nghiên cứu đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết dengue và chế tạo kháng nguyên ns1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút dengue bằng kỹ thuật elisa

ỉ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG ---*--- HOÀNG XUÂN CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

TỔNG QUAN

Tổng quan bệnh sốt xuất huyết Dengue

Sốt xuất huyết Dengue là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue gây nên Vi rút truyền từ người bệnh sang người lành do muỗi đốt Muỗi

Aedes aegypti và Aedes albopictus là trung gian truyền bệnh chủ yếu [18] Bệnh có đặc trưng bởi sốt, xuất huyết và thoát huyết tương có thể dẫn đến sốc và tử vong nếu không được điều trị đúng và kịp thời [19]

Sốt xuất huyết Dengue là bệnh truyền nhiễm cấp tính do muỗi có tốc độ lây truyền nhanh nhất thế giới, trong 50 năm qua diện tích vùng có dịch tăng lên 30 lần Các trường hợp được báo cáo cho WHO đã tăng từ 505.430 trường hợp vào năm 2000 lên 5,2 triệu vào năm 2019 Nghiên cứu cũng cho thấy ước tính có 390 triệu ca nhiễm SXHD mỗi năm, trong đó 96 triệu ca có biểu hiện lâm sàng [20] Hiện nay, vi rút Dengue lưu hành và gây dịch ở trên 100 quốc gia và vùng lãnh thổ, chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á Thái Bình Dương, Châu Phi, Châu Mỹ, Địa Trung Hải [21] Châu Á Thái Bình Dương là khu vực chịu ảnh hưởng của SXHD nhiều nhất, theo WHO, riêng tại khu vực này có khoảng 1,8 tỷ người sống trong vùng dịch tễ SXHD, tập trung nhiều tại vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương Từ năm 2001 đến 2008, 4 quốc gia có tỷ lệ mắc và tử vong do SXHD cao nhất khu vực Tây Thái Bình Dương là Việt Nam, Campuchia, Malaysia và Philippines với 1.020.333 ca bệnh [19] Năm 2023, tại Bangladesh, Thái Lan, Campuchia, Lào và Philippin với số mắc (tử vong) lần lượt là 308.167 (1598), 136.655 (147), 35.390 (99); 32.109 (20); 195.603 (657) [5], [9]

Vụ dịch sốt xuất huyết Dengue lần đầu tiên xảy ra tại miền Bắc vào năm

1958 và ở khu vực phía Nam năm 1960 với 68 bệnh nhi đã được ghi nhận tử vong Những đợt bùng phát của SXHD được ghi nhận ở nước ta thường xảy ra với chu kì khoảng 10 năm (1987, 1998, 2009, 2017) Các ca mắc thường gia tăng vào mùa mưa - mùa sinh sản của muỗi truyền bệnh, miền Bắc vào khoảng tháng 4 đến tháng 11, miền Nam vào khoảng tháng 6 đến tháng 11 [22] Theo báo cáo của Bộ Y tế, số ca mắc SXHD ở khu vực Miền Nam cao nhất chiếm 57%, tiếp theo là miền Trung chiếm 33% và chủ yếu ở đối tượng từ 15 tuổi trở lên chiếm từ 57%-85% tuỳ theo khu vực Số mắc tích luỹ chỉ trong 8 tháng đầu năm 2020 của thành phố Hồ Chí Minh là 13.322 ca, chiếm tỷ lệ cao nhất cả nước, đứng thứ hai là Phú Yên với 4.898 ca Hà Nội ở vị trí thứ 10 với 1.993 ca Giám sát huyết thanh trong 8 tháng đầu năm 2020 cũng cho thấy týp DENV2 chiếm 51%, týp DENV1 chiếm 39% và týp DENV4 chiếm 10% [23]

Trong giai đoạn từ 1998 - 2020 tại miền Bắc Việt Nam, trung bình mỗi năm ghi nhận 8.683 trường hợp mắc, trong đó chỉ có từ 1 - 2 trường hợp tử vong Năm 2017 có số mắc cao nhất trong lịch sử ghi nhận của hệ thống giám sát với 55.531 trường hợp mắc, 7 trường hợp tử vong Số mắc và tử vong do SXHD chủ yếu tại khu vực Đồng bằng sông Hồng (chiếm 72,6% ca mắc toàn khu vực) [24] Từ năm 2001 đến 2020, tại khu vực phía Nam, số mắc SXHD trung bình hàng năm là 64.153 ca SXHD/năm; số ca tử vong trung bình hàng năm trong giai đoạn này là 53 ca/năm và giảm dần qua các năm [25]

Hà Nội là một trong các địa phương lưu hành bệnh SXHD có diễn biến phức tạp do sự ảnh hưởng của các yếu tố nguy cơ bao gồm đô thị hóa, mật độ dân số cao, vệ sinh môi trường kém, thời tiết khắc nghiệt Vào các năm 2009,

2015 và 2017 đã ghi nhận các đợt dịch lớn tại miền Bắc trong đó 90% các trường hợp tập trung tại Hà Nội Týp DENV1 là căn nguyên chính gây ra các vụ dịch sốt xuất huyết tại Hà Nội vào các năm 2009 và 2015 Đợt dịch SXHD gần nhất xảy ra tại Hà Nội vào năm 2017 đã có 37.651 ca mắc và 7 ca tử vong [26]

Giai đoạn 1999-2020 có tổng số 1.844.407 trường hợp mắc SXHD, trong đó có 1.250 trường hợp tử vong Tỷ lệ mắc SXHD/100.000 dân tại Việt Nam có xu hướng tăng lên, mức tăng trung bình hằng năm trong giai đoạn1999-2020 bằng 9,6% [27] Năm 2020, cả nước có 133.321 trường hợp mắc SXHD, trong đó có 27 trường hợp tử vong [28] Năm 2022 cả nước ghi nhận 367.729 ca

SXHD và 140 ca tử vong [8]; so với cùng kỳ năm 2021 (72.880 ca mắc và 27 ca tử vong), số ca mắc cộng dồn cao gấp 5 lần Tính tới 17/12/2023, cả nước ghi nhận 166.619 ca mắc SXHD, trong đó có 42 ca tử vong [9]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue

Sau khi muỗi đốt, vi rút Dengue xâm nhập vào cơ thể, nằm trong các tế bào đơn nhân lớn Các đại thực bào này tập trung nhiều ở hạch bạch huyết khu vực, trong các tế bào Kupffer, hạch bạch huyết và mảng Payer [19] Có bằng chứng cho thấy các tế bào đích bao gồm các tế bào lưới đuôi gai, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho, tế bào gan và các tế bào nội mô mạch máu Sự sao chép của vi rút dường như xảy ra ở các tế bào gai, bạch cầu đơn nhân, và có thể lưu hành các tế bào bạch huyết và các tế bào đích khác xảy ra thông qua các cơ chế miễn dịch trung gian liên quan đến kháng thể chéo và cytokine được giải phóng bởi tế bào đuôi gai, bạch cầu đơn nhân và tế bào nội mô mạch máu

Có bằng chứng về sự kích hoạt tế bào đồng thời cũng ức chế miễn dịch trong quá trình nhiễm trùng Việc kích hoạt các tế bào T của bộ nhớ dẫn đến các chuỗi cytokine gây viêm, bao gồm yếu tố hoại tử khối u, interleukin (IL-

2, IL-6, IL-8) và các chất trung gian hóa học khác làm tăng tính thấm nội mô mạch máu hoặc gây chết tế bào thông qua cơ chế apoptosis [29] Tình trạng giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch gây thoát huyết tương, chủ yếu là albumin qua thành mạch đến khoang gian bào Khi thoát huyết tương nhiều dẫn đến hiện tượng giảm protein trong huyết thanh, cô đặc máu, giảm khối lượng tuần hoàn và nặng hơn là tình trạng sốc Nếu kéo dài sẽ dẫn đến thiếu oxy ở các mô, toan chuyển hóa và tử vong nếu không xử trí kịp thời Sốc kéo dài cũng sẽ dẫn tới nguy cơ đông máu nội quản rải rác [19] Tình trạng rối loạn đông máu xảy ra do 3 yếu tố tác động, gồm giảm tiểu cầu, biến đổi thành mạch và rối loạn yếu tố đông máu Hai rối loạn sinh bệnh học thoát huyết tương và rối loạn đông máu tạo thành một vòng xoắn bệnh lý Tình trạng thoát huyết tương tạo điều kiện cho tình trạng rối loạn đông máu nặng hơn và ngược lại Một số giả thuyết giải thích bệnh cảnh sốt xuất huyết Dengue nặng:

- Giả thuyết của Hammon cho rằng cơ thể bị nhiễm đồng thời 2 týp huyết thanh khác nhau của vi rút Dengue [19]

- Giả thuyết của Leon Rose, nhận thấy các týp vi rút có khác nhau về độc lực như khả năng ly giải tế bào sinh miễn dịch, khả năng nhân lên Giả thuyết về độc lực của vi rút cũng phù hợp trong một số vụ dịch gây nên do vi rút Dengue týp huyết thanh 2, tỷ lệ bệnh nặng và tử vong cao [19]

- Giả thuyết tăng cường miễn dịch của Halstead, cho rằng đó là kết quả của đáp ứng nhớ lại, do bị tái nhiễm với 1 týp huyết thanh vi rút Dengue khác Đáp ứng miễn dịch của cơ thể ở lần nhiễm thứ 2 mạnh hơn nhiều so với lần nhiễm đầu, dẫn đến tình trạng tăng tính thấm thành mạch [19].

Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng sốt xuất huyết Dengue

1.2.1 Các triệu chứng lâm sàng thường gặp

Bệnh cảnh lâm sàng của nhiễm vi rút Dengue có nhiều dạng khác nhau, từ không biểu hiện triệu chứng đến các biểu hiện của hội chứng nhiễm vi rút, biểu hiện của sốt Dengue, biểu hiện bệnh cảnh của SXHD hay cả của hội chứng sốc Dengue Theo khuyến cáo của WHO năm 2009, để có thể dễ dàng hơn cho việc đánh giá và chăm sóc người bệnh (NB), nhiễm vi rút Dengue được phân chia làm thể nghiêm trọng và không nghiêm trọng Thể nghiêm trọng của nhiễm vi rút Dengue hay còn gọi là hội chứng sốc SXHD Sốt xuất huyết không nghiêm trọng bao gồm SXHD có thể xảy ra, SXHD không có dấu hiệu cảnh báo và SXHD có dấu hiệu cảnh báo [1]

Có 80% người nhiễm vi rút Dengue không có biểu hiện triệu chứng, hoặc chỉ biểu hiện sốt nhẹ Mức độ biểu hiện của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: týp vi rút Dengue gây bệnh, số lần bị nhiễm Dengue của NB, thứ tự nhiễm các týp, thời gian giữa các lần nhiễm của NB và phụ thuộc cả vào các yếu tố khác như tuổi, tình trạng miễn dịch, bệnh nền của NB Tình trạng của bệnh cũng có thể chuyển biến nhanh chóng sang thể SXHD nặng, với các triệu chứng lâm sàng từ dạng nhẹ như sốt cao, đau đầu, đau cơ, phát ban, đến dạng nặng như suy đa tạng hay tình trạng sốc giảm thể tích [30]

Các triệu chứng lâm sàng thường gặp gồm: sốt cao, đau đầu và đau mắt, đau cơ và đau khớp, phát ban và xuất huyết

Sốt trong bệnh SXHD là kết quả của phản ứng miễn dịch của cơ thể đối phó với tình trạng nhiễm vi rút Sốt trong SXHD có thể cao đến 40 độ C và thường diễn tiến trong vòng 2-7 ngày khi vào giai đoạn toàn phát [3] Sốt thường khởi phát đột ngột, chủ yếu là sốt nóng, ít khi có gai rét và rét run Sốt liên tục, thường không có cơn Một số trường hợp ít chịu tác dụng của thuốc hạ sốt thông thường [31]

Khi vi rút Dengue xâm nhập vào tuần hoàn máu, nó bắt đầu nhân lên và xâm nhiễm các tế bào khác nhau trong cơ thể, đặc biệt là tế bào Langerhans

Hệ thống miễn dịch nhận ra sự hiện diện của vi rút và khởi động phản ứng miễn dịch để tiêu diệt chúng, kích thích tiết các phân tử tín hiệu gọi là cytokine, bao gồm interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) Những cytokine này tác động lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dưới đồi ở não, kích thích sản xuất prostaglandin, đặc biệt là prostaglandin E2 (PGE2) Kết quả là cơ thể tăng mức độ chuyển hóa, dẫn tới tăng mức thân nhiệt và gây ra sốt Sốt đóng vai trò như một cơ chế phòng vệ chống lại quá trình nhiễm vi rút Nó tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của vi rút vì nhiệt độ cao có thể làm tác động lên quá trình nhân lên của vi rút và thúc đẩy hoạt động của các tế bào miễn dịch [31]

1.2.1.2 Đau đầu và đau mắt

Các biểu hiện thần kinh thường hiếm và xuất hiện nhiều ở NB mắc sốt Dengue hơn so với NB SXHD hay thậm chí NB sốc Dengue Mất tỉnh táo, buồn ngủ và co giật là những biểu hiện phổ biến nhất, đi kèm với đau đầu và đau mắt [32] Đau đầu ở NB nhiễm vi rút Dengue đã được mô tả là đau nghiêm trọng, lan tỏa từ trước ra sau và ở sau mắt Trong các nghiên cứu (NC) trước đây, đau đầu được tìm thấy ở hơn 95% NB [33] Biểu hiện đau mắt ngày càng được quan tâm là một biến chứng quan trọng của bệnh SXHD, đặc biệt là ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi bệnh này phổ biến Các biến đổi quan sát được trong quá trình khám cơ bản bao gồm xuất huyết điểm vàng, bệnh võng mạc và quanh nhú, đốm Roth, phù võng mạc lan tỏa, tế bào thủy tinh thể, mờ ranh giới đĩa thị, bong võng mạc huyết thanh, tràn dịch màng đệm và các bệnh lý khác như thoái hóa hoàng điểm mắt [32]

Cơ chế bệnh lý thần kinh của nhiễm DENV vẫn chưa được hiểu rõ Các yếu tố vi rút và vật chủ mang có thể đóng vai trò quan trọng trong các rối loạn thần kinh liên quan đến Dengue Trong bối cảnh này, nhiễm trùng trực tiếp của vi rút trong hệ thống thần kinh trung ương, phản ứng tự miễn, các rối loạn chuyển hóa và xuất huyết có thể liên quan đến cơ chế gây bệnh [34]

Dưới đây là một số cơ chế có thể đóng vai trò trong việc gây đau đầu trong nhiễm vi rút Dengue [34]:

- Tác động trực tiếp của vi rút: Vi rút Dengue có thể xâm nhập vào các mô và tế bào trong cơ thể, bao gồm cả não Việc tác động trực tiếp lên các tế bào trong não có thể gây kích thích và gây ra đau đầu

- Phản ứng viêm: Nhiễm vi rút Dengue kích thích hệ thống miễn dịch và gây ra phản ứng viêm trong cơ thể Các phân tử tín hiệu gọi là cytokine, bao gồm interleukin-1 (IL-1) và interleukin-6 (IL-6) được sản xuất và giải phóng trong quá trình này Sự gia tăng của các cytokine này có thể gây viêm nhiễm và tăng cường hoạt động của các tế bào viêm, gây ra đau đầu

- Thay đổi mạch máu và áp lực trong não: Các mô và mạch máu trong não có thể bị ảnh hưởng trong quá trình nhiễm vi rút Dengue Thay đổi này có thể gây ra sự co bóp mạch máu và thay đổi áp lực trong các khu vực não, góp phần vào cảm giác đau đầu

- Rối loạn nước điện giải: nhiễm vi rút Dengue có thể gây ra mất nước và mất điện giải trong cơ thể Hiện tượng mất nước và mất cân bằng điện giải có thể gây ra tình trạng khó chịu và đau đầu Điều quan trọng là đau đầu trong nhiễm vi rút Dengue thường là một triệu chứng phổ biến, nhưng không đặc trưng Nó có thể xuất hiện đồng thời với các triệu chứng khác như sốt, đau nhức cơ xương, và có thể không cần phải coi là một biểu hiện nghiêm trọng [30], [42]

1.2.1.3 Đau cơ Đau cơ được đặc trưng bởi đau, nhạy cảm và sưng cơ nhẹ Đau cơ lan tỏa là một trong những triệu chứng đặc trưng của bệnh SXHD và được ghi nhận trong giai đoạn đầu của bệnh Đau cơ thường ảnh hưởng đến các cơ ở lưng và chi gần NB có thể gặp khó khăn khi đi lại do đau cơ [35] Đau cơ đã được xuất hiện ở 93% NB SXHD Trong một nghiên cứu từ Peru, Bolivia, Ecuador và Paraguay, trong số 1.716 trường hợp SXHD được xác nhận, 90,1% (n = 1.546) NB bị đau cơ [36] Chứng đau cơ ít xảy ra hơn ở những du khách phương Tây trở về từ các quốc gia lưu hành SXHD Người bệnh là người lớn có nhiều khả năng bị đau cơ hơn trẻ em [37], [38]

Sinh bệnh học của đau cơ trong SXHD chưa được biết chính xác Giả thuyết đặt ra có thể liên quan đến sự xâm nhập lan tỏa của vi rút vào cơ (tại thời điểm nhiễm vi rút trong máu) và những thay đổi viêm sau đó trong cơ dẫn đến đau cơ [39]

1.2.1.4 Phát ban và xuất huyết

Trong báo cáo của Idota và CS năm 2006, trong 62 trường hợp SXHD được nhập cảnh vào Nhật Bản từ 1985 – 2000 đã được xét nghiệm tại bệnh viện Komagome (Tokyo, Nhật Bản) có đến 82% có biểu hiện lâm sàng phát ban trên da [40] Đây là một trong những biểu hiện đặc trưng nhất của sốt Dengue và SXHD

Trong sốt Dengue, phát ban đầu tiên là ban đỏ thoáng qua trên mặt, thường xảy ra ngay trước hoặc trong vòng 24-48 giờ đầu tiên kể từ khi xuất hiện các triệu chứng và được cho là kết quả của sự giãn nở mao mạch Phát ban thứ hai thường xảy ra 3-6 ngày sau khi bắt đầu sốt và nó được đặc trưng bởi ban dát sẩn hoặc phát ban dạng sởi không có triệu chứng Trong một số trường hợp, các tổn thương riêng lẻ có thể liên kết với nhau và được coi là ban đỏ hợp lưu toàn thân với chấm xuất huyết và các đảo tròn không có lông - “các đảo trắng trong biển đỏ” Một số NB chỉ phát ban ban đầu và hồi phục hoàn toàn, nhưng có những NB khác có thể tiến triển ban đỏ toàn thân [41] Phát ban toàn thân bắt đầu ở mu bàn tay và bàn chân rồi lan ra cánh tay, chân và thân mình và kéo dài trong vài ngày và giảm dần mà không bong vảy Trong một số trường hợp, sự kết thúc của cơn sốt cũng được đánh dấu bằng những thay đổi ở da dưới dạng ban xuất huyết trên bàn tay, cẳng tay, bàn chân, cẳng chân, và trong miệng [42]

Các biểu hiện xuất huyết thường xảy ra vào thời kỳ giảm sốt Biểu hiện là xuất huyết dưới da, niêm mạc hoặc xuất huyết tạng [43]

Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue

= RT-PCR) được sử dụng rộng rãi hiện nay để phát hiện các gen vi rút trong mẫu huyết thanh giai đoạn cấp; mảnh lai ghép; hóa mô miễn dịch

1.3 Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue

1.3.1 Diễn biến lâm sàng sốt xuất huyết Dengue (Hình 1.1)

Sốt xuất huyết Dengue có biểu hiện lâm sàng đa dạng, từ nhẹ đến nặng Bệnh thường khởi phát đột ngột và diễn biến qua 3 giai đoạn [18]: a, Giai đoạn sốt:

- Lâm sàng: Sốt cao đột ngột, liên tục; nhức đầu, chán ăn, buồn nôn; da xung huyết; đau cơ, đau khớp, nhức hai hố mắt; nghiệm pháp dây thắt dương tính; thường có chấm xuất huyết dưới da, chảy máu chân răng hoặc máu mũi

- Cận lâm sàng: Hematocrit (Hct) bình thường; số lượng tiểu cầu bình thường hoặc giảm dần; số lượng bạch cầu thường giảm b, Giai đoạn nguy hiểm

- Lâm sàng: Người bệnh có thể còn sốt hoặc đã giảm sốt; có thể có các biểu hiện sau:

+ Đau bụng nhiều: đau bụng nhiều và liên tục hoặc tăng cảm giác đau nhất là ở vùng gan;

+ Vật vã, lừ đừ, li bì;

+ Gan to > 2 cm dưới bờ sườn, có thể đau; nôn ói;

+ Biểu hiện thoát huyết tương do tăng tính thấm thành mạch (thường kéo dài 24-48 giờ): Tràn dịch màng phổi, mô kẽ (có thể gây suy hô hấp), màng bụng, phù nề mi mắt; nếu thoát huyết tương nhiều sẽ dẫn đến sốc với các biểu hiện vật vã, bứt rứt hoặc li bì, lạnh đầu chi, mạch nhanh nhỏ, huyết áp kẹt (hiệu số huyết áp tối đa và tối thiểu ≤ 20mmHg hoặc tụt Huyết áp, không đo được huyết áp, mạch không bắt được, da lạnh, nổi vân tím (sốc nặng), tiểu ít

+ Xuất huyết: Xuất huyết dưới da (nốt xuất huyết rải rác hoặc chấm xuất huyết thường ở mặt trước hai cẳng chân và mặt trong hai cánh tay, bụng, đùi, mạn sườn hoặc mảng bầm tím); xuất huyết niêm mạc (chảy máu chân răng, chảy máu mũi, nôn ra máu, tiêu phân đen hoặc máu, xuất huyết âm đạo hoặc tiểu máu); xuất huyết nặng (chảy máu mũi nặng (cần nhét bấc hoặc gạc cầm máu), xuất huyết âm đạo nặng, xuất huyết trong cơ và phần mềm, xuất huyết đường tiêu hóa và nội tạng (phổi, não, gan, lách, thận), thường kèm theo tình trạng sốc, giảm tiểu cầu, thiếu oxy mô và toan chuyển hóa có thể dẫn đến suy đa phủ tạng và đông máu nội mạch nặng Xuất huyết nặng cũng có thể xảy ra ở người bệnh dùng các thuốc kháng viêm như acetylsalisilic acid (aspirin), ibuprofen hoặc dùng corticoid, tiền sử loét dạ dày-tá tràng, viêm gan mạn) + Một số trường hợp nặng có thể có biểu hiện suy tạng như tổn thương gan nặng/suy gan, thận, tim, phổi, não Những biểu hiện nặng này thường có thể xảy ra ở người bệnh có hoặc không có sốc do thoát huyết tương: Tổn thương gan nặng/suy gan cấp, enzyme gan ALT, ALT ≥ 10000 U/L; tổn thương/suy thận cấp; rối loạn tri giác (SXHD thể não); viêm cơ tim, suy tim hoặc suy chức năng các cơ quan khác

+ Cô đặc máu khi Hematocrit tăng > 20% so với giá trị ban dầu của người bệnh hoặc so với giá trị trung bình của dân số ở cùng lứa tuổi

+ Số lượng tiểu cầu giảm

+ Trường hợp nặng có thể có rối loạn đông máu

+ Siêu âm hoặc X quang có thể phát hiện tràn dịch màng bụng, màng phổi c, Giai đoạn hồi phục

+ Người bệnh hết sốt, toàn trạng tốt lên, thèm ăn, huyết động ổn định và tiểu nhiều

+ Có thể phát ban hồi phục hoặc ngứa ngoài da

+ Có thể có nhịp tim chậm, không đều

+ Hematocrit trở về bình thường hoặc có thể thấp hơn do hiện tượng pha loãng máu khi dịch được tái hấp thu trở lại

+ Số lượng bạch cầu máu thường tăng lên sớm sau giai đoạn hạ sốt + Số lượng tiểu cầu dần trở về bình thường, muộn hơn so với số lượng bạch cầu

+ AST, ALT có khuynh hướng giảm

Hình 1.1 Các giai đoạn lâm sàng của SXHD [18]

1.3.2 Chẩn đoán mức độ bệnh

Bệnh sốt xuất huyết Dengue được chia làm 3 mức độ [18]:

- Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo

- Sốt xuất huyết Dengue nặng a, Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue

- Dịch tễ: Sống và/hoặc đi đến vùng có dịch

Thay đổi về xét nghiệm

- Lâm sàng: Sốt ≤ 7 ngày và có 2 trong các dấu hiệu sau:

+ Đau cơ, đau khớp, nhức hai hố mắt

+ Xuất huyết da hoặc dấu hiệu dây thắt (+)

+ Hematocrit bình thường hoặc tăng

+ Tiểu cầu bình thường hoặc giảm

+ Bạch cầu bình thường hoặc giảm b, Chẩn đoán SXHD có dấu hiệu cảnh báo

- Lâm sàng: Bao gồm các triệu chứng lâm sàng của SXHD, kèm theo một hoặc nhiều dấu hiệu cảnh báo sau:

+ Vật vã, lừ đừ, li bì

+ Đau bụng nhiều và liên tục hoặc tăng cảm giác đau vùng gan

+ Gan to > 2 cm dưới bờ sườn

+ Nôn ói nhiều ≥ 3 lần/1 giờ hoặc ≥ 4 lần/6 giờ

+ Xuất huyết niêm mạc: chảy máu chân răng, mũi, nôn ra máu, tiêu phân đen hoặc có máu, xuất huyết âm đạo hoặc tiểu máu

+ Tiểu cầu giảm nhanh chóng

+ Tràn dịch màng phổi, màng bụng trên siêu âm hoặc Xquang

Người bệnh có dấu hiệu cảnh báo có thể tiến triển thành sốt xuất huyết Dengue nặng Vì vậy cần lập kế hoạch theo dõi ý thức, mạch, huyết áp, số lượng nước tiểu và làm lại xét nghiệm hematocrit, tiểu cầu để có chỉ định điều trị kịp thời [18] c, Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue nặng

- Sốt xuất huyết Dengue nặng là sốt xuất huyết có một hoặc nhiều biểu hiện sau:

+ Thoát huyết tương nặng dẫn đến sốc giảm thể tích (sốc SXHD), tràn dịch ở khoang màng phổi và ổ bụng nhiều (SXHD nặng)

+ Xuất huyết nặng: Gồm chảy máu cam nặng và khó cầm, rong kinh nặng, xuất huyết trong cơ và phần mềm và xuất huyết nội tạng Xuất huyết nặng có thể xảy ra ở những NB đã dùng các thuốc acetylsalicylic acid (aspirin), ibuprofen hoặc corticoid, tiền sử loét dạ dày - tá tràng, viêm gan mạn

+ Suy các tạng: Suy gan cấp (enzyme gan AST hoặc ALT > 1000 U/l); Thần kinh trung ương (Rối loạn tri giác); Suy thận cấp; Viêm cơ tim, suy tim, hoặc suy chức năng các cơ quan khác [18]

- Sốt xuất huyết có sốc:

+ Thường xảy ra vào ngày thứ 3-7 của bệnh, biểu hiện bằng các triệu chứng vật vã; bứt rứt hoặc li bì thậm chí hôn mê; lạnh đầu chi, da lạnh ẩm; mạnh nhanh nhỏ hoặc mất, huyết áp kẹt, tụt huyết áp hoặc không đo được; tiểu ít

+ Được chia làm 2 loại: SXHD có sốc (mạch nhanh nhỏ, huyết áp kẹt hoặc tụt, kèm theo các triệu chứng da lạnh, ẩm, bứt rứt hoặc vật vã li bì) và SXHD có sốc nặng (mạch khó bắt, huyết áp không đo được)

Bệnh SXHD có biểu hiện lâm sàng đa dạng, diễn biến nhanh chóng từ nhẹ đến nặng, việc phát hiện sớm bệnh và hiểu rõ những vấn đề lâm sàng trong từng giai đoạn của bệnh giúp chẩn đoán sớm, điều trị đúng và kịp thời, nhằm cứu sống người bệnh [18]

- Sốt phát ban do vi rút

- Nhiễm khuẩn do liên cầu lợn, não mô cầu, vi khuẩn gram âm, …

Vi rút Dengue

Vi rút Dengue thuộc nhóm Arbovirus, giống Flavivirus, có 68 thành viên trong đó có 26 loài gây bệnh ở người [53] Vi rút Dengue có 4 týp huyết thanh: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 Sau khi nhiễm một vi rút Dengue sẽ có phản ứng dương tính với týp huyết thanh đó nhưng không trung hòa hoàn toàn được các týp huyết thanh còn lại Như vậy, một người có thể bị SXHD nhiều lần [1], [54] Tại Việt Nam trong những năm qua có sự lưu hành của cả

4 týp huyết thanh vi rút Dengue, tuy nhiên phổ biến hơn cả là vi rút Dengue týp huyết thanh 2 [19] Ở vùng dịch lưu hành nặng, tỷ lệ mắc bệnh của trẻ em thường cao hơn, còn ở vùng dịch lưu hành nhẹ, khả năng mắc của trẻ em và người lớn như nhau Người từng nhiễm vi rút Dengue hoặc đã mắc bệnh thường có miễn dịch lâu dài với vi rút cùng týp huyết thanh Tuy nhiên, nếu nhiễm lại một týp huyết thanh vi rút Dengue khác thường xuất hiện bệnh cảnh lâm sàng nặng hơn [54], [55], [56] Vi rút Dengue lan truyền từ người này sang người khác qua trung gian truyền bệnh là muỗi vằn tức là Aedes aegypti, ngoài ra còn do Aedes albopictus [57] Muỗi Aedes là trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue, có thể bay trong bán kính 100 mét, khoảng bay của muỗi thường không vượt quá 300 mét từ ổ lăng quăng [58] Muỗi trưởng thành có thể di chuyển đến các nơi khác cùng với những phương tiện di chuyển của con người Do đó, giúp chúng có thể nhanh chóng lây lan dịch Nguy cơ lây truyền cho con người được coi là cao hơn ở những nơi có sự hiện diện của Aedes aegypti trong khu vực của Aedes albopictus Điểm này được minh chứng cho sự bùng nổ của bệnh sốt xuất huyết Dengue khi kết hợp

Aedes albopictus với Aedes aegypti Vòng đời của muỗi Aedes aegypti qua 4 giai đoạn Giai đoạn trứng từ 2 đến 3 ngày, lăng quăng từ 6 đến 8 ngày, nhộng từ 2 đến 3 ngày, muỗi trưởng thành từ 2 đến 3 ngày Nếu nhiệt độ khoảng

20 o C và độ ẩm là 80% thì từ lúc trứng cho đến khi thành muỗi trưởng thành mất từ 12 đến 17 ngày [59] Ở Việt Nam, 95% SXHD là do muỗi Aedes aegypti truyền, do Aedes albopictus chỉ 5% Muỗi Aedes albopictus ít có vai trò truyền bệnh do ít hút máu người hơn Aedes aegypti và có thể sống ngoài thiên nhiên, rừng núi hoặc xung quanh nhà [60] Muỗi Aedes aegypti cái hút máu và truyền bệnh vào ban ngày, trong lúc con người đang thức và di chuyển nên muỗi thường phải hút máu nửa chừng sau đó hút máu tiếp người khác, đó là lý do làm vi rút lây lan đến nhiều người Hơn nữa do muỗi Aedes thích hút máu người vì thế chúng tập trung ở những nơi có mật độ dân số cao Sau khi hút máu người, muỗi Aedes aegypti sẽ mang vi rút và truyền bệnh cho người khác Ấu trùng của Aedes aegypti phát triển rất tốt ở nhiệt độ 25-32°C Mức độ phát triển của bệnh SXHD gia tăng cùng với số lượng ấu trùng SXHD lan truyền không phụ thuộc độ bay xa của muỗi và trong những thời điểm có dịch, muỗi theo phương tiện giao thông để di chuyển từ vùng này sang vùng khác và truyền vi rút cho người [58], [61]

Hình 1.2 Muỗi Ae aegypti – Trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue

Muỗi Aedes aegypti có màu đen sẫm, trên thân và chân có những đốm trắng (Hình 1.2)

Muỗi Aedes aegypti phân bố khắp thế giới, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Các giai đoạn chưa trưởng thành của muỗi đều diễn ra ở những nơi nước đọng, chủ yếu trong các bể chứa gần nhà [3], [62], [63]

1.4.2 Cấu trúc vi rút Dengue

Vi rút Dengue thuộc chi Flavivirus của họ Flaviviridae có cấu tạo dạng hình cầu, đường kính khoảng 35-50nm, đối xứng khối Vỏ ngoài là lớp lipid kép chứa glycoprotein và protein có nguồn gốc từ màng lưới nội bào của tế bào chủ Protein capsid (cấu thành bởi 32 capsomer) bao quanh acid nucleic tạo thành nucleocapsid có đường kính 30nm; vi rút có 3 protein cấu trúc cùng

7 protein không cấu trúc (Hình 1.3) [64], [65]

Hình 1.3 Cấu trúc của hạt vi rút Dengue [64]

Hệ gen của vi rút Dengue chứa một sợi RNA đơn dương, kích thước khoảng 11 kb, với đầu 5’ vùng không dịch mã (5’- UTR) khoảng 100 bp, trong khi đầu 3’-UTR dài khoảng 450 bp (Hình 1.4) Giữa vùng không dịch mã ở hai đầu là một khung đọc mở (ORF- open reading frame) mã hóa một polyprotein gồm khoảng 3400 axit amin trong đó có 3 protein cấu trúc là protein C (protein capsid), protein M (protein màng), protein E (protein vỏ) và

7 protein phi cấu trúc (NS) Những protein này được tạo ra trong quá trình phân tách sau dịch mã bởi protease của vi rút và vật chủ và chúng đều có các vai trò khác nhau trong quá trình gây bệnh của của vi rút [64]

Hình 1.4 Cấu trúc hệ gen và protein của vi rút Dengue [4]

Protein capsid có khối lượng khoảng 11 kDa nằm ở bên trong lớp lipid kép Vùng kỵ nước ở trung tâm của protein capsid có khả năng tương tác với màng tế bào và đóng vai trò trong quá trình lắp ráp vi rút Protein C chứa một vùng C-terminal tác động như một chuỗi tín hiệu cho sự chuyển đoạn của protein M vào khoang mạng lưới nội chất Capsid được tách ra khỏi polyprotein của vi rút dưới tác dụng của protease NS3/2B Sự phân tách này là cần thiết cho sự hình thành nucleocapsid [64], [65]

Protein prM/M gồm 166 a xit amin có khối lượng là 26 kDa Trong đó, đầu N-terminal của prM được tạo ra bởi peptidase ở mạng lưới nội chất trong suốt quá trình giải phóng vi rút từ tế bào chủ Protein prM (màng) có vai trò quan trọng trong định hình và sự trưởng thành của hạt vi rút, bao gồm 7 cấu trúc gấp nếp β ngược chiều Trong quá trình tạo ra vi rút hoàn chỉnh, prM trong mạng lưới Golgi bị cắt thành peptide ‘pr’ được giải phóng khỏi hạt vi rút hoàn chỉnh và protein M vẫn tồn tại trên vỏ vi rút [66]

Protein E (vỏ) thường được glycosyl hóa để thành glycoprotein, với khối lượng phân tử xấp xỉ 50 kDa Đầu C-terminal của protein E chứa một chuỗi tín hiệu chuyển NS1 vào trong mạng lưới nội chất Đây là một protein được tìm thấy trên bề mặt vi rút, đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết hạt vi rút vào tế bào chủ Một vài thụ thể tương tác với protein E (ICAM3, CD209, Rab 5,

GRP 78 và thụ thể Mannose) là tác nhân quan trọng giúp quá trình gắn kết và xâm nhập của vi rút [66] Ngoài ra, đột biến từ các vùng khác nhau của protein này đã tạo nên các týp biến thể của vi rút [64]

Bảng 1.1 Số lượng axit amin và trọng lượng phân tử của các protein cấu trúc và phi cấu trúc của vi rút Dengue

Protein Số lượng axit amin Trọng lượng phân tử (kDa)

Nguồn: Theo Roy SK và cs (2021) [64]

NS1 là một glycoprotein 45 kDa nằm bên trong mạng lưới nội chất và được tiết từ tế bào Đây là kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm vi rút [67]

NS2A là một loại protein kỵ nước với khoảng 231 axit amin NS2A được tách ra từ NS1 trong mạng lưới nội chất và được tách ra khỏi NS2B bởi protease NS3 NS2A liên kết với đầu 3’-UTR trong hệ gen của vi rút, được cho là có liên quan đến khả năng lắp ráp và bài tiết vi rút NS2B là một protein liên kết màng, khối lượng 14 kDa, có chứa 2 miền kỵ nước bao quanh vùng ưa nước Vùng trung tâm của NS2B đóng vai trò như cofactor của protease NS3 [64], [68]

NS3 của vi rút Dengue là một serine protease, đồng thời cũng có hoạt tính RNA helicase và RTPase/NTPase Vùng protease bao gồm sáu sợi β sắp xếp thành hai khối trụ bởi các thành phần 1-180 của protein Ba gốc axít amin trong trung tâm hoạt động của enzym (His-51, Asp73, và Ser-135), được tìm thấy ở giữa hai khối này, và hoạt tính protease phụ thuộc vào sự có mặt của cofactor NS2B Các thành phần còn lại của NS3 (180-618) tạo thành ba tiểu vùng helicase của vi rút Dengue [68]

Sử dụng kháng nguyên trong chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue

(Ba dimer NS1 liên kết với nhau để tạo thành cấu trúc hexamer Mỗi dimer chứa ba vùng:miền β-roll (đỏ), miền cánh (vàng) và thang β (xanh) Chất mang lipid (lõi kỵ nước) ở bên trong hexamer (màu cam))

Khác với các protein phi cấu trúc khác, ngoài việc tham gia tạo nên lớp vỏ protein của vi rút, NS1 còn được bài tiết dưới dạng hexamer vào máu, với tên gọi khác là sNS1 Điều này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của SXHD cũng như các phương pháp xét nghiệm để chẩn đoán SXHD

1.5 Sử dụng kháng nguyên trong chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue

1.5.1 Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp (Hình 1.6)

Công nghệ DNA tái tổ hợp là quy trình thí nghiệm chèn đoạn DNA (gen) từ một sinh vật vào vector, thường là plasmid vi khuẩn tạo vector tái tổ hợp duy trì trong tế bào chủ, dễ dàng thu hồi khi cần [71]

Trên thế giới, protein tái tổ hợp đã và đang được phát triển nghiên cứu, đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và điều trị Tuy nhiên, để thương mại hóa thành công các dược phẩm sinh học này, khả năng mở rộng quy mô và hiệu quả chi phí là những yếu tố quyết định Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp được mô tả thành các bước chính như sau [71]:

- Nhân bản gen: Bước đầu tiên trong sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp là nhân bản gen mã hóa kháng nguyên cần quan tâm vào một vật trung gian phù

Chất mang lipid (lõi kỵ nước) miền cánh (lõi kỵ nước) miền β- roll (lõi kỵ nước) thang β hợp, ví dụ như plasmid Điều này thường được thực hiện bằng cách sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp, bao gồm việc cắt DNA bằng các enzym cắt giới hạn và gắn nó vào vectơ

- Biến nạp: Vectơ chứa gen nhân bản sau đó được đưa vào một tế bào chủ thích hợp như tế bào vi khuẩn, nấm men hoặc động vật có vú,… Điều này cho phép tế bào chủ tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp

- Biểu hiện: Tế bào chủ sau đó được nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp, cho phép biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp Điều này thường liên quan đến việc tạo ra sự biểu hiện của gen được nhân bản bằng cách sử dụng trình tự khởi đầu, giúp thúc đẩy quá trình phiên mã của gen thành RNA thông tin (mRNA)

- Tinh sạch: Sau khi kháng nguyên tái tổ hợp được tạo ra bởi tế bào chủ, nó phải được tinh sạch khỏi tế bào nuôi cấy Điều này thường được thực hiện bằng cách sử dụng kết hợp sắc ký, lọc và các kỹ thuật phân tách khác, giúp phân lập kháng nguyên khỏi các thành phần tế bào khác

Sau khi tinh chế, kháng nguyên tái tổ hợp thường được định dạng thành sản phẩm phù hợp với mục đích sử dụng Kháng nguyên có thể được thêm chất ổn định, chất đệm hoặc các chất phụ gia khác mà vẫn đảm bảo rằng kháng nguyên ổn định và đạt hiệu quả

Hình 1.6 Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp [72]

Trong các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp khác nhau, Escherichia coli (E.coli) được sử dụng nhiều nhất để biểu hiện ở sinh vật nhân sơ Ngược lại, sự biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn có nhiều lựa chọn hơn với các sinh vật khác nhau, từ hệ thống biểu hiện đơn giản hơn như nấm men đến một hệ thống sử dụng thực vật, động vật hoặc tế bào người [73]

Tuy nhiên, khi một gen ngoại lai xâm nhiễm vào một sinh vật khác, trình tự gen mới có thể gây ra những thay đổi trong cơ thể vật chủ để biểu hiện gen Protein tái tổ hợp có thể mất các đặc tính cần thiết trong môi trường vật chủ Trong số các vi sinh vật để biểu hiện, E coli, Bacillus sp., và Pseudomonas sp là một trong những sinh vật nhân sơ chủ yếu được sử dụng E coli là một lựa chọn hàng đầu để biểu hiện protein tái tổ hợp, được sử dụng để sản xuất khoảng

30% dược phẩm sinh học và 70% protein cho mục đích nghiên cứu [74]

Trong bệnh SXHD, sự biểu hiện của các protein như NS1 đã giúp phát triển các kháng thể đa dòng để chẩn đoán Flavivirus cũng như DENV Protein Capsid có vai trò thiết yếu trong tế bào vật chủ bị nhiễm bệnh và vòng đời của vi rút Ngoài ứng dụng chẩn đoán, E coli còn được sử dụng để biểu hiện một số protein để tạo ra kháng thể trung hòa và phát triển vắc xin [75]

1.5.2 Các kỹ thuật sử dụng kháng nguyên trong chẩn đoán

1.5.2.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật thử nghiệm sinh học được sử dụng để phát hiện và đo lường lượng lớn các chất khác nhau như protein, peptit, hormone, và khá nhiều loại các hợp chất sinh học khác Có tới 4 loại phương pháp ELISA khác nhau: ELISA trực tiếp (Direct ELISA), ELISA gián tiếp (Indriect ELISA), ELISA sandwich, ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) [76] Đây là kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzym dựa vào tính hấp phụ tự nhiên của protein trên một số chất như polystyrene Các kháng nguyên hoặc kháng thể được gắn lên bản nhựa trên, sau đó cho kháng thể hoặc kháng nguyên đặc hiệu tương ứng vào để tạo nên phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể Các kháng thể hoặc kháng nguyên đã biết trước được gắn với enzym Enzym sẽ phân hủy cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu đặc trưng Mật độ màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và được đọc chính xác bằng quang phổ kế Dựa trên nguyên lý của các phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể, nếu muốn tìm kháng thể trong hỗn dịch thì phải có kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đó đã biết hoặc ngược lại [76]

ELISA gián tiếp sử dụng một kháng thể thứ cấp, thường là một kháng thể kháng lại kháng thể cần được kiểm tra Bước đầu tiên là hấp thụ chất cần kiểm tra lên một bề mặt chất chống (thường là một microplate) Sau đó, một lượng nhỏ kháng thể chính được thêm vào và kết hợp với chất cần kiểm tra

Tình hình ứng dụng kháng nguyên NS1 trong chẩn đoán xác định kháng thể IgM/IgG sốt xuất huyết Dengue và tiềm năng kết hợp NS1 và

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu 1: Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y

Người bệnh SXHD điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103 (BVQY103) và Bệnh viện Quân y 175 (BVQY175) không phân biệt tuổi, giới và điều kiện kinh tế xã hội a Tiêu chuẩn lựa chọn: Dựa vào Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt xuất huyết Dengue, ban hành theo Quyết định số 3705/QĐ-BYT ngày 22/8/2019 của Bộ Y tế [18]

* Người bệnh được chẩn đoán SXHD với các biểu hiện

- Dịch tễ: Sống và/hoặc đi đến vùng có dịch SXHD

+ Bạch cầu bình thường hoặc giảm

- Cận lâm sàng: xét nghiệm có NS1 (+) và/ hoặc IgM (+);

* Người bệnh tình nguyện đồng ý tham gia NC b Tiêu chuẩn loại trừ

* Người bệnh đang mắc các bệnh ung thư, ghép tạng, bệnh tự miễn, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS)

* Người bệnh bị đồng nhiễm các mầm bệnh khác (vi khuẩn, EBV, CMV, viêm gan B, C)

* Mắc các bệnh giảm tiểu cầu khác: giảm tiểu cầu miễn dịch, xơ gan giảm tiểu cầu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu 1

Người bệnh SXHD điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103 (BVQY103) và Bệnh viện Quân y 175 (BVQY175) không phân biệt tuổi, giới và điều kiện kinh tế xã hội a Tiêu chuẩn lựa chọn: Dựa vào Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt xuất huyết Dengue, ban hành theo Quyết định số 3705/QĐ-BYT ngày 22/8/2019 của Bộ Y tế [18]

* Người bệnh được chẩn đoán SXHD với các biểu hiện

+ Bạch cầu bình thường hoặc giảm

- Cận lâm sàng: xét nghiệm có NS1 (+) và/ hoặc IgM (+);

* Người bệnh tình nguyện đồng ý tham gia NC b Tiêu chuẩn loại trừ

* Người bệnh đang mắc các bệnh ung thư, ghép tạng, bệnh tự miễn, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS)

* Người bệnh bị đồng nhiễm các mầm bệnh khác (vi khuẩn, EBV, CMV, viêm gan B, C)

* Mắc các bệnh giảm tiểu cầu khác: giảm tiểu cầu miễn dịch, xơ gan giảm tiểu cầu

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022,

- Địa điểm nghiên cứu: Tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y

Nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của NB SHXD điều trị nội trú năm 2022 tại hai Bệnh viện

Tại mỗi bệnh viện, áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả, ước lượng một tỷ lệ, sử dụng sai số tuyệt đối n = 𝑍 (1−∝/2) 2 p(1−p) d 2 Với mức ý nghĩa 95% ta có Z1-α/2= 1,96; P: tỷ lệ ước đoán sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo phải nhập viện, chọn P = 31,3% theo nghiên cứu của Bùi Vũ Huy và CS năm 2019 [110], chọn sai số tuyết đối d=5%, tính được n = 331/01 bệnh viện, trên thực tế số mẫu thu thập được là

368 NB tại BVQY103 và 359 NB tại BVQY175

- Sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện

- Tất cả người bệnh nhập viện với chẩn đoán SXHD tại hai bệnh viện thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn đều được chọn vào nghiên cứu

- Tiến hành thu thập thông tin triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm và thu thập mẫu bệnh phẩm

Nghiên cứu mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh SXHD tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175

2.1.5 Phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.1.5.1 Phương pháp thu thập số liệu

- Các thông tin liên quan đến nội dung nghiên cứu sẽ được tổng hợp từ y văn và các nghiên cứu công bố trong và ngoài nước

- Các thông tin về thông tin chung, biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng sẽ được thu thập vào bệnh án nghiên cứu

* Tiêu chuẩn chẩn đoán SXHD: Theo hướng dẫn chẩn đoán SXHD của Bộ y tế 2019 [18]

+Bạch cầu bình thường hoặc giảm

* Chẩn đoán mức độ SXHD: Theo tiêu chuẩn Bộ Y tế Việt Nam năm

+ Lâm sàng: sốt cao đột ngột, liên tục từ 2 - 7 ngày và có ít nhất 2 trong các dấu hiệu sau: Buồn nôn, nôn; Phát ban; Đau cơ, đau khớp, nhức hai hốc mắt; Xuất huyết da hoặc dấu hiệu dây thắt (+);

+ Cận lâm sàng: HCT bình thường (không có biểu hiện cô máu) hoặc tăng; Số lượng tiểu cầu bình thường hoặc giảm; Số lượng bạch cầu bình thường hoặc giảm

- SXHD có dấu hiệu cảnh báo

+ Lâm sàng: Bao gồm các triệu chứng lâm sàng của SXHD, kèm theo các DHCB: Vật vã, lừ đừ, li bì; đau bụng nhiều và liên tục hoặc tăng cảm giác đau vùng gan; gan to > 2 cm dưới bờ sườn; nôn ói nhiều ≥ 3 lần/1 giờ hoặc ≥

4 lần/6 giờ; xuất huyết niêm mạc: chảy máu chân răng, mũi, nôn ra máu, tiêu phân đen hoặc có máu, xuất huyết âm đạo hoặc tiểu máu; tiểu ít;

+ Cận lâm sàng: HCT tăng; Tiểu cầu giảm nhanh chóng; AST/ALT ≥

400 U/l; tràn dịch màng phổi, màng bụng trên siêu âm hoặc Xquang

- SXHD nặng: Khi NB có một trong các biểu hiện sau

+ Thoát huyết tương nặng dẫn đến sốc giảm thể tích (sốc SXHD), tràn dịch ở khoang màng phổi và ổ bụng nhiều (SXHD nặng)

+ Suy các tạng: Gan (AST hoặc ALT > 10000 U/l); Thần kinh trung ương (rối loạn ý thức); tim và các cơ quan khác

2.1.5.3 Kỹ thuật thăm khám lâm sàng a Hỏi bệnh: Tuổi; giới; vào viện ngày thứ mấy của bệnh; các xét nghiệm được lấy vào ngày thứ mấy của bệnh? địa chỉ; nghề nghiệp b Khám phát hiện các triệu chứng lâm sàng:

- Sốt [111]: Mức độ sốt, tính chất sốt, thời gian sốt

+ Nghiệm pháp dây thắt dương tính: Đặt huyết áp kế ở cánh tay NB, duy trỡ trong 5 phỳt ở huyết ỏp trung bỡnh bằng ẵ (huyết ỏp tõm thu + huyết áp tâm trương), sau đó xả hơi nhanh, tháo băng quấn và để tay người bệnh trở về sắc thái như trước khi làm nghiệm pháp Nghiệm pháp dây thắt dương tính khi có ≥ 20 chấm xuất huyết/6,25cm 2 ) da (hình vuông cạnh 2,5 cm)

+ Xuất huyết dưới da: chấm, nốt, mảng

+ Xuất huyết niêm mạc: chảy máu cam, chảy máu chân răng, chảy máu âm đạo Theo dõi số lượng và ngày xuất hiện

+ Xuất huyết nội tạng: xuất huyết tiêu hóa (nôn ra máu, đi ngoài phân đen), xuất huyết tiết niệu (đái ra máu), xuất huyết não, chảy máu trong

+ Xuất huyết nói chung: là một trong các hình thái xuất huyết trên

- Tình trạng tràn dịch: nề mi mắt, tràn dịch ổ bụng, tràn dịch màng phổi

2.1.5.4 Các xét nghiệm cận lâm sàng a Công thức máu: Xét nghiệm này được làm tại Khoa Huyết học – BVQY103 và BVQY175 Giá trị tham chiếu lấy theo “Xét nghiệm sử dụng trong lâm sàng” của Nguyễn Thế Khánh và Phạm Tử Dương [112] b Sinh hóa máu các enzym gan (AST, ALT ), chức năng thận Các xét nghiệm này được làm tại Khoa Sinh hóa - BVQY103 và BVQY175 Giá trị tham chiếu lấy theo “Xét nghiệm sử dụng trong lâm sàng” của Nguyễn Thế Khánh và Phạm Tử Dương [112]

Các chỉ số tham chiếu cho các xét nghiệm huyết học, sinh hóa ở hai bệnh viện nghiên cứu là tương đồng nhau c Xét nghiệm vi sinh vật: xác định kháng nguyên NS1, kháng thể kháng vi rút Dengue (IgM, IgG) sử dụng SXHD Bioine Dengue Duo theo nguyên lý sắc ký miễn dịch phát hiện đồng thời cả kháng nguyên NS1 và kháng thể IgG/IgM của vi rút Dengue trong huyết thanh của người bệnh

Bộ kít xét nghiệm NS1 (-)/IgM (-)/IgG (-) NS1 (+)/ IgM (+)/ IgG (+)

Hình 2.1 Kít Dengue Duo phát hiện NS1và IgG/IgM của vi rút Dengue d Xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh: siêu âm (ổ bụng, màng phổi, màng tim), chụp XQ tim phổi

2.1.6 Các chỉ số nghiên cứu

2.1.6.1 Các chỉ số dịch tễ lâm sàng

- Nghề nghiệp: Làm ruộng, viên chức, sinh viên,

- Địa chỉ: Tỉnh, quận (huyện)

- Bệnh dịch tại địa phương: Đang có dịch SXHD hay không

- Nơi ở 1 tuần trước khi sốt (xác định vùng dịch tễ SXHD)

- Tiền sử tiếp xúc với người nghi bị SXHD trước khi bị bệnh

- Tiền sử bệnh của bản thân: Bệnh lý mạn tính, hoặc có yếu tố nguy cơ ảnh hưởng đến diễn biến bệnh

- Ngày của bệnh khi vào viện

2.1.6.2 Các chỉ số lâm sàng

+ Sốt: Mức độ sốt, tính chất sốt, thời gian sốt

+ Đau mỏi người, cơ khớp

+ Hạch ngoại vi và vị trí cụ thể

+ Trên da: Theo các mức độ như, nghiệm pháp dây thắt dương tính, xuất huyết các dạng chấm nốt, đám, mảng

+ Xuất huyết niêm mạc: Chảy máu lợi, chảy máu cam, kinh nguyệt sớm hoặc kéo dài

+ Xuất huyết tạng: Nôn ra máu, đi ngoài ra máu, xuất huyết não

- Biểu hiện ứ dịch trên lâm sàng: Phù chi, nặng mặt, nề mi mắt…

- Tình trạng sốc suy tuần hoàn

- Đánh giá tình trạng các cơ quan:

+ Biểu hiện tiêu hóa: Buồn nôn và nôn, đau vùng gan, gan to, vàng da, mắt vàng

+ Biểu hiện hô hấp: Nhịp thở, hội chứng 3 giảm, SP02

+ Biểu hiện tim mạch: Nhịp tim và tiếng tim bất thường

+ Biểu hiện thận – tiết niệu: Thiểu niệu, vô niệu

2.1.6.3 Các chỉ số cận lâm sàng

+ Công thức máu: Số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu, Hct,

+ Sinh hóa máu: AST, ALT, creatinin máu, albumin máu…

+ Chỉ số đông máu cơ bản: Tỷ lệ prothrombin, APTT, Fibrinogen

− Xét nghiệm huyết thanh học:

+ Huyết thanh chẩn đoán dengue IgM, IgG

− Xét nghiệm vi rút học: Định týp dengue bằng kỹ thuật qRT-PCR

− Xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh:

+ XQ tim phổi, siêu âm: Để phát hiện tình trạng tràn dịch ổ bụng, tràn dịch màng phổi

+ Điện tim, chụp cộng hưởng từ, hoặc chụp cắt lớp vi tính, nếu có viêm não

Mục tiêu 2

- Trình tự gen NS1 gộp 4 týp đã được thiết kế tối ưu bằng các phần mềm tin sinh và tổng hợp nhân tạo tại công ty Genscript Biotech (Piscataway, New Jersey, Hoa Kỳ) được giữ trong vector pJET1.2 (Thermo Fisher, Mỹ) đã được thiết kế có hai vùng nhận biết cắt của enzym giới hạn là NdeI và XhoI, kích thước thiết kế là 471bp

- Huyết thanh người bệnh được chẩn đoán SXHD tại BVQY103 và BVQY175 Huyết thanh người khỏe mạnh tham gia hiến máu tình nguyện

2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01 năm 2022 đến tháng 7 năm 2023

- Địa điểm nghiên cứu: Tại Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm

- Cỡ mẫu nghiên cứu Áp dụng công thức tính cỡ mẫu để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, sử dụng sai số tuyệt đối:

+ Công thức tính cỡ mẫu để xác định độ nhạy:

+ Công thức tính cỡ mẫu để xác định độ đặc hiệu:

𝑑 2 (1 − 𝑃) Với ngưỡng xác xuất α = 0,05 (độ tin cậy 95%) thì z1-α/2 =1,96

Se (Độ nhạy ước đoán), trong nghiên cứu này chọn Se = 95%;

Sp (Độ đặc hiệu ước đoán), trong nghiên cứu này chọn Sp = 90%; d (Sai số tuyết đối của Se, Sp), chọn d =5%

P là tỷ lệ dương tính trong số mẫu thử nghiệm, trong nghiên cứu này dự kiến tỷ lệ này là 50% (p = 0,5).

Thay số vào các công thức, ta có cỡ mẫu cho ước đoán Se là 146 mẫu, cỡ mẫu ước đoán cho Sp là 277 mẫu Trên thực tế đã thu thập và tiến hành nghiên cứu đánh giá trên 666 mẫu (trong đó 366 mẫu dương tính và 300 mẫu âm tính) Tiêu chuẩn vàng cho xét nghiệm sử dụng xét nghiệm khẳng định qRT-PCR Trong 366 mẫu dương tính có 180 mẫu tại BVQY103 và 186 mẫu tại BVQY175; 300 mẫu âm tính được lấy từ huyết thanh của người khỏe mạnh tham gia hiến máu tình nguyện tại BVQY103

+ Nhóm chuẩn dương: Các mẫu bệnh phẩm của NB SXHD được chọn ngẫu nhiên, đủ số lượng 366 mẫu

+ Nhóm chuẩn âm: Thu tuyển theo phương pháp thuận tiện từ người đến hiến máu tình nguyện tại BVQY103, có tiền sử chưa mắc SXHD và hiện tại không có biểu hiện của SXHD Chọn 300 mẫu đủ tiêu chuẩn

2.2.5.1 Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp DENV

- Tách dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp vi rút Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 và Dengue 4 trên vi khuẩn E.coli

- Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp NS1-DENV1-4 (rNS1)

- Kiểm tra nồng độ và xác định hoạt tính kháng nguyên tái tổ hợp rNS1 bằng kỹ thuật Western Blot

2.2.5.2 Đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA

- Đánh giá hiệu quả sử dụng kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng phương pháp ELISA

- So sánh kết quả sử dụng kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng phương pháp ELISA với kỹ thuật sinh học phân tử khác

2.2.6 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.2.6.1 Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp đặc hiệu của 4 týp huyết thanh vi rút Dengue

- Kỹ thuật lựa chọn gen đích

Dự đoán cấu trúc đoạn protein nhân tạo và thiết kế đoạn gen đích Bốn trình tự NS1 chuẩn của 4 týp huyết thanh được lấy từ ngân hàng dữ liệu có mã số ID lần lượt là: DENV1 (NP_722461.1), DENV2 (NP_739584.2), DENV3 (YP_001531169.2), DENV4 (NP_740318.1) Các trình tự được dóng hàng với nhau và các đoạn bảo tồn cao được chọn Các đoạn chung này tiếp tục được phân tích để xác định các vùng có khả năng tạo epitope, là vùng có chỉ số liên kết tương tác kháng nguyên kháng thể Trình tự NS1 được sử dụng trong nghiên cứu là đoạn thiết kế nhân tạo đã được phân tích chọn các vùng bảo thủ có khả năng sinh epitope từ 4 trình tự chuẩn của các týp huyết thanh khác nhau có ID sequence được liệt kê như trên Các phần mềm được sử dụng đánh giá bao gồm: BepiPred 2.0, Discotope 2.0 Tiếp tục thử nghiệm các mô hình docking của các epitope đã chọn với kháng thể bằng HADDOCK Quá trình docking với 2 cấu trúc kháng thể đã được công bố cấu trúc: bao gồm kháng thể 1G5.3 Fab liên kết với protein NS1 ở DENV2 (Mã PDB: 7BSC) và kháng thể 2B7 Fab liên kết với protein NS1 của DENV1 (Mã PDB: 6WEQ) Vùng biến đổi của 2 kháng thể trên được trích xuất từ phức hợp kháng nguyên-kháng thể sử dụng PDB-tool và ProABC-2

- Kỹ thuật tách dòng đoạn gen NS1 gộp 4 týp vi rút Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 và Dengue 4

Hình 2.2 Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET-rNS1 ở tế bào E.coli DH5α

(A): Tách chiết DNA vi khuẩn (B): PCR khuẩn lạc (C): Cắt mở vòng plasmid với e enzyme XhoI và NdeI (D): Kiểm tra khuẩn lạc E.coli DH5α trên môi trường LB có bổ sung ampicillin (E): PCR sàng lọc khuẩn lạc mang plasmid pJET và gen NS1 tái tổ hợp (rNS1) F: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cắt với enzyme XhoI và NdeI

Hình 2.3 Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pET22b+ và rNS1 ở tế bào E.coli BL21

(A): Cắt mở vòng vector pET22b+ với 2 enzyme XhoI và NdeI (B):

Kiểm tra khuẩn lạc E.coli BL21 mang plasmid trên môi trường LB có bổ sung ampicillin (C): Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cắt với enzyme XhoI và NdeI (D): PCR sàng lọc khuẩn lạc mang gen rNS1 (E) Kiểm tra hoạt tính sinh học của protein bằng phản ứng Westerb blot

Trình tự đoạn gen NS1-DENV1-4 nhân tạo được thiết kế bởi Viện Nghiên cứu hệ gen (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghê Việt Nam) và được tổng hợp nhân tạo tại công ty Genscript Biotech (Piscataway, New Jersey, Hoa Kỳ) Đoạn gen NS1-DENV1-4 được hãng giữ trong vector pJET1.2 có kích thước 2974 bp [T7 promoter, Ampr] và được phòng Nghiên cứu hệ gen biến nạp giữ dòng trong vi khuẩn E.coli DH5α (Invitrogen, Mỹ)

Dòng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp được bảo quản trong tủ âm 20 độ, đến khi triển khai các bước biểu hiện protein

Chuyển gen vào vector biểu hiện pET22b+ kích thước 5493 bp, [T7 promoter, T7 terminater, N-terminal T7•Tag sequence, C-terminal His•Tag sequence, Ampr] (Novagen, Mỹ), có sử dụng 2 enzyme cắt giới hạn NdeI và

XhoI để cắt mở vòng vector pET22b+, sản phẩm được kiểm tra trên gel agarose 1% và tinh sạch bằng GenJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Chuyển plasmid tái tổ hợp pET22b+ mang gen NS1 vào tế bào khả biến E coli BL21 (Invitrogen, Mỹ) bằng phương pháp sốc nhiệt Những tế bào mang gen tái tổ hợp trên môi trường LB agar/Amp(100μg/ml) sẽ mọc được trên môi trường nuôi Để xác định gen mục tiêu có được biến nạp toàn bộ hay chỉ một phần, phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho NS1 được sử dụng để sàng lọc những dòng tế bào mang đủ đoạn gen NS1 đã được chèn và kiểm tra giải trình tự Sanger Trình tự mồi sau khi thiết kế: NS1_Cl_F CATATGAAGTATTCATGGAAAACATGGGG và NS1_Cl_R CTCGAGGTAACCCGGAGG Chu trình nhiệt PCR để phát hiện gen

NS1 nhân tạo: 95 o C/3 phút; 30 chu kỳ (95 o C/30 giây; 58 o C/30 giây; 72 o C/30 giây);

Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp rNS1 bằng cột sắc ký Niken: Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng hệ thống cột resin gắn nickel chuyên dùng cho các protein tái tổ hợp chứa các gốc Histidine

Tế bào E coli BL21 mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 50ml môi trường LB cú bổ sung khỏng sinh 50àl ampicillin (100mg/ml) và cảm ứng 100àl IPTG (100mM) để về nồng độ cuối cựng là 0.1mM qua đờm trờn mỏy lắc 200 rpm ở 37 o C Ly tâm dịch nuôi ở 4000 rpm trong 5 phút rồi tiến hành thu cặn Hòa cặn với 5ml Equilibration Buffer (20mM Na3PO4; 300mM NaCl; 10mM Imidazole; pH = 7,4) cú bổ sung thờm 5àl lysozyme (10mg/ml) ủ 30 phút trong đá Sonicate để phá màng tế bào theo chu trình 15 giây 5 lần, nghỉ 5 giây một lần Sau đó, ly tâm 10000 rpm trong 10 phút, hút dịch sau sonicate sang ống mới, hòa tan cặn với 5ml Equilibration Buffer (20mM Na3PO4; 300mM NaCl; 10mM Imidazole; pH = 7,4) để kiểm tra

Trước khi tinh sạch cần cân bằng cột bằng 10 ml đệm cân bằng Equilibration Buffer (20mM Na3PO4; 300mM NaCl; 10mM Imidazole; pH 7,4), giữ trong 1 giờ, xả dịch Cho dịch sau sonicate qua cột, giữ trên cột 30 phút, xả và thu dịch qua cột Rửa hai lần bằng 20ml Wash Buffer (20mM Na3PO4; 300mM NaCl; 25mM Imidazole; pH = 7,4), rửa một lần bằng washing buffer Bổ sung 5 ml Elution Buffer (20mM Na3PO4; 300mM NaCl; 250mM Imidazole; pH = 7,4) để kiểm tra điện di trên gel SDS-PAGE 12%

- Kiểm tra nồng độ và xác định hoạt tính kháng nguyên tái tổ hợp rNS1- bằng kỹ thuật Western Blot

+ Kiểm tra nồng độ, chất lượng protein tái tổ hợp

Chuẩn bị dung dịch Bradford bằng cách hòa tan 100mg coomassie brillian blue G-250 trong 50ml ethanol, bổ sung 100ml phosphoric acid 85% Sau đó định mức đến 1L bằng nước cất Chuẩn bị dung dịch BSA chuẩn (0,1mg/ml), hòa tan 10mg BSA trong 100ml nước cất Chuẩn bị các ống eppendorf 1,5ml đánh số thứ tự từ 1 đến 6 rồi hút các dung dịch theo thứ tự vào ống như bảng dưới Giữ các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng, cứ 1 phút lắc một lần, để trong 5 phút Không dùng máy votex để tránh tạo bọt Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 595 nm Xây dựng đồ thị y = ax + b trong đó: X là nồng độ BSA (mg/ml); Y là OD của dung dịch hỗn hợp trong ống nghiệm được đo ở bước sóng 595nm bằng máy đo quang phổ UV-VIS

(Eppendorf - Đức) Quy trình thực hiện xây dựng đường chuẩn bradford được mô tả như bảng dưới đây:

Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn phát hiện màu braford

- Kỹ thuật tinh sạch protein tái tỏ hợp bằng cột tinh sạch sắc ký ái lực miễn dịch

Các biến số trong nghiên cứu

Các biến số trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Các biến số trong nghiên cứu

Tên biến Định nghĩa biến Phân loại biến

Cách khai thác và phiên giải biến số

Tuổi Tuổi của người bệnh (lấy năm nhập Định Năm tuổi

Cách khai thác và phiên giải biến số viện trừ năm sinh, tính theo năm dương lịch) lượng

Nhóm tuổi Chia các mức: Dưới 18 tuổi, 18-39,

40-59 và từ 60 tuổi trở lên Định lượng

Giới tính Giới tính của người bệnh ghi trên căn cước công dân Nhị phân Nữ, nam

Sốt Đo nhiệt độ ở nách bằng nhiệt kế thủy ngân Sốt được tính khi nhiệt độ > 37 o C Nhị phân Có, không

Kiểu khởi phát sốt Đột ngột: sốt cao trong khoảng 48 giờ đầu

Từ từ: khoảng từ ngày thứ 3 trở đi mới xuất hiện sốt cao

Sốt nóng đơn thuần hoặc sốt có kèm theo gai rét, rét run Nhị phân Có, không

Thứ hạng Nhẹ, vừa, cao, rất cao

Thời gian sốt 1-3 ngày; 4-7 ngày và > 7 ngày Định lượng Ngày

Xuất huyết Tình trạng chảy máu dưới da, niêm mạc, nội tạng Nhị phân Có, không

Các triệu chứng liên quan đến cơ quan tiêu hóa: đau bụng, đau bụng vùng gan, nôn, buồn nôn, tiêu chảy Định danh Có, không

Cách khai thác và phiên giải biến số

Tràn dịch màng là tình trạng ứ dịch trên siêu âm của ổ bụng, màng phổi, màng tim và các màng hoạt dịch khác

Số lượng hồng cầu, bạch cầu,tiểu cầu

Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu trong máu ngoại vi Định lượng

Hematocrit Hematocrit trong kết quả công thức máu (tăng (>0,47), giảm (50), Giảm(145), giảm (106), giảm (120), giảm(0,5), bình thường (0-0,5)) Định lượng mg/L

APTT Thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa Định lượng giây

Fibrinogen Nồng độ fibrinogen trong máu Định lượng g/l

Tiền sử bệnh Các bệnh mắc trước khi nhập viện Định danh

Công việc chính của người bệnh tại thời điểm nghiên cứu Định danh

II Mục tiêu 2 qRT-PCR Xét nghiệm Realtime PCR trong chẩn đoán bệnh Định danh

Không nhiễm Nhiễm týp huyết thanh 1/2/3/4 Cut-off value

Giá trị ngưỡng xác định trong phản ứng miễn dịch Indirect ELISA Nhị phân Âm tính, dương tính

Diện tích dưới đường cong ROC đánh giá độ tin cậy của của mô hình dự đoán

Tốt, chấp nhận, không giá trị

IPTG Chất cảm ứng sinh học Định mM

Cách khai thác và phiên giải biến số lượng rAgNS1-

DENV1-4 Kháng nguyên tái tổ hợp NS1 Định lượng mg/ml

Sai số trong nghiên cứu

Tuân thủ các quy định về lựa chọn, sàng tuyển đối tượng tham gia nghiên cứu; tăng cỡ mẫu để đảm bảo số liệu thống kê và đề phòng mất mẫu Bệnh án nghiên cứu ban đầu được thiết kế sẵn với sự góp ý của Hội đồng thông qua đề cương, tiến hành thu thập thông tin, những điểm chưa phù hợp sẽ được chỉnh sửa trước khi thu thập chính thức Đối tượng chọn vào nghiên cứu chưa chính xác do các thông tin chẩn đoán chưa đầy đủ

Biện pháp khắc phục: Tập huấn cho các cán bộ, BS điều trị cần chỉ định và thu thập đủ thông tin dịch tễ, lâm sàng và cận lâm sàng, chẩn đoán xác định SXHD cho các người bệnh vào viện

Sai số đo lường: Một số các chỉ số xét nghiệm có thể sai lệch (mạch, nhiệt độ, …chỉ só xét nghiệm huyết học, sinh hoá) có thể sai khác do kĩ thuật lấy mẫu và xét nghiệm Biện pháp khắc phục: Tập huấn cho cán bộ điều dưỡng, KTV xét nghiệm thực hiện đúng quy trình

Sai số nhớ lại: Các thông tin khai thác từ tiền sử, yếu tố dịch tễ của NB có thể bị sai do nhớ lại không chính xác hoặc bị nhiễu bởi thông tin của người thân Biện pháp khắc phục: Hỏi bệnh khi NB tỉnh táo, kết hợp thông tin khai thác thêm từ người thân để sử dụng thông tin đúng nhất Kiểm tra đối chiếu lại thông tin ở các lần thăm khám và hỏi bệnh.

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Các số liệu được xử lí theo thuật toán thống kê dùng trong y - sinh - dược, bằng hệ thống EXCEL 2019, SPSS 20.0., phần mềm thống kê GraphPath Prism 5.0 và TableCurve 2Dv4

Giá trị của các biến số định lượng được trình bày dưới dạng số trung bình, độ lệch chuẩn với phân phối chuẩn, median và tứ phân vị với phân bố không chuẩn Độ tin cậy trong nghiên cứu 95%, có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

Xác định giá trị cut-off: Giá trị OD450 của 300 mẫu huyết thanh người khỏe mạnh đi hiến máu được xác định bằng phương pháp ELISA gián tiếp và thí nghiệm được lặp lại 3 lần Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các mẫu đo ở bước sóng 450nm đã được xử lý bằng Graphpad Prism 9 Software

(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) Tổng giá trị OD450 trung bình với 3 lần độ lệch chuẩn được sử dụng làm giá trị ngưỡng để xác định xét nghiệm ELISA gián tiếp [116] Đối với những mẫu huyết thanh có giá trị OD450 trên đường giá trị cut-off được coi là mẫu dương tính và ngược lại Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm: Độ chính xác xét nghiệm phát hiện kháng thể IgM/IgG trong mẫu huyết thanh sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp NS1-DENV1-4 được so sánh với tiêu chuẩn vàng là phản ứng qRT-PCR Một đường cong ROC được xây dựng nhằm đánh giá độ tin cậy của phương pháp xét nghiệm miễn dịch sử ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp NS1-DENV1-4 trong chẩn đoán Giá trị xét nghiệm qRT-PCR được dùng làm tiêu chuẩn để đánh giá kết quả của xét nghiệm ELISA gian tiếp Các mẫu OD trung bình từ các mẫu bệnh nhân sẽ được so sánh đánh giá với kết quả tương đương với pRT-PCR bằng phần mềm Graphpad Prism 9 Software (các mẫu dương tính trong qRT-PCR được quy định là 1 và âm tính được quy định là 0) Đồng thời việc so sánh chỉ số đồng thuận Cohen’s Kappa giữa kết quả xét nghiệm ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp phát hiện kháng thể IgM/IgG với kết quả phát hiện kháng thể IgM/IgG từ bộ kít test nhanh Dengue Duo cũng được phân tính để đánh giá sự phù hợp từ hai xét nghiệm tương đương

Kết quả được tính toán bằng cách sử dụng các công thức xét nghiệm chẩn đoán độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán (+) và giá trị tiên đoán (-) [117] Trong đó: TP = số lượng kết quả (+) thật, FP = số lượng kết quả (+) giả, FN = số lượng kết quả (-) giả và TN = số lượng kết quả (-) thực Độ nhạy: Se = 𝑇𝑃

Giá trị dự đoán âm: NPV = 𝑇𝑁

Giá trị dự đoán dương: PPV = 𝑇𝑃

Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu được phê duyệt bởi Hội đồng đánh giá đạo đức của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương (Quyết định số 58/CN-VSR ngày 31/12/2021) và được sự đồng ý của hai Bệnh viện (BVQY103 và BVQY175)

Giải thích cho NB về mục đích của nghiên cứu, chỉ nghiên cứu ở người tự nguyện tham gia nghiên cứu Đảm bảo thông tin của NB được giữ bí mật, đánh giá trên số liệu chung của cả nhóm và chỉ phục vụ cho nghiên cứu

Các xét nghiệm được tiến hành trong nghiên cứu là các xét nghiệm thường quy khi nhập viện và không ảnh hưởng đến tình trạng chung của NB

Các thí nghiệm sinh học phân tử trong in vivo và in vitro đều được thực hiện trong điều kiện tiêu chuẩn phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 2 của Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Sơ đồ nghiên cứu

BN được chẩn đoán SXHD

Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA

Mô tả đặc điểm LS, CLS ở NB SXHD điều trị tại BVQY103 và BVQY175 năm 2022

Thu thập mẫu huyết thanh NB

Thu thập mẫu huyết thanh nhóm chứng

Xác định týp DENV 1-4 bằng qRT-PCR

So sánh, đánh giá kết quả của phương pháp ELISA sử dụng NS1 tái tổ hợp với qRT-PCR

Chuẩn hóa phương pháp ELISA sử dụng KN NS1 tái tổ hợp DENV1-4 phát hiện kháng thể kháng NS1

Chế tạo KN NS1 tái tổ hợp DENV1-4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022

3.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

Luận án tiến hành nghiên cứu mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở

727 NB SXHD điều trị tại BVQY103 và BVQY175 trong năm 2022, một số đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu đã được mô tả phân bố theo nhóm tuổi (Bảng 3.1), theo giới và nghề nghiệp (Bảng 3.2)

Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi

Nhóm tuổi Số lượng Tỷ lệ (%)

(8-80) Kết quả Bảng 3.1 cho thấy tuổi trung bình của đối tượng tham gia nghiên cứu 36,8 tuổi, trong đó nhỏ nhất là 8 tuổi và lớn nhất là 80 tuổi; tập trung chủ yếu nhóm tuổi từ 18 – dưới 60 chiếm 91,1%

Bảng 3.2 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, nghề nghiệp Đặc điểm Số lượng Tỷ lệ (%)

Khác (công nhân, kinh doanh…)

Tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ tương đương nhau, nghề nghiệp chủ yếu là lao động tự do và nghề nghiệp khác (bao gồm công nhân, kinh doanh,

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue

Một số đặc điểm lâm sàng của NB SXHD tại 2 bệnh viện được trình bày trong Hình 3.1 và từ Bảng 3.3 đến Bảng 3.13

Hình 3.1 Tiền sử bệnh của đối tượng nghiên cứu

Sốt xuất huyết Đái tháo đường

Tăng huyết áp Viêm gan Viêm dạ dày Khác

Kết quả Hình 3.1 cho thấy tiền sử của các đối tượng nghiên cứu gồm đã bị sốt xuất huyết chiếm 1,1%; đái tháo đường 3,4%; tăng huyết áp 4,7%; viêm dạ dày 12,4% và các bệnh lý khác chiếm 15% (sỏi thận, sỏi tiết niệu, viêm da dị ứng,…)

Bảng 3.3 Triệu chứng cơ năng ở đối tượng nghiên cứu

- Trong các triệu chứng cơ năng của đối tượng nghiên cứu, sốt chiếm đa số 77,4%; đau đầu 69,9%; đau mỏi người 63,1%; đau khớp 48,4%; buồn nôn 37,6%, nôn 18,2% (Bảng 3.3)

- Các triệu chứng của xuất huyết gồm: chảy máu cam 6,7%; cháy máu chân răng 24,5%; rong kinh 4,1; nôn ra máu 0,6%; đi ngoài phân đen 4,3% (Bảng 3.3)

Triệu chứng (nr7) Số lượng %

Sốt 563 77,4 Đau đầu 508 69,9 Đau người (cơ) 459 63,1 Đau khớp 352 48,4 Đau hố mắt 51 7,0 Đau vùng gan 3 0,4

Nôn ra máu 4 0,6 Đại tiện ra phân đen 31 4,3

Triệu chứng khác (Tiểu ít) 8 1,1

Bảng 3.4 Số lượng triệu chứng cơ năng trên một người bệnh

Số lượng triệu chứng Số lượng Tỷ lệ (%)

Từ 2 đến dưới 5 triệu chứng 148 20,4

Từ 5 triệu chứng trở lên 155 21,3

Số lượng người bệnh có dưới 2 triệu chứng chiếm đa số với tỷ lệ

58,3%; người bệnh có từ 2 đến dưới 5 triệu chứng 20,4%, tỷ lệ người bệnh có từ 5 triệu chứng trở lên chiếm 21,3% (Bảng 3.4)

Bảng 3.5 Tình trạng sốt ở đối tượng nghiên cứu trước khi vào viện Đặc điểm

Sốt (tại nhà lúc trước khi vào viện)

Tỷ lệ sốt khi khai thác tiền sử của người bệnh trước khi vào viện cho thấy nam 77,4%; nữ 77,5% sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p

Bảng 3.6 Đặc điểm sốt từ khi khởi phát bệnh theo giới tính Đặc điểm

Sốt rất cao (5) 2 0,6 8 2,2 10 1,4 Sốt cao (4) 112 31,3 115 31,2 227 31,2 Sốt vừa (3) 105 29,3 128 34,7 233 32,0 Sốt nhẹ (2) 79 22,1 56 15,2 135 18,6 Không sốt (1) 60 16,8 62 16,8 122 16,8 p 0,046

Tỷ lệ người bệnh bị sốt cao và rất cao 32,6%; 16,8% nhập viện đã hết giai đoạn sốt, sự khác biệt về mức độ sốt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Thời gian sốt đa phần dưới 7 ngày, có 2,5% có sốt kéo dài trên 7 ngày Kiểu khởi phát sốt đa phần khởi phát đột ngột 72,2%; sốt nóng 85,5%, gai rét 75,1% và có rét run 3,5% Mức độ sốt cao và rất cao gặp ở nữ giới nhiều hơn nam giới Thời gian kéo dài cơn sốt, kiểu khởi phát, tình trạng sốt nóng và sốt rét run, nhưng không khác biệt giữa nam và nữ với p > 0,05 (Bảng 3.6)

Bảng 3.7 Đặc điểm sốt ở đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi

Sốt và biểu hiện của sốt tập trung chủ yếu nhóm tuổi từ 18 đến dưới 60; tuy nhiên sự khác biệt giữa các mức độ của sốt và nhóm tuổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 (Bảng 3.7) Đặc điểm

Sốt rất cao 1 (7,7) 5 (1,1) 4 (1,8) 0 Sốt cao 4 (30,8) 132 (29,9) 71 (32,1) 20 (38,5) Sốt vừa 5 (38,4) 150 (34.0) 63 (28,5) 15 (28,8) Sốt nhẹ 2 (15,4) 81 (18,4) 40 (18,1) 12 (23,1) Không sốt 1 (7,7) 73 (16,6) 43 (19,5) 5 (9,6) p 0,522

Bảng 3.8 Triệu chứng thực thể ở đối tượng nghiên cứu (nr7)

Biểu hiện ở dạng da xung huyết chiếm 45,5%; nghiệm pháp dây thắt (+) 2,3%; có xuất huyết da và niêm mạc 43,2%; tràn dịch các màng 15,5%; sốc sốt xuất huyết 1,3% Các triệu chứng khác như khám đau điểm thượng vị, gan to, tiểu ít, xuất hiện ral ở phổi (Bảng 3.8)

Bảng 3.9 Đặc điểm xuất huyết theo giới tính (nr7) Đặc điểm

Tỷ lệ xuất huyết giữa nam và nữ tương đương nhau; có xuất huyết nam 44,4%; nữ 42% Xuất huyết dưới da của nam 12%, nữ 11,9%; xuất huyết niêm mạc của nam 36,9%, nữ 34,7%; xuất huyết nội tạng nam và nữ 1,4%

Không có sự khác biệt về tình trạng xuất huyết giữa nam và nữ với p > 0,05 (Bảng 3.9)

Bảng 3.10 Đặc điểm dạng xuất huyết theo nhóm tuổi (nr7)

Tình trạng và biểu hiện xuất huyết chủ yếu tập trung vào nhóm tuổi từ

18 đến dưới 60 tuổi chiếm đa số, tiếp đến là nhóm trên 60 tuổi Thấp nhất là nhóm dưới 18 tuổi Tình trạng chấm xuất huyết, mảng xuất huyết, xuất huyết niêm mạc cao nhất thuộc nhóm từ 18 đến 39 tuổi; riêng xuất huyết nội tạng cao nhất nhóm từ 40 đến 59 tuổi (Bảng 3.10) Đặc điểm

Bảng 3.11 Số lượng dạng xuất huyết kết hợp

Số lượng xuất huyết kết hợp Số lượng %

Có 37,3% có kết hợp 2 tình trạng xuất huyết (là sự kết hợp của 2 trong 4 dạng xuất huyết: chấm xuất huyết, mảng xuất huyết, xuất huyết niêm mạc, xuất huyết nội tạng), 5,9% có kết hợp 3 dạng xuất huyết khác nhau (là sự kết hợp của 3 trong 4 dạng xuất huyết: chấm xuất huyết, mảng xuất huyết, xuất huyết dưới da, xuất huyết nội tạng) (Bảng 3.11)

Bảng 3.12 Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo giới tính

Tình trạng tràn dịch được đánh giá qua siêu âm ở giới nữ cao hơn nam nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p >0,05), cụ thể tràn dịch màng bụng nam 12%, nữ 13,6% Tràn dịch màng phổi nam 8,7%, nữ 11,7%; tràn dịch màng tim nam 0% và nữ 0,8% Không có sự khác biệt về đặc điểm các loại tràn dịch giữa giới nam và giới nữ với p > 0,05 (Bảng 3.12) Đặc điểm

Bảng 3.13 Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo nhóm tuổi (nr7)

Tình trạng tràn dịch tập trung độ tuổi từ 18 đến dưới 60; tiếp đến nhóm tuổi từ 60 trở lên và thấp nhất là nhóm dưới 18 tuổi Nhóm tràn dịch các màng hay gặp nhất là nhóm từ 18 đến 39 tuổi, tiếp đến là nhóm 40 đến 59 tuổi Không có sự khác biệt về các loại tràn dịch theo nhóm tuổi với p > 0,05 (Bảng 3.13)

3.1.2.2 Đặc điểm cận lâm sàng

Bên cạnh các đặc điểm lâm sàng, một số đặc điểm cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu cũng được xác định Kết quả được trình bày ở Bảng 3.14 đến Bảng 3.21 Đặc điểm

Bảng 3.14 Xét nghiệm công thức máu theo giới tính

Kết quả trong Bảng 3.14 cho thấy số lượng tiểu trung bình 44,8 G/l, tỷ lệ người bệnh có tiểu cầu giảm mạnh 71,6%, trong đó giới nam 75,7%) có tỷ Đặc điểm

Giảm mạnh ( 0,05 (Bảng 3.16)

Bảng 3.17 Xét nghiệm chức năng gan theo giới tính Đặc điểm

Tăng cao 9 2,8 4 1,2 13 1,9 Tăng vừa 24 7,4 31 9,0 55 8,2 Tăng nhẹ 267 81,8 255 74,3 522 78,1 Bình thường 26 8,0 53 15,5 79 11,8 p

Tiêu đề	Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA
Tác giả	Hoàng Xuân Cường
Người hướng dẫn	PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy, TS. Trần Tất Thắng
Trường học	Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Trung Ương
Chuyên ngành	Y học
Thể loại	Luận án Tiến sĩ
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	246
Dung lượng	5,65 MB