tạo dòng biểu hiện tinh chế protein rhau53 cfp cho cảm ứng sự dimer protein bằng cấu trúc rna g quadruplex

Trong khi đó, G-quadruplex là những cấu trúc thứ cấp đặc biệt của DNA và RNA được đánh giá là đầy tiềm năng cho sự dimer protein vì cấu trúc này hình thành ngay trong tế bào cơ thể nên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

^0® -BÙI NHƯ NGỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

BÙI NHƯ NGỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Bùi Như Ngọc

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học y dược Mã học viên: 1653010193 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Bùi Như Ngọc

Giảng viên hướng dẫn: TS ĐẶNG THANH DŨNG

Học viên thực hiện: BÙI NHƯ NGỌC Lớp: DH16YD01 Ngày sinh:14/07/1998 Nơi sinh: Long An

Tên đề tài: TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH CHẾ PROTEIN RHAU53-CFP CHO CẢM ỨNG SỰ DIMER PROTEIN BẰNG CẤU TRÚC RNA G-QUADRUPLEX

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên:

được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: Đồng ý cho sinh viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô Khoa Công nghệ sinh học trong suốt bốn năm học qua đã cho em kiến thức, bản lĩnh, tinh thần làm việc đầy khoa học và trách nhiệm

Xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học đã tạo môi trường học tập, tiếp thu kiến thức và các kĩ năng nghiên cứu cho em trong suốt thời gian vừa qua

Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Đặng Thanh Dũng là người đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt rất nhiều kiến thức quý báu, giúp em nỗ lực hơn trong học tập và hoàn thành thật tốt khóa luận tốt nghiệp Một lần nữa em xin cảm ơn thầy rất nhiều

Xin cảm ơn chị Tươm, chị Phương, và các anh chị phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã quan tâm và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Xin cảm ơn bạn Nguyễn Thị Thu Thảo và tất cả những người bạn đã cùng học tập, chia sẻ kiến thức, giúp đỡ vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học tập

Lời cảm ơn chân thành, sâu sắc cuối cùng xin gửi đến bố, mẹ người luôn chăm sóc, bên cạnh và động viên con rất nhiều trong suốt thời gian 4 năm học tập

Bình Dương, ngày 22 tháng 07 năm 2020

BÙI NHƯ NGỌC

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sự dimer protein 3

1.1.1 Dimer và vai trò của sự dimer hóa protein 3

1.1.2 Các phương pháp tạo protein dimer 3

Khóa luận tốt nghiệpTrang ii GVHD: Đặng Thanh Dũng

1.4 Phương pháp FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer-Truyền

năng lượng cộng hưởng huỳnh quang) 16

1.4.1 Nguyên tắc 16

1.4.2 Cặp protein CFP và YFP 17

PHẦN 2 18

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu 19

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị: 19

2.2.2 Hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm 20

2.2.2.1 Hóa chất dùng trong PCR 20

2.2.2.2 Hóa chất điện di DNA 20

2.2.2.3 Hóa chất dùng trong phản ứng cắt giới hạn và nối 20

2.2.2.4 Hóa chất dùng trong tạo tế bào E.coli khả nạp 20

2.2.2.5 Hóa chất dùng trong biểu hiện và tinh chế protein 21

2.2.2.6 Hóa chất điện di protein 21

2.2.2.7 Các hóa chất khác 21

2.2.3 Vật liệu sinh học 22

2.2.3.1 Chủng vi sinh vật 22

2.2.3.2 Plasmid, DNA, RNA và protein 22

2.3.1 PCR thu gen CFP với cặp mồi đặc hiệu 25

2.3.2 Tạo vector tái tổ hợp pRHAU-CFP 27

2.3.3 Sàng lọc dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp 29

2.3.4 Tinh sạch, thu nhận plamid 30

2.3.5 Giải trình tự 31

2.3.6 Biểu hiện protein tái tổ hợp 31

2.3.6.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pRHAU53-CFP vào chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) 31

2.3.6.2 Kiểm tra tính tan của protein RHAU53-CFP 32

2.3.6.3 Tinh chế protein RHAU53-CFP 33

2.3.7 Cảm ứng tạo cấu trúc RNA G-quadruplex 35

PHẦN 3 36

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả dòng hóa tạo vector pRHAU53-CFP 37

3.1.1 Thu nhận gen CFP 37

3.1.2 Tạo vector tái tổ hợp pRHAU53-CFP 37

3.1.3 Giải trình tự 39

3.2 Biểu hiện và tinh chế protein RHAU53-CFP 40

3.2.1 Sàng lọc chủng biểu hiện mang vector tái tổ hợp pRHAU53-CFP 40

3.2.2 Kiểm tra tính tan của protein RHAU53-CFP 40

3.2.3 Kết quả tinh chế protein mục tiêu 41

3.3 Cảm ứng tạo cấu trúc RNA G-quadruplex 43

Phần 4 41

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 41

Khóa luận tốt nghiệpTrang iv GVHD: Đặng Thanh Dũng

4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 Tài liệu tham khảo 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Sự dimer protein (A) homodimer; (B) heterodimer (Charles và cộng sự, 2013) 3 Hình 1 2: Các phương pháp tạo protein dimer 4 Hình 1 3: Cấu trúc protein caspase-9 sau khi đột biến có thể hình thành thể dimer (Y Chao và cộng sự, 2005) 5 Hình 1 4: (A) cấu trúc c-Fos – c-Jun heterodimer (B) Mô hình dimer protein của cấu trúc dây kéo leucine (c-Jun và c-Fos) (GyörgyVámosi và cộng sự, 2008) 6 Hình 1 5: Cucurbit[8]uril lựa chọn liên kết và dimer tripeptide phenylalanine-glycine-glycine (FGG) (Urbach, 2006) 7 Hình 1 6: Thiết kế tạo dimer bằng các phân tử nhỏ (A) tạo dimer protein bằng phân tử có hai bán phần đối xứng, (B) tạo protein dimer bằng phân tử có hai bán phần bất đối xứng 8 Hình 1 7: Phức hợp FKBP-Rapamycin-FRB 8 Hình 1 8: Thiết kế tạo protein dimer bằng ion Ni2+ ( Tezan và cộng sự, 2009) 9 Hình 1 9: G-quadruplex được hình thành từ những chuỗi DNA hoặc RNA giàu Guanine liên tục 10 Hình 1 10: Chức năng sinh học của G-quadrplex trong tế bào (Lipps và cộng sự, 2009) 11 Hình 1 11: Cấu trúc G-quadruplex 11 Hình 1 12: Hai guanine liên kết hydrogen Hoogsteen ở các vị trí N1, N2 và O6, N7 12 Hình 1 13: Các kiểu cấu trúc song song và không song song của G-quadruplex (Oscar và cộng sự, 2019) 13 Hình 1 14: Khác với DNA G-quadruplex, RNA G-quadruplex chỉ có kiểu cấu trúc song song, tuy nhiên lại có tính ổn định hơn so với cấu trúc DNA G-quadruplex 14 Hình 1 15: RHAU chứa trình tự peptide đặc hiệu ngắn RSM có khả năng nhận diện và bám vào cả DNA và RNA với ái lực cao (Lattmann và cộng sự, 2010) 15

Khóa luận tốt nghiệpTrang vi GVHD: Đặng Thanh Dũng

Hình 1 16: (A) 4 guanine của G-tetrad tương tác với 4 amino acid G9, I12, G13 và A17 của RHAU B) 3 amino acid tích điện dương của RHAU (K8, R10 và K19) tương tác với khung sườn phosphate tích điện âm (C) tương tác theo tỉ lệ 1 G-

quadruplex : 2 RHAU (Heddi và cộng sự, 2015) 16

Hình 1 17: Nguyên tắc phương pháp FRET (Hussain và cộng sự 2009) 17

Hình 1 18: CFP và YFP là cặp protein sử dụng phổ biến trong phương pháp FRET 18

Hình 2 1: Sơ đồ plamid pET-Duet1 22

Hình 2 2: Thang chuẩn sử dụng trong thí nghiệm điện di 24

Hình 2 3: Quy trình dòng hóa tạo vector tái tổ hợp chứa gen RHAU53-CFP 25

Hình 2 4: Chu trình nhiệt PCR 27

Hình 2 5: Vị trí bắt cặp của mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pRHAU53 30

Hình 2 6: quy trình tinh chế thu nhận protein mục tiêu 34

Hình 3 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen mục tiêu CFP M là thang DNA 37

Hình 3 2: Nuôi cấy dòng tế bào E coli chứa vector tái tổ hợp trên môi trường amp A) Chủng E coli DH5α chứa vector tái tổ hợp, B) Chủng E coli DH5α không chứa vector tái tổ hợp 38

LB-Hình 3 3: Kết quả điện di 4 sản phẩm PCR khuẩn lạc ngẫu nhiên từ đĩa nuôi cấy M là thang DNA Ladder 200bp 39

Hình 3 4: Kết quả giải trình tự với trình tự mồi ON30 39

Hình 3 5: Kết quả sàng lọc chủng biểu hiện mang vector pRHAU53-CFP A) chủng có mang vector mục tiêu, B) chủng không mang vector mục tiêu 40

Hình 3 6: Khảo sát tính tan của protein RHAU53-CFP 41

Hình 3 7: Kết quả SDS-PAGE kiểm tra việc tinh chế protein RHAU53-CFP M:Thang protein OD1,2: Mẫu sau cảm ứng IPTG 42

Hình 3 8: Kết quả phân tích CD của mẫu cảm ứng RNA để tạo G-quadruplex 43

Khóa luận tốt nghiệpTrang viii GVHD: Đặng Thanh Dũng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CFP Cyan Fluorescent Protein

dH2O distilled water

DNA Deoxyribose Nucleic Acid

dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acide

EGFR Epidermal growth factor receptor

FGG Tripeptide phenylalanine-glycine-glycine

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

GPCR G-protein-coupled receptors

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB-Amp Môi trường Luria-Bertani chứa Ampicillin

PCR Polymerase Chain Reaction

PMSF Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride

RHAU RNA Helicase associated with AU-rich element

RHAU53 protein RHAU dài 53 amino acid

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TAE Tris-Acetate-EDTA

TEMED N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine

YFP Yellow Fluorescent Protein

Khóa luận tốt nghiệpTrang 1 GVHD: Đặng Thanh Dũng

MỞ ĐẦU

Trong cơ thể, protein dimer đóng vai trò như một nhân tố điều hòa Trên thực tế, các protein hầu như không hoạt động “một mình” khi thực hiện chức năng của chúng trong cơ thể (Yanagida, 2002), một nghiên cứu đã báo cáo rằng có hơn 80% protein hoạt động ở các dạng phức hợp (Berggard và cộng sự, 2007) dimer hoặc oligomer Việc tự liên kết các protein monomer để tạo thành các thể dimer hoặc oligomer bậc cao là một hiện tượng rất phổ biến Protein dimer đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như điều hòa enzyme, phiên mã, con đường truyền tín hiệu và thậm chí điều hòa con đường gây bệnh

Các nghiên cứu về cấu trúc và sinh lý gần đây cho thấy sự dimer hoặc oligomer hóa protein là yếu tố chính trong việc điều hòa các protein như enzyme, kênh ion, thụ thể và các yếu tố phiên mã Cụ thể như trong tế bào, enzyme pro-caspase-9 tồn tại ở dạng monomer không có hoạt tính, khi được dimer caspase-9 sẽ cắt và kích hoạt caspase 3/7, từ đó kích thích quá trình apoptosis và mang đến nhiều tiềm năng trong việc điều trị ung thư (Riedl và cộng sự, 2004), (Ledgerwood và cộng sự, 2009) Ngoài ra, sự dimer các thụ thể G-protein-coupled receptors (GPCR) trên bề mặt tế bào kích thích quá trình truyền dẫn tín hiệu nội bào dẫn đến tạo ra các phản ứng thích hợp cho tế bào,…( Renatus và cộng sự, 2001) Do đó, việc hình thành và kiểm soát dimer protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng trong tế bào

Hiện nay, có nhiều nhiều công trình nghiên cứu tìm ra phương pháp tạo ra protein dimer, tuy nhiên mỗi phương pháp vẫn còn tồn tại một số hạn chế nhất định Đầu tiên, phương pháp thiết kế protein (protein engineering) được áp dụng và mang lại những kết quả đáng chú ý nhưng sự dimer chỉ diễn ra theo một chiều, tức là chỉ hình thành mà không tách cấu trúc dimer ra được, dẫn đến việc cản trở quá trình điều hòa hoạt tính của protein Sau đó, phương pháp sử dụng các phân tử từ bên ngoài để cảm ứng sự dimer protein ra đời đã giải quyết được những hạn chế của các phương pháp trước đây Nhưng việc can thiệp vào cấu trúc tế bào bằng các phân tử lạ lại mang đến nhiều hạn chế, ví dụ như Rapamycin được sử dụng như một phân tử cảm ứng sự

dimer nhưng lại gây độc cho tế bào người và những nghiên cứu ứng dụng thì chưa được sử dụng rộng rãi

Trong khi đó, G-quadruplex là những cấu trúc thứ cấp đặc biệt của DNA và RNA được đánh giá là đầy tiềm năng cho sự dimer protein vì cấu trúc này hình thành ngay trong tế bào cơ thể nên có độ an toàn cao Sự hình thành G-quadruplex ở đầu telomer và vùng promoter đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình sinh học như kéo dài telomer, phiên mã, dịch mã và sao chép ( Tuấn Anh, 2010) Mặt khác, G-quadruplex có thể gắn đặc hiệu và dimer RHAU peptide và sự liên kết chặt chẽ của RHAU peptide với protein CFP VÀ YFP cho phép thiết kế xây dựng mô hình cảm ứng sự dimer phức hợp RHAU-CFP/RHAU-YFP bằng G-quadruplex (Lattmann và cộng sự, 2010)

Trong thí nghiệm dimer protein, hai protein được quan tâm đến là CFP và YFP vì đây là 2 protein dễ biểu hiện, bền và đặc biệt là có sự chồng lấp giữa quang phổ phát ra của CFP (Cyan Fluorescent Protein) với quang phổ hấp thụ của YFP (Yellow Fluorescent Protein) nên dễ dàng quan sát sự hình thành thể dimer thông qua phương pháp FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer-Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang)

Nhận thấy vai trò quan trọng của protein dimer trong cơ thể và sự cần thiết cho việc nghiên cứu ra phương pháp mới cho dimer protein, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH CHẾ PROTEIN RHAU53-CFP CHO CẢM ỨNG SỰ DIMER PROTEIN BẰNG CẤU TRÚC RNA G-QUADRUPLEX” với mục tiêu tạo ra một mô hình mới G-quadruplex-RHAU cho

sự cảm ứng dimer hóa protein và tiến tới ứng dụng trên các protein chức năng trong tế bào Đề tài thực hiện các nội dung như sau:

− Tạo dòng vector pRHAU53-CFP

− Biểu hiện và tinh chế protein RHAU53-CFP bằng phương pháp sắc kí ái lực

− Cảm ứng tạo cấu trúc RNA G-quadruplex

Khóa luận tốt nghiệp GVHD: Đặng Thanh Dũng

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sự dimer protein

1.1.1 Dimer và vai trò của sự dimer hóa protein

Sự dimer protein: là quá trình hai protein liên kết với nhau để hình thành cấu

trúc homodimer (dimer 2 protein giống nhau) hoặc heterodimer (dimer 2 protein khác nhau)

Hình 1 1: Sự dimer protein (A) homodimer; (B) heterodimer (Charles và cộng sự,

2013)

Vai trò : Sự dimer protein đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh

học như hoạt hóa enzyme, điều hòa phiên mã, dịch mã, và thậm chí là khả năng kháng bệnh cũng được điều hòa thông qua sự dimer protein Ví dụ như sự dimer enzyme Caspase-9 kích hoạt quá trình apoptosis, dimer thụ thể epidermal growth factor receptor (EGFR) dẫn đến sự tự phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase, giúp EGFR kết hợp được với các phân tử tín hiệu ở giai đoạn sau của con đường tín hiệu (Oda và cộng sự, 2005) Ngoài ra, sự dimer protein có thể giúp giảm thiểu kích thước bộ gen nhưng vẫn duy trì các lợi ích của sự hình thành phức hợp protein-protein (Radford và cộng sự, 2010)

1.1.2 Các phương pháp tạo protein dimer

Việc kiểm soát quá trình dimer hóa protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng như điều hòa các quá trình sinh học diễn ra trong tế bào và đáng chú ý gần đây

Khóa luận tốt nghiệpTrang 4 GVHD: Đặng Thanh Dũng

là ứng dụng trong liệu pháp tế bào Nhận thấy tiềm năng đó, nhiều công trình nghiên cứu tìm ra phương pháp tạo protein dimer đã được báo cáo

Hình 1 2: Các phương pháp tạo protein dimer

1.1.2.1 Kĩ thuật protein

Đây là một trong những phương pháp đầu tiên được ứng dụng để tạo ra protein dimer bằng cách thay đổi cấu trúc bề mặt của protein mục tiêu, phương pháp này tạo điều kiện làm tăng tính ổn định và chức năng của protein

⮚ Gây đột biến bề mặt cấu trúc protein:

Thí nghiệm tiến hành thay đổi một vài trình tự amino acid trên protein mục tiêu sẽ dẫn đến tiềm năng dimer của chúng Những thí nghiệm đầu tiên thiết kế tạo protein dimer được tiến hành trên enzyme caspase-9 Shi và các cộng sự tạo ra enzyme Caspase-9 có tiềm năng dimer nhờ thay thế 5 amino acid trong chuỗi β6 của Caspase-9 (Gly402‐Cys‐Phe‐Asn‐Phe406) bằng các amino acid thường hiện diện trong Caspase-

3 (Cys264‐Ile‐Val‐Ser‐Met268), dẫn đến bề mặt của protein Caspase-9 có thể hình thành

dimer (hình 1.3) Những protein Capase-9 này đã có khả năng hình thành homodimer

trong buffer dẫn đến làm tăng sự hoạt hóa enzyme in vitro, có ý nghĩa trong nghiên cứu tế bào (Y Chao và cộng sự, 2005)

Bên cạnh những thành công đạt được, phương pháp này vẫn tồn tại nhiều hạn chế, đặc biệt là ở khía cạnh kiểm soát các sự kiện diễn ra trong quá trình dimer dẫn dến hoạt tính enzyme của caspase-9 được dimer thấp hơn so với caspase-9 được hoạt hóa bởi Apaf-1 Mặt khác, gây đột biến các vùng chức năng của protein mục tiêu có thể dẫn đến thay đổi cấu trúc và chức năng của chúng

Hình 1 3: Cấu trúc protein caspase-9 sau khi đột biến có thể hình thành thể dimer

(Y Chao và cộng sự, 2005)

⮚ Phương pháp “cấu trúc dây kéo”:

Cấu trúc dây kéo hay còn gọi là coiled - coil zipper được hình thành từ hai cấu trúc xoắn ∝ ở dạng monomer, hai cấu trúc này liên kết với nhau bằng các tương tác

kị nước giữa các vùng giàu leucine để hình thành thể homo – heterodimer (hình 1.4a)

Phương pháp này dựa trên sự hình thành cấu trúc dây kéo giữa hai chuỗi polypeptide c-Jun và c-Fos, sau đó dung hợp cấu trúc này với protein mục tiêu dẫn

đến tiềm năng dimer protein (hình 1.4b) Tuy nhiên, phương pháp chỉ tạo dimer một

Khóa luận tốt nghiệpTrang 6 GVHD: Đặng Thanh Dũng

chiều và không có tác động ngược lại Việc tác động trực tiếp lên cấu trúc protein có thể dẫn đến thay đổi trình tự amino acid, làm biến đổi cấu trúc chức năng protein mục tiêu, gây khó khăn cho việc tìm hiểu cơ chế cũng như kiểm soát quá trình dimer

1.1.2.2 Thiết kế protein dimer bằng các phân tử từ bên ngoài

Hiện nay, phương pháp tác động hóa học thông qua các phân tử nhỏ từ bên ngoài đã được sử dụng đề kiểm soát sự dimer hóa protein (Fegan và cộng sự, 2010) Ưu điểm của phương này là có tác động dimer hai chiều, tạo điều kiện thuận lợi cho việc kiểm soát sự dimer

⮚ Hệ thống chủ – khách (host- guest system):

Gần đây, những thí nghiệm về việc sử dụng siêu phân tử để thiết kế tạo protein dimer đã được báo cáo Cyclodextrin và cucurbit[8]uril là hai siêu phân tử tiêu biểu được nghiên cứu sử dụng cho việc chọn lọc và kiểm soát quy trình dimer của chúng trong cả in vitro và in vivo Hai phân tử này mang những đặc tính mong muốn để sử dụng trong các nghiên cứu sinh hóa như độ hòa tan trong nước, có khả năng liên kết với hệ thống chủ và ít độc

Urbach và cộng sự đã chứng minh sự dimer giữa hai phân tử tripeptide

phenylalanine-glycine-glycine (FGG) khi cho chúng liên kết với cucurbit[8]uril để

của cấu trúc dây kéo leucine (c-Jun và c-Fos) (GyörgyVámosi và cộng sự, 2008)

tạo thành phức hợp cân bằng hóa học 1:2 với ái lực cao bằng liên kết chủ yếu các

amin ở đầu N-terminal của chuỗi peptide với phân tử cucurbit[8]uril (hình 1.5)

Việc sử dụng các siêu phân tử cung cấp phương pháp hữu hiệu và dễ dàng để thiết kế tạo protein dimer, hơn nữa phương pháp này có tác động ngược lại tạo điều kiện thuận lợi để thiết kế và kiểm soát quá trình dimer (Dang T D, 2012), tuy nhiên thể dimer lại khó đưa vào trong tế bào

Hình 1 5: Cucurbit[8]uril lựa chọn liên kết và dimer tripeptide

phenylalanine-glycine-glycine (FGG) (Urbach, 2006)

⮚ Sử dụng các phân tử nhỏ:

Đây là phương pháp sử dụng các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp mang phân tử gồm hai bán phần đồng chức năng, chúng có khả năng liên kết với hai protein hoặc hai miền protein và mang hai phân tử protein này lại gần nhau để tạo

thành thể homo-dimer hoặc hetero-dimer (hình 1.6) Tuy nhiên do có nhiều nhược

điểm nên phương pháp này vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi

Khóa luận tốt nghiệpTrang 8 GVHD: Đặng Thanh Dũng

phân tử có hai bán phần đối xứng, (B) tạo protein dimer bằng phân tử có hai bán phần bất đối xứng

Có nhiều phân tử nhỏ đã được nghiên cứu để cảm ứng sự dimer hóa như

rapamycin, cyclosporine, FK506, và coumermycin BisMTX (Stephan và cộng sự,

2000) Ví dụ về phân tử rapamycin, phân tử này có hai miền liên kết protein khác biệt về mặt hóa học có thể liên kết với FK506 (FK506 binding protein) và FRB (FKBP rapamycin binding) của mTOR (mammalian target of rapamycin) dẫn tới tạo sự dimer giữa hai phân tử này Hệ thống FKBP-Rapamycin-FRB sau đó được ứng dụng để

kiểm soát sự phiên mã và biểu hiện gen (Choi và cộng sự, 1996) (hình 1.7) Tuy

nhiên phân tử này lại gây độc tế bào (Crabtree và cộng sự, 2006)

Hình 1 7: Phức hợp FKBP-Rapamycin-FRB

⮚ Sử dụng các ion kim loại:

Một số ion kim loại có khả năng tạo dimer giữa hai protein như Ni2+, Co2+, Cu2+và Zn2+ Tezcan và các cộng sự đã nghiên cứu thiết kế tạo sự dimer phân tử Cytochrome cb562bằng cách sử dụngion Ni2+ và qua đó giúp tăng cường sự ổn định

cho protein (hình 1.8)

Tuy nhiên, phương pháp còn có nhược điểm là khó kiểm soát vì cấu trúc của protein không chỉ có một mình vị trí liên kết của các ion kim loại cho nên sẽ gây ra các tương tác hấp dẫn hoặc đẩy lùi từ đó sẽ dẫn đến sự hình thành nhiều thể protein khác nhau

Hình 1 8: Thiết kế tạo protein dimer bằng ion Ni2+ ( Tezan và cộng sự, 2009)

1.2 G-quadruplex

Việc sử dụng các phân tử trong nghiên cứu mang đến nhiều triển vọng to lớn cho sự cảm ứng protein dimer Tuy nhiên, phương pháp đó vẫn còn tồn tại nhiều hạn chế, đặc biệt là về tính an toàn nên chỉ ngừng lại ở những nghiên cứu in vitro Từ đó, yêu cầu mới đặt ra là tìm ra những phân tử cảm ứng ưu thế hơn và an toàn để phục vụ cho những nghiên cứu xa hơn và có thể ứng dụng vào cơ thể người

G-quadruplex được đánh giá là một phân tử tiềm năng to lớn cho nghiên cứu thiết kế cảm ứng dimer protein Theo mô phỏng bởi phần mềm máy tính thì có khoảng 300000 trình tự có thể hình thành cấu trúc G-quadruplex trong bộ gen người (Rhodes và Lipps, 2015) Sự hiện diện của G-quadruplex trong vùng telomere, promoter, góp

phần điều hòa nhiều quá trình sinh học trong cơ thể

1.2.1 Khái niệm

Khóa luận tốt nghiệpTrang 10 GVHD: Đặng Thanh Dũng

Theo mô hình Watson–Crick, DNA là 1 phân tử xoắn kép có 2 sợi tự bắt cặp bổ sung với nhau bằng các cặp bazơ (A-T, G-C) Khi những trình tự DNA hay RNA giàu purine và chứa nhiều guanine (G) liên tục, chúng có khả năng hình thành cấu trúc 4 sợi được gọi là G-quadruplex (Gellert và cộng sự, 1962)

Cấu trúc này được giữ ổn định bởi ion dương hóa trị một như K+ hoặc Na+ tại

trung tâm mặt phẳng của mỗi G-tetrad (Smith và Feigon, 1992) (hình 1.9) Cấu trúc

này không được tìm thấy ở một vị trí ngẫu nhiên mà thường xuất hiện trong vùng telomere, promoter và một số vị trí khác trong bộ gen ở eukaryote (Heddi và cộng sự, 2015)

Hình 1 9: G-quadruplex được hình thành từ những chuỗi DNA hoặc RNA giàu

Guanine liên tục 1.2.2 Chức năng của G-quadruplex

Trong bộ gen, G-quadruplex được tìm thấy ở vùng telomere (Anh Tuan Phan và cộng sự, 2007) và trong promoter của một số gen (Cogoi và Xodo, 2006) Trong RNA, G-quadruplex được tìm thấy trong những vùng không dịch mã của RNA thông tin Ngoài ra, sản phẩm phiên mã từ telomere, TERRA cũng có thể hình thành nên cấu trúc G-quadruplex (Takahama và cộng sự, 2013) Sự hình thành cấu trúc G-quadruplex trong DNA hay RNA đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học của tế bào như: sao chép DNA, phiên mã, dịch mã, và đặc biệt trong quá trình kéo

dài của telomer (Lattmann và cộng sự, 2010) (hình 1.10)

Hình 1 10: Chức năng sinh học của G-quadrplex trong tế bào (Lipps và cộng sự,

2009) 1.2.3 Cấu trúc G-quadruplex

Trong cấu trúc G-quadruplex, bốn guanine liên kết với nhau bằng liên kết Hoogsteen ở các vị trí N1, N2 và O6, N7 của các guanine kế cận để hình thành cấu trúc guanine tetrad (hay G-tetrad), sau đó các G-tetrad xếp chồng lên nhau để hình

thành G-quadruplex (hình 1.11a) Cấu trúc G-quadruplex được giữ ổn định bởi sự

hiện diện của các cation dương hóa trị một như K+, Na+,…nằm ở trung tâm cấu trúc

G-tetrad (hình 1.11b)

Hình 1 11: Cấu trúc G-quadruplex

Khóa luận tốt nghiệpTrang 12 GVHD: Đặng Thanh Dũng

Cấu trúc G-tetrad

G-tetrad là mặt phẳng được hình thành từ bốn phân tử guanine ở bốn gốc Mỗi guanine ở một góc sẽ liên kết với hai guanine khác thông qua liên kết hydrogen

Hoogsteen ở các vị trí N1, N2 và O6, N7 cận tạo nên mặt phẳng G-tetrad (hình 1.12)

Hình 1 12: Hai guanine liên kết hydrogen Hoogsteen ở các vị trí N1, N2 và O6,

N7

Phân loại

G-quadruplex có thể được phân loại theo hai cách Dựa vào số lượng phân tử acid nucleic cấu thành nên G-quadruplex có thể chia thành unimolecular, bimolecular và tetramolecular (Oscar và cộng sự, 2016) Dựa vào chiều của 4 sợi acid nucleic đi qua các G-tetrad mà G-quadruplex có thể chia thành các dạng khác nhau như: 4 sợi có thể xếp song song (xếp theo cùng một hướng) hoặc là không song song (3 sợi chạy cùng hướng và 1 sợi chạy ngược hướng, 2 sợi chạy cùng hướng và 2 sợi còn lại chạy

ngược hướng) (Wang & Patel, 1993) (hình 1.13)

Hình 1 13: Các kiểu cấu trúc song song và không song song của G-quadruplex

(Oscar và cộng sự, 2019)

Điều kiện ảnh hưởng đến sự hình thành và ổn định G-quadruplex

Sự hình thành và ổn định của cấu trúc G-quadruplex chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố bên trong và bên ngoài như: số lượng guanine (G), kiểu hình thành loop (loop đường chéo, loop bên hay loop đảo ngược) và số base trong mỗi loop, chiều hướng gấp cuộn của sợi DNA (G-quadruplex song song, G-quadruplex đối song hay dạng lai), và sự hiện diện của các ligand có khả năng tương tác với G-quadruplex cũng ảnh hưởng đến sự ổn định của cấu trúc này (Burge và cộng sự, 2006) Ngoài ra, các nhân tố môi trường như nhiệt độ, pH, nồng độ của ion Na+ hoặc K+ cũng ảnh hưởng đến

sự hình thành và ổn định của cấu trúc G-quadruplex Tiềm năng cho nghiên cứu dimer

Từ các nghiên cứu trước đây, G-quadruplex được đánh giá là một phân tử tiềm năng cho sự dimer protein Đầu tiên, G-quadruplex có kích thước nhỏ nên dễ tổng hợp hóa học, và có thể dễ đưa vào tế bào hơn Thứ hai, cấu trúc này bền, cho đến hiện nay người ta vẫn chưa tìm được bất kì một enzyme nào cắt được cấu trúc này Bên cạnh đó, trình tự này có sẵn trong tế bào nên tiêu chí an toàn của nó được đánh giá cao, có ý nghĩa lớn trong việc nghiên cứu các tương tác protein in vivo

Khóa luận tốt nghiệpTrang 14 GVHD: Đặng Thanh Dũng

1.2.4 Cấu trúc RNA G-quadruplex

Một trong những cấu trúc thứ cấp của RNA - RNA G-quadruplex, được chứng minh là có sự hiện diện ổn định trong các tế bào khối u ở người, virus hoặc các loài liên quan đến khả năng gây bệnh ( Wang và cộng sự, 2015)

Sự khác nhau cơ bản của RNA và DNA G-quadruplex cũng giống như sự khác biệt giữa RNA và DNA Trong cấu trúc RNA G-quadruplex có uracil và đường ribose, sự hiện diện của nhóm 2’-hydroxyl trong đường ribose tạo ra những liên kết hydro nội phân tử trong G-quadruplex, đồng thời nhóm có khả năng mang phân tử nước nên giúp cấu trúc RNA G-quadruplex ổn định hơn so với cấu trúc DNA G-quadruplex Tuy nhiên, cấu trúc RNA G-quadruplex chỉ tồn tại ở dạng song song, trong đó 4 sợi

lõi của G-tertrad hướng theo cùng một chiều (hình 1.14)

song song, tuy nhiên lại có tính ổn định hơn so với cấu trúc DNA G-quadruplex

1.3 Protein RHAU

1.3.1 Giới thiệu về protein RHAU

Protein RHAU (RNA Helicase associated with AU-rich element) là protein thuộc nhóm RNA helicase có liên kết với vùng trình tự giàu Adenine và Uracil của RNA (Lattmann và cộng sự, 2011; Vaughn và cộng sự, 2005) Protein này gồm có

1008 amino acids thuộc họ DEAH-box được mã hóa bởi gen DHX36, RHAU có khả

năng tương tác và tháo xoắn cả trình tự RNA và DNA G-quadruplex

Protein này gồm 3 vùng như trong hình 1.15:

- Vùng NTR (vùng đầu N − N-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 1 đến 203 và chứa trình tự RSM (RHAU-specific motif) có khả năng tương tác đặc hiệu với G-quadruplex

- Vùng HCR (vùng lõi heliacse − Helicase Core Region) gồm các motif từ I tới VI thể hiện hoạt tính ATPase hoặc helicase và kéo dài từ amino acid 204 đến 615

- Vùng CTR (vùng đầu C − C-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 616 tới 1008

và bám vào cả DNA và RNA với ái lực cao (Lattmann và cộng sự, 2010) 1.3.2 Chức năng

Một số nghiên cứu cho thấy, RHAU tham gia vào quá trình đáp ứng stress của tế bào thông qua liên kết với RNA thông tin (mRNA) và tạo thành phức hợp protein-RNA có nồng độ cao, từ đó giúp bảo vệ RNA khỏi tác động phân hủy từ những điều kiện bất lợi trong tế bào (Chalupnikova và cộng sự, 2008) Ngoài ra, protein này còn tham gia điều hòa quá trình phiên mã và sau phiên mã thông qua việc tháo xoắn các G-quadruplex tại promoter và mRNA (Huang và cộng sự, 2012), (Nie và cộng sự, 2015),…

1.3.3 Protein RHAU liên kết đặc hiệu với G-quadruplex

Trình tự peptide đặc hiệu ngắn (RSM, RHAU54-66) ở vùng NTR có khả năng nhận biết và bám đặc hiệu vào cấu trúc song song của G-quadruplex DNA hoặc RNA RHAU chỉ nhận diện và bám lên cấu trúc DNA hay RNA G-quadruplex song

song (Chen và cộng sự, 2018) vì hai đầu 5’ và 3’ của mặt phẳng G-tetrad không bị

Khóa luận tốt nghiệpTrang 16 GVHD: Đặng Thanh Dũng

các loop che khuất như ở G-quadruplex đối song chính vì thế mà RHAU dễ dàng nhận diện và bám lên Đáng chú ý, G-quadruplex có thể tương tác với RHAU theo tỉ lệ 1:2 vì cả hai đầu 3’ và 5’ trên mặt phẳng G-tetrad đều có thể được nhận diện bởi

RHAU (hình 1.16c)

Khi liên kết RHAU peptide sẽ bao phủ lên cấu trúc tetrad và liên kết với quadruplex bằng 3 tương tác tĩnh điện giữa các amino acid tích điện dương với nhóm

G-phosphate tích điện âm (Heddi và cộng sự, 2015) (hình 1.16)

Hình 1 16: (A) 4 guanine của G-tetrad tương tác với 4 amino acid G9, I12, G13 và

A17 của RHAU B) 3 amino acid tích điện dương của RHAU (K8, R10 và K19) tương tác với khung sườn phosphate tích điện âm (C) tương tác theo tỉ lệ 1 G-

quadruplex : 2 RHAU (Heddi và cộng sự, 2015)

Trong đó, đoạn trình từ RHAU dài 53 amino aicd (từ vị trí amino acid 53 tới 105) có chứa vùng RSM và được chứng minh là có ái lực mạnh với G-quadruplex (đề tài sẽ gọi là RHAU53) được chọn sử dụng để nghiên cứu sự dimer protein

1.4 Phương pháp FRET (Fluorescence Resonance Energy Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang)

bản Đồng thời, thể nhận sau khi nhận năng lượng sẽ chuyển sang trạng thái kích

thích và trở về trạng thái cơ bản bằng cách phát tín hiệu huỳnh quang (hình 1.17)

Hình 1 17: Nguyên tắc phương pháp FRET (Hussain và cộng sự 2009)

Điều kiện xảy ra FRET là khoảng cách giữa thể cho và thể nhận phải <10 nm và cả hai phân tử này phải có sự chồng lắp giữa quang phổ phát ra của chất cho (donor)

và quang phổ hấp thụ của chất nhận (acceptor) (hình 1.17)

Hiện nay, phương pháp FRET đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực hóa học và sinh học như nghiên cứu tế bào, khảo sát protein cũng như nhiều ứng dụng sinh trắc quang học,…

1.4.2 Cặp protein CFP và YFP

Trong phương pháp FRET, cặp protein CFP (Cyan Fluorescent Protein) và YFP (Yellow Fluorescent Protein) là cặp phát huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất Ưu điểm của cặp protein này là dễ biểu hiện, bền và ánh sáng huỳnh quang phát ra dễ quan sát (Bajar và cộng sự, 2016) Mặt khác, quang phổ phát ra của CFP có phần trùng lắp với quang phổ hấp thụ của YFP nên phù hợp với yêu cầu của FRET

Theo nguyên tắc của FRET, khi có sự dimer, protein CFP bị kích ở bước sóng 410 nm và phát quang ở bước sóng 475 nm, còn YFP bị kích thích bởi ánh sáng có

bước sóng 475 nm và phát quang ở bước sóng 525 nm (hình 1.18) Nếu như không

có sự dimer diễn ra, tức là khoảng cách của hai protein > 10 nm, CFP bị kích thích và không truyền năng lượng cho YFP mà phát quang với peak 475 nm

Khóa luận tốt nghiệpTrang 18 GVHD: Đặng Thanh Dũng