Luận văn thạc sĩ khoa học lâm nghiệp: Nhân giống một số loài phong lan bản địa bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm (Invitro)

Để đánh giá kết quả học tập và nghiên cứu trong 3 năm đào tạo sau đại học - hệ cao học, tôi được thực hiện để tài: “Nhân giống một số loài phong lan bản địa bằng phương pháp nuôi cấy tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BO NÔNG NGHIỆP VÀ PINT

‘TRUONG ĐẠI HỌC LAM NGHIỆP.

'Vũ Thị Huệ

NHÂN GIỐNG MỘT SỐ LOÀI PHONG LAN BẢN DIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRONG

ỐNG NGHIÊM (IN VITRO)

LUẬN VĂN T11\C SI KHOA HỌC LAM NGHIỆP.

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC:

PGS TS Dương Mộng Hùng

MỤC LỤC

“hư

TrangChương 1: Mở đầu 11.1 Đặt vấn để 2

1.2 Mục tiêu 51.3 Đối tượng 5

Chương 2: Tổng quan vấn để nghiên cứu, 6

2.1 Lịch sử phát triển nuơi cấy mơ tế bào thực vật 62.2 Lịch sử nuơi trồng lan 9

2.2.1 Trên thé giới 9

2.2.2 6 Việt Nam 10

2.3 Giới thiệu vẻ phong lan it2.3.1 Nguồn gốc, vj tf, phân loại của cây hoa phofigylan "2.3.2 Vài nét về hình thái phong lan 22.3.3 Giá trị kính tế và sử dụng của cây phong lan 12.4 Cơ sở khoa học của phương pháp nhan giống bằng nuơi cấy mơ tế bào 172.4.1 Khái niệm phương pháp nhân giống bằng nuơi cấy mơ tế bào „

2.4.2 Cơ sở khoa học của nuơi cấy mơ tế bao, 1

2.4.3 Các giai đoạn trong quá tình nhân giống in vitro 192.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá tình phát sinh hình thái mơ tế bào trong — 21nhân giống bằng phương pháp nuơÏ ©ấy in vi

2.5.1 Mơi trường nuơi dưỡng 22.5.2 Moi trường vật lý a

2.5.3 Vat liệu nuơi cấy 282.5.4 Điều kiện vơ trùng 22.5.5 Buéng nuơi cấy 30

2.6 Ứng dung muơi cấy mơ tế bào thực vật (nuơi cấy in vitro) trong cơng tác —_ 30

3.1.2 Môi trường nhân nhanh chối.

Môi trường kéo đài chổi

| Tạo cây hoàn chỉnh

3.1.5 Giai đoạn vườn ươm

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm bố trí thí nghiệm

3.2.2 Công thức thí nghiệm và cách bổ tr

3.2.3 Các chỉ tiêu theo di

3.3 Phương pháp thống kê và sử lý số liệu

Chương 4: Kết quả nghiên edu và thảo luận

4.1 Tạo thể chổi và chổi

4.1.1 Phương pháp khử trùng,

4.1.2 Tạo thể chổi và chổi

4.1.3 Ảnh hưởng của thời điểm lấy hạt đến khẵ oăng nảy mắm và tạo thể ch

4.1.4 Ảnh hưởng của số lượng thể chổi và chồi trong một cum đến khả năng

nhân chổi

4.2 Giai đoạn nhân nhanh thể chồi và chổi.

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân chối

4.2.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chi.

4.2.3 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chối.

4.2.4 Ảnh hưởng của hỗn hợp Kinetin + BAP và Kinetin + NAA đến khả năng.

nhân chối

4.3 Giai đoạn kéo dai chối

4.4 Giai đoạn tạo cây huditchinh,

4.4.1 Ảnh hưởng của nổng độ TBA đến khả năng ra rể.

4.4.2 Ảnh hưởng của phương pháp huấn luyện cây con.

4.5 Giai đoạn chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm.

Chương 5: Kết luận tôn tại và dé nghị.

15

82

82 84

85

LỜI NÓI ĐẦU

Nang cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là một trongnhững mục tiêu quan trọng của quá trình hoàn thiện chương trình cao học lâm

nghiệp - Trường đại học Lam nghiệp Để đánh giá kết quả học tập và nghiên

cứu trong 3 năm đào tạo sau đại học - hệ cao học, tôi được thực hiện để tài:

“Nhân giống một số loài phong lan bản địa bằng phương pháp nuôi cấy trong

ống nghiệm (in vitro)

Hoàn thành bản luận van này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâusắc đến PGS.TS Dương Mộng Hùng, chủ nhiệm bợ thôn Di truyền chọn giống,

Khoa Lâm nghiệp - Trường đại học lâm nghiệp, người trực tiếp hướng dẫn tôitrong quá trình nghiên cứu khoa học Nhân địp sầy tôi xin bày tổ sự biết ơn

chân thành tới tất cả các nhà chuyên môn, eác bạn đồng nghiệp đã tận tình

"hướng dẫn chỉ bảo và diu đất tôi trong suốt quá trình học tap

Trong thời gian học tập và thực hiện bản luận văn này, tôi cũng đã luônnhận được sự ủng hộ, động viên, tạo điều kiện thuận lợi của Khoa nang cao, các

đồng nghiệp và toàn thể bộ môi! Di truyén chọn giống Khoa Lâm nghiệp

-“Trường Đại học lãm nghiệp Nis dịp này, tôi xin chan thành cảm ơn về tất cả

sự ủng hộ và giúp đỡ nhiệt tình, quý báu đó

Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô là một vấn để khó trong lâm

nghiệp, nhưng nhân giống phong lan bản địa lại càng khó hơn Việc nghiên cứu

nhân giống bai loài nH địa trong dé tài này nhằm góp phẩn xây đựng cơ sởhoàn thiện quy tình cde hệ sản xuất cây với số lượng lớn, đồng đều có chấtlượng cao do vậy không thể tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong được sựchỉ bảo, bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp để công

trình nghiên cứu này được hoàn thiện hơn

đit châm thank edn on

“Ngày 30 tháng 11 năm 1999

Vũ Thị Huệ

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ:

Rừng nhiệt đới Việt Nam là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý

giá Ngoài khả năng cung cấp gỗ thì rừng còn là một nơi cung cấp một lượng

lớn đặc sản quý, được liệu cho nén kinh tế quốc dan và cho xuất khẩu Ngàynay khi nói đến lợi dung rừng thì người ta nghĩ ngay đến lợi dụng rừng tổng.hợp Một trong những sản phẩm quý của rừng hiện nay được mọi người

quan tâm đến là các loài lan, nhất là phong lan thột loài thực vật cảnh mà

thiên nhiên ưu đãi, tô điểm cho cảnh quan núi rừng Phong cách đặc biệt của

phong lan là vẻ đẹp trang nhã, với sắc hoa đẹp, Hương thơm thanh nhã phẳng

phat bay xa đã gợi cho ta cảm giác thanh 46, tỉnh khiết, đạm bạc, hương sắccủa phong lan đã di vào thế giới nội tâm của người dân dat Việt, vừa gắn bó

với phong tục tập quán, vừa hoà đồng với tập tục nghỉ lễ [6] Chính phonglan cũng như bất kỳ cây cảnh nào đều gép phần vào việc cải tạo môi trường

sống, là điều kiện tốt để con người tăng thêm lượng 6 xy Không ding ở lại

đây, phong lan còn có vai tid đi (Lai trong chúng ta ngờ tới đó là khả năng

điều chỉnh hành vi, phong cách của con người nhờ sự tao nhã của nó Ngắm

nhìn phong lan con người có thể thanh thản hơn, yêu đời hơn và quên di

những mệt mỗi căng ti#ig trong mỗi ngày lao động vat va của đời thường

Hoa lan là một loàÏ Hoa tất giá tri, ngoài tác dụng lục hoá còn làm dep,

thơm môi trường Giá uj của chúng vượt xa nhu cầu là để thưởng thức, nó cồn

có hiệu ích kinh tế xã hội, sinh thái và trở thành nghề kinh doanh mới Bêncanh đó nó còn là nguồn dược liệu cho y học và là nguồn hương liệu chế biến

nước hoa, xà phòng thơm chúng có giá ti kinh tế rất cao, thị trường quốc tế.

tiêu thụ phong lan rất nhiều Có người nổi: “Vang có giá nhưng hoa lan thì vô

i"; “Một tấc hoa lan một te vàng” [48] Chính vì vậy kink doanh phong lan

đã làm tăng thêm thu nhập và trở nên giàu có cho một số nước có kinh

nghiệm và khả năng gây trống Ở nước ta có nhiều vùng (thành phố Hồ Chí

Minh, Đà Lạt ) đã giải quyết công ăn việc làm cho không ít người lao động,

và đã nổi tiếng trên toàn quốc Đất nước chúng ta được thiên nhiên ưu đãi về địa lý, khí hậu, điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng thích hợp với việc trồng

hoa lan, không những thế nước ta ở vị trí thug lợi cho việc giao lưu quốc tế

mà rùng của chúng ta lại có nhiều loài lan quý, hoa của chúng có nhiều màu

sắc rực rỡ và đa dạng Theo Phan Thúc Huân thì bẩu trời Việt Nam là nhàkính thiên nhiên vĩ đại phi hợp với nuôi trồng lan Song trong những năm gần.day rừng ngày càng bị thu hẹp dẫn và đang ở mức báo động Rừng bị thn phá

thì không những ảnh hưởng đến môi trường sinh thái mà rồi đây các nguồn

gen quý hiếm sẽ bị diệt vong Đến nay nguén tài nguyên hoa lan hoang đạingày càng ít, các chủng tốt ngày càng th’ nên quý Vì vậy điều đáng quantâm ở đây là ngoài nhu cẩu thị trường, tài nguyên hoa lan cẩn phải được bảo

vệ, thuần hoá, nhân giống và nuôi đưỡng chúng Đó là việc làm hết sức cầnthiết đối với chúng ta trong giai đoạn hiện nay

Dé có số lượng, chất lượng đáp ứng được nhu cẩu thị hiếu của khách

"hàng trong và ngoài nước, kết hợp với định hướng phát triển nông nghiệp nước

ta giai đoạn 1996 - 2000, chúng ta không chỉ đơn thuần khai thác tiểm năng,

sẵn có của thiên nhiên mà vấn để dat ra là cẩn giải quyết cả về mặt tổ chức

kinh doanh và kỹ thus (B2! luan giống và cham sóc các loài phong lan có giátrị Hiện nay kỹ thuật /t9ô: cấy mô tế bào thực vật được áp dụng rộng rãi và

có kết quả tiên một số cây giống đặc biệt trong lĩnh vực hoa tưới, hoa lan đã

thừa hưởng sớm các công trình nghiên cứu này Từ lâu ở các nước tiên tiến

như: Anh, Pháp, Mỹ, Nhật hoa lan đã trở thành nhu cầu lớn trong các buổi

18 trang trong tại gia đình, giá rất cao, chỉ có gia đình khá giả mới mua được

‘Vi vậy người ta đã suy nghĩ: khi có một giống lan đạc sắc, thì làm thế nào để

phổ biến rộng rãi giống lan này cho mọi người và ai cũng có thể mua được với

giá phải chăng, hợp túi tiền Hơn nữa làm sao người ta có thể làm chúng thích

nghị với khí hậu bản xứ nếu giống lan đó lấy từ các vàng khí hậu khác nhau trên thế giới Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật sẽ giải quyết được các vấn để trên Vì vậy trong công nghệ sin xuất hoa thương mại, việc ứng dụng

kỹ thuật nudi cấy mô tế bào thực vật được đặc biệt quan tâm và ứng dụng rất hiệu quả trong lai tạo và nhân giống vô tính các cây hoa, cây cảnh quý lạ có giá trj kinh tế cao nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và các cơ quan sạch bệnh

khác như (hat, lá, rễ ) Có thể tạo ra những cây sạch bệnh cho chất lượng hoa

cao và khả năng sinh trưởng tối hơn cây me rất nhiễu Phương pháp nhân giống để sản xuất ra hàng loạt cây con từ một bộ pẬN của cây bằng cách nuôi

cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện môi trường thích hợp và được kiểm

soát (in vitro) là phương pháp duy nhất hiện nay ©ó thể nhân giống nhanh với

số lượng lớn để đưa vào sản xuất cây con dip ng được các yêu cầu mong muốn Cho nên tit những loài lan có-ưong thiên nhiên đến nay đã có trên hàng tram hàng ngần giống khác nhau, từ một số ít cây quý hiếm chỉ có một

số người khá giả hoặc biết thưởng thức mới dám nghĩ tới, đến nay hầu như các

giống quý hiếm được phổ biến đến nhiều người trong thời gian ngắn bởi vì

trình độ thưởng ngoạn về hoá của con người đạt đến đỉnh cao và trình độ khoa học của con người đã giải đáp được nhiều điều bí ẩn của loài lan: đó là khả

năng lai tạo để tạo ra các giống lan mới mà thiên nhiên không thể nào có

được, đồng thời nhờ bã uang nhân giống các loài lan trong phòng thí nghiệm

được thực hiện bởi mote độ mà ngoài thiên nhiên không thể đáp ứng được trong thời gian ngắn Ngày nay đời sống vật chất và tri thúc của con người

ngày càng tăng lên, cùng với sự phát triển vé tí tuệ, con người ngày càng,

nhận thức vẻ đẹp, vẻ tao nhã của phong lan Vì vậy phát triển nuôi trồng phong lan là điều không thể không xảy ra Trong khi đó nhân giống phong lan bằng phương pháp kinh điển có nhiều han chế như: số lượng tạo ra còn ít, cần không gian lớn và thời gian dài để ươm cây, cây bị lão hoá nhanh, sinh trưởng

kém do không sạch bệnh Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô

‘cho một số loài lan bản địa sẽ khắc phục những hạn chế trên và góp phần choviệc lưu trữ phát tiển nguồn gen quý hiếm, tạo nguồn cây giống phong phúphục vụ cho nhu cẩu trổng hoa lan tai địa phương cũng như sự phát tiển

ngành sản xuất lan Xuất phát từ ý tưởng trên, đồng thời g6p phân hoàn thiện

quy tình sin xuất hoa phong lan khắc phục những khó khăn, tổn tai trong

khâu sin xuất cây giống, phong lan, chúng tôi tiến hành dé tài: "Nhu giốngmột số loài phong lan bản địa bằng phương pháp nudi cấy trong ống

nghiệm (in viiro)."

1.2 MỤC TIÊU:

Nghiên cứu toàn điện các công đoại tong bệ thống nhân nhanh

in vitro cho hai loài lan nghiên cứu, im ra môi liường thích hợp nhất để nhân

giống, từng bước hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất hai loài hoa lan

bin địa en với số lượng lớn, đồng đều; có chất lượng cao, đồng thời để xuất

những giải pháp cụ thể góp phần xây dựng quy trình nhân nhanh các giống

lan nói chung

1.3 ĐỐI TƯỢNG:

Do đặc điểm các loài phong lan bản địa đã quen sống hoang dã ởtrong các rừng già mà chứa được thuần hoá nên rất khó điều khiển và nhangiống trong tự nhiên Vì vậy nuôi cấy mô tế bào là biện pháp duy nhất hiện

nay có thé nhân ging alan với số lượng lớn để đưa vào sản xuất cây con

có tính trạng mong rauốĐ, Để tài tập trung nghiên cứu nhân giống in vitrocho 2 loài phong lan

Hoang thảo Giả hac (Phi điệp) - Dendrobium anosmum Lindl

Bắp ngô nhiều hoa (Lan huong) - Acampe rigida P F Hunt Còn có

tên là Acampe multiflora Lindl

Vat ligu nghiên cứu: Hạt lấy ở các giai đoạn chín khác nhau.

Chương 2

TONG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN COU

2.1 LICH SỬ PHÁT TRIEN CUA NUÔI CẤY MÔ TẾ BẢO THUC VAT:

2.2.1 Trên thế giới

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vat được khởi xướng vào nhữngnăm cuối thế kỷ 19, cho đến nay đã trải qua trên 90 năm phát triển Có thể

tạm chia quá trình này thành 4 giai

2.2.1.1 Giai đoạn khỏi xướng: (1898 + 1930)

Haberlandt (1898) là người đâu tiên để xuất phương pháp muôi cấy mô

tế bào thực vat Ông đã tìm cách nuôi cấy cất tế bào đã phân hoá tách từ lá.

một số cây một lá mầm nhưng không thành eông Ngày nay, chúng ta đã biếtrất rõ nguyên nhân thất bại của Haberlandt vì các cây một lá mắm là đốitượng rất khó nuôi cấy Hơn nữa ông lại dùng tế bào đã mất hết khả năng táisinh Nhiều nhà khoa học khác Winker (1902), Thielmann (1924), Kuster(1928), cũng tiến hành nuôi cấy lế bào tương tự nhưng không thu được kếtquả Năm 1909 Berard đã tình eờ phát hiện ra rằng nấm rất quan trọng cho

sự nảy mầm của hạt phong lan Điều đó thể hiện rằng cây phong lan sống

nhờ mối quan hệ cộng sinh Với nấm kể từ lúc mới nảy mầm Nấm quan trọng

nhất mà có mối quan bê cộng sinh với phong lan là giống nấm Rhiroetonia

'Từ những ngày đâu (Ít clip thập kỷ (1900-1910) người ta đã cho rằng phong.lan chỉ có thể nay main in vitro với sự tham gia của nấm, (chi sự nảy mắmcộng sinh của phong lan), các cây phong lan mới nẫy mắm và thể chổi là dịdưỡng phụ thuộc vào nấm cho sự cung cấp các chất đỉnh dưỡng

‘Nguyen nhân chính cho giả thuyết này là một số lượng nhỏ chất dự trữ đượctìm thấy trong các hạt phong lan Nam 1922 Knudson chỉ ra rằng sự nảy

mầm của hạt phong lan là có thể trong một môi trường đơn giản chứa các

loạn:

chất khoáng và đường với sự vắng mặt của nấm Nấm ít quan trọng đối với

cây sau thời kỳ non trẻ bởi vì sau đó thực vật là sinh vật quang hợp tự dưỡng(Withner, 1974) Những nghiên cứu của Knudson vào khoảng những năm

1922 đã làm simg sốt đối với giới nghiên cứu phong lan bởi vì Ong ta đã chỉ

ra ring các hạt của Cattleya, Epidendrum và nhiều loại phong lan khác cókhả nang nay mầm không cộng sinh in vitro Mặc dù phát hiện của Knudsonđược công nhận ngay nhưng thường rất khó có thé tạo nên một môi trường

mà trong đó các loài phong lan được lựa chon có thé nảy mắm và phát triển.Nhiều môi trường dinh dưỡng đã được mô tả cho nhiều loài khác nhau Vào

những năm 1930, Schmacker (1929), Scheittefér (1931), Pfeiffer (1931),

Laurue (1933) đã bước đầu nuôi cấy thành ng đầu rễ phân lập trong môi

trường nhân tạo Day là những tiến bộ rất có ý ghia

2.2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 +1950)

Giai đoạn này được bắt đầu bởï Công trình của White (1934) khi nuôicấy thành công đầu rễ cà chua Rễ sinh trưởng mạnh trong môi trường nhântạo Cùng thời kỳ này có sự phát hiện ra Auxin của Thimann (1935) Nhiềunhà khoa học đã sử dụng Auxin (IAA) và cả Vitamin bổ sung vào môi

trường nuôi cấy Các tác giả đã khẳng định vai trò của Vitamin và Auxin

trong môi trường nuôi cấy mô Năm 1939, Gautheret đã thành công trong

Việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt (Dancus

carota) tiên môi trườy¡g gảo bằng cách cấy truyền 6 tuần 1 lần

Năm 1954, StuðE và Miller đã tìm ra Kinetin trong địch thuỷ phân

ADN của tinh dich cá be Cùng với việc phát hiện vai trò của IAA, 24D,

NAA, các Vitamin và nước dita là những bước tiến rất quan trọng trong giai

đoạn thứ hai cia lịch sử nuôi cấy mô thực vật đó là tiền để kỹ thuật cho việc

xây dựng các moi trường nuôi cấy

2.2.1.3 Giai đoạn phái sinh hình thái (1957 + 1960)

Năm 1957 Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh.

hưởng của tỷ lệ Kinetin/Auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hìnhthành cơ quan của mô sẹo thuốc lá Từ đó dẫn đến nhiễu phát hiện quantrọng khác Mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực

vật Vào những năm 1958 -1959, Reinert (Đức) va Steward (Mỹ) đã thu đượcphôi xô ma từ mô cây Cà rốt Năm 1960 Bergman đã tái sinh thành công tế

"bào đơn thuốc lá bằng kỹ thuật gieo tế bào

2.2.1.4 Giai đoạn nghiền cứu di truyền (1960 cho tới nay)

'Các thành tựu của giai đoạn này đã thực sự đưa nuôi cấy mô thực vat

in vito vào ứng dụng trong công tác giống và nghiền cứu di truyền Các

thành tựu có tính chất đánh đấu giai đoạn này lầt

Sau năm 1960 một cuộc cách mạng điễn ra trong nhân giống sinh

dưỡng cây phong lan Morel (1960) đã nhân giống loài Địa lan (Cymbidium)

bằng việc nuôi cấy mo phan sinh và đã nhận được từ các đỉnh chổi này cácchối mắm giống như nay mắm từ hạt, Các mắm rễ có khả năng tự phân chianhưng thường nó nhận được bằng cách cất mắm rễ thành từng mẫu Vềnguyên tắc sy cắt này của mắm tễ có thể lặp lại vô hạn Khi dừng cắt đầuchối trong mỗi mắm rễ về nguyên tắc có thể phát triển thành chéi với lá và

18, Bằng cách thức này Morel đã lạo ra hàng ngần cây trong một năm bắt đầuchỉ với một đỉnh chéi, 3/ ấy dòng phong lan bằng cấy mô phân sinh trởthành ứng dụng thương le! nhân giống sinh dưỡng, đầu tiên trong in vitro.Phương pháp này đầu tiên được phát triển cho Cymbidium sau đó được chỉnh

lý và sử dụng cho Cattleya và nhiều thế hệ phong lan khác

~ Nitsch (1967), Nakata, Tanaka (1968) đã nuôi cấy bao phấn thuốc

0 thành công cây thuốc lá đơn bội

- Năm 1971, Takabe tái sinh được cây thuốc là hoàn chỉnh từ

protoplast

lá,

~ Năm 1972, Carlson đã tạo được con lai xơ ma đầu tiên giữa hai lồi

thuốc lá

~ Năm 1977 Melchers dung hợp protoplast thành cơng giữa Khoai tây

và Cà chua tạo cây “pomate” Từ năm 1980 đến nay hàng loạt thành cơngmới trong lĩnh vực cơng nghệ gen thực vật đã được cơng bố Nuơi cấy mơ tế

bào thực vật trở nên một cơ sở khơng thể thiếu của cơng nghệ sinh học hiện đại (chủ yếu sử dụng cơng nghệ ADN tái tổ hợp) Nuơi cấy mơ tế bào trở

thành một cơng cụ quan trọng trong cơng nghệ tạo giống và nhan giống hiệnđại Nuơi cấy mơ tế bào thực vật cũng mang lại nhiều lý luận mới mẻ cho ditruyền học và sinh lý thực vật

2.2, LICH SỬ NUOLTRONG LAN.

2.2.1 Trên thế giới

“Trong thế giới lồi hoa, cây cảnh Hộ lan là một trong những lồi hoađẹp nhất Hoa lan khơng những dep vẻ mầu sắc mà cịn đẹp cả vẻ hình dáng

Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa tao nhã đến

những dạng hình duyên dáng của thân, lá, cành, hoa mà ít cĩ hoa nào sánhnổi

Ho lan Orchidaceae là mi0t trong những đỉnh cao của sự tiến hố các

lồi cây cĩ hoa Hoa lan đến với con người từ rất sớm Ở Châu Á, lan rừng.

đã được dùng làm thuốc chữa bệnh từ thời vua thin nơng (2800 trước cơng,

nguyên) [2]

"Trong quyển cược thio và phương pháp dưỡng sinh của Maosiang đờinhà Tống Trung quốc (niin 960 - 1279) đã tình bày rất rõ những cơng dụngchữa bệnh của nhiều lồi lan thuộc chi Dendrobium

Vio đời nhà Minh (1368-1644), hoa lan đã được nhiều hoạ sĩ nổi tiếng, của Trung Quốc lúc bấy giờ vẽ vào tranh tạo nên những tác phẩm nghệ thuật

phu vụ cho việc trang tr

Năm 1728, Matuka (Nhật Bản) đã viết lên những kiến thức ban đâu,những kinh nghiệm trồng và chăm sĩc các lồi hoa lan

© Châu Âu, hoa lan được con người biết đến từ trước công nguyên Phrastus (376-285 Trước công nguyên) là người đẩu tiên dùng danh từ

erchis chỉ một loài lan có cũ tròn dùng làm thuốc chữa bệnh [9]

Các thế kỷ 16,17,18, người Chau Âu đặc biệt là người Anh đã đi khắp

thế giới nghiên cứu, sưu tập cây cỏ Trong thời kỳ này, nhiều loài lan nhiệt

đối đã được đưa về Anh Năm 1974, ở Anh người ta đã biết được 15 loài lan

nhiệt đới và đến năm 1812 Loridiges đã thiết lập vườn lan thương mại đầu

tiên tên thế giới

'Về phân loại, nấm 1783 Linne đã dùng danh từ orchis để chỉ các loài lan Năm 1836 John Lindley cũng sử dụng danh từ orchis để chỉ chung cho

các loài lan và từ đó các loài lan được xếp thành một bọ trong hệ thống phân

loại chung gọi là Orchidaceae

Ngày nay lan rừng đã được xác định có khoảng 750 giống, hơn 25.000

loài và đã có hơn 30.000 loài lan lai

2.2.2 Ở Việt Nam :

Đấu vết nghiên cứu buổi ban đậu khong rõ Có thé nói người đầu tí

khảo cứu lan là Joannis Loueire là nhà tuyên giáo Bổ Đào Nha vàonăm 1789 Sau khi người Pháp đến Việt Nam cũng có rất nhiều nhà khoa học

Pháp đã nghiên cứu khảo sát về lan và đã có nhiều công tình rất đáng kể

như của F.Gaynepain và A Gullanmin đã mô tả 101 chi gồm 750 loài cho cả

3 nước Đông Dương (30 Ðộ, *Thực vật chí đông” xuất bản năm 1932-1934,

Ngoài ra còn có một ð lẤc phẩm khác cũng để cập đến phong lan Việt Nam

của Schmid, Tixer Bên cạnh đó một số tác phẩm người Việt Nam cũng

bước du nghiên cứu vẻ phong lan, đáng kể nhất là công trình nghiên cứu

“Cay cỏ miễn Nam” của giáo sư Pham Hoàng Hộ Sau này cũng chính

sư đã bổ sung rất nhiều loài trong tác phẩm “Phong lan Việt Nam” Mặt khác các công trình nghiên cứu vẻ kỹ thuật gây trồng phong lan như của

Huỳnh Văn Thới, Nguyễn Tịch Trổng hoa lan của kỹ sư

10

"Nguyễn Công Nghiệp, kỹ thuật lai tạo và phương pháp nhân giống phong lan của tiến sỹ Dương Công Kiên Hoa lan nuôi trồng và kinh doanh của Phan Thúc Huan Phong lan Việt Nam của Trin Hợp và một số để tài về nhân giống phong lan của trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã thúc đẩy thêm cho việc phát tiển, gây trồng phong lan ở nước ta

2.3, GIỚI THIỆU VỀ PHONG LAN.

2.3.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại của cây hoa phong lan:

Lan thuộc ngành ngọc lan (hạt kín, Magnoliophyta), lớp hành (một lá mắm Liliopsida), bộ lan (Orchidales), họ lan (Orchidaceae ) với 750 chỉ và

20.000 ~ 25.000 loài (theo A.L - Takhtajan, 1987) Họ lan chiếm vị tí thứ 2sau họ cúc trong ngành thực vật hat kín và là họ lớn nhất trong lớp một lá

mắm (Monocotyledones) Hoa lan phân bố khắp nơi trên trái đất, nhưng phong phú nhất là ở các rừng ẩm nhiệt đếi, các ving Đông Nam A và Trung Mỹ,

'Nhìn chung, họ lan phân bố từ 68 độ vĩ bắc đến 56 độ vĩ nam Tuy nhiên trung tâm phân bổ của phofig lan vẫn là khu vực nhiệt đới, đặc biệt ở

Châu Mỹ và Đông Nam Châu Ấ: Theo nghiên cứu của R.LPresley (1981) ở

vùng nhiệt đới Châu Mỹ có khoăng 306 chi và 8.266 loài, & vùng nhiệt đới

Châu A có khoảng 250 chỉ Và 6.800 loài, trong đó có 1.400 loài thuộc chi

Dendrobium Coelogye ©4 200 loài, chi Phalaenopsis có 35 loài, chi Vanda

có 60 loài Còn vùng ne đói Chau Mỹ TA quê hương của nhiều chỉ, loài nổi tiếng trên thế giới Cattleya (60loài ), Epidendrum (500loài) ở các vùng nhiệt

đới khác cũng có nhiều loài: Colombia có 1300 loài và Tân Ghine có 1.450 loài [9J Theo F.G Briger (1971) họ phong lan phân bố giảm din khi vượt

quá vĩ độ nhiệt đới đến vùng khí hậu lạnh Ở vùng bán cẩu Bắc có khoảng.

75 chỉ và 900 loài, ở vùng ôn đổi bán cầu Nam số chỉ, số loài còn ít hơn 40

chỉ và 500 loài

'Ngay ở các vùng nhiệt đới, họ phong lan càng phân bố rộng khắp tir

vũng đấm lấy sát bờ biển qua vùng đổi núi thấp lên cả vùng đổi núi cao Mặc

di da số loài phong lan sống ở độ cao dui 2000" so với mặt biển, tuy nhiên

có một số loài sống được ở độ cao 5000" so với mat nước biển Ở Colombia

có loài phong lan sống ở vùng núi quanh năm phủ tuyết (6)

“Số lượng các chi, các loài được phát hiện ngày càng nhiều Theo thống

kê của các nhà thực vat học Việt Nam hiện nay nước ta có khoảng 125 chỉ và

hơn 800 loài Lẽ di nhiên con số này còn xa so với thực tế Như vay, họ Lan

đã trở thành một đối tượng cực kỳ phong phí và dic sắc của hệ thống thực

vật Việt Nam, nó chẳng những là hệ thực vật phong phú nhất mà còn đóng.

góp nhiều mặt về giá tr sử dụng và thắm mf cho nên kinh tế, văn hoá củanước ta

2.3.2, Vài nét về hình thái phong lan

Họ lan (Orchidaceae) là một họ tất phong phú và phúc tạp, nhìn chung.

là những loài cây than thảo sống IA năm ở dưới đất hoặc trên kế đá (Địa lan,Thạch lan) hoặc sống bám tên những cây gỗ lớn với bộ rế khí

(Phong lan)

Khi sống ở đất nó thường có dạng cũ nạc, rễ mập và xum xuê hoặc

than tế bò dài hoặc ngắn

Lối sống độc đáo nhất của phong lan là lối sống phụ sinh, treo lơ lửngtrên các vỏ các cây gố khi,

Hệ rễ khí sinh vài Piru nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏ cây

số và từ không khí, vừa bám chặt vào giá thể để lấy thế cho cây, nó còn làm

nhiệm vụ bấp thy chất định dưỡng Hệ rễ được bao bởi một lớp mô hút ẩm

ồm một lớp tế bào chết chứa đẩy không khí Với lớp mô xếp đó rễ không

những lấy được nước mưa chảy dọc thân cây gỗ mà còn hấp thụ nước từ

ngoài không khí Ở một số loài phong lan có thân kém phát triển (thậm trí

tiêu giảm hoàn toàn), hệ rễ phát triển day đặc kiêm cả mhiệm vụ quang hợp.

Do 46 có dang đẹp, bò dài và màu xanh như lá [6]

“Thân cây họ lan cũng phong phú về kiểu dáng ngắn hay kéo dài, có mang lá hoặc không (Theo MLE Pfitzer-1882) Cay lan có thể xắp xếp

thành hai nhóm :

+ Nhóm da thân (Sympodial) gồm các giống Catleya, Dendrobium,

‘Cymbidium Cây trong nhóm này thường không tăng trưởng liên tục mà có thời gian nghỉ sau mùa tăng trưởng.

+ Nhóm đơn thân (Monopodial) gồm các giống Vanda, Phalaenopsis,

Rhynclostylis Cay trong nhóm này thường tang-trtiing (heo chiều cao.

'Ngoài ra còn có một ít giống trung gian giữa hai nhóm trên như cácgiống Pachyphyllum, Centropelalum, than Cũa ching thường biến động từ

0,1 ;0,2m đến 3 ; 4m

Hầu hết các loài lan sống tự dưỡng nên nó phát triển đây đủ hệ thống,

14, Lá mềm mại duyên đáng và hấp dẫn Lá đơn nguyên dày, cứng hay mềm

có gân giữa nổi rõ, có loài lá biến đổi thành vảy hay tiêu biến hoàn toàn.

Hình dang lá rất phong phú: hình trụ, hình kim, bau dục, tiết diện tồn hay

có rãnh Lan ở các ving nhiệt đổi thường rụng lá trong mùa khô hạn

Hoa lan có cấu tạơ cực kỳ phong,_phú và hấp din Hoa có cấu trúc cơbản của hoa mẫu 3 Hoa cổ 3 lá đài thường có dạng cánh hoa và giống nhau

"Trong số 3 cánh hos {esi tring) ở đa số các loài lan, cánh giữa khác bivới các cánh còn lai, có chite năng đặc biệt trong thụ phấn và được gọi là

cánh môi Môi thường lớn hơn các cánh khác của bao hoa Bầu hạ, nhị nhuy hợp thành trục Sau khi thụ phấn các tiểu noãn sẽ biến đổi thành hạt, bầu noãn to dân thành quả Quả chín sẽ nứt đọc theo 3 đường để hạt bay ra ngoài Quả lan thuộc loại quả nang, có nhiễu hình dạng khác nhau: Hình trụ phình ở giữa hoặc thuôn dài Quả lan có nhiều hạt và nhỏ bé, mỗi quả lan

có đến hàng triệu hat Hạt chỉ cấu tạo bởi phôi chưa phân hoá trên mạng lưới

nhỏ, xốp, chứa đấy không khí, phải qua từ 2 - 18 tháng hạt mới chín, hạt muốn nảy mầm được ở ngoài tự nhiên thì phải gặp nấm cộng sinh cản thiết

“Trọng lượng hạt cực kì nhỏ bé nên được gió mang di rất xa khi quả nứt ra

Muốn phát triển ngành trồng lan ở Việt Nam chúng ta phải đầu tư và

«mg dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật hiện đại vào công việc nghiên cứu sản xuất lan Phải khẳng định rằng, chỉ có bằng phương pháp nuôi cấy mô và

tế bào mới có một số lượng lan nhiều và đồng nhất trong một thời gian ngắn.

và chỉ có kết hợp lai tạo với gieo hạt lan bing phương pháp nảy mam không, cộng sinh trong phòng thí nghiệm chúng ta mới có nhiều giống lan độc đáo

6 thể cạnh tranh với thị trường thế giới trong tương lai

2.3.3 Giá trị kinh tế và sử dụng của cây phong lan.

Hoa lan là một loài hoa quý được nhiều người tra thích, với vẻ đẹp mê

hồn, màu sắc cực kỳ phong phú, cùng với Sự đa dang về loài, hình đáng, bộ

18 độc đáo hương thơm thoang thoảng, nhẹ nhàng thanh cao Hoa lan được coi là loài hoa cao quý hoa lệ nhất trong thế giới cỗ cây Người phương tây gọi là “Bách hoa nữ vương” (vua của trăm thứ hoa) Có nhiều ti liệu ghỉ

chép, hoa lan đều có tất ck mau $ắc của hoa có trong thiên nhiên, điều đó đã

khiến nó mang lại nhiều giá trị sử dụng cho cơn người [48] Ngoài việc phục

vụ như cầu giải tí, thưởng thife cái đẹp của con người, hoa cũng đồng thời

mang lại một nguồn lợi kinh tế quan trọng Theo I.T.C (Trung tâm phát triển

xuất khẩu của Liên hợp quốc): tổng kim ngạch xuất nhập khẩu về hoa, lan, cây cảnh của thế pigiyiiat 1.8 tỷ USD vào năm 1989 [9] Nhưng

Tito j Rimando cho cya: hàng năm kisn ngạch xuất nhập khẩu hoa, lan, cây

cảnh trên thế giới đạt tị giá $0 tỷ USD [47] Các nước thuộc Châu á nhiệt đới như Thái Lan, Singapore, Philippin, Indonexia là những nước sản xuất

và xuất khẩu lượng lớn hoa lan Đặc biệt Thái lan là nước điển hình về nuôi

trồng và xuất khẩu hoa lan Kim ngạch xuất khẩu của hoa lan ở Thái Lan

1987 là 21 triệu USD, năm 1990 là 26 triệu USD, 1991 lên tới 30 triệu USD

t0]

4

"Việt Nam nằm trong vùng khí Bu nhiệt đới ẩm, nên các loài hoa lan

Viet Nam là những thành phẩn quan trọng trong hệ sinh thái rừng tạo chonước ta thành một trong những vùng phân bố các loài hoa lan quý trên thế

giới

“Tir xa xưa Ong cha chúng ta cũng đã biết đến hoa phong lan, biết cách

trồng và chăm sóc hoa nhưng hoa lan chúng ta trồng chủ yếu là hoa rừng tự

nhiên nên khó nhân giống và chăm sóc mà hoa chỉ ra mỗi năm một lần,

không thuận lợi cho sản xuất và xuất khẩu Ở Việt Nam việc sản xuất và xuất khẩu hoa phong lan mới được hình thành và phát triển hơn 10 năm gần

đây Từ khi thực hiện kế hoạch phát triển kinh doanli xuất khẩu hoa lan trong

ba năm đầu thành phố Đà Lạt đã đạt được giá trị sẵn lượng xuất khẩu là

320,000USD Ở miễn Bắc điển hình có xã Đằng Hải - An Hải - Hải Phòng,

những năm qua bước đẩu đã sản xuất và Xuất khẩu hoa tươi đi các nước

khác, và trong ba năm đầu thu được giá trị sản phẩm xuất khẩu là 350.000

USD [9] Bên cạnh đó trong những năm qua Việt Nam đã nhập nội các loàihoa lan từ Thái Lan, Singapore, Pháp va một số nước khác về làm cho tậpđoàn hoa lan Việt Nam vốn di đã phong phú càng thêm phong phú hơn

"Ngày nay nhu cầu sử dụig hoa phong lan rất lớn với những cành hoa

đẹp mau sắc phong phú đã làm cho giá tri của một gid phong lan lên tới cả

chục ngần đô 1a như: Paphlopedium, Volontennum Đặc biệt một số loài nở

“đúng dip tết nguyên đán nhyt: Ngọc điểm, Mạc lan, Bạch cấp đã làm tăng giá tri của lan gấp sib '@/ Mao Không chỉ cho hoa đẹp mà hoa phong lan còn

rất bén với thời gian Có những loài hoa như Hồ điệp hoa nở 2 đến 3 tháng

mới tàn, đó là ưu điểm mà không loài hoa nào có được.

“Trồng hoa phong lan không cẩn diện tích lớn, du tư chỉ phí vừa phải

nhưng với giá cả và mức tiêu thy hiện nay thì nó đem lại nguồn lợi vô cùng

lớn cho người sin xuất

Hoa lan không chỉ là để thưởng thức mà người ta còn làm tỉnh dầu thom, làm thực phẩm và dược liệu.

Giá tị được liệu: Cá loài hoa lan mọc núi để có giá tr chữa bệnh mắt

mát dịu, hơn lan đốt lên có giá tị chữa ho mắt cổ họng, Tòng lan có thể cắm

máu, sinh cơ, Lan hành có thể tiêu viêm, lợi tiểu.[48}

Giá tị lầm thức an:

dưỡng đặc biệt dùng cho người bị viêm da dày [48]

“ic loại lan Hồng môn có thể làm chế phẩm dinh

2.3.4, Đặc dl

2.3.4.1, Loài Lan Phi điệp (Dendrobium anosmum Lindl): lan sống phụ,thân hình trụ dhi, phân đốt, có các khía mờ đọc thân cây, thân buông thống

sinh học của loài lan nghiên cứu:

xuống, lá hình giáo thuôn, mềm, xếp hai day dễ dụng, mặt dưới l4 màu xanhnhạt, sau khi rụng lá thì mang hoa, cum hoa ngắt Cổ hai hoa trên mỗi đốt lárụng Hoa mầu hồng tím, hai cánh trang hai bên bằng nhau, mễm uốn cong

ra Cánh môi lớn, cuộn lại, mầu tím với hai đến: lớn màu tím đệm phủ một

lớp lông màu trắng Nhị bình khối 1Ìqyễ nhô, nhiều mọc cum dưới gốc thân.Huong thom đậm đà.

2.3.4.2 Loài Lan hương (Acampe rigida PF Hunt): lan sống phụ, than lớn,hoá gỗ, nhiều rễ chống to map mọc tản ở tiên thân, có màu xanh Lá lớn, đầygấp theo gân giữa, đâu chia hai thu? tròn không đều Cụm hoa dài, cứng cónhiều hoa Cánh hoa dày mầu vàng có nhiễu đốm nâu đỏ Cánh môi màutrắng hay vàng nhạt, điểm nhiễu vệt màu nâu đậm, gốc có túi ngắn Hương

Ảnh]: Loài Lan Phi điệp Ảnh2: Loài Lan hương.

2.4 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI 'CẤY MÔ TẾ BÀO.

2.4.1 Khái niệm phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào:

'Nuôi cấy mô tế bào (vi nhân giống) là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng có môi trường thích hợp và được kiểm soát.

2.4.2, Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào:

2.4.2.1.Tink toàn năng (Totipotence) của tế bào:

'Ngay cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lý thực vat học người Đức

Haberlandt đã phát biểu tính toàn năng của té bào Theo ông: tế bào bất kỳ

của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền.

(ADN) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó kiện thích hợp, mỗi

tế bào đều có thể phát triển thành một cấ thể hoàn chỉnh.

“Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luậncủa phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay con người đã

'hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh.

từ một tế bào riêng rế

2.4.2.2 Tuổi giai đoạn.

Vào thế kỷ 17, 18 người la cho rằng các dòng vô tính bị thoái hoá di

theo tuổi và chỉ có thể iné fos thông qua sinh sản bằng hat, song thực tế cho thấy đời sống của mội đễn¿ vô tính là vô hạn nếu như nó sống trong môi trường thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh sản sinh dưỡng Nguyên nhân

thoái hoá chủ yếu do tác hại của vi rút Khả năng tái sinh là một đấu hiệuquan trọng xác định sự chuyển giai doan từ non trẻ sang thành thục, khả

năng ra chồi, rễ ở các thành phẩn khác nhau là rất khác nhau, nuôi cấy ở

đoạn non tré sẽ ra chi, ra rễ tốt hơn các bộ phận thành thục

Vi vậy việc xử lý trẻ hoá là một biện pháp quan trọng nhất trong việc

nhân giống sinh dưỡng

(Qué trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy thực vật in vitro thực chất

là kết quả phân hoá và phần phân hoá tế bào.

2.4.2.3.Su phân hoá va phan phân hoá tế bào:

Co thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm.

nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau

thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào

đồ đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh

‘Sy phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, dim nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể.

Quá trình phan hoá tế bào có thể biểu th

'Tế bào phôi sinh => Tế bào din =3 “Tế bào phân hoá chức năng Tuy

nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành mo chức năng chúng không hoàn toàn

mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cẩn thiết, điều kiện

thích hợp, chúng lại có thể trở vẻ dạng tế bào phôi sinh và lại phan chia

mạnh mẽ, Quá trình đó gọi là sự phần phan hóa tế bào, ngược lại với sự phân

hoá tế bào

KT Phân hoá tếbào—— |

“Tế bào pho} sis > Tế bào din > Tế bào chuyên hos

l ~~ Phan phân hoá tế bào4 |

‘Vé bản chất thì sự phân hóa và phản phân hoá là một quá trình hoạt

hoá phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá tình phát triển cá thể,

có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính

trang mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xây ra theo

I8

một chương trình đã được mế hoá trong cấu trúc của phân từ ADN của mỗi

tế bào

Mật khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức

chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân hoá sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn.

2.4.3 Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro.

(Qué trình nuôi cấy in vitro được chia ra 5 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị.

Giai đoạn này coi như là một bước thuần WOK vật liệu để nuôi cấy Cay

giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên của nó để chúng thích ứng với

môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng Thiễm bệnh của mẫu nuôi cấy

và chủ động trong công tác nhân giống Trồng trường hợp cẩn thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống Ở một số tøài phong lan khó thụ phấn và hình

thành quả trong tự nhiên, có thể thụ phấn nhân tạo cho chúng một cách

thuận tiện

+ Giai đoạn 2: Cấy khỏi động

LA giai đoạn tạo ra cấe chối mới từ các mẫu vật đã được khử trùng và

được nuôi cấy trong môi trường thích hợp Giai đoạn này cân dim bảo các

yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tổn tại và sinh trưởng tốt Kết quả của giai đoạn này piu thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy cho nên khi

Mấy mẫu cần chọn đồng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Theo

Bhatt thì mô lấy tir cây non có khả năng tdi sinh cao hơn các mô cũa cây

trưởng thành (Bhatt,1979} Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ

sung vào môi trường than hoạt tính (Aetivalis chacoal) hay ngâm mẫu trước

khí cấy vào hỗn hợp Axit aseobie và Axit xitric (25 - 150mg/))

Giai đoạn này thường kéo dài 4 - 6 tuần lễ,

+ Giai đoạn 3: Nhân nhanh : Toàn bộ quá trình nhân giống in vitroxét cho cùng chỉ nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất Chính vì vậy

giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Nghĩa là giai

đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh thành nhiều các chổi mầm cung cấp: cho giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn 1

và cấy chúng trên môi trường mới theo định kỳ Hệ số nhân ở giai đoạn này

biến động từ 5 đến 50 lần tuỳ thuộc loài cây và _ phương pháp nhân Vấn

để là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có thể có hiệu quả cao nhất Vai trò cũa hooe môn trong giai đoạn này là rất quan trọng để sản sinh ra lượng cay con tối da ffi vẫn đảm bảo sức sống và

bản chất di truyền của cây Theo nguyên tắc chung trong môi trường có

nhiễu Xytokinin sẽ kích thích tạo chi Chế độ nuối cấy thường là 25° 27°C

và 10 - 16 giờ sáng/ngày, cường độ ánh sáng 1000 lux [43] Tuy nhiên.đối với mỗi loại đối tượng, mục đích thé nghiệm mà chế độ nuôi cấy khácnhau

+ Giải đoạn 4: Cho ra rễ:

Day là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô

trùng khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường.

ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường sau 2 - 3 tuần, từ những chối

riêng lễ này sẽ xuất hiện rế và trở thành cây hoàn chỉnh © giai đoạn này moi

trường được giảm lương jẤytokinin và ting lượng Auxin để tạo điểu kiện

thuận lợi cho sự ra ¡Ö cỗ chổi cây Giai đoạn này thường kéo dài từ 2 - 4tuần lễ, sau đó được chuyển sang môi trường không có Auxin để rễ phát

triển Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt

động của lá và rể mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng

+ Giai đoạn 5: Đưa cây ra môi trường ngoài

Day là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài tdi Tạo điều kiện để cay con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghỉ dẫn

20

với moi trường tự nhiên, cây con cứng cáp để đủ tiêu chuẩn mang trồng Đây

là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sẵn xuất

Để đưa cây từ ống nghiệm ra môi trường tự nhiên bên ngoài đạt tỷ lệ

sống cao cần đảm bảo mot số yêu cầu:

Cay trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định.

(số lá, số 18, chiều cao cây)

C6 giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể tơi xốp, thoátnước

Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nước.

“Trong 2 - 3 tuần 18 và tránh ánh sáng quá mạnh Điều kiện moi trườngtrong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển,cứng cấp và phòng bệnh cho cây

28 CÁC YẾU TỐ ANH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT SINH HÌNH THAI MÔ TẾ BẢO TRONG NHÂN GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CAY IN VITRO,

Một số lượng lớn các yu tố phức tap ảnh hưởng tới sự phát sinh hình

thái mô tế bào Tuy nhiên nliũng yếu tố này phụ thuộc mạnh mẽ vào loài

2.5.1, Môi trường nuôi dưỡng:

Trong nuôi cấy in vitro, môi tường nuôi cấy và môi trường xungquanh được xem là án 4È quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy n8U Ï2 phần "đệm" để cung cấp các chất cần thiết cho

sự tăng trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro

"Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng

da lượng, vi lượng, nguồn các bon, các axit amin và các chất điễu hoà sinh

trưởng (cũng có thể bổ sung thêm mot số phụ gia khác như than hoạt tink )

tuỳ vào từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí uỳ từng cơ quan

khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh đưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của

(1957) Tuy nhiên mỗi môi trường chỉ thích hợp với vài loài cây nhất định

Ví dụ: Môi trường MS-62 thích hợp cho nhiều loại cây trồng nhưng môi

trường Knudson hoặc môi trường Vacin and Went lại thích hyp cho cây

phong lan hơn Mặc dù môi trường Thomale GDY không chứa canxi nhưng,môi trường này cực kỳ phù hợp cho loài Paphiopedilum [45] Ddi hỏi khoáng,của phong lan nhìn chung không cao và môi trườg nghèo muối thường phù

hợp Vì vậy trong nuôi cấy in vitro, tuỳ thuộc vào quá trình phát triển mà

nhu cầu dinh dưỡng trong mỗi giai đoạn phát triển của mô tế bào khác nhau.Nhiều công tinh nghiên cứu đã chứng minh: thành phần, hàm lượng cácchất trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát sinh hình tháicủa các bộ phận nuôi cấy, khả năng tái sinh chối, lá, rễ để tạo ra cây hoànchỉnh cũng như sự sinh trưởng phất triển của toàn cây

Vi vậy vấn để lựa chọn moi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát

triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy in vitro rất quan

trọng, số lượng và céc Ío;š hoá chất phải cực kỳ chính xác phù hợp với từng.đối tượng cụ thể,

Các nguồn thành phẩn định dưỡng chính thường được bổ sung vàomôi trường gồm:

Các nguyên tố đa lượng: N, P, K, S, Mg, Ca là cẩn thiết và thay đổituỳ theo đối tượng nuôi cấy Nói chung néng độ các nguyên tố trên trongmôi trường khoảng trên 30 ppm Có nhiều môi trường có thành phẩn, tỷ lệcác chất khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn để sử dụng Nói chung môi

2

trường giàu nits và kali thích hợp cho việc hình thành chổi, còn môi trường

giàu Kali sẽ xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất Thành phẩn khoáng của

một môi trường cấy được xác định một cách chính xác do sự cân bằng các

nông độ của những ion khác nhau trong dung dịch Để lựa chọn một thành

phần khoáng và để so sánh các sự cân bằng khác nhau vé ion giữa chúng,

người ta sẽ sử dụng các nông độ ion thể biện bằng mg/l Nhưng việc lựa

chọn một thành phần khoáng rất khó nên chúng ta cẩn lưu ý và hiểu biết về

sinh lý thực vật đối với đỉnh dưỡng khoáng

Các nguyên tố vi lượng: Rat nhiều nguyên tố vi lượng đã được chứng

‘minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô đó là: Sắt, Đồng,

Kém, Mangan, Molybden, Bo, Coban, lốt [38], các nguyên tố này đóng vaitrò quan trọng trong các hoạt động của Enzim, chúng được dùng ở nồng độ

thấp hon nhiều so với các yếu tố đa lượng Mot vài tác giả đã c¡

thành phần vi lượng từ 5 đến 9 chất đưới dạng Sunfat hoặc Clorua Nhưng,

không có sự cân bằng ion nào cố định, vì vậy người ta có thể pha chế dung,dịch vi lượng riêng cho từng người

Nguồn các bon: Cay in viro sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng, mặc dù dưới ánh sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp

lục và quang hợp nhưng bị hạn chế, chính vì vậy mà người ta cẩn thêm vàomôi trường cấy các Gluxid cẩn thiết cho sự phát triển của mô Cho nênnguồn các bon dưới dug fu cơ là thành phan bắt buộc của môi trường và

phát triển của mô thực YêU giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối Tuy

thuộc vào mục đích và sự đồi hỏi của từng hệ mô trong trường hợp đặc biệt

eó thé đùng các loại đường khác như: Maltoza (Ragnin, 1984), Glactoza và

Lactoza (Ankler, 1974) Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấykhác nhau nhưng thường ding liễu lượng từ 20 - 40 g/l Việc trải qua nổi hấp,

điện gây ra việc phân huỷ đường do sự thuỷ phân nhưng không thể hiện điều

bất lợi nào cho sự phát triển của thực vật.

in các

Các vitamin và các chất tự nhiên: Các vitamin, các axitamin và các chất

phụ gia hữu cơ thường được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng nhằm thúc

đẩy quá trình sinh trưởng, phát triển của mô nuôi cấy Mặc dù cây in vitro có

thể tự tổng bợp vitamin, nhưng không đủ cho như cẩu (Czocnowoki, 1952).

Do vay để mô sinh trưởng tối tu, một số vitamin nhóm B (BI, B3, BS, B6)

được bổ sung vào môi trường một lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô vàgiai đoạn nuôi cấy Nổng độ thường dùng là 1 mg/l, Myo-inositol cần được

bổ sung ở một lượng khá lớn 50 - 500mg/l, chất này tỏ ra có tác dụng rất rõ

đến sự phân chia của mô Các axitamin thường được bổ sung vào môitrường, một mặt làm nguồn nitơ hữu cơ, khi hàm lng nite trong môi trường

bị thiếu hụt, mặt khác cũng làm tăng sự sinh trưởng của mô cấy khá rõ rệt

(Che chất phụ gia hữu cơ như nước dita, địch chiết nấm men được

bổ sung vào môi trường nhằm kích thích sự sÏnh trưởng của mô sẹo và các cơ

quan [40 Nước dita đã được sử dụng vào nuôi cấy in vitro từ năm 1941 vàđược ứng dung khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro (Phonglan, dứa ) Trong nước dừa thường chứa các axitamin, axit hitu cơ, đường,ARN và AND Đặc biệt trong nước đừa eó chứa những hợp chất quan trọng

cho nuôi cấy in vitro đó là Myo-ïnositol, các hợp chất có hoạt tính Auxin,các gluoxit của xytokinin

Các chất điều hoà sinh trường: là yếu tố quan trọng nhất trong môi

trường quyết định kết 5Š quoi cấy, 5 nhóm chất điều hoà sinh trưởng của

thực vat: Auxin, Gibbsieliin, Ethylen, Axit absixic, Xytokinin Có tácdụng lên sự phát sinh hình thái mô cấy ở ngay hàm lượng rất thấp

(107-105 M) Đặc biệt sự tương tác của nhóm Auxin và Xytokinin ảnh

hưởng có tính chất quyết định tới sự phân hoá cơ quan thực vật (Skoog vàMiller, 1957)

Auxin: Kích thích sự hình thành mô sẹo và xuất hiện rễ bất định, kíchthích sự giãn của tế bào Các Auxin thường sử dụng là (IAA, IBA, NAA,

24D) Néng độ Auxin dùng trong nuôi cấy dao động tuỳ từng chất va đối

tượng nuôi cấy nhưng thường là từ 0,001-10mg/1

‘Cu tạo của một số Auxin:

CH„COOHCH,-COOH

Indol butyric axit (IBA) _2/4.dichlorophenoxy axetic axit (2,4D)

Xytokinin: Được béisung vào moi trường chủ yếu để kích thích sự

phan chia tế bào và quyết định sự phân hoá chổi bất định từ mô sẹo và cơquan [40] Việc sử dung tỷ lệ Auxin/Xytokinin trong moi trường nuôi cấy

quyết định sự phân 04 cha mô theo hướng tạo rễ, tạo chối hay mô sẹo Cácchất thuộc nhóm XjtclUnu thường được sử dụng là Kinetin, Benzyl adeninpurin (BAP), Zeatin Trong các chất này BAP và Kinetin được dùng phổ biến

nhất vì có hoạt tính cao và giá không đất, tuỳ từng hệ mô và mục đích nuôi

cấy mà Xytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau Ở nồng độ thấp.

107 - 10M các Xytokinin kích thích sự phân bào, nổng độ 105 - 105M kích

thích sự phân hoá chổi Trong nuôi cấy mô phân sinh để kích thích sự nhânnhanh người ta thường ding nồng độ Xytokinin cao 10° - 10M

Cau tạo của một số chất thuộc nhóm Xytol

N N

LÍ LP

N " Ñ H

Kinetin (K ) 6 - Benzyl amino purine (BAP)

Gibberellin: Được dùng phổ biến nhất là GA, (Axit gibberellic) kích

thích sự giãn dài tế bào, kéo đài lóng đốt than cành cây Bên cạnh đó GA,

còn có tác dung phá ngủ các phôi, ức chế tạo ré phụ (Pierik, 1987) cũng nhưtạo chổi phụ (Street, 1973), GA, còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số

thực vật và có tác dung rút ngắn thời gian sinh trưởng đỉnh đưỡng của cây.

Ngoài các chất có tác dụng KÍÊh thích trên, còn có các chất có tác

dung ức chế sinh trưởng, phát triển khác như ABA, Etylen cũng gây ảnhhưởng khá 16 tới sự phát sinh bình thái của một số cay trồng trong nuôi cấy

in vitro Khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chổi cao hơn khi ding

BAP riêng rế (Ben et al, 1989, Chang et al, 1991)

‘Chit làm dong cứng môi trường - Agar

Để làm giá thể cho nudi cấy người ta thường sử dụng thạch Agar.

Agar là một loại Folyseetrit của tảo Khả năng ngậm nước của Agar khá

cao: 6 - 12 g/lt nước Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rất

18 đến sinh trưởng của mô nuôi cấy Néng độ của thạch dùng trong nuôi cấy

rất dao động tuỳ thuộc vào độ tỉnh khiết của hoá chất và mục tiêu nuôi cấy(thường từ 6 - 10 g/0

Môi trường ling thường chỉ sử dụng cho nuôi cấy tế bào và nuôi cấy

tế bào trấn (protoplast), khi nuôi cấy trong môi trường lỏng thì vấn để oxygen rất quan trọng, chính vì thế các bình nuôi cấy trong môi trường lồng

26

thường phải đặt trên máy lắc hoặc mô nuôi cấy được dat trên một miếng giấy.

thấm nhúng vào moi trường

+ Độ pH của môi trường là yến tố ảnh hưởng khá rõ nét tới khả năng,

hoà tan các chất khoáng trong môi trường, sự ổn định của môi trường, khả

năng hấp thy chất dinh dưỡng của cay Nếu pH thấp (<4,5) hoặc cao (7,0)

cđều gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro Như

vay xác định được độ pH ban đâu của môi trường cho quá tình sinh trường,

phát uiển của mô cấy là điều cần thiết.

2.5.2, Môi trường vật lý

'Các yếu tố chính của môi trường vật lý là nh sáng và nhiệt độ, độ ẩm,

độ ẩm tương đối không đáng kể vi nó luôn luôn bằng 100% trong các bình.

nuôi cấy

Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của m0 nuôi cấy phụ thuộc nhiều

vào các yếu tố như: thời gian chiếu 4ág, cường độ ánh sáng, và chất lượng,ánh sáng

"Thời gian chiếu sáng có vai trồ quan trong trong quá tình phát tiển

của mô nuôi cấy, với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là từ

12 - 18/ngày

Cường độ ánh sáng là yếu tố quan trọng tác động lên quá trình phát

sinh hình thái của mô cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sink trưởng của

mô sẹo trong khi cưng đà (hấp gây nên sự tạo chổi (Ammirato, 1986) Nhìnchung, cường độ ánh sf thích hợp cho mô nuôi cấy là: 1000 - 7000 lux

(Moresin lap, 1974),

Ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình

thái của mô thực vật in vitro, ánh sáng đỗ làm tăng chiêu cao thân chổi hơn

so với ánh sáng trắng, nếu mô nuôi trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn

cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo [20]

Do vậy trong các phòng thí nghiệm, sử dụng nguồn cung cấp năng

lượng ánh sống là các din đèn huỳnh quang đặt cách phía trên các ống

nghiệm khoảng 25 - 30cm sẽ cho cường độ ánh sáng dat trên tiêu chuẩn

2000 - 2500 lux

"Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan

trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá tinh sinh hoá trong cây

Tuy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phùhợp Thường cây nhiệt đới đòi hồi nhiệt độ cao hơn so với cây ôn đới Nhìn

‘chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25°C

(White, 1973).

2.5.3 Vật liệu nuôi cấy

Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp quyết định đến sự thành bại

của quá trình nhân giống in vitro Về nguyên tắc, trừ những mô đã hoá gỗ,các mô khác trong cơ thé thực vật đê CÓ thể dùng làm mô nuôi cấy Tuythiên các mô đang phát triển mạnh (mô phân sinh đầu ngọn, đầu rễ, lá non,

tượng ting ) có thé nuôi cấy dễ ding hơn Trong một số điều kiện thì vật

liệu nuôi cấy có thể là hạt Các mô khác nhau trên cùng một cây tuy mang,một lượng thông tin di truyễn! như nhau, nhưng khi nuôi cấy có thể cho môseo phát triển hoàn toàn khác nhau, khả năng hình thành chổi, rễ rất khác

nhau Vì vậy tốc độ nhân giống, chất lượng nhân giống, hiệu quả nhân giống

phụ thuộc rất nhiều vào xiê: chon mẫu Vì vậy các mô trẻ sinh lý, chưa bịphân hoá quá sâu sắc vÀ ©úl trưởng tốt là nguồn mẫu nuôi cấy lý tưởng bởi

có thé dễ tác động và điều khiển quá tình phát sinh hình thái và tái sinh cây

hoàn chỉnh từ chúng Các khả năng trên còn phụ thuộc vào mùa vụ lấy vật

liệu trong năm, kích thước vật liệu nuôi cấy, tuổi cây mẹ, tuổi của quả, vị trílấy mẫu trên cây mẹ

28

Tuy nhiên tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu, nguền mẫu vật, giống, loại

cây trồng mà có thé sử dụng các cơ quan khác nhau để có thể thu được kết

qua như ý muốn, có hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt

2.5.4, Điều kiện vo trùng

'Nuôi cấy in vitro là quá trình nuôi cấy trong điều kiện vô tring, nếukhông đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị

nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Diu kiện v6 trùng có ý nghĩa quyết định đến

sự thành bại của nuôi cấy in vitro

Phương pháp khử trùng mẫu ban đầu: Việc tạo nguyên liệu vô trùng

in vitro là khâu đẩu tiên có ý nghĩa thành bai ella công việc nhân giống và

tốc độ nhân giống Chọn đúng được phương pháp khử trùng sẽ cho được tỷ lệsống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đặt toe độ sinh trưởng nhanh

Phương tiện khử trùng:

= Nổi hấp tiệt trùng: Sử dụng chơ việc khử trùng môi trường muôi cấy,

dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nước cổ áp suất và nhiệt độ cao (1,2 - 1,5 atm,

120 - 130°C)

- Tih sấy: Để sấy khô các dụng cụ (huỷ tinh và dụng cụ cấy

~ Dung địch khử tring: Để khử trùng mẫu vật đưa vào nuôi cấy người

ta thường ding các dung dịch HgCl,, Hypoclorit natri, Hypoclorit canxi,H,0,, Cén ding để khử trùng sơ bộ mẫu và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy

~ Phễu lọc vô lu: Dùng để khử trùng các dung địch, không khử

trùng được ở nhiệt dd 40 sine dung dich Enzim hoặc một số chất điều hoà

sinh trưởng Hiện nay người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùngdung tích lớn để thanh trùng các dung dich nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần

"hay huyền phù tế bào

+ Budng và bàn nuôi cấy vô trùng

~ Buồng vô trùng: Nơi dat bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ Buồng,

phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp,

chiến đèn tử ngoại

~ Bàn nuôi cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flowbox Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng

và thổi không khí vô tring về phía người ngồi thao tác.

2.5.5 Budng nuôi cấy

LA buổng đạt các mẫu nuôi cấy Buồng này cẩn dim bảo các điểnkiện:

= Nhiệt độ 25 - 30°C

- Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux.

~ Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài

2.6 UNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BAO THỰC VAT (NUÔI CẤY IN VITRO) TRONG CÔNG TÁC GIỐNG CÂY TRỔNG.

"Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro được xem là một trong những giảipháp công nghệ mới có ý nghĩa khoa học công nghệ sinh học Trên các môi

trường nhân tao, từ các mô, tế bào thực vat sẽ phân chia, phân hoá và phát

tuiển thành cây hoàn chỉnh Day là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một

phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống

vô tính Kỹ thuật nay: cho phếp tạo ra một quần thé cây con đồng đều, giữ

nguyên đặc tính của Ay rao, có hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được

"hiệu quả kin tế, không tôn diện tích cho nhân giống dễ chăm sóc và dễ khắc

phục những ện bất lợi Phương pháp này đặc biệt tỏ ra ưu việt với các

loài cây khó nhân giống bằng con đường hữu tính (Phong lan), các giống

qui hiếm có số lượng ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh

Nôi cấy mô tế bào thực vật cũng được ứng dụng để:

~ Lam phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống

ñ

~ Làm sạch vi rút, phục trắng những giống thoái hoá, bị bệnh.

= Nhân nhanh và duy tì các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học có

giá trị kinh tế cao Ung dụng này được quan tâm hơn cả Ngoài ra tuỳ thuộc.

vào bộ phận nuôi cấy và khả năng sử dung chúng trong công tác giống cây

trồng,

+) Đối với đỉnh sinh trưởng có thể tạo và nhân nhanh dòng đồng nhấtv6 di truyền, làm sạch vi rút và nghiên cứu sinh lý phát triển

+) Với cơ quan sinh sẵn:

~ Hoa cái (bầu quả, non): Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ

lai xa, tạo đơn bội, tạo da phôi

- Hoa đực: (bao phẩn và hạt phan}

- Tạo mô sẹo và cây đới! bội

- Tạo đột biến & mức đơn bội

- Tao dòng đồng hợp tử

+) Đối với phôi: - - Nuôi phôi lại xã

= Nhân áơ đồng lai xa

~ Phẩ ngủ nghỉ của hạt

+) Đối với tểbào:.- Tạo đột biến ở mức độ tế bào.

STE bào trần để la vô tính

Biến nạp gen, nuôi cấy tế bào đơn

+)Mô sẹo: (PE Tao phôi vo tin

~ Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trấn

~ Tạo cây có biến di soma

Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật dé thấy nhất là trong

Tinh vực nhân giống và phục trắng cây trồng Với phương pháp nuôi cấy đỉnhsinh trưởng Morel đã mở ra 1 hướng lớn không chỉ là một cuộc cách mạng

trong công nghiệp lan mà còn áp dụng cho nhân giống nhiễu loại cây trồng

khác: Bu đủ, Dâu tây, Khoai tây (Morel, 1960)

Năm 1985 theo Roca có 55 loài cây trồng được áp dụng để nhân giống

sạch bệnh qua nuôi cấy mô, gồm 11 loài cây ăn quả, 8 loài cây lấy củ, 7 loài

cây công nghiệp và 23 loài cây cảnh

Năm 1965, Morel và Martin đã ding kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh

tạo được cây khoai tây không chứa vi rút mang lại ý nghĩa lớn cho ngành sin

xuất Khoai tây thế giới

'Năm 1970 Storrisky đã rất thành công khi nuôi cấy vầy cũ hoa Lay ơn

trên môi trường dinh dưỡng có 5 mg BA/I và cay Dạ lan hương với nồng độ2-8 ppm IAA

Ở Việt Nam từ năm 1975 đến nay, nhiều pliéng nuôi cấy mô trong cả

nước đã được thành lập và thu được một số kết quả đáng kể,

Viện khoa học Việt Nam đã nghiên cứu tù tình nhan giống in vitro

một số cây trồng có giá trị như Lúa, Thuốc lá, Khoai lang, Dita sợi

+ Trường Đại học nông nghiệp-I; Viện di truyền nông nghiệp đã

nghiên cứu qui trình nhân giống Khoai tây, Chuối, Du đủ, Phong lan thươngmại, các loại cây cảnh sạch bệnh, chat lượng cao đã đi vào sin xuất

- Trường Đại học Lâm nghiệp đã nghiên cứu nhân giống in vitro các

loài Bạch đàn, Lan bin địa, Keo lai, Sến mật, Song mây, Tre luồng

'Ngoài ra còn một số nơi cũng nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấymô: _- Trang tim sin xuất hoa Đà Lạt

~ Trường Đại học Tog lâm - Thành phố Hồ Chí Minh.

~ Đại học khoa oe tự nhiên - Thành phố Hồ Chí Minh

'Ở các tỉnh phía nam đã xây dung được ngân hàng Cà phê với 10 dòng

khác nhau, đã nhân giống Cao su và nhiễu loại cây khác (cây ăn quả, câythuốc, cây rừng )

32

Nội dung của để tài được tóm tắt bằng sơ đồ sau:

3.1.1 Tạo thể chổi và chổi;

~ _ Hiệu quả của phương pháp khử trùng

~ Môi trường khởi động tạo thé chổi và chồi

~ Ảnh hưởng của thời điểm lấy hạt đến khả

năng nảy mắm và tgo thể chổi

~_ Ảnh hưởng của số:lượng chối cấy trong 1

cụm đến sự phân chia chỗi3.1.2 Môi trường nhân nhanh chối

~ Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

"Nhân nhanh chối nhân chổi

~ _ Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng

nhận chi

- Ảnh hưởng của nổng độ Kinetin đến khả

năng nhân chổi

>, Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin + BAP đến

khả năng nhân chối

3.1.3 Môi trường kéo dài chối

3 “Tạo cây hoàn chỉnh.

- Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra

6

~ Ảnh hưởng của phương pháp huấn luyện cay

con.

3.1.5 Giai đoạn vườn ươm

~ _ Tiêu chuẩn cây con.

~ Tim giá thể thích hợp.

~ _ Sinh trưởng và phát tiển của cây lan con

3.2, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN COU.

3.2.1 Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm.

+ Địa điểm: Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được tiến hành tại phòng,

nuôi cấy mô, Bộ môn Di truyền - Chọn giống - Khoa Lâm nghiệp - Trường

Dai học Lâm nghiệp Các thí nghiệm được duy tì trong điều kiện nhan tạo

- Số giờ chiếu sáng trong ngày: 10 giờ/ngày.

= Cường độ ánh sáng: 2000 - 3000 lux

- Nhiệt độ phòng nuôi: 25° - 27°C ban ngày, ban đêm 18°-20°C

~ Các hạt phong lan được cấy vào mii trường đạc (8g agar ).3.2.2, Các công thức thí nghiệm và cách bố trí

3.3.2.1 Tạo thể chối và chi.

sa Hiệu quả của một sốphương pháp khử tràng

‘Thi nghiệm được tiến hành Với 2 phương pháp:

+ Khử tring quả

+ Khử tring bạt

Mỗi thí nghiệm lầm với 3 lần lặp lại và theo dõi 10 ống

nghiệm/1 lân lập lại đổi với mỗi loài

b Môi trường tạo thể chối và chải.

Các thí nghiêm được tiến hành trên các moi trường sau:

Cong thức 1: Mội.tulŠng I (Knudsons C, 1960) Xem phụ biểu 1

‘Cong thức 2: Mpi thường II (Knudsons C cải tiến) Xem phụ biểu 2Mỗi công thức thí nghiệm theo dõi 10 ống nghiệm/ 1 lần lặp và được

lập lại 3 lần đối với mỗi loài

cc Ảnh hưởng của thời điểm lấy hạt đến khả năng nảy mắm: và tạo thé

chải

~ Thí nghiệm được lấy hạt vào 3 thời điểm khác nhau đối với mỗi loài.Mỗi thời điểm theo dõi 10 ống nghiệm/1 lần lặp lại và được lặp lại 3lần

34

d Anh hưởng của số lượng chối cấy trong một cụm đến sự phân chia

chổi

Cée thí nghiệm được bố trí như s

Môi trường I: - Cấy tách riêng rẽ từng chổi (T1)

- Cấy cụm ( mỗi cụm có từ 3-4 chỗi) (C1)Môi trường II: - Cấy tách riêng tẽtừng chổi (T2)

= Cấy cụm ( mỗi cụm có từ 3-4 chổi) (C2)

3.2.2.2 Môi trường nhân nhanh chối.

Mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần lặp lại và theo dõi 10 bình,

1 lần lặp lại, mỗi bình cấy 20 chổi Thí nghiệm được đánh giá sau 6 tuầntheo đối đối với mỗi loài

1 Nghiên cứu Ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân chổi

“Các thí nghiệm được bố tí theo sơ đổ sau.

Loài Lan Phi điệp Lan hương,

MT

Nông độ NAA(mg/) ojos] 1 | 0 | os] 1

1 | Biel | 1N, | IN, | Bel | IN | IN,Công thức thí nghiệm

me} Dey | HN, | HN | Be2 | HN, | IN,

Dic 1: Ðộ chưng của môi trường TDje 2: BA} ching của môi trường IIIN: Môi trường T có bổ sung 0,5 mg/l NAA

IN,: Môi trường I có bổ sung 1 mg/l NAA.

TIN,: Môi trường II có bổ sung 0,5 mg/l NAA.

TIN,: Môi trường II có bổ sung 1 mg/l NAA.

2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi.

“Các thí nghiệm được bố trí theo sơ đổ sau:

Loài Lan Phi điệp Lan hương

MT

'Nồng độ BAP (mg/l) o |0s|1 |0 |0s| 1

1 |Ð/el| 1B, | 1B, | Bie, | 1B, | 1B,(Cong thức thí nghiệm

1 | Be, | 1B, | HB, | De, | 1B, | 1B,

1B,: Môi trường I có bổ sung 0,5 mg/l BAP.

1B;: Môi trường 1 có bổ sung 1 mg/l BAP.

IB,: Môi trường II có bổ sung 0,5 mg/l BAP

TIB,: Môi trường [1 ¢6 bổ sung 1 mg/l BAP.

Loài Lan Phi điệp Lan Huong Néng độ Kinetin(mg/l) o}os} 1} o |os| 1

1 JĐeL| 1K, | 1K, |Đ/e1| 1K, | 1K,

‘Cong thức thí nghiệm

Hl | Đức; | WK, | WK, |Đ/c2| WK, | UK,

IK,: Môi trường I có bổ sung 0,5 mg/l kinetin

1K,: Môi trường I có bổ sung 1 mg/ kinetin

TIK,: Môi trường II có bổ sung 0,5 mg/l kinetin

AIK: Môi trường IT có bổ sung 1 mg/l kinetin

36

4 Ảnh hưởng của hỗn hợp Kinetin + BAP và Kinetin + NAA đến khả

năng nhân chối.

Loài Lan Phi điệp Loài Lan Hương

Nông độ Kinetinvà | 0 | 05 | NéngdoKinetinva | 0 | 05

BAP (mg/l) NAA (mg/l)

Công thức tí | Đ/el | IBK | Congthdety | Đ/e1 | IKN

nghiệm Died | IIBK nghiệm Đực2 | HKN

IBK: Môi trường [có bổ sung 0,5 mg/l Kinejn và 0,5 mg/l BAP)

TIBK: Môi trường II có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l BAP) TKN: Môi trường ï có bổ sung 0,5 mg/l Kinètin và 0,5mg/ NAA)

TIKN: Môi trường I1 có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin và 0,5mg/1 NAA) 3.2.2.3 Moi trường kéo dài chối.

Mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần lặp lại và theo dõi 5 bình 1

Tân Jap lại, mỗi bình cấy 15 chổi Thí nghiệm được đánh giá sau 12 tuẫn theo

đối (sau 2 đợt cấy truyén),

Loài Lân Phí điệp Lan hương

'Nồng độ nước đùa 100m Nước dừa Nước đùa

Nông độ Myo-inositol 109mg” |~ Myoinostol Myo-inositol

Néng độ Gibberrelin Gibberrefin GibberreRn

Đối chứng Đối chứng

3.2.2.4 Tạo cây hoàn chink

Mỗi công thức thí nghiệm được làm với 3 lần lặp lại và theo doi 10bình/1 lần lặp lại, mỗi bình cấy 10 chổi Thí nghiệm được đánh giá sau 6

tuần theo dõi