt 39,1% trọng lượng khô cũng cao hơn lượng glucan có trong mũ nấm chiếm 20,4% (Golak-Siwulska et al., 2018) Pleurotus ostreatus và Pleurotus djamor đã được xác nhận là hai loài nổi bật hơn cả nhờ vào khả năng chống bệnh, kháng oxy hóa, kháng u và điều hòa miễn dịch (Su et al., 2016; Itisam et al., 2006), chống ung thư gan và ung thư mô liên kết (Hexiang et al., 2000), giảm cholesterol ở người (Inga et al., 2010)
Vitamin được xếp vào nhóm yếu tố vi lượng, là những yếu tố mà cơ thể không thể tự tổng hợp mà phải được cung cấp từ bên ngoài qua việc tiêu thụ những thực phẩm hoặc đồ uống chứa vitamin Mặc dù cơ thể chỉ cần vitamin với một lượng nhỏ (yếu tố vi lượng ở dạng vết) nhưng nó lại giữ vai trò chủ đạo trong nhiều quá trình trao đổi chất của tế bào và cơ thể Quả thể của các loài Pleurotus chứa rất nhiều loại vitamin, trong đó chiếm đa số là vitamin D2, vitamin B1, vitamin C và vitamin B2 (Manzi et al.,2004) Các vitamin nhóm B có rất nhiều trong quả thể nấm, đặc biệt là thamine, pantotene acid, riboflavin, nicotinic acid, folic acid, pyridoxine, nicotinamid và cobalamin cũng như các vitamin khác như ergosterol, biotin, phytochinon và tocopherols (Mattiala et al., 2001) Hàm lượng vitamin có sự dao động giữa các loài Cụ thể, P ostreatus chứa nhiều folacine, vitamin B1, vitamin B3 nhưng hàm lượng vitamin B12 lại ít hơn những loài khác (Deepalakshmi et al., 2014)
1.3.2.4 Protein, axit amin và các hợp chất khác
Các loài Pleurotus được đánh giá là nguồn protein dồi dào tốt cho cơ thể và rất thích hợp với những người ăn chay (Raman et al., 2021) Mức độ dao động trong lượng protein giữa các loài Pleurotus cũng có sự khác nhau tùy theo loài, hàm lượng này chiếm khoảng từ 9,29 g đến 37,4 g/100 g khối lượng khô (Ritota, 2019) Cụ thể, hàm lượng protein được tìm thấy ở Pleurotus ostreatus và Pleurotus djamor var roseus khoảng 23,91–35,5 g/100g (Alam et al., 2008; Jegadeesh et al., 2018) Protetin có trong thể quả tươi của
Pleurotus ostreatus chiếm 28,85% (Tolera and Abera, 2017), của Pleurotus eous chiếm
24,10% (Kortei et al., 2015) Một số axit amin góp phần nâng cao hương vị thơm ngon của nấm (Kortei et al., 2015) Axit amin tryptophan, cysteine, alanine và glycine có tác dụng hiệp đồng (hiệu ứng đồng vận) với vitamin C và E trong việc chống oxi hóa của cơ thể (Raman et al., 2021) Ngoài ra, Pleurotus còn cung cấp cho cơ thể một nguồn chất xơ dồi dào hỗ trợ tiêu hóa (Raman et al., 2021) Hàm lượng chất xơ có trong quả thể của
Pleurotus ostreatus là 10,21%, Pleurotus flabellatus là 11,9%, Pleurotus florida là
29,9%, P sajor-caju là 10,9%, P pulmonarius là 14,7%, P eous là 15,91%, P djamor var roseus là 14,60%, và P tuber-regium là 10,86% (Bano et al., 1981; Ijeh et al., 2009;
Smiderle et al., 2012; Mshandete and Cuff, 2008; Salami et al., 2017; Jegadeesh et al., 2018).
Tiềm năng ứng dụng của Pleurotus
Từ xa xưa, nấm nói chung và cách riêng các loài Pleurotus đã sớm được con người khai thác để làm thực phẩm hay trong những nét đặc trưng về truyền thống văn hóa dân tộc cũng như phong tục tập quán của người Châu Âu, người Châu Mĩ và người Châu Á (Tsiantas et al., 2021) Cùng với đó, nấm cũng được các danh y thời xưa áp dụng để chữa nhiều bệnh khác nhau vì chúng có nhiều đặc tính quý giúp cải thiện nâng cao sức khỏe như kháng viêm, chống oxy hóa, giảm cholesterol, chống ung thư, điều hòa miễn dịch và còn nhiều đặc tính khác liên quan đến một chất cụ thể có trong nấm như ergothioneine, polysaccharide (chitosan, β-glucan), terpene, lectin và lovastatin (Patel et al., 2012; El
Enshasy et al., 2013; Gargano et al., 2017; Muszýnska et al., 2018; Boulaka et al., 2020; Tsiantas et al., 2021).
1.4.1 Đối với lĩnh vực thực phẩm
Các loài Pleurotus phần lớn thuộc các loài nấm ăn đặc trưng với mùi vị thơm ngon và tính chất bổ dưỡng nên đây cũng chính là lí do Pleurotus đã sớm được trồng và khai thác làm thực phẩm trong suốt thời kì chiến tranh thế giới ở Đức (Kaufert et al., 1936) Ngày nay, một số loài Pleurotus được trồng thương mại vì chúng có hàm lượng khoáng chất cao, tính chất dược liệu và rất kinh tế (Yildiz et al., 2002) Các loài Pleurotus xếp trong 5 nhóm nấm được trồng và cung cấp hàng đầu thế giới (Royse et al 2017; Tsiantas et al., 2021); đạt gần 13 tỉ tấn năm 2013 (Royse et al., 2017) Chi nấm Pleurotus được chứng minh là thành phần tiềm năng trong việc tạo các sản phẩm thịt (Torres-Martínez et al., 2022) do vậy rất phù hợp cho những người ăn chay Ở Việt Nam, về lĩnh vực thực phẩm hiện đã có các đề tài về Pleurotus đã được triển khai ứng dụng Trong đó, nổi bật là “Nghiên cứu định danh và khả năng sinh trưởng hệ sợi của các giống nấm bào ngư thương mại trên một số môi trường dinh dưỡng” của nhóm tác giả Bùi Ngọc, T et al., 2021; “Nghiên cứu về quy trình chế biến nấm bào ngư sấy tẩm gia vị ăn liền” của tác giả Nguyễn, T T D., 2019; “Nghiên cứu nuôi trồng nấm (Pleurotus spp.) sử dụng cơ chất lên men” của nhóm tác giả Mai, N H., Nguyên, T B., & Đại, P H (2019); “Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và một số hoạt tính sinh học của nấm bào ngư trắng Pleurotus plorida được trồng ở Miền Bắc Việt Nam” của tác giả Bích N.T N, (2018);…
1.4.2 Đối với lĩnh vực y học
1.4.2.1 Khả năng giảm cholesterol trong máu
Theo Durrington và Ramakrishman, sự tăng cholesterol (hypercholesterolemia) được hiểu là sự biểu hiện ở mức độ cao nồng độ cholesterol trong máu (Durrington 2003; Ramakrishnan et al., 2017) Tăng cholesterol là một dạng rối loạn chuyển hóa có thể là thứ phát đối với nhiều bệnh, nó góp phần hình thành các dạng bệnh như cao huyết áp,
15 xơ vữa động mạch, tim mạch vành, béo phì và nhiều biến chứng liên quan (Khan et al., 2012) Tam et al., 1986 đã báo cáo đầu tiên chiết xuất từ P sajor-caju được sử dụng để giảm huyết áp ở chuột Tình trạng tăng cholesterol gây xơ vữa ở chuột và thỏ đã được cải thiện sau khi áp dụng điều trị bằng chế độ ăn kết hợp với P ostreatus và P florida đã được nhiều báo cáo chứng minh (Bobbek et al., 1995; 1999; Bajaj et al., 1997; Hossain et al., 2003) Bột nấm từ quả thể khô, dịch chiết nước nóng, dịch chiết từ ethyl acetate và methanol của P citrinopileatus được Hu et al, Khan et al chứng minh có khả năng giảm lipid máu và chống oxi hóa ở chuột (Hu et al., 2006; Khan et al., 2012) Vào những năm trở lại đây, lovastatin là một trong những chất được tiến hành nghiên cứu nhiều nhất trong việc hỗ trợ làm giảm cholesterol trong máu Chất này không những có chức năng làm giảm lipid trong máu, phòng ngừa bệnh Parkinson, Alzheimer và xơ vữa động mạch mà nó còn có chức năng kháng viêm và tăng cường tái tạo xương cho cơ thể (Upendra et al., 2013) Lovastatin đã được sự công nhận từ Cục quản lí Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kì (FDA) vào năm 1987 (Endo 1988) Lovastatin được tìm thấy ở một số loài
Pleurotus gồm P eryngii, P ostreatus (Gunde-Cimerman, 1995), P cornucopiae (Krasnopolskaya et al., 1998), Các nhà khoa học hiện nay trên thế giới đang hướng đến nghiên cứu khảo sát khai thác các loài nấm ăn có khả năng sản xuất nguồn Lovastatin dồi dào với mục đích phát triển thuốc điều trị bệnh tăng cholesterol trong tương lai (Ramakrishnan et al., 2017)
1.4.2.2 Khả năng kháng ung thư
Choi et al., 2004 đã nghiên cứu thành công dịch chiết từ quả thể của Pleurotus ferulae có chức năng chống ung thư phổi và ung thư cổ tử cung sau khi thực hiện trên hai dòng tế bào SiHa và HeLa Năm 2006, Gu và cộng sự chứng minh dịch chiết nước nóng của P ostreatus ngăn được sự tăng sinh của dòng tế bào MCF-7 ở bệnh nhân ung thư vú Sau đó, Jedinak và Silva tiếp tục thử nghiệm hiệu quả với dịch chiết P ostreatus từ ethanol và nhóm tác giả kiểm tra thấy dịch chiết này kìm hãm được sự tăng sinh của các tế bào ung thư vú (MDA-MB-231, MCF-7) và ung thư ruột kết (HCT-116, HT-29)
16 mà không tác động đến sự tăng sinh bình thường của các tế bào biểu mô tuyến vú MCF- 10A và tế bào ruột kết bình thường FHC (Jedinak and Sliva, 2008) Sau đó, càng ngày có nhiều công trình nghiên cứu chống ung thư từ dịch chiết quả thể của các loài
Pleurotus là một loại nấm ăn được có tiềm năng chống ung thư đã được nghiên cứu sâu rộng Nghiên cứu trên P citrinopileatu và P eryngii cho thấy chúng có tác dụng kháng ung thư bạch cầu bằng cách tác động lên tế bào đích U937 Ngoài ra, loài P nebrodensis cũng được chứng minh có khả năng kháng ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (Lu-04) và ung thư gan.
(HepG2) (Lv et al., 2009), dịch chiết nước nóng polysaccharide của P geesteranus có chức năng gây độc cho dòng tế bào MCF-7 ở bệnh nhân ung thư vú (Zhang et al., 2011),…
Gần đây, Pleurotus ostreatus là 1 trong 3 loài nấm đã được nhận định rất có tiềm năng nghiên cứu về khả năng kháng SARS-CoV2 (Elhusseiny et al., 2022) Điều đó cho thấy các loài Pleurotus rất có giá trị tiềm năng trong việc kháng lại virus nói chung và SARS-CoV2 nói riêng Hợp chất polysaccharide từ chiết xuất nước và methanol của P pulmonarius có khả năng kháng vi rút cúm A (Ilyicheva et al., 2020) Enzyme laccase được tinh sạch từ P ostreatus tác dụng lên Hepatitis C virus làm ức chế sự xâm nhiễm của nó đồng thời ngăn chặn tế bào HepG2 sao chép (El-Fakharany et al., 2010) Một ubiquitin mới có bản chất protein được thu thập từ P ostreatus ức chế được hoạt động của HIV-1 reverse transcriptase (Wang et al., 2000) Một enzyme laccase khác và lectin được tách chiết từ quả thể tươi của P cornucopiae có nồng độ ức chế lần lượt với IC50 là 22 àM và IC50 là 0,93 àM cú hiệu quả với reverse transcriptase ở HIV-1 (Wong et al., 2010; Li et al., 2008) Các loài P djamour, P sajor-caju, và P citrinopileatus được khuyến khích dùng trong thực phẩm và trong việc điều trị bệnh và chú trọng cách riêng với bệnh nhân bị nhiễm HIV/AIDS vì chiết xuất methanol từ các loài nấm này cho thấy hiệu quả kháng HIV cao (Kidukuli et al., 2010),…
P levis và P tuber-regium là 2 loài được cho là có tiềm năng cao trong kháng khuẩn Bacillus subtilis (Adebayo et al., 2018) Dịch chiết từ Pleurotus ostreatus (CP- 800) cú nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 36,38 àg/ml đối với Stenotrophomonas spp., 145,52 àg/ml đối với Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis và Pseudomonas aeruginosa Nồng độ diệt khuẩn có hiệu quả nhất ở dịch chiết của P tuber-regium (CP-182) là 24,12 àg/ml; của P ostreatus (CP-800) là 36,38 àg/ml Khụng chỉ kháng các vi khuẩn ở trên, dịch chiết của P tuber-regium còn có tác dụng kháng S typhi và P aeruginosa với MBC là 24,12 àg/ml, MBC là 48,23 àg/ml đối với S agalactiae, Stenotrophomonas spp., B subtilis, S aureus, L monocytogenes và ở 96,46 àg/ml đối với E coli (Adebayo et al., 2018) Cao chiết từ P sajor-caju cú tỏc dụng ức chế Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus (Ngai et al., 2004)
2 CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN
Cơ chế tổng hợp Lovastatin
Chú thích: LNKS: Lovastatin nonketide synthase
Cơ chế sinh tổng hợp Lovastatin ở Aspergillus terreus : Lovastatin được biết đến là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp được tổng hợp từ Aspergillus terreus (Kennedy et al., 1999) Năm 1999, Kennedy và nhóm của ông đã tìm thấy được 18 gen có liên quan tham gia con đường tín hiệu tổng hợp Lovastatin được tổ chức thành một cụm gen có kích thước 64 kb chứa nhiều gen có chức năng mã hóa cho nhiều enzyme khác nhau tham gia
Hình 1.3 Sơ đồ con đường chuyển hóa Lovastatin trên Aspergillus terreus
(Kennedy et al, 1999; Ma et al, 2009; Xu et al, 2013)
19 con đường chuyển hóa Lovastatin Con đường tín hiệu tổng hợp cũng được làm rõ thông qua các đặc điểm về di truyền (Kennedy et al., 1999; Hendrickson et al., 1999) và sinh hóa (Xie et al., 2009) Từ đó, hiểu được quá trình sinh tổng hợp Lovastatin sẽ mở ra một cơ hội tiềm năng nhằm tận dụng những kiến thức của các nhà khoa học góp phần cho những nỗ lực trong tương lai trong việc tác động, điều chỉnh, chỉ đạo việc sinh tổng hợp Lovastatin hoặc các hợp chất tương tự Lovastatin (Ames et al., 2012) Lovastatin được tổng hợp theo con đường polyketide synthase loại I lặp đi lặp lại (PKS) Quá trình tổng hợp Lovastatin đi theo 2 hướng, hướng 1 tổng hợp khung naphatalen-lactone do LovB và nhiều enzyme khác do qua nhiều giai đoạn phản ứng, hướng 2 tổng hợp chuỗi bên 2(S)-methylbutyrate chủ yếu do LovF xúc tác Sau đó, chuỗi bên sẽ gắn vào khung nhờ LovD Cụ thể hơn, Lovastatin nonketide synthase (LNKS hoặc LovB), enoylreductase (LovC) và Thioesterase (LovG) là những enzyme quan trọng để tổng hợp nên dihydromonacolin L bắt đầu từ 9 đơn vị acetyl-CoA và 1 đơn vị malonyl-CoA (Kennedy et al., 1999; Ma et al., 2009; Xu et al., 2013) Sau đó, dihydromonacolin L bị hydroxyl hóa và khử nước liên tục, lần lượt tạo ra axit monacolin L và axit monacolin J bởi có sự xúc tác của cytochrome P450 monooxygenase (LovA) Chính vì thế, lượng Lovastatin được kiểm soát thông qua việc tác động vào những gen có chức năng mã hóa cho các enzyme cần thiết tham gia xúc tác trong con đường chuyển hóa chất quý này.
Transesterase (LovD)
Transesterase là một enzyme được mã hóa từ gen LovD Enzyme này có chức năng xúc tác việc chuyển chuỗi bên α-metylbutyrat đến vị trí C8-hydroxy của axit monacolin
J (MJA) để tạo ra lovastatin Ngoài ra, theo như Hendrickson et al, 1999 và Kennedy et al, 1999 enzyme methylbutyryt transesterase còn xúc tác gắn axit 2 – metylbutyric vào monacolin J trong bước cuối cùng của con đường sinh tổng hợp lovastatin Để khẳng định transesterase có tầm quan trọng đến mức nào, có một số nghiên cứu đã thực hiện gây đột biến bất hoạt gen LovD trên Aspergillus terreus Kết quả cho thấy rằng mặc dù có gen LovB, LovF và LovC hiện diện và cho thấy có sự tích tụ monacolin J nhưng cuối
20 cùng lại không hình thành Lovastatin Điều đó ủng hộ cho quan điểm rằng transesterase tham gia vào phản ứng este hóa hình thành nên Lovastatin trong bước cuối cùng của con đường chuyển hóa Điều này đã được Martín và cộng sự của ông xác nhận khi cho gen
LovD biểu hiện trong E coli và khi đem ủ với monacolin J và CoA-thioester của 2(S)- methylbutyrate thì Lovastatin được tạo ra (Martín et al, 2014).
Lovastatin diketide synthase (LovF) 20 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
LovF là một enzyme do gen LovF tổng hợp gồm có 7 miền xúc tác: KS
(ketosynthase), AT (Acyl transferase), MeT (Methyl transferase), ACP (Acyl carrier protein), ER (enoyl reductase), DH (Dehydratase) và KR (ketoreductase) Enzyme này tham gia tổng hợp nên 2-metylbutyryl-CoA bắt đầu từ 2 đơn vị acetyl-CoA và 1 đơn vị malonyl-CoA, đây là hướng thứ 2 tổng hợp chuỗi bên của quá trình sinh tổng hợp Lovastatin Đây là nhân tố quyết định giúp chuyển đổi 2-methybutyryl–CoA thành alpha-methyl-beta-ketobutyryt (hay còn được gọi là monacolin J) LovF ngoài chức năng xúc tác việc tổng hợp chuỗi bên của alpha-S-methylbutyrate và sau đó được chuyển thành monacolin J, hình thành nên Lovastatin mà một miền protein mang acyl (ACP) của LovF có vai trò chuyển nhóm α-methylbutyrate đến transesterase (LovD), và sau đó đến Monacolin J (Hutchinson et al., 2000)
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các công cụ khai thác dữ liệu
- Trang cơ sở dữ liệu (CSDL) sinh học NCBI (National Center for Biotechnology Information) với địa chỉ trang web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ là CSDL được dùng để tìm kiếm và khai thác thông tin, dữ liệu sinh học
- Genbank: Là CSDL dùng cho việc tìm kiếm toàn bộ thông tin có liên quan đến trình tự nucleotide của một hoặc nhiều gen đã được mã hóa (DNA, RNA) và protein, genome,… đã công bố trên Pubmed
PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.pubmed/) là cơ sở dữ liệu sinh học tập hợp toàn bộ các bài báo khoa học đã được công nhận về Y - Sinh có trong MEDLINE.
- Phần mềm trực tuyến BLAST với địa chỉ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/: giúp tìm kiếm các vùng tương đồng cục bộ giữa các trình tự được lưu trữ trên Genbank của NCBI với trình tự đầu vào bằng cách so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trên Genbank để tìm ra các trình tự được cho là có tương đồng với trình tự truy vấn
- IDT analyzer với địa chỉ truy cập: https://sg.idtdna.com/calc/analyzer là phần mềm trực tuyến dùng để đánh giá các thông số quan trọng của mồi như: phần trăm GC, chiều dài của mồi, nhiệt độ nóng chảy cũng như khả năng mồi hình thành nên cấu trúc thứ cấp (hairpin-dimer, self-dimer và hetero-dimer),…
- Annhyb phiên bản 4.946: là phần mềm kết hợp nhiều công cụ dùng để chỉnh sửa và xử lí các trình tự nucleotide như: sắp gióng cột trình tự, đọc và xuất thông tin về trình tự mục tiêu cũng như kiểm tra độ đặc hiệu của mồi,
- Chromas Lite phiên bản 2.1.1: đây là phần mềm dùng để thực hiện đọc kết quả giải trình tự
- Bioedit version 7.2.5: Phần mềm dùng để phân tích và hiệu chỉnh trình tự gen, protein
Mẫu nấm
Mẫu nấm thuộc chi Pleurotus dùng trong nghiên cứu thực nghiệm gồm có hai mẫu được thu mua từ AEON Mall Canary Bình Dương ở khu phố Thuận An, tỉnh Bình Dương Hình ảnh về mẫu nấm thực nghiệm được hiển thị rõ nét trong hình sau
Hình 2.1 Hình ảnh mẫu nấm bào ngư T (a) và X (b) dùng trong nghiên cứu
Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
Các dụng cụ sử dụng bao gồm: erlen, bercher, đèn cồn, kẹp lấy mẫu, eppendorf, micro pipette, đầu tip, ống đong, chày tán mẫu,
Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức); máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý); cân kỹ thuật (Satoriois, Đức); máy luân nhiệt (My-Cycle Thermal, Biorad); máy đo quang phổ (Scanning UV/VIS, Smart Spec, Biorad); tủ lạnh (LG); tủ đông (Sanyo); tủ ủ nhiệt (Multitemp III); tủ hút khí độc (Ascent Max); lò vi sóng (Sharp); máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, Biorad); bộ điện di DNA (Biorad), cân kỹ thuật (SatRious, Đức)
1.3.3 Hóa chất của quá trình tách chiết DNA
Tris-HCl pH = 8 (1M); dd PBS 1X (dd H2O; NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4); NaCl 2,5M (đã hấp); β-mercaptoethanol 99,9%; CTAB 10%; H2O (đã hấp); proteinase K
1mg/ml; PCI: Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1); NaOAc 3M; TE 1X; Phenol; Isoamylalcohol; Chloroform; Ethanol 70%; Isopropanol
1.3.4 Hóa chất cho quá trình PCR và điện di
Master Mix (2X), primer reverse 10 μM, primer forward 10 μM, H2O (đã hấp), TBE 1X, Gel red, thang chuẩn 50 bp, agarose (1,5%).
Quy trình nghiên cứu
Hình 2.2 Quy trình thực hiện nghiên cứu
Tách chiết DNA tổng số Đo OD
Thực hiện khuếch đại các gen mục tiêu
Giải trình tự cho gen mục tiêu và hiệu chỉnh trình tự
Kết luận sự hiện diện của gen mục tiêu ở mẫu nấm phân tích và loài có tiềm năng trong y học
Phương pháp khai thác cơ sở dữ liệu
Tiến hành tìm kiếm và thu thập thông tin từ các bài báo khoa học về chi nấm Pleurotus và những thông tin trình tự của các gen liên quan con đường tín hiệu chuyển hóa Lovastatin được thu nhận từ các cơ sở dữ liệu uy tín như: NCBI, PUBMED, Web of Science, Google Scholar, ScienceDirect, có đính kèm theo các từ khóa như: Lovastatin AND Pleurotus, Biosynthesis Lovastatin pathway,
Phương pháp đánh giá mồi
2.2.1 Đánh giá thông số vật lý mồi
Các mồi nghiên cứu được thiết kế dựa trên các công bố trước Các thông số vật lý và vị trí mồi bắt cặp được kiểm tra trên trình tự và độ đặc hiệu của mồi Các thông số quan trọng của mồi được kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến IDT analyzer, phải đạt các tiêu chuẩn sau: chiều dài 18-28 bp, nhiệt độ nóng chảy (Tm) 50-60 °C, hàm lượng %GC 40-60%, không lặp lại các base G hoặc C liên tiếp dài hơn 3 base tại đầu 3' của mồi và năng lượng hình thành cấu trúc thứ cấp (ΔG) lớn hơn hoặc bằng - 9 kcal/mol.
2.2.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Sau khi kiểm tra chất lượng mồi, Annhyb v.4.946 sẽ xác định vị trí mối bắt cặp trên trình tự mục tiêu và kích thước sản phẩm PCR Đồng thời, phần mềm trực tuyến BLASTn trên NCBI sẽ kiểm tra tính đặc hiệu của mồi để đảm bảo độ chính xác trong quá trình thực nghiệm tiếp theo.
Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Tách chiết DNA bằng phương pháp Phenol/Chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB
Bước 1: Tiến hành ly giải tế bào với dung dịch đệm ly giải (lysis buffer) có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB
- Dùng kéo tách mẫu và kẹp gắp lấy một phần hệ sợi nấm (khoảng 100 mg) đưa vào trong ống eppendorf Sau đó, rửa 5-6 lần bằng dd PBS 1X Chuyển mẫu vào eppendorf mới và tán nhuyễn mẫu bằng chày (vô trùng) Tiếp theo cho vào epp (chứa mẫu đã nghiền) 700 μl dung dịch ly giải mẫu (lysis buffer) (dung dịch này gồm có: 70 μl Tris-HCl pH 1M; 392 μl NaCl 2,5 M; 14 μl β- mercaptoethanol
99,9%; 140 μl CTAB 10%; 14 μl dd H2O; 70 μl Proteinase K 1 mg/ml); đảo đều ống Lượng hóa chất dùng để pha 25 ml dd PBS (phosphate buffer saline) 1X thể hiện trong bảng 2.1
Bảng 2.1 Lượng hóa chất cần để pha dung dịch PBS 1X
Tên hóa chất Số lượng dd H2O 25 ml
Bước 2: Loại bỏ protein và các thành phần phụ khác
- Tiến hành ly tâm trong 10 phút ở 13000 vòng/phút
- Loại bỏ phần cặn, thu lấy dịch nổi, tiếp đó bổ sung 700 μl dung dịch PCI (phenol/chloroform/isoamylalcohol với tỉ lệ 25:24:1), lắc đều ống sau đó đem đi ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút
- Thu dịch nổi, bổ sung 1V chloroform, lắc đều Tiếp tục ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút
- Thu dịch nổi, bổ sung dung dịch NaOAC 3 M với tỉ lệ 1:10V, lắc đều Sau đó, thêm vào 1V isopropanol, lắc đều và đem epp đi ủ ở 4 o C trong vòng 2 giờ
- Ly tâm epp mẫu ở 13000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa
- Bổ sung vào epp 1ml ethanol 70%, đem ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở
- Làm khô cặn ở 50 o C (loại bỏ ethanol)
- Đem trữ mẫu ở -20 o C cho đến khi thực hiện nghiên cứu
2.3.2 Kiểm tra độ tinh sạch của DNA
Nguyên tắc: Nồng độ DNA trong mẫu tách chiết được xác định dựa trên giá trị của mật độ quang OD260 (Optical Density 260 nm và A260 = 1 = 50μg/ ml DNA sợi đôi) Có thể xác định được hàm lượng DNA dựa trên sự hấp thụ cực đại ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
260 nm Hơn nữa, protein hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 280nm Vì thế, tiến hành đo ở các bước sóng lần lượt là 260 và 280 nm nhằm kiểm tra mức độ tinh sạch và tính toán nồng độ DNA có trong dung dịch mẫu Tỉ số A260/A280 được áp dụng nhằm mục tiêu đánh giá độ tinh sạch của DNA Tỉ số này nếu nằm từ 1,8 đến 2,0 cho thấy DNA đã tách chiết được tinh sạch Trường hợp tỉ số nhỏ hơn 1,8 chứng tỏ mẫu còn nhiễm protein, còn trường hợp tỉ số lớn hơn 2,0 thì mẫu tách chiết nhiễm RNA Chỉ số A230 cũng được tiến hành đo chung với chỉ số A260 và A280 Chỉ số A230 cho thấy mẫu DNA có khả năng bị nhiễm tạp chất (carbonhydrate hoặc phenol)
Quy trình thực hiện: Pha loãng DNA bộ gen tách chiết 50 lần bằng TE 1X Tiếp đó, đưa toàn bộ dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở các bước sóng 260 nm, 280 nm,
230 nm Thực hiện xác định độ tinh sạch của DNA bằng tỉ số A260/A280 Tỉ số này nếu dao động trong khoảng cho phép từ 1,8 đến 2,0 là đạt yêu cầu
2.3.3 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nhằm khuếch đại gen LovF, LovD được tham khảo trong các công bố của Zhgun và cộng sự Và thông tin về các mồi dùng trong thực nghiệm được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 Thông tin về mồi sử dụng trong thực nghiệm
Gen Mồi Kí hiệu Trình tự (5’-3’)
Bảng 2.3 Thành phần của một phản ứng PCR
Mồi xuôi LovD-F; LovF-F (10uM) 0,5 μl Mồi ngược LovD-R; LovF-R (10uM) 0,5 μl
Chu trình nhiệt độ chung của PCR bao gồm quá trình bắt cặp mồi ở nhiệt độ tối ưu (X), biến tính DNA ở nhiệt độ cao và kéo dài DNA ở nhiệt độ trung bình Sau khi tiến hành PCR, sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,5% bằng dung dịch đệm TBE ở mức điện thế 135V trong 30 phút Kết quả điện di được quan sát bằng máy chụp ảnh gel BioRad.
Sau khi xác nhận sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di, các mẫu đạt yêu cầu về kích thước sẽ được tiến hành giải trình tự Sanger tại Nam Khoa, Q.7, TP HCM Phương pháp Sanger sử dụng dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng kéo dài mạch DNA, do ddNTP thiếu nhóm 3'-OH cần thiết cho liên kết phosphodiester với nucleotide tiếp theo.
Tiến hành hiển thị trình tự bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1 Kiểm tra các peak ở 2 đầu của trình tự mồi xuôi và mồi ngược, nếu peak không rõ ràng phải tiến hành hiệu chỉnh Đối với mạch F, tiến hành xuất (exprort) thành file fasta, còn mạch R tiến hành reverse & complement và xuất thành file fasta Sử dụng phần mềm Bioedit để sắp gióng cột và kiểm tra mức độ giống nhau của trình tự, hiệu chỉnh trình tự của 2 mạch Nếu có những lỗi (mismatch) hay những gap trong trình tự thì tiến hành mở lại trình tự bằng phần mềm
Chromas lite 2.1.1 để so sánh, kiểm tra lại các peak hiện diện có rõ hay không và đưa ra kết luận sau cùng để xuất trình tự cuối cùng có độ chính xác nhất của đoạn DNA
2.3.6 So sánh với cơ sở dữ liệu Genbank
Sau khi hiệu chỉnh và xuất ra trình tự có độ chính xác nhất của đoạn DNA, tiếp theo sẽ tiến hành đánh giá trình tự bằng BLAST Nếu cho ra kết quả trình tự tương đồng và phù hợp Nếu có thể tìm được một vài trình tự hoàn toàn tương đồng về chiều dài, có sự giống nhau giữa các nucleotide với trình tự đang hướng đến thì trình tự nghiên cứu sẽ được chấp nhận là đã hiệu chỉnh xong Nếu trường hợp trình tự hiệu chỉnh có sai khác đối với các trình tự trên Genbank của NCBI thì tiến hành xem xét lại các nucleotide có sự sai khác này Dựa vào peak tương ứng trên Chromas lite 2.1.1 để xác định chính xác vì có thể là lỗi kỹ thuật trong quá trình hiệu chỉnh hoặc giải trình tự Nếu peak không rõ ràng, không thể nhận ra là nucelotide nào thì phải giải quyết như sau: tiến hành thu nhận những trình tự có mức tương đồng hơn 50% trên NCBI so với trình tự nghiên cứu, sắp gióng cột và kiểm tra tần số xuất hiện tại nucleotide là nucleotide nào rồi xác định nucleotide cần thay thế ở vị trí đó Kết thúc việc kiểm tra và hiệu chỉnh sẽ thu nhận được trình tự mang sự chính xác cũng như đạt độ tin cậy lớn nhất
PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN
Kết quả kiểm tra thông số vật lí của các cặp mồi bằng IDT analyzer
Bảng 3.1 Các thông số vật lí của các cặp mồi
Gen Kí hiệu Trình tự (5’-3’) L
- (1) Hairpin dimer là cấu trúc kẹp tóc, (2) Self dimer là sự tự bắt cặp của mồi, (3) Hetero dimer là mồi xuôi và mồi ngược tự bắt cặp chéo với nhau
- L là chiều dài mồi (bp)
- Nhiệt độ nóng chảy (T m ): là điểm nhiệt độ mà tại đó 50% DNA mạch đôi tách nhau tạo thành DNA mạch đơn
- Năng lượng tự do (Gibbs free energy) ΔG (kcal/mole) được hiểu là mức độ liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp ở mồi
Theo như phân tích IDT, việc đánh giá các thông số quan trọng của cặp mồi tham khảo dựa vào một số tiêu chí sau: chiều dài mồi thường dao động 17-28 bp; %GC tốt khoảng 40-60% để không ảnh hưởng đến (Tm) của mồi Mồi với %GC lớn hơn có thể dẫn đến phản ứng kém hiệu quả vì không biến tính tốt trong khi thực hiện PCR Kết quả sau khi khảo sát IDT cho thấy cặp mồi trên có chiều dài 19-20 bp phù hợp với tiêu chí;
%GC nằm trong khoảng 40-60% Tm của các mồi cũng là thông số rất quan trọng, dựa trên đó mà quyết định nhiệt độ bắt cặp (Ta) của mồi trên mạch đơn DNA trong quá trình diễn ra PCR Tm của mồi đã được tham khảo đạt yêu cầu vì nằm trong khoảng 50-65 0 C
Ta của mồi nên thấp hơn Tm của mồi khoảng 5 0 C để đảm bảo mồi bắt được với mạch đơn DNA
Trong phản ứng PCR, cấu trúc thứ cấp của mồi như hairpin, homo-dimer và hetero-dimer làm giảm hiệu quả phản ứng do cản trở quá trình liên kết mồi với trình tự đích Mối liên kết của mồi có ΔG < -9 kcal/mol sẽ hạn chế tối đa cấu trúc thứ cấp, đảm bảo tính đặc hiệu PCR Đối với cặp mồi LovF-F/R và LovD-F/R, các đặc tính vật lý (chiều dài, %GC, Tm) và năng lượng liên kết đều nằm trong ngưỡng cho phép, đảm bảo phản ứng PCR diễn ra hiệu quả.
34 mồi đạt yêu cầu, Tm của mồi xuôi là 56,7 o C và bằng với mồi ngược, chênh lệch nhiệt độ giữa hai mồi là 0 o C %GC của mồi xuôi là 57,1%, mồi ngược là 57,1%, nằm trong khoảng giá trị cho phép, nên mồi đạt yêu cầu Khảo sát năng lượng liên kết tự do (∆G) của cặp mồi đa số đều đạt yêu cầu theo tiêu chí của IDT Kết luận mồi đạt yêu cầu, có khả năng khuếch đại gen mục tiêu LovD.
Kết quả kiểm tra cặp mồi Transesterase (LovD) trên phần mềm Annhyb và
Sau khi thực hiện khảo sát các thông số của cặp mồi LovD-F/R bằng IDT và cho thấy mồi đạt yêu cầu theo đúng như các tiêu chí trước đó, bước tiếp theo độ đặc hiệu của mồi sẽ được tiến hành kiểm tra trên phần mềm Annhyb và phần mềm Blast trên trang cơ sở dữ liệu NCBI
Hình 3.1Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Annhyb của cặp mồi LovD-F/R
Trong hình minh họa, các vị trí bắt cặp của mồi LovD-F được thể hiện bằng màu xanh lá, các vị trí bắt cặp của mồi LovD-R được thể hiện bằng màu đỏ Ngược lại, các vị trí không bắt cặp của mồi được thể hiện bằng màu hồng.
Hình trên thể hiện vị trí bắt cặp của cặp mồi LovD-F/R lên trên trình tự loài đại diện là Pleurotus ostreatus với mã số truy cập là XM_036772010 Kết quả cho thấy mồi
LovD-F bắt cặp 57,14% với trình tự từ 188 bp - 208 bp, mồi LovD-R bắt cặp 39,52% với trình tự từ 271 bp – 292 bp Sản phẩm khuếch đại thu được có chiều dài 105 bps
Hình 3.2 Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Blast của cặp mồi LovD-F/R
Hình trên thể hiện kết quả Blast của cặp mồi LovD-F/R, theo như kết quả này thì thấy rằng cặp mồi trên bắt cặp được một phần vùng trình tự của loài Pleurotus Do đó,
LovD-F-R là cặp mồi khuếch đại được vùng gen với các điểm số: E value = 110; Max score = 22,9; Total score = 22,9; Query cover = 19%; Max ident = 100%.
Kết quả kiểm tra cặp mồi Lovastatin diketide synthase (LovF) trên phần mềm
Sau khi xác nhận mồi LovF-F/R đạt yêu cầu thông qua công cụ IDT, nhóm nghiên cứu tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm ANNHYB và công cụ BLAST trên kho dữ liệu GenBank của NCBI.
Hình 3.3 Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Annhyb của cặp mồi LovF-F/R
Chú thích: Màu xanh lá thể hiện vị trí bắt cặp của mồi LovF-F, màu đỏ thể hiện vị trí bắt cặp của mồi LovF-R, màu hồng là vị trí không bắt cặp của mồi
Hình trên thể hiện vị trí bắt cặp của cặp mồi LovF-F/R lên trên trình tự loài đại diện là Pleurotus ostreatus với mã số truy cập là XM_036772119 Kết quả cho thấy mồi
LovF-F bắt cặp 51% với trình tự từ 377 bp - 396 bp, mồi LovF-R bắt cặp 43,68% với trình tự từ 591 bp – 611 bp Sản phẩm khuếch đại thu được có chiều dài 235 bps
Hình 3.4 Kết quả kiểm tra bằng phần mềm Blast của cặp mồi LovF-F/R
Hình trên thể hiện kết quả Blast của cặp mồi LovF, theo như kết quả này thì cặp mồi trên bắt cặp được một phần vùng trình tự của loài Pleurotus Do đó, LovF-F/R là cặp mồi khuếch đại được vùng gen với các điểm số: E value = 14; Max score = 24,7; Total score = 24,7; Query cover = 33%; Max ident = 100%
Kết quả tách chiết DNA
Hai mẫu nấm thuộc chi Pleurotus sau khi được thu mua tại AEON Mall Canary
Bình Dương thuộc khu phố Thuận An, tỉnh Bình Dương sẽ tiến hành tách chiết DNA bộ gen theo phương pháp Phenol/Chloroform có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB Sau khi tách chiết sẽ tiến hành kiểm tra mức độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo
OD ở bước sóng 260 nm, 280 nm và 230 nm Kết quả đo được thể hiện trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Giá trị đo OD của các mẫu nấm thuộc chi Pleurotus
Chú thích: X: Nấm bào ngư xám
A 260 ; A 280 ;A 230 : Bước sóng đo OD lần lượt ở 260 nm; 280 nm và 230 nm C: nồng độ DNA có trong dung dịch (μg/ml)
Bảng trên thể hiện kết quả đo OD cho hai mẫu nấm thực nghiệm Theo như kết quả thể hiện được thì tỉ số A260/A280 của hai mẫu nấm X và T đạt được giá trị nằm trong khoảng cho phép 1,8 – 2,0 cho thấy mẫu DNA tách chiết tinh sạch, không bị nhiễm protein hay RNA Tỉ số A260/A230 có giá trị nằm trong khoảng 2,0 – 2,2 cho thấy mẫu không bị nhiễm phenol, carbonhydrate Điều đó cho thấy mẫu tách chiết bằng phương pháp Phenol/ Chloroform có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB cho hiệu quả tách chiết tốt DNA tách chiết tinh sạch, đạt được nồng độ DNA khá cao do đó thỏa điều kiện để tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại các gen mục tiêu
Kết quả phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu
Sau khi tách chiết, DNA được kiểm tra độ tinh sạch và khuếch đại bằng phản ứng PCR cho vùng gen liên quan đến con đường tín hiệu chuyển hóa Lovastatin, gồm transesterase (LovD) và Lovastatin diketide synthase (LovF) Sau đó, sản phẩm PCR được tiến hành định tính bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.
Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR của gen LovD
Chú thích: X: mẫu nấm thực nghiệm bào ngư xám; T: mẫu nấm thực nghiệm bào ngư trắng; N: chứng âm; L: là thang phân tử 50 bp
Hình ảnh trên là kết quả điện di của gen LovD sau phản ứng PCR Kết quả này cho thấy mẫu âm tính (N) chỉ có một băng duy nhất khoảng 50bp, điều này là do các mồi đã tự bắt cặp với nhau nên không xảy ra tạp nhiễm trong quá trình khuếch đại Trái lại, ở mẫu X, ta thấy xuất hiện một băng sản phẩm duy nhất có kích thước khoảng 100 bp - gần tương đồng với kích thước sản phẩm dự kiến là 105 bp sau khi khảo sát in silico trên loài nấm đại diện Pleurotus ostreatus Ngoài ra, kích thước này cũng khá gần với kích thước 204 bp được nhóm tác giả Zhgun et al., 2019; 2020 tham khảo Mẫu T cũng xuất hiện một băng có kích thước 50 bp bằng với kích thước của mẫu âm tính, cho thấy rằng ở mẫu này, các mồi cũng đã tự bắt cặp với nhau Do đó, có thể kết luận rằng cặp mồi LovD-F/R đã khuếch đại thành công gen mục tiêu ở mẫu X, trong khi không khuếch đại thành công ở mẫu T.
T Tiếp đó, sản phẩm PCR của mẫu X sẽ được đem đi giải trình tự ở công ty Nam Khoa và tiến hành Blast nhằm khẳng định chính xác trình tự khuếch đại chính là gen đích transesterase hiện diện trên mẫu nấm này
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR của gen LovF
Chú thích: T: mẫu nấm thực nghiệm bào ngư trắng; X: mẫu nấm thực nghiệm bào ngư xám; N: chứng âm; L: thang phân tử 50 bp
Theo kết quả điện di thì chứng âm (N) không xuất hiện băng sáng, chứng tỏ không bị tạp nhiễm trong quá trình khuếch đại Dựa trên hình thấy ở mẫu X xuất hiện băng sản phẩm duy nhất với kích thước khoảng 200 bp, còn băng khoảng 70 bp là do mồi tự bắt cặp Kích thước này gần đúng với kích thước sản phẩm dự kiến 235 bp từ khảo sát in silico trên loài đại diện Pleurotus ostreatus và gần bằng với kích thước tham khảo 237 bp từ nhóm tác giả Zhgun et al., 2018; 2020 Bên cạnh đó, mẫu T không thấy xuất hiện băng sáng theo như kích thước dự kiến nên kết luận cặp mồi LovF-F/R không khuếch đại thành công gen mục tiêu đối với mẫu nấm này Như vậy, nghiên cứu đã khuếch đại thành công vùng gen LovF bằng cặp mồi LovF-F/R trên mẫu nấm bào ngư xám (mẫu X)
Tiếp theo, sản phẩm PCR của mẫu X sẽ được đem đi giải trình tự để tiến hành Blast kiểm tra, khẳng định chính xác trình tự khuếch đại chính là gen đích Lovastatin diketide synthase hiện diện trên mẫu nấm này.
Kết quả giải trình tự
Sau khi khuếch đại trình tự gen LovD mục tiêu thành công bằng PCR, kích thước sản phẩm được xác nhận lại bằng phương pháp điện di đã nêu trước đó Kết quả chứng minh sự hiện diện của gen LovD trong mẫu nấm bào ngư xám Để khẳng định độ chính xác của băng sản phẩm, mẫu đã được tiến hành giải trình tự.
Hình 3.7 Kết quả giải trình tự gen LovD của mẫu X (một đoạn trình tự đại diện)
Hình 3.8 Kết quả Blast kết quả giải trình tự gen LovD trên mẫu X
Hình trên thể hiện kết quả Blast của gen LovD ở mẫu X sau khi thu nhận kết quả từ công ty Nam Khoa Theo như kết quả Blast thì trình tự gen mục tiêu đã thu nhận có sự tương đồng cao với trình tự gen có mã truy cập XM_036773087 của loài Pleurotus ostreatus với điểm số tương đồng 90, 65%, E value = 8e-36, Query cover = 32%, Max score = 149, Total score = 149 Dựa vào Blast cho thấy trình tự gen của loài này mã hóa cho protein chưa biết chức năng cụ thể ở loài Pleurotus và giống với kết quả dự kiến khảo sát in silico Hay nói cách khác, kết quả giải trình tự của mẫu X có sự trùng khớp với trình tự của loài Pleurotus ostreatus Từ đó, kết hợp kết quả Blast này với kết quả khảo sát in silico và kết quả điện di, kết luận nghiên cứu đã khuếch đại thành công trình tự gen LovD tham gia con đường tín hiệu chuyển hóa Lovastatin ở loài Pleurotus Hình ảnh bổ sung kết quả trình tự gen LovD được trình bày trong phần phụ lục
Việc triển khai đề tài khảo sát sự hiện diện của gen LovD là cần thiết vì nó mã hóa cho transesterase Đây là một enzyme tham gia xúc tác phản ứng gắn chuỗi bên α- metylbutyrat đến vị trí C8-hydroxy của axit monacolin J (MJA) trong bước cuối cùng của con đường chuyển hóa để tạo ra lovastatin (Kennedy et al., 1999; Hendrickson et al., 1999) Nếu không có sự hiện diện và biểu hiện của LovD thì sản phẩm cuối cùng có được từ con đường chuyển hóa chỉ là monacolin J mà không có sự hình thành Lovastatin (Martín et al., 2014) Vì thế có thể kết luận rằng gen LovD có vai trò quyết định sau cùng đến việc sinh tổng hợp Lovastatin trong loài Aspergillus nói chung và loài Pleurotus mà nghiên cứu đang khảo sát nói riêng.
Sau khi thực hiện khuếch đại trình tự gen mục tiêu LovF bằng phương pháp PCR và kiểm tra kết quả theo phương pháp điện di Cùng với đó chứng minh có sự hiện diện của gen LovF ở mẫu nấm bào ngư xám, để khẳng định tính chính xác của băng sản phẩm, mẫu được đem giải trình tự
Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen LovF của mẫu X (một đoạn trình tự đại diện)
Hình 3.10 Kết quả Blast kết quả giải trình tự gen LovF trên mẫu X
Hình trên thể hiện kết quả Blast của gen LovF ở mẫu X sau khi thu nhận kết quả từ công ty Nam Khoa Theo như kết quả Blast thì trình tự gen mục tiêu thu nhận được có sự tương đồng cao với trình tự gen có mã truy cập XM_036780233 của loài Pleurotus ostreatus với điểm số tương đồng 95%; E value = 9,6; Query cover = 9%, Max score 29,2; Total score = 29,2 Dựa vào Blast cho thấy kết quả giải trình tự của mẫu X có sự trùng khớp với trình tự gen của loài Pleurotus ostreatus Kết hợp giữa kết quả khảo sát in silico, kết quả điện di với kết quả Blast, kết luận nghiên cứu đã khuếch đại thành công
44 trình tự gen LovF tham gia con đường tín hiệu chuyển hóa Lovastatin ở loài Pleurotus Hình ảnh bổ sung kết quả trình tự gen LovF được trình bày trong phần phụ lục.
Như đã đề cập trước đó, theo Kennedy et al., 1999 thì gen LovF mã hóa cho lovastatin diketide synthase (LDKS), enzyme này chịu trách nhiệm cho sự tổng hợp chuỗi bên (2R)-2-methylbutyryl của lovastatin Gen LovF đã được nhiều công trình chứng minh có vai trò rất quan trọng cho quá trình tổng hợp Lovastatin Một nghiên cứu về sự tương tác giữa protein–protein đã chứng minh rằng gen LovD và LovF đóng vai trò then chốt trong việc chuyển (2R)-2-methylbutyryl-CoA từ LDKS (được mã hóa từ gen LovF) đến cho transferase được mã hóa bởi gen LovD, do đó đảm bảo hiệu quả trong việc sinh tổng hợp lovastatin (Xie et al., 2006) Sự biểu hiện vượt mức của gen này có chức năng giúp cải thiện tổng hợp statin (Hutchinson et al., 2005) Một nghiên cứu khác đã chứng minh sự tổng hợp Lovastatin đã được cho là có sự tương quan với việc tăng sự biểu hiện của gen LovF và LovB (Sorrentino et al., 2010).
