Tạo dòng biểu hiện tinh chế protein rhau53 cfp để cảm ứng sự dimer protein nhờ cấu trúc rna g quadruplex
MỤC LỤC
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Ví dụ như sự dimer enzyme Caspase-9 kích hoạt quá trình apoptosis, dimer thụ thể epidermal growth factor receptor (EGFR) dẫn đến sự tự phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase, giúp EGFR kết hợp được với các phân tử tín hiệu ở giai đoạn sau của con đường tín hiệu (Oda và cộng sự, 2005). Bên cạnh những thành công đạt được, phương pháp này vẫn tồn tại nhiều hạn chế, đặc biệt là ở khía cạnh kiểm soát các sự kiện diễn ra trong quá trình dimer dẫn dến hoạt tính enzyme của caspase-9 được dimer thấp hơn so với caspase-9 được hoạt hóa bởi Apaf-1. Đây là phương pháp sử dụng các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp mang phân tử gồm hai bán phần đồng chức năng, chúng có khả năng liên kết với hai protein hoặc hai miền protein và mang hai phân tử protein này lại gần nhau để tạo thành thể homo-dimer hoặc hetero-dimer (hình 1.6).
Ví dụ về phân tử rapamycin, phân tử này có hai miền liên kết protein khác biệt về mặt hóa học có thể liên kết với FK506 (FK506 binding protein) và FRB (FKBP rapamycin binding) của mTOR (mammalian target of rapamycin) dẫn tới tạo sự dimer giữa hai phân tử này. Tuy nhiên, phương pháp còn có nhược điểm là khó kiểm soát vì cấu trúc của protein không chỉ có một mình vị trí liên kết của các ion kim loại cho nên sẽ gây ra các tương tác hấp dẫn hoặc đẩy lùi từ đó sẽ dẫn đến sự hình thành nhiều thể protein khác nhau. Trong cấu trúc G-quadruplex, bốn guanine liên kết với nhau bằng liên kết Hoogsteen ở các vị trí N1, N2 và O6, N7 của các guanine kế cận để hình thành cấu trúc guanine tetrad (hay G-tetrad), sau đó các G-tetrad xếp chồng lên nhau để hình thành G-quadruplex (hình 1.11a).
Sự hình thành và ổn định của cấu trúc G-quadruplex chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố bên trong và bên ngoài như: số lượng guanine (G), kiểu hình thành loop (loop đường chéo, loop bên hay loop đảo ngược) và số base trong mỗi loop, chiều hướng gấp cuộn của sợi DNA (G-quadruplex song song, G-quadruplex đối song hay dạng lai), và sự hiện diện của các ligand có khả năng tương tác với G-quadruplex cũng ảnh hưởng đến sự ổn định của cấu trúc này (Burge và cộng sự, 2006). Trong cấu trúc RNA G-quadruplex có uracil và đường ribose, sự hiện diện của nhóm 2’-hydroxyl trong đường ribose tạo ra những liên kết hydro nội phân tử trong G-quadruplex, đồng thời nhóm có khả năng mang phân tử nước nên giúp cấu trúc RNA G-quadruplex ổn định hơn so với cấu trúc DNA G-quadruplex. Một số nghiên cứu cho thấy, RHAU tham gia vào quá trình đáp ứng stress của tế bào thông qua liên kết với RNA thông tin (mRNA) và tạo thành phức hợp protein- RNA có nồng độ cao, từ đó giúp bảo vệ RNA khỏi tác động phân hủy từ những điều kiện bất lợi trong tế bào (Chalupnikova và cộng sự, 2008).
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
− Dung dịch giải nhuộm: Ethanol tuyệt đối 100 ml; Glacial Acetic 100 ml pha trong 1 lít dung dịch. − Trình tự đoạn gen RHAU53 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học. − Protein RHAU53-YFP dùng trong phương pháp FRET kiểm tra sự dimer nhận từ trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
− Môi trường LB-Amp: môi trường LB bổ sung thêm kháng sinh Ampicilin để đạt nồng độ 100 μg/ml. − Môi trường LB-Amp agar: là môi trường LB-agar bổ sung thêm kháng sinh Ampicilin để đạt nồng độ cuối 100 μg/ml.
Phương pháp thực hiện
Plamid pETduet1 chứa trình tự gen RHAU53 được cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI tạo đầu dính đồng thời đoạn gen mục tiêu cũng được xử lý với 2 enzyme trên nhằm mục đích nối đoạn gen CFP vào plamid. Vì enzyme có bản chất là protein nên cần giữ trong buffer để nâng cao hiệu quả của phản ứng nối, ở đây buffer 10X được sử dụng để thực hiện phản ứng cắt cho cả hai enzyme cắt giới hạn vì phù hợp với cả 2 enzyme. Nguyên tắc của quá trình này là dựa trên sự xáo trộn của màng tế bào do thay đổi nhiệt độ đột ngột gây ra, tế bào và vector mục tiêu được ủ ở nhiệt độ thấp (4°C) , sau đó sốc nhiệt ở 42°C trong 90 giây.
Các dòng tế bào mang vector đã được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc sẽ được nuôi cấy và thu nhận vector để gửi đi giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger cải tiến tại công ty Macrogen Hàn Quốc. Nguyên tắc của phương pháp: các protein dung hợp có chứa đuôi histidine khi đi qua cột HisTrap sẽ bám lại trên cột nhờ vào liên kết giữa histidine và Ni2+trong cột, còn protein và các thành phần khác sẽ bị loại bỏ. Một vài nghiên cứu cho thấy, protein RHAU lựa chọn liên kết đặc hiệu với cấu trúc G-quadruplex song song (Hussain S.A, 2009), đồng thời RNA G-quadruplex chỉ hình thành 1 kiểu cấu trúc song song trong tế bào và có khả năng liên kết chặt chẽ giữa với RHAU peptide nên phù hợp với đề tài.
Quang phổ CD có thể được sử dụng để: xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein, DNA; nghiên cứu động học của các phản ứng quang hoạt, độ bền của protein, các yếu tố nhiệt độ, Ph,…ảnh hưởng tới sự chuyển hóa cấu trúc của protein;….
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Biểu hiện và tinh chế protein RHAU53-CFP
Ta tiến hành sàng lọc bước đầu bằng cách nuôi cấy chủng trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin (LB-Amp). Vì vector pRHAU53-CFP có mang gen kháng kháng sinh Ampicilin nên những khuẩn lạc mọc được trên đĩa môi trường chứng tỏ. 5: Kết quả sàng lọc chủng biểu hiện mang vector pRHAU53-CFP. A) chủng có mang vector mục tiêu, B) chủng không mang vector mục tiêu. Khi quan sát kết quả điện di các pha tổng, tủa, tan của protein ta thấy pha tổng và pha tan xuất hiện một vạch đậm và có kích thước tương ứng gần bằng nhau, trong khi vạch protein trong pha tủa mờ và nhỏ hơn rất nhiều so với hai pha còn lại. Vậy protein RHAU53-CFP được biểu hiện ở dạng tan trong điều kiện nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,3 mM, nhiệt độ 16⁰C và thời gian cảm ứng trong 24 giờ.
Sau đó thu sinh khối và tiến hành tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực sử dụng cột Ni-NTA và dung ly ra nhiều phân đoạn khác nhau. Sau khi thu sinh khối protein, ta tiến hành load vào cột tinh chế và kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE, kết quả so sánh các mẫu trước cột, sau cột và rửa cột, ở mẫu trước cột có xuất hiện vạch protein mục tiêu đậm tương ứng kích thước 36 kDa, đây chính là kích thước protein mục tiêu. Ở phân đoạn rửa cột, giếng điện di quan sát thấy rất nhiều vạch protein có kích thước khác nhau, đó là các protein tạp không bám đặc hiệu vào cột Histrap nên bị dịch rửa cột rửa trôi.
Sau đó, các phân đoạn dung ly ở nồng độ 60 mM và 80 mM Imidazole có chứa protein mục tiêu nhiều nhất được thẩm tách nhằm giảm nồng độ Imidazole ra khỏi dịch protein đã thu.
Cảm ứng tạo cấu trúc RNA G-quadruplex
Protein tinh sạch được bảo quản ở -80°C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
Kết luận
Đề tài thí nghiệm “cảm ứng sự dimer protein huỳnh quang CFP và YFP bằng cấu trúc G-quadruplex liên kết với RHAU peptide” được xem là một “mô hình” thí nghiệm để từ đó áp dụng G-quadruplex vào cảm ứng sự dimer protein chức năng trong cơ thể. − Biểu hiện thành công protein RHAU53-CFP và tinh chế được protein mục tiêu thông qua phương pháp sắc ký ái lực sử dụng cột Histrap. − Cảm ứng tạo cấu trúc RNA G-quadruplex để sử dụng trong phương pháp FRET cảm ứng sự dimer protein RHAU-CFP và RHAU-YFP.
Tài liệu tham khảo
(2015), “Insights into G-quadruplex specific recognition by the DEAH-box helicase RHAU: Solution structure of a peptide-quadruplex complex”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 112(31), 9608–9613. Heitmann LM1, Taylor AB, Hart PJ, Urbach AR, Sequence-specific recognition and cooperative dimerization of N-terminal aromatic peptides in aqueous solution by a synthetic host, 2006 Sep 27;128(38):12574-81. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.
Shi-Ke Wang, Yue Wu, Tian-Miao Ou (2015) , RNA G-Quadruplex: The New Potential Targets for Therapy, Current Topics in Medicinal Chemistry, Volume 15 , Issue 19. Vaughn, Steven A Akman, Yoshikuni Nagamine, Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU, 38(18), 1 October 2010,6219–6233.