Định lượng ergosterol trong một số loài nấm linh chi (ganoderma) bằng phương pháp hplc

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH LƢỢNG ERGOSTEROL TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LINH CHI (GANODERMA) BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Trần Đình Thắng Sinh viên thực hiện: Nhữ Thị Hồng Vân Lớp: 49K - Công nghệ thực phẩm MSSV : 0852045293 Vinh, tháng 12/2012 i LỜI CẢM ƠN Đề tài tốt nghiệp thực phịng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An tồn Thực phẩm Mơi trường, Trường Đại học Vinh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Trần Đình Thắng - Khoa Hóa học , Trường Đại học Vinh giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Chu Thị Thanh Lâm – Trung tâm kiểm định An toàn thực phẩm Mơi trường ThS Trương Thị Bình Giang Khoa Hóa – Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình làm thí nghiệm, hướng dẫn cách sử dụng máy HPLC đo mẫu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, cán khoa Hố giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Và lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Vinh, tháng 12 năm 2012 Sinh viên Nhữ Thị Hồng Vân ii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài .1 Nhiệm vụ nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Nấm 1.1.1 Giới nấm 1.1.2 Sự đa dạng 1.1.3 Hình thái 1.1.4 Đặc điểm sinh học .5 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Phân loại 1.1.7.Vai trò .9 1.2 Nấm Linh chi 10 1.2.1 Giới thiệu chung : 10 1.2.2 Vị trí phân loại : 11 1.2.3 Đặc điểm hình thái .11 1.2.4 Phân bố, sinh thái 12 1.2.5 Thành phần hóa học nấm Linh chi 12 1.2.6 Tác dụng trị liệu nấm Linh chi 14 1.2.7 Ứng dụng lâm sàng Linh chi 20 1.2.8 Các chế phẩm từ Linh chi 21 1.3 Steroid .26 1.3.1 Khái niệm 26 1.3.2 Công dụng .27 1.3.3 Phân loại 27 1.4 Sterol 30 1.4.1 Khái niệm 30 1.4.2 Phân loại sterol 30 1.4.3 Vai trò sterol .31 1.5 Ergosterol 32 iii 1.5.1 Tóm tắt 32 1.5.2 Cấu tạo hóa học .34 1.5.3 Ứng dụng 34 1.5.4 Độc tính 35 1.6 Hệ thống phân tích HPLC 36 1.6.1 Nguyên lý 36 1.6.2 Phân Loại 37 1.6.3 Pha t nh sắc ký pha đảo 37 1.6.4 Pha động sắc ký pha đảo 40 1.6.5 Một số đại lượng phân tích sắc ký 43 1.6.6 Các phận hệ thống HPLC 45 1.6.7 Phương phấp tiến hành sắc ký .48 Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 42 2.2 Phƣơng pháp phân tích 50 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM 51 3.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 51 3.1.1 Thiết bị 51 3.1.2 Dụng cụ 51 3.1.3 Hóa chất 51 3.2 Kỹ thuật thực nghiệm 51 3.2.1 Chuẩn bị hóa chất phân tích 51 3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 52 3.2.3 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 52 3.3 Tiến hành phân tích máy HPLC / UV 53 3.4 Tối ƣu hóa phƣơng pháp 53 3.5 Khảo sát đánh giá phƣơng pháp .54 3.5.1 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn xác định (LOQ) phương pháp 54 3.5.2 Khảo sát độ lặp 55 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .56 4.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn Ergosterol .56 iv 4.2 Đánh giá phƣơng pháp 58 4.2.1 Xác định độ lặp lại phương pháp 58 4.2.2 Sắc đồ 61 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .67 5.1 Kết luận .67 5.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 : Hình ảnh nấm Linh chi 10 Hình 1.2 Thuốc viên nang 22 Hình 1.3 Trà Linh chi .24 Hình 1.4 Nước cốt linh chi .24 Hình 1.5 Tasly Lingzhi 300 .25 Hình 1.6: Cấu trúc sterol 30 Hình 1.7: Cấu trúc số sterol 32 Hình 1.8: Cấu trúc ergosterol 34 Hình 1.9 Bề mặt silica thủy phân 38 Hình 1.10: Tạo nhánh bề mặt silica 38 Hình 1.11: Cấu trúc cột ODS 39 Hình 1.12 Cấu trúc cột LC-DB 40 Hình 1.13: Cấu trúc cột có gốc isopropyl 40 Hình 1.14: Độ nhớt hỗn hợp nước dung mơi hữu 25oC 43 Hình 1.15 Thời gian lưu cấu tử phân tích 44 Hình 1.16: Sơ đồ hệ thống HPLC .45 Hình 1.17: Máy HPLC dùng thực nghiệm…………………………………………41 Hình 2.1: Hình ảnh số mẫu nấm dùng phân tích .43 Hình 4.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn Ergosterol 57 Hình 4.2: Sắc đồ chuẩn ergosterol 10 ppm 17,321 61 Hình 4.3: Sắc đồ chuẩn ergosterol 50 ppm 17,346 62 Hình 4.4: Sắc đồ chuẩn ergosterol 100 ppm 17,408 62 Hình 4.5: Sắc đồ mẫu nấm 650 (Mẫu 1) : 17.320 63 Hình 4.6: Sắc đồ mẫu nấm 660 (Mẫu 2) : 17.225 63 Hình 4.7: Sắc đồ mẫu nấm 661 (Mẫu 3) : 17.237 64 Hình 4.8: Sắc đồ mẫu nấm 662 (Mẫu 4) : 17.263 64 Hình 4.9: Sắc đồ mẫu nấm 663 (Mẫu 5) : 17.372 65 Hình 4.10: Sắc đồ mẫu nấm 270 (Mẫu 6) : 17.421 65 Hình 4.11: Sắc đồ mẫu nấm 621 (Mẫu 7) : 17.352 66 Hình 4.12: Sắc đồ mẫu nấm Hồng (Mẫu 8) : 17.313 66 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Thành phần hóa dược nấm Linh chi 13 Bảng 1.2: Các hoạt chất sinh học dẫn xuất nấm Linh chi 13 Bảng 1.3: Lục bảo linh chi theo thời Lý Trần (1590) .15 Bảng 1.4: Tính chất số pha động sắc ký lỏng 42 Bảng 4.1: Diện tích peak ergosterol nấm tương ứng với nồng độ chuẩn 56 Bảng 4.2: Giá trị LOD LOQ 57 Bảng 4.3: Kết phân tích hàm lượng ergosterol nấm 58 Bảng 4.4 Kết trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên mẫu nấm 58 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao LOD: Giới hạn phát LOQ: Giới hạn định lượng / giới hạn xác định MeOH: Metanol ACN : Acetonitril HPLC-MS: Sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối đầu dò khối phổ SKPB : Sắc ký phân bố SKPT : Sắc ký pha thường SKPĐ : Sắc ký pha đảo Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Từ xa xưa người biết sử dụng thảo dược thiên nhiên nhằm mục đích bồi bổ sức khỏe, dưỡng tâm-can-tỳ -phế, làm chậm lại q trình lão hóa, kéo dài tuổi thọ Ngày xu hướng sử dụng thảo dược thiên nhiên để trị bệnh trở nên phổ biến, việc tìm kiếm khả chữa trị từ loại thảo dược tiến hành nhiều nơi giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, ….Trong đó, nấm Linh chi đối tượng nghiên cứu nhiều quốc gia Đặc biệt nước vùng Châu Á có Việt Nam, có nhiều tiềm nguồn dược liệu Ở Nhật Bản, người ta sử dụng nấm nguồn thực phẩm dược phẩm hàng đầu, họ có sức khỏe tốt tuổi thọ cao Không dùng đơn dạng nấm tươi mà Nhật nấm sản xuất thành nhiều dạng sản phẩm như: nước tương, bột nấm, súp nấm, thực phẩm chức bổ, loại, thuốc, trà để điều trị số bệnh như: viêm phế quản mãn tính, bệnh tim mạch, viêm gan cấp, viêm khớp, viêm phổi Hiện nhà khoa học nghiên cứu phát thành phần nấm có hoạt chất có dược tính mạnh với bệnh nan y viêm gan, ung thư, HIV v.v Việc đưa vào sử dụng rộng rãi chế phẩm tách chiết từ nấm giúp người khỏe mạnh phòng chống nhiều bạn tiềm ẩn nguy hiểm cao huyết áp Các giống nấm biết đến nhiều nhắc đến Linh chi, nấm Lim, nấm Thượng Hồng Ngồi cơng dụng phịng ung thư, tăng cường sức khỏe, nhiều loại nấm quý vừa ăn ngon vừa mỹ phẩm thiên nhiên khơng tác dụng phụ giúp chống lão hóa, dưỡng tóc, đẹp da Các nghiên cứu dược học đại chứng minh Linh chi chứa tới 120 chất, bao gồm hợp chất hữu cơ, nguyên tố vi lượng vitamin Linh chi có tác dụng đặc biệt triệu chứng suy giảm miễn dịch, căng thẳng thần kinh suy sụp tinh thần, giải độc kém, ngủ, triệu chứng hệ tim mạch, ăn không ngon, da xấu nhiều nếp nhăn Linh chi có tác dụng việc ngăn ngừa bệnh AIDS làm chậm trình phát bệnh bệnh nhân mắc phải bệnh Họ sử dụng phương pháp bào chế thông thường ngâm rượu, cắt lát nấu lấy Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an nước, nghiền bột để uống, bào chế thành viên nang, viên hoàn thuốc tiêm Sterol thực vật cơng nhận có tác dụng tích cực cho sức khỏe, chúng chứng minh làm giảm nồng độ cholesterol huyết có lợi việc ngăn ngừa ung thư ruột kết, viết Piironen, Lindsay, Miettinen, Toivo, Lampi (2000) Các nhà khoa học xác định nhiều steroid có tác dụng phịng chữa trị bệnh hiểm nghèo thấp khớp, suy tim, ung thư Mà số steroid lại tồn giới Nấm Do việc xác định định lượng hợp chất nấm để tìm phương pháp chữa bệnh cần thiết Ergosterol, gọi tiền vitamin D2 , chất béo khơng xà phịng hố tìm thấy ergot, nấm men, loại nấm khác, hợp chất tinh thể màu trắng không tan nước hịa tan dung mơi hữu Nó chuyển đổi thành ergocalciferol (vitamin D2) chiếu xạ ánh sáng tia cực tím bắn phá điện tử Ergosterol qua trình quang phân tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím tạo loạt sản phẩm photoirradiation, sản phẩm chủ yếu previtamin D2 , tachysterol lumisterol Tiền vitamin D2 qua trình tự phát nhiệt xếp lại tạo thành vitamin D2 (Jones, Seamark, Trafford, Makin, 1985; Parrish, 1979; Singh, 1985) Như vitamin D2 có vai trị nguồn chế độ ăn uống có sẵn vitamin D người không ăn sản phẩm động vật , người hấp thụ nguồn vitamin D phong phú thông qua tiếp xúc với ánh sáng mặt trời Trong giới thực vật (Plantate) động vật (Animalia) , ergosterol vitamin D2 gần khơng có Tuy nhiên, mức thấp hợp chất tìm thấy thực vật chúng bị ô nhiễm nấm mốc nấm men (Young & Game, 1993) Vitamin D hợp chất cần thiết cho người Nó tạo thành da tác động ánh sáng mặt trời hấp thụ từ chế độ ăn uống đường ruột Lượng vitamin D đưa vào từ thực phẩm đặc biệt ý v độ phía bắc (hoặc phía Nam) Hơn nữa, số nhóm dân số, ví dụ: người ăn chay, có nguy đặc biệt thiếu hụt vitamin từ chế độ ăn uống họ (LambergAllardt, Kärkkäinen, Seppänen & Biström, 1993) Mặc dù thiếu hụt vitamin D cổ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 56 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn ergosterol Dãy chuẩn ergosterol Nấm khảo sát có nồng độ sau:10 ppm; 50 ppm; 100 ppm Phân tích chuẩn nói xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích peak Bảng 4.1: Diện tích peak ergosterol nấm tƣơng ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn Diện tích ppm peak 10 72,45404 50 385,27191 100 772,85449 m b R2 7,75006 -2,35726 0.99998 Sử dụng chương trình Microsoft Excel để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng ergosterol sau: Phương trình hồi qui đường chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = mx +b x nồng độ, y diện tích pic m= 7,75006 b = -2,35726 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 =0.99998 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 57 Hình 4.1 Đƣờng chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu đƣợc nồng độ chuẩn ergosterol Giá trị LOD LOQ phương pháp qua lần đo nồng độ khác 10ppm, 50ppm, 100 ppm mẫu nấm ta đươc kết bảng sau : Bảng 4.2: Giá trị LOD LOQ Ghi : Giá trị Chuẩn ergosterol (ppm) LOD 0,0695 LOQ 0,2317 3*Sy 10*LOD LOD = LOQ = LOQ = m m hệ số góc phương trình hồi quy Độ lệch chuẩn Sy: Σ( Xi – Xtb )2 Sy = ΣXi Xtb = n-1 n Sy = 0,17959 Qua bảng số liệu ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát khoảng định lượng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát hàm lượng ergosterol có mẫu phân tích Từ giá trị diện tích peak đo ta tính hàm lượng C0 (ppm) - Sau ta tính hàm lượng ergosterol có mẫu tính theo công thức: C = (C0/ m) Vdm f Trong đó: C : nồng độ ergosterol có mẫu tính (g/l) Co: nồng độ ergosterol dịch chiết tính từ đường chuẩn, tính theo ppm m : Khối lượng mẫu lấy để phân tích (g) Vdm: Thể tích bình định mức mẫu (l) f : Hệ số pha lỗng (nếu có) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 58 Bảng 4.3: Kết phân tích hàm lƣợng Ergosterol Nấm Mẫu C0(ppm) Khối lƣợng (g) Diện tích pic C(g/l) 360,05472 2,0 2788,08813 3,60055 15,34597 2,0 116,57489 0,15346 298,50211 2,0 2311,05176 2,98502 397,39607 2,0 3077,48584 3,97396 342,37217 2,0 2651,04736 3,42372 311,85958 2,0 2414,57300 3,11859 213,65189 2,0 1653,45752 2,13652 310,76641 2,0 2406,10083 3,10766 4.2 Đánh giá phƣơng pháp 4.2.1 Xác định độ lặp lại phương pháp Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV% (RSD) Thực phân tích 2g mẫu Nấm loại ,tiến hành phân tích lặp lại lần điều kiện Kết phân tích lần lặp lại độ lặp lại phương pháp nêu bảng 4.4 Độ lặp lại phương pháp đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (CV) Dựa vào nồng độ tương ứng tính kết trung bình tính độ lệch chuẩn hệ số biến thiên theo công thức đây: Bảng 4.4 Kết trung bình , độ lệch chuẩn , hệ số biến thiên mẫu nấm Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Lần Xtb Khối lƣợng g Nồng độ g/l Khối lƣợng g Nồng độ g/l Khối lƣợng g Nồng độ g/l Khối lƣợng g Nồng độ g/l 2,0 2,0 3,6005 3,6124 2,0 2,0 0,1535 0,1528 2,0 2,0 2,9850 2,9957 2,0 2,0 3,9740 3,9805 2,0 3,6031 3,6053 2,0 0,1445 0,1503 2,0 2,9804 2,9870 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 2,0 3,9703 3,9749 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 59 S CV(%) 0,00626 0,174 0,00501 3,333 0,00785 0,263 0,00516 0,130 Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Lần Khối lƣợng g Xtb S CV(%) Nồng độ g/l 2,0 3,4237 2,0 3,4314 2,0 3,4158 3,4236 0,0078 0,228 Khối lƣợng g Nồng độ g/l Khối lƣợng g 2,0 3,1186 2,0 3,1008 2,0 3,1145 3,1146 0,0101 0,324 Nồng độ g/l 2,0 2,1365 2,0 2,1275 2,0 2,1368 2,1336 0,00528 0,247 Khối lƣợng g Nồng độ g/l 2,0 3,1077 2,0 3,1124 2,0 3,1023 3,1075 0,0051 0,164 - Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x = 3,6053 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 i  xtb ) = 0,00626 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = S  100 0.00626 =  100 = 0,174 % xtb 3,6053 - Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x = 0,1503 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 i  xtb ) = 0,00501 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = S  100 0.00501 =  100 = 3,333 % xtb 0,1503 - Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x = 2,9870 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  ( xi  xtb ) i 1 n 1 = 0,00785 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 60 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = - S  100 0.00785 =  100 = 0,263 % xtb 2,9870 Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x = 3,9749 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 i  xtb ) = 0,0036 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = S  100 0,00516 =  100 = 0,130 % xtb 3,9749 - Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x =3,4236 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1  xtb ) S  100 0.0078 =  100 = 0,228% xtb 3,4236 Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x = 3,1146 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  ( xi  xtb ) i 1 = 0,0101 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = - = 0,0078 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = - i S  100 0.0101 =  100 = 0,324%\ xtb 3,1146 Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x = 2,1336 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 i  xtb ) n 1 = 0,00528 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 61 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = S  100 0.00528 =  100 = 0,247 % xtb 2,1336 - Giá trị trung bình hàm lượng ergosterol mẫu : Xtb = n  x = 3,1075 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = i  xtb ) n 1 = 0,0051 S  100 0.0051 =  100 = 0,164 % xtb 3,1075 Trong đó: Xi nồng độ Ergosterol lần chạy thứ i Xtb nồng độ trung bình n lần chạy n số lần chạy lặp lại Nhận xét: Kết tính tốn cho thấy, phương pháp có độ lặp lại cao cho độ tốt ,đáp ứng yêu cầu định lượng 4.2.2 Sắc đồ Hình 4.2: Sắc đồ chuẩn ergosterol 10 ppm 17,321 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 62 Hình 4.3: Sắc đồ chuẩn ergosterol 50 ppm 17,346 Hình 4.4: Sắc đồ chuẩn ergosterol 100 ppm 17,408 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 63 Hình 4.5: Sắc đồ mẫu nấm 650 (Mẫu 1) : 17.320 Hình 4.6: Sắc đồ mẫu nấm 660 (Mẫu 2) : 17.225 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 64 Hình 4.7: Sắc đồ mẫu nấm 661 (Mẫu 3) : 17.237 Hình 4.8: Sắc đồ mẫu nấm 662 (Mẫu 4) : 17.263 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 65 Hình 4.9: Sắc đồ mẫu nấm 663 (Mẫu 5) : 17.372 Hình 4.10: Sắc đồ mẫu nấm 270 (Mẫu 6) : 17.421 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 66 Hình 4.11: Sắc đồ mẫu nấm 621 (Mẫu 7) : 17.352 ` Hình 4.12: Sắc đồ mẫu nấm Hồng (Mẫu 8) : 17.313 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 67 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Căn vào nhiệm vụ đề tài luận văn hoàn thành nhiệm vụ sau: + Về lý thuyết: - Lý thuyết chung giới nấm tình hình sử dụng vai trị nấm đời sống - Lý thuyết chung ergosterol - Phương pháp định lượng ergosterol +Về thực nghiệm: - Đã nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng ergosterol mẫu Nấm lớn - Đã xác định hàm lượng ergosterol mẫu Nấm lớn + Mẫu : 3,60055 g/l + Mẫu : 0,15346 g/l + Mẫu : 2,98502 g/l + Mẫu : 3,97396 g/l + Mẫu : 3,42372 g/l + Mẫu : 3,11859 g/l + Mẫu : 2,13652 g/l + Mẫu : 3,10766 g/l - Đã xác định giới hạn phát phương pháp 0,0695 ppm - Đã xác định giới hạn xác định phương pháp LOQ = 0,2317 ppm - Xác định độ lặp lại : + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,174 % + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 3,333 % + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,263 % Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 68 + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,130 % + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,228 % + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,324 % + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,247 % + Độ lặp lại ergosterol mẫu với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,164 % 5.2 Kiến nghị Với kết thu đề tài này, góp phần đánh giá hàm lượng ergosterol Nấm Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồng Kim Anh Hóa học thực phẩm NXB Khoa Học Kỹ Thuật TS Phan Quốc Kinh Giáo trình hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Nhà xuất giáo dục Việt Nam- 2011 Trang 74- 80 Lê Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Hoàng Thị Châm Bước đầu khảo sát mối tương quan hàm lượng Ergosterol thóc chất lượng thóc Tạp chí khoa học phát triển 2009.Tập VII, số 1.Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.Trang 65-72 Phạm Luân (1999) Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao Đại học quốc gia Hà Nội Hoàng Văn Lựu Các phương pháp sắc ký DHVinh Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1985) Các phương pháp sắc ký Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Duyên Tư Giáo trình Phân tích chất lượng thực phẩm Hoàng Minh Châu, Từ Vọng Nghi, Từ Văn Mặc Cơ sở hóa học phân tích Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật PGS.TS Nguyễn Khắc Ngh a Xử lí số liệu thống kê DHVinh Tiếng Anh : 10 D.Tardieu, J.D Bailly, G.Benarn and P.Guerre Comparison of two extraction methods for Ergosterol determimation in vegetal feeds.2007 11 Pirjo Mattilaa,*, Anna-Maija Lampib , Riitta Ronkainenb , Jari Toivob , Vieno Piironenb.The contents of vitamin D2 and sterols in some wild and cultivated mushrooms 12 V.M Chiocchio and L Matkovic 2011.Determination of Ergosterol in cellular fungi by HPLC A modified technique In the journal of the Argentine Chemical Society Page 10-15 13 Ronald R Êitnmiller Lin Ye W.O.Landen, Jr Vitamin analysis for the health and food sciences 14 Litwack, Gerald (2007) Vitamin Hormones p75 San Diego, CA: Elsevie Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn