(Luận án tiến sĩ) Nghiên Cứu Mối Liên Quan Giữa Cccdna Tế Bào Gan Với Hbv Dna, Hbv Rna Huyết Tương Ở Bệnh Nhân Viêm Gan B Mạn Tính Và Xơ Gan Do Hbv

Bè GIÁO DĂC VÀ ĐÀO T¾O Bè QUàC PHÒNG HæC VIàN QUÂN Y

Đä THä Là QUYÊN

NGHIÊN CĀU MÞI LIÊN QUAN GIĀA cccDNA

T¾ BÀO GAN VèI HBV DNA, HBV RNA HUY¾T T¯¡NG Þ BÞNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ XƠ GAN DO HBV

LUÂN ÁN TIÀN S) Y HâC

HÀ NæI – 2024

Bè GIÁO DĂC VÀ ĐÀO T¾O Bè QUàC PHÒNG

HæC VIàN QUÂN Y

CHĄ NHIàM Bè MÔN

TS LÊ VN NAM

Đæ THà Là QUYÊN

NGHIÊN CĀU MÞI LIÊN QUAN GIĀA cccDNA

T¾ BÀO GAN VèI HBV DNA, HBV RNA HUY¾T T¯¡NG Þ BÞNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ XƠ GAN DO HBV

Ngành: TruyÃn nhißm và các Bánh nhiát đëi

LêI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cću cąa tôi vëi sự h°ëng dÁn khoa hãc cąa tÃp thÅ cán bé h°ëng dÁn

Các kÁt quÁ nêu trong luÃn án là trung thực và đ°āc công bá mét phÅn trong các bài báo khoa hãc LuÃn án ch°a từng đ°āc công bá NÁu có điÃu gì

sai tôi xin hoàn toàn cháu trách nhiám

Tác giÁ

Đç Thá Lá Quyên

Ch°¢ng 1: TäNG QUAN TÀI LIàU 3

1.1 Tình hình nhißm HBV trên ThÁ giëi và Viát Nam 3

1.1.1 Tình hình nhißm HBV trên ThÁ giëi 3

1.1.2 Tình hình nhißm HBV á Viát Nam 4

1.2 C¢ chÁ bánh sinh và dißn biÁn nhißm HBV m¿n 5

1.2.1 C¢ chÁ bánh sinh cąa bánh do HBV gây ra 5

1.2.2 TiÁn trình tự nhiên cąa nhißm HBV m¿n tính 7

1.3 Viêm gan virus B m¿n tính và x¢ gan do HBV 10

1.3.1 Viêm gan virus B m¿n tính 10

1.5.2 Mét sá ph°¢ng pháp đánh l°āng cccDNA trong tÁ bào gan 22

1.6 Vai trò sinh thiÁt gan và hình Ánh mô bánh hãc trong viêm gan virus 30

1.7 Các nghiên cću và cccDNA và HBV DNA, HBV RNA á bánh nhân

nhißm HBV m¿n trên ThÁ giëi và Viát Nam 31

1.7.1 Các nghiên cću trên ThÁ giëi 31

1.7.2 Các nghiên cću á Viát Nam 35

Ch°¢ng 2: ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 37

2.1 Đái t°āng nghiên cću 37

2.1.1 Tiêu chu¿n lựa chãn 37

2.1.2 Tiêu chu¿n lo¿i trừ 37

2.2 Ph°¢ng pháp nghiên cću 38

2.2.1 ThiÁt kÁ nghiên cću 38

2.2.2 Thßi gian và đáa điÅm nghiên cću 38

2.2.3 Cÿ mÁu và ph°¢ng pháp chãn mÁu 38

2.3 Các chß tiêu và néi dung nghiên cću 39

2.3.1 Các chß tiêu nghiên cću 39

2.3.2 Các néi dung nghiên cću 40

2.3.3 Ph°¢ng pháp thu thÃp sá liáu 41

2.4 Kỹ thuÃt và ph°¢ng tián nghiên cću 41

2.4.1 Quy trình thu thÃp và bÁo quÁn mÁu 41

2.4.2 Ph°¢ng pháp thực hián các chß tiêu xét nghiám c¢ bÁn 42

2.4.3 Ph°¢ng pháp thực hián các chß tiêu xét nghiám sinh hãc phân tÿ 44

2.4.3 Ph°¢ng pháp phân tích xÿ lý sá liáu 60

2.5 VÃn đà đ¿o đćc nghiên cću 61

Ch°¢ng 3: KÀT QUÀ NGHIÊN CĆU 63

3.1 ĐÁc điÅm chung cąa đái t°āng nghiên cću 63

3.1.1 Tuåi và giëi cąa bánh nhân nghiên cću 63

3.1.2 Mét sá triáu chćng lâm sàng, cÃn lâm sàng á hai nhóm bánh nhân64 3.2 Nãng đé cccDNA tÁ bào gan, tÁi l°āng HBV DNA, nãng đé HBV RNA huyÁt t°¢ng á các bánh nhân nghiên cću 68

3.2.1 Nãng đé cccDNA tÁ bào gan á các nhóm bánh nhân nghiên cću 68

3.2.2 Nãng đé HBV RNA huyÁt t°¢ng á hai nhóm bánh nhân nghiên cću 72

3.2.3 TÁi l°āng HBV DNA á hai nhóm bánh nhân nghiên cću 76

3.3 Mái liên quan giāa nãng đé cccDNA vëi HBV DNA và HBV RNA á hai nhóm bánh nhân nghiên cću 81

3.3.1 Mái liên quan giāa nãng đé cccDNA vëi tÁi l°āng HBV DNA á các nhóm bánh nhân 81

3.3.2 Mái liên quan giāa nãng đé cccDNA tÁ bào gan vëi HBV RNA huyÁt t°¢ng á hai nhóm bánh nhân 84

Ch°¢ng 4: BÀN LUÂN 90

4.1 ĐÁc điÅm chung cąa các bánh nhân nghiên cću 90

4.1.1 ĐÁc điÅm và tuåi và giëi tính 90

4.1.2 Mét sá biÅu hián lâm sàng, cÃn lâm sàng á hai nhóm bánh nhân nghiên cću 91

4.2 cccDNA tÁ bào gan, HBV RNA, HBV DNA huyÁt t°¢ng á các bánh nhân nghiên cću 96

4.2.1 Nãng đé cccDNA á các bánh nhân nghiên cću 96

4.2.2 Nãng đé HBV RNA á các bánh nhân nghiên cću 99

4.2.3 TÁi l°āng HBV DNA á các bánh nhân nghiên cću 104

4.3 Mái liên quan giāa cccDNA vëi HBV DNA và HBV RNA á hai nhóm bánh nhân nghiên cću 108

4.3.1 Mái liên quan giāa cccDNA tÁ bào vëi HBV DNA huyÁt t°¢ng 108 4.3.2 Mái liên quan giāa cccDNA tÁ bào gan vëi HBV RNA huyÁt t°¢ng 110

4.3.3 Mái t°¢ng quan giāa nãng đé HBV RNA vëi tÁi l°āng HBV DNA huyÁt t°¢ng 113

KÀT LUÂN 119

H¾N CHÀ CĄA ĐÂ TÀI 121 KIÀN NGHà 122 DANH MĂC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CĆU CĄA TÁC GIÀĐÃ CÔNG Bà LIÊN QUAN ĐÀN LUÂN ÁN

TÀI LIàU THAM KHÀO PHĂ LĂC

DANH MĀC CÁC CHĀ VI¾T TÀTTT PhÅn vi¿t tÁt PhÅn vi¿t đÅy đÿ

1 ALT Alanine aminotransferase 2 AFP Alpha-fetoprotein

3 AST Aspartate aminotransferase 4 VGBMT Viêm gan virus B m¿n tính

5 cccDNA Covalently closed circular Deoxyribonucleic acid

7 DNA Deoxyribonucleic acid

8 Dsl DNA double-stranded linear DNA: Sāi đôi DNA tuyÁn tính

9 ddPCR droplet digital Polymerase Chain Reaction

10 EASL European Asscociation for the Study of the Liver Hiáp héi Gan mÃt Châu Âu

11 FFPE Formalin-Fixed Paraffin-Embedded: parafin cá đánh bằng formalin

12 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

13 HAI Histology Activity Index: chß sá ho¿t đéng mô bánh hãc

14 HBV Hepatitis B Virus: Virus viêm gan B

15 HBcAb Hepatitis B core antibody: kháng thÅ kháng kháng nguyên lõi cąa virus viêm gan B

16 HBeAb Hepatitis B e antibody

kháng thÅ kháng kháng nguyên e cąa virus viêm gan B 17 HBeAg Hepatitis B e antigen

kháng nguyên e cąa virus viêm gan B

18 HBsAb Hepatitis B surface antibody: kháng thÅ kháng kháng nguyên bà mÁt cąa virus viêm gan B

TT PhÅn vi¿t tÁt PhÅn vi¿t đÅy đÿ

19 HBsAg Hepatitis B surface antigen

kháng nguyên bà mÁt cąa virus viêm gan B 20 HBcrAg Hepatitis B core related Antigen

21 HCC Hepatocellular Carcinoma Ung th° biÅu mô tÁ bào gan 22 IC Internal control: kiÅm soát néi bé 23 Kb Kilobase

24 LHBs Large Hepatitis B Surface Protein

Protein lën bà mÁt cąa virus viêm gan B 25 MHBs Middle Hepatitis B Surface Protein

Protein trung bình bà mÁt cąa virus viêm gan B 26 NA Nucleot(s)ide Analogue

27 NTCP Na+/ taurocholate co-transporting polypeptide: Polypeptide đãng vÃn chuyÅn taurocholate phă thuéc Na +

28 NK Natural killer cells: các tÁ bào diát tự nhiên 29 NKT Natural killer T cells: tÁ bào T diát tự nhiên 30 mRNA Messenger RNA: RNA thông tin

31 RCA Rolling Circle Amplification 32 rcDNA Relaxed circular DNA

33 RNA Ribonucleic acid

34 RT Reverse Transcriptase: enzym sao mã ng°āc 35 SHBs Small Hepatitis B Surface Protein

Protein nhß bà mÁt cąa virus viêm gan B

37 PCR Polymerase Chain Reaction

TT PhÅn vi¿t tÁt PhÅn vi¿t đÅy đÿ

38 qPCR Quantitative PCR

39 qHBsAg Quantitative Hepatitis B surface antigen 40 Pg RNA Pregenomic Ribonucleic: RNA tiÃn gen 41 POL Polymerase

42 PSAD Plasmid Safe ATP-dependent DNAase DNAase phă thuéc ATP an toàn Plasmid

43 RACE A rapid amplification of complimentary DNA (cDNA)-ends: Kỹ thuÃt khuÁch đ¿i nhanh phÁn ćng chuçi polymerase thßi gian thực (PCR) dựa trên DNA hoÁc circle DNA tự do

44 tDNA Total Deoxyribonucleic acid: DNA toàn bé

DANH MĀC CÁC BÀNG

1.1 Các ph°¢ng pháp trực tiÁp đ°āc sÿ dăng trong đánh l°āng cccDNA 24

2.1 Giá trá bình th°ßng các xét nghiám sinh hóa 43

2.2 Trình tự các mãi cąa phÁn ćng RCA nh° d°ëi đây 46

2.3 Trình tự primer và probe cąa phÁn ćng real-time PCR đánh l°āng HBV cccDNA 47

2.4 Chu trình nhiát ch¿y máy Realtime PCR 55

2.5 Thành phÅn phÁn ćng 56

2.6 Chu trình luân nhiát tái °u cąa phÁn ćng RT-qPCR 57

3.1 Tuåi và giëi cąa bánh nhân nghiên cću 63

3.2 Mét sá triáu chćng lâm sàng th°ßng gÁp giāa hai nhóm bánh nhân 64 3.3 Tình tr¿ng mang kháng nguyên HBe á hai nhóm bánh nhân 64

3.4 Ho¿t đé ALT, AST và nãng đé Bilirubin TP á 2 nhóm bánh nhân 65

3.5 ĐÁc điÅm và tiÅu cÅu á 2 nhóm bánh nhân 66

3.6 Mćc đé tån th°¢ng và x¢ hóa gan nhóm bánh nhân VGBMT 66

3.7 Mái liên quan giāa mćc đé tån th°¢ng gan vëi HBeAg á chung hai nhóm bánh nhân 67

3.8 Mćc đé x¢ hóa gan theo HBeAg á chung hai nhóm bánh nhân 67

3.9 Mái liên quan giāa nãng đé cccDNA tÁ bào gan vëi các chß tiêu nghiên cću á nhóm VGBMT 69

3.10 Mái liên quan giāa nãng đé cccDNA tÁ bào gan vëi mét sá chß tiêu nghiên cću á nhóm x¢ gan 70

3.11 Phân tích hãi quy đa biÁn các chß tiêu nghiên cću Ánh h°áng đÁn cccDNA á nhóm VGBMT và X¢ gan 71

3.15 Mái liên quan giāa nãng đé HBV RNA huyÁt t°¢ng vëi mét sá chß

tiêu nghiên cću á chung hai nhóm 73 3.16 Mái liên quan giāa nãng đé HBV RNA huyÁt t°¢ng vëi các chß tiêu

nghiên cću á nhóm VGBMT 74 3.17 Phân tích hãi quy đa biÁn các chß tiêu nghiên cću Ánh h°áng đÁn

HBV RNA á nhóm VGBMT và X¢ gan 75 3.18 Nãng đé HBV RNA theo mćc tån th°¢ng gan và mćc x¢ hóa gan á

chung hai nhóm bánh nhân 75 3.19 TÁi l°āng HBV DNA á hai nhóm bánh nhân nghiên cću 76 3.20 Mái liên quan giāa tÁi l°āng HBV DNA vëi các chß tiêu nghiên cću 3.24 ĐÁc điÅm nãng đé cccDNA theo tÁi l°āng HBV DNA huyÁt t°¢ng á

chung hai nhóm bánh nhân 81

BÁng Tên bÁng Trang

3.25 T°¢ng quan giāa cccDNA vëi HBV DNA theo mét sá chß tiêu

nghiên cću á hai nhóm 83 3.26 Nãng đé cccDNA vëi mćc HBV RNA á hai nhóm nghiên cću 84 3.27 T°¢ng quan giāa nãng đé cccDNA tÁ bào gan vëi HBV RNA huyÁt

t°¢ng theo các chß tiêu nghiên cćuá hai nhóm nghiên cću 86 3.28 Mái liên quan giāa tÁi l°āng HBV DNA vëi nãng đé HBV RNA

huyÁt t°¢ng á các bánh nhân nghiên cću 86 3.29 T°¢ng quan giāa tÁi l°āng HBV DNA vëi HBV RNA huyÁt t°¢ng

theo các chß tiêu nghiên cću á hai nhóm 88

DANH MĀC BIÂU Đà

3.1 Nãng đé cccDNA tÁ bào gan á các hai nhóm bánh nhân nghiên cću 68 3.2 Giá trá cąa cccDNA tÁ bào gan, HBV RNA và HBV DNA huyÁt t°¢ng

vëi tình tr¿ng HBeAg á nhóm VGBMT 79 3.3 T°¢ng quan giāa nãng đé cccDNA tÁ bào gan vëi tÁi l°āng HBV DNA huyÁt t°¢ng á chung hai nhóm 82 3.4 T°¢ng quan giāa nãng đé cccDNA tÁ bào gan vëi tÁi l°āng HBV DNA 3.7 T°¢ng quan giāa HBV RNA và HBV DNA á chung hai nhóm 87 3.8 T°¢ng quan giāa HBV RNA và HBV DNA á nhóm VGBMT và x¢

DANH MĀC HÌNH

1.1 Tình hình nhißm HBV trên ThÁ giëi 3

1.2 Vòng đßi cąa HBV và chu trình sinh hãc cąa cccDNA 5

1.3 Phân lo¿i giai đo¿n nhißm HBV 8

1.4 Quá trình hình thành cccDNA từ rcDNA 19

2.1 MÁnh gan thực tÁ sinh thiÁt 43

2.2 CÃu trúc cąa cccDNA và rcDNA bé gen cąa HBV 47

2.3 Bé kit QIAamp Viral RNA mini kit 51

2.4 S¢ đã vá trí thiÁt kÁ mãi cąa phÁn ćng đánh l°āng HBV RNA 53

2.5 Quy trình Onestep-RT PCR phát hián chãn lãc HBV pgRNA 54

Đ¾T VÂN ĐÀ

Hián nay, theo Tå chćc Y tÁ ThÁ giëi °ëc tính trên toàn cÅu có khoÁng 296 triáu ng°ßi nhißm virus viêm gan B (Heptitis B virus: HBV) m¿n tính Hàng nm có khoÁng 820.000 tr°ßng hāp tÿ vong liên quan đÁn các biÁn chćng cąa bánh nh° viêm gan B m¿n tính (VGBMT), x¢ gan và ung th° biÅu mô tÁ bào gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) [1] Viát Nam là quác gia có tß lá nhißm HBV cao trong khu vực, cháu hÃu quÁ nÁng nà do nhißm HBV gây ra Dā liáu từ Bé Y tÁ Viát Nam nm 2019 cho thÃy tß lá nhißm HBV m¿n tính từ 6 – 20% dân sá, t°¢ng đ°¢ng vëi khoÁng 8 triáu ng°ßi ĐiÃu đó đÁt ra mét thách thćc lën cho há tháng chm sóc sćc khße céng đãng và trong theo dõi, quÁn lý điÃu trá ng°ßi nhißm HBV [2]

Deoxyribonucleic acid d¿ng vòng khép kín céng hóa trá cąa HBV (cccDNA: Covalently closed circular Deoxyribonucleic acid ) đóng vai trò quan trãng trong sự tãn t¿i dai dẳng, duy trì và nhân lên cąa virus trong tÁ bào gan cccDNA, d°ëi d¿ng mét nhißm sắc thÅ nhß, bÃn vāng, đãng thßi là khuôn mÁu sÁn xuÃt ra các Ribonucleic acid (RNA) nh° pgRNA (pregenomic RNA) và các mRNA mã hóa cho các protein cąa HBV[3] Bên c¿nh đó, hián t¿i ch°a có thuác kháng virus nào có thÅ điÃu trá, thÁi trừ cccDNA ra khßi ng°ßi bánh HBV DNA vÁn là dÃu Ãn sinh hãc th°ßng quy đ°āc sÿ dăng trong thực hành điÃu trá tuy nhiên l¿i không phÁn ánh chính xác sự ho¿t đéng cąa cccDNA [4] Trong khi đó, viác tách chiÁt và phân tích cccDNA đòi hßi phÁi thực hián sinh thiÁt gan, mét kỹ thuÃt xâm lÃn và th°ßng không đ°āc sự hāp tác cąa nhiÃu ng°ßi bánh ĐiÃu này làm cho quy trình xét nghiám, phân tích cccDNA trá nên khó khÁ thi trong thực tÁ lâm sàng

Chính vì vÃy, viác tìm kiÁm mét dÃu Ãn trong huyÁt t°¢ng có khÁ nng dự đoán hoÁc đ¿i dián cho cccDNA có ý ngh*a quan trãng HBV pgRNA (HBV RNA) là mét sÁn ph¿m phiên mã cąa cccDNA có l°u hành trong huyÁt t°¢ng,

dÃu Ãn này có tiÃm nng phÁn ánh trung thực tình tr¿ng ho¿t đéng cąa cccDNA trong tÁ bào gan [5], [6] Tìm hiÅu mái liên quan giāa cccDNA vëi HBV DNA, HBV RNA huyÁt t°¢ng có thÅ giúp nâng cao hiÅu biÁt và c¢ chÁ bánh sinh cąa bánh và cung cÃp thông tin hāu ích cho viác quÁn lý, điÃu trá ng°ßi bánh nhißm HBV, đÁc biát á Viát Nam, n¢i ch°a có nghiên cću nào và vÃn đà này

XuÃt phát từ lý do trên chúng tôi tiÁn hành đà tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV= vëi hai măc tiêu sau:

1 Xác định nồng độ cccDNA tế bào gan, tÁi lượng HBV DNA và nồng độ HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B m¿n tính và xơ gan do HBV

2 Đánh giá mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với tÁi lượng HBV DNA và nồng độ HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B m¿n tính và xơ gan do HBV

Ch°¢ng 1

TâNG QUAN TÀI LIàU

1.1 Tình hình nhißm HBV trên Th¿ giéi và Viát Nam

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới

Theo tháng kê cąa Tå chćc Y tÁ ThÁ giëi, toàn cÅu có khoÁng 300 triáu ng°ßi nhißm HBV m¿n tính và gÅn 1 triáu ng°ßi tÿ vong mçi nm các nguyên nhân liên quan đÁn các virus viêm gan trong đó chą yÁu là HBV [1]

Hình 1.1 Tình hình nhißm HBV trên ThÁ giëi

Bên c¿nh đó, HBV là nguyên nhân cąa 60 - 80% ca mắc HCC trên toàn cÅu và là mét trong ba nguyên nhân gây tÿ vong hàng đÅu á châu Phi, châu Á Tỷ lá HBsAg d°¢ng tính trên ThÁ giëi thay đåi từ 0,1% đÁn 20%, phă thuéc từng khu vực đáa lý và quÅn thÅ dân c° Nhāng n¢i trên ThÁ giëi đ°āc coi là

vùng l°u hành dách cao khi ít nhÃt 8% dân sá có HBsAg d°¢ng tính Tỷ lá nhißm HBsAg thay đåi giāa các n°ëc khác nhau, á nhāng n°ëc phát triÅn, tỷ lá HBsAg d°¢ng tính th°ßng cao h¢n á nhóm ng°ßi di c° đÁn từ nhāng n°ëc có tỷ lá mắc bánh cao hoÁc từ nhāng ng°ßi có hành vi nguy c¢ cao [8], [9]

1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Viát Nam là mét trong 10 n°ëc đćng đÅu ThÁ giëi và tỷ lá tÿ vong do HCC, trong đó 80% ca HCC này liên quan nhißm HBV m¿n tính Theo kÁt quÁ mét sá công trình nghiên cću cho thÃy, tỷ lá HBsAg (+) dao đéng từ 3,1% – 19% dân sá tùy theo từng đái t°āng nguy c¢, tỷ lá này thÃp nhÃt á trẻ em (3,4% (3,1-3,8%)) và cao nhÃt á ng°ßi tr°áng thành, đÁc biát nhóm đái t°āng bánh nhân điÃu trá néi trú có kèm các tån th°¢ng gan nh° trong bánh sát xuÃt huyÁt Dengue, nhißm khu¿n huyÁt, sát rét [2] Theo nghiên cću tång hāp mëi nhÃt nm 2022, tỷ lá d°¢ng tính HBsAg trong quÅn thÅ ng°ßi Viát Nam dao đéng quanh 11 -13% [10] HBV là nguyên nhân hàng đÅu gây viêm gan tái cÃp, x¢ gan và ung th° gan á Viát Nam Theo báo cáo cąa Căc Y tÁ dự phòng – Bé Y tÁ 2019 và tình tr¿ng hián nhißm HBV, tỷ lá hián nhißm cao nhÃt đ°āc ghi nhÃn t¿i Nam Trung Bé (11,4%), Tây Nguyên (11,1%) và Tây Bắc (11,1%), trong khi Bắc Trung Bé có tỷ lá hián nhißm thÃp nhÃt là 7,5% Các tßnh, thành phá có tỷ lá HBsAg d°¢ng tính cao bao gãm: S¢n La (13,5%), Bình ThuÃn (12,8%), QuÁng Nam (11,9%), Kon Tum (11,9%), Đắk Nông (11,8%) [2]

1.2 C¢ ch¿ bánh sinh và dißn bi¿n nhißm HBV m¿n

1.2.1 C¢ ch¿ bánh sinh cÿa bánh do HBV gây ra

- Vòng đời của HBV

Hình 1.2 Vòng đßi cąa HBV và chu trình sinh hãc cąa cccDNA

HBV có bé gen dài 3,2 kb, đ°āc tå chćc thành bán khung đãc má có phÅn chãng lên nhau Chúng mã hóa bán sÁn ph¿m gen chính: (1) polymerase (POL) cąa virus, (2) ba polypeptide kháng nguyên bà mÁt (HBs) cąa HBV, că thÅ là các kháng nguyên bà mÁt nhß (S), trung bình (M) và lën (L); (3) Protein lõi cąa HBV (HBc), kháng nguyên e cąa HBV (HBeAg), protein tiÃn lõi và (4) protein X (HBx) Cùng vëi các yÁu tá vÃt chą, các protein virus này thúc đ¿y quá trình

hoàn thián vòng đßi cąa HBV, bao gãm sự xâm nhÃp cąa virus, quá trình sinh hãc cąa cccDNA, sÁn xuÃt nucleocapsid thÁ há con, hình thành virion và sự thoát ra cąa virion [3]

Quá trình sao chép cąa HBV má đÅu bằng viác gắn virion vào thă thÅ đÁc hiáu cąa virus trên bà mÁt tÁ bào gan đ°āc gãi là NTCP (NTCP:Na+/ taurocholate co-transporting polypeptide) thông qua các protein preS Sau khi

gắn lëp vß cąa virus, hòa màng vëi màng tÁ bào, qua đó phóng thích

nucleocapsid virus vào bào t°¢ng Từ đây, HBV DNA đ°āc vÃn chuyÅn vào trong nhân tÁ bào gan và chuyÅn d¿ng thành cccDNA nhß các enzyme cąa tÁ bào vÃt chą Trong quá trình nhißm HBV m¿n tính, cccDNA đ°āc dùng làm khuôn đÅ tång hāp các RNA thông tin vëi các kích th°ëc khác nhau 3,5; 2,4; 2,1 và 0,7kb Các RNA này đ°āc gắn đuôi và di chuyÅn ra tÁ bào chÃt và thực hián chćc nng cąa mình Sau khi pgRNA đ°āc tång hāp, nó đ°āc đóng gói trong vß nucleocapsid và chuyÅn vào bào t°¢ng, bắt đÅu quá trình sao chép bé

gen [11], [12], [7]

Trong các phćc hāp sao chép này, pgRNA đ°āc phiên mã ng°āc thành HBV DNA, sau đó trÁi qua quá trình đóng gói Capsid chća HBV DNA liên kÁt vëi protein bà mÁt HBV trên l°ëi néi chÃt, đ°āc chuyÅn vào lõi tr°ëc khi thoát ra khßi tÁ bào gan qua con đ°ßng bài tiÁt và sau đó đ°āc giÁi phóng d°ëi d¿ng các h¿t virus tr°áng thành mRNA đ°āc phiên mã từ cccDNA cũng t¿o ra nhiÃu kháng nguyên virus khác nhau Ngo¿i trừ cccDNA, tÃt cÁ các sÁn ph¿m khác cąa virus nh° HBV rcDNA, HBV RNA, HBeAg, HBsAg, HBcrAg đÃu xác đánh đ°āc trong máu Chúng đ°āc t¿o ra từ quá trình phiên mã từ các điÅm khái đÅu khác nhau codon cąa gen lõi preC và quá trình xÿ lý protein khác biát sau đó

- Cơ chế bệnh sinh

BÁn thân sự sao chép cąa HBV không gây tån th°¢ng tÁ bào gan, nh°ng phÁn ćng mißn dách cháng l¿i HBV nhằm lo¿i bß virus có thÅ dÁn đÁn tån

th°¢ng tÁ bào gan Quá trình này có tác đéng quan trãng đÁn tiÁn triÅn lâm sàng và kÁt quÁ cąa bánh viêm gan B Đáp ćng mißn dách cąa vÃt chą cháng l¿i HBV chą yÁu bao gãm hai phÅn: mißn dách b¿m sinh và mißn dách thích ćng Trong sá đó, các phÁn ćng mißn dách b¿m sinh chính đ°āc gây ra bái thă thÅ nhÃn d¿ng mÁu, tÁ bào tiêu diát tự nhiên (tÁ bào NK), tÁ bào NKT và b¿ch cÅu đ¢n nhân, đ¿i thực bào; các tÁ bào tham gia đáp ćng mißn dách thích ćng chính bao gãm tÁ bào lympho T CD4, tÁ bào lympho T CD8 và tÁ bào lympho B Đáp ćng mißn dách b¿m sinh hiáu quÁ không chß có tác dăng kháng virus trực tiÁp mà còn có tác đéng quan trãng đÁn đáp ćng mißn dách đÁc hiáu vëi HBV Đáp ćng cąa tÁ bào lympho T đÁc hiáu vëi HBV và tÁ bào lympho B là nhāng yÁu tá quyÁt đánh trong viác lo¿i bß virus tự do, tÁ bào gan nhißm virus và đóng vai trò kiÅm soát mißn dách lâu dài đái vëi HBV Trong quá trình nhißm HBV m¿n tính, virus s¿ l¿n trán và ćc chÁ khÁ nng kháng virus cąa há tháng mißn dách thích ćng và mißn dách b¿m sinh thông qua các c¢ chÁ khác nhau, từ đó đ¿t đ°āc sự sao chép liên tăc, đãng thßi vÃt chą cũng có biÅu hián rái lo¿n chćc nng cąa các tÁ bào mißn dách khác nhau [13]

1.2.2 Tiến trình tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính

Phân chia cąa Hiáp héi gan mÃt Châu Âu 2017 so vëi các phân lo¿i cũ có nhiÃu °u điÅm, theo cách phân chia này, bánh nhân VGBMT đ°āc chia thành hai tình tr¿ng: viêm gan B m¿n và nhißm HBV m¿n có HBeAg d°¢ng tính hay âm tính [14] Tuy nhiên, á mét sá l°āng bánh nhân đáng kÅ, biÅu hián tng đ¢n đéc dÃu Ãn ho¿t đéng cąa HBV không cho phép phân lo¿i vào mét giai đo¿n că thÅ nào, bên c¿nh đó cÅn theo dõi HBeAg, tÁi l°āng HBV DNA và ALT huyÁt thanh th°ßng xuyên đÅ quyÁt đánh viác điÃu trá Ngay cÁ sau khi đánh giá đÅy đą, mét sá tr°ßng hāp vÁn r¢i vào mét khu vực màu xám không xác đánh, khi đó viác quÁn lý cÅn phÁi đ°āc cá nhân hóa Các giai đo¿n cąa nhißm HBV m¿n tính không nhÃt thiÁt phÁi tuÅn tự nh° cách phân lo¿i trong các nghiên cću tr°ëc

đây chß ra, viác phân lo¿i này cąa EASL nhằm giúp ích cho viác điÃu trá đ°āc dß dàng h¢n [7], [14], [15]

Hình 1.3 Phân lo¿i giai đo¿n nhißm HBV

- Giai đoạn 1

Nhißm HBV m¿n tính có HBeAg d°¢ng tính t°¢ng ćng vëi <giai đo¿n dung n¿p mißn dách= đÁc tr°ng bái sự hián dián cąa HBeAg huyÁt t°¢ng, tÁi l°āng HBV DNA rÃt cao và ALT duy trì á mćc bình th°ßng [16] à gan chß thÃy tån th°¢ng viêm hoÁc ho¿i tÿ tái thiÅu mà không thÃy tình tr¿ng x¢ hóa gan, nh°ng mćc đé tång hāp HBV DNA cao cho thÃy nguy c¢ tiÁn triÅn thành ung th° gan xuÃt hián ngay á giai đo¿n đÅu cąa sự nhißm trùng [16], [17] Giai đo¿n này th°ßng gÁp và tãn t¿i kéo dài đÁn tuåi tr°áng thành, tỷ lá mÃt HBeAg tự nhiên rÃt thÃp và nguy c¢ lây truyÃn th°ßng cao do tÁi l°āng HBV DNA cao [18]

- Giai đoạn 2

VGBMT, HBeAg d°¢ng tính đ°āc đÁc tr°ng bái sự hián dián cąa HBeAg huyÁt t°¢ng, tÁi l°āng HBV DNA cao và ALT tng, nhāng tr°ßng hāp này th°ßng có tình tr¿ng ho¿i tÿ gan vừa hoÁc nÁng kèm theo sự tiÁn triÅn cąa x¢

hóa xÁy ra nhanh chóng [17] Hián t°āng này có thÅ gÁp á giai đo¿n đÅu nhißm HBV nh°ng th°ßng gÁp h¢n á các tr°ßng hāp nhißm HBV khi đã vào tuåi tr°áng thành KÁt căc cąa giai đo¿n này rÃt đa d¿ng, nhiÃu bánh nhân có thÅ đ¿t HBeAg âm tính do chuyÅn đÁo huyÁt thanh tự nhiên, giÁm tÁi l°āng HBV DNA và b°ëc vào giai đo¿n không ho¿t đéng [19]

- Giai đoạn 3

Nhißm HBV m¿n tính HBeAg âm tính, tr°ëc đây đ°āc gãi là <giai đo¿n mang virus không ho¿t đéng=, đ°āc đÁc tr°ng bái sự hián dián cąa kháng thÅ vëi kháng nguyên HBe trong huyÁt t°¢ng, tÁi l°āng HBV DNA không thÅ phát hián hoÁc á mćc thÃp (<2.000 IU/ml) và ALT bình th°ßng Nhāng bánh nhân này có nguy c¢ tiÁn triÅn thành x¢ gan hoÁc HCC thÃp h¢n nhāng tr°ßng hāp khác, tuy nhiên mét sá tr°ßng hāp cũng có thÅ tiÁn triÅn thành VGBMT [16] MÃt HBsAg do điÃu trá đ°āc coi là ph°¢ng pháp điÃu trá khßi chćc nng và giÁi quyÁt tình tr¿ng nhißm HBV m¿n tính Mét sá nghiên cću đã ghi nhÃn kÁt quÁ lâm sàng thuÃn lāi sau khi mÃt HBsAg hoÁc đÁo ng°āc huyÁt thanh á đé tuåi sëm (d°ëi 50 tuåi) trong tr°ßng hāp không có x¢ gan á nhāng ng°ßi bá nhißm HBV m¿n tính Đ¿t đ°āc viác mÃt HBsAg hiÁm khi xÁy ra á bánh nhân châu Á dùng thuác kháng virus đ°ßng uáng (<1% mçi nm), nh°ng mét khi đã đ¿t đ°āc thì th°ßng duy trì kÁt quÁ lâu dài ChuyÅn đÁo huyÁt thanh và hình thành kháng thÅ kháng kháng nguyên bà mÁt HBV (Hepatitis B surface antibody: HBsAb) gÁp á mét sá ít bánh nhân mÃt HBsAg sau khi điÃu trá Tuy nhiên, đái vëi bánh nhân dùng NA, mÃt HBsAg mà không xuÃt hián HBsAb là tiêu chí điÃu trá có thÅ chÃp nhÃn đ°āc [20]

- Giai đoạn 4

VGBMT, HBeAg âm tính, đ°āc đÁc tr°ng bái viác mÃt HBeAg và xuÃt hián HBeAb kèm theo là tÁi l°āng HBV á mćc từ trung bình đÁn cao (th°ßng thÃp h¢n á bánh nhân HBeAg d°¢ng tính), ALT tng từng đāt hoÁc liên tăc, kÁt quÁ mô hãc gan cho thÃy tình tr¿ng có biÅu hián viêm, ho¿i tÿ và x¢ hóa á

các mćc đé trung bình – nÁng HÅu hÁt các tr°ßng hāp này xÁy ra đét biÁn Pre core/ core cąa HBV làm mÃt khÁ nng biÅu hián cąa HBeAg Giai đo¿n này có liên quan đÁn tỷ lá thuyên giÁm bánh tự nhiên thÃp nÁu không đ°āc can thiáp điÃu trá [19]

- Giai đoạn 5

Giai đo¿n HBsAg âm tính, có hoÁc không có HBsAb MÃt HBsAg tr°ëc khi bắt đÅu x¢ gan làm giÁm nguy c¢ x¢ gan, mÃt bù gan và HCC, từ đó cÁi thián khÁ nng sáng sót Tuy nhiên, nÁu x¢ gan đã phát triÅn tr°ëc khi mÃt HBsAg, bánh nhân vÁn có nguy c¢ bá HCC do đó cÅn tiÁp tăc theo dõi sát Sau điÃu trá liáu pháp kháng virus á bánh nhân VGBMT chß có khÁ nng mÃt HBsAg vëi tỷ lá 1 – 3% [16], [19]

1.3 Viêm gan virus B m¿n tính và x¢ gan do HBV

1.3.1 Viêm gan virus B mạn tính

VGBMT là tình tr¿ng viêm và ho¿i tÿ tÁ bào gan đ°āc gây ra bái sự tãn t¿i cąa HBV kéo dài trên 6 tháng HÅu hÁt bánh nhân VGBMT không rõ tiÃn sÿ viêm gan tr°ëc đây à các quác gia nằm trong vùng dách l°u hành thÃp có khoÁng 30-50% bánh nhân VGBMT là có tiÃn sÿ viêm gan B cÃp, trong khi đó á các quác gia nằm trong vùng dách l°u hành cao, tỷ lá này chß < 30% [21]

Dựa vào xét nghiám HBeAg, ng°ßi ta chia VGBMT làm hai nhóm: VGBMT, HBeAg d°¢ng tính và VGBMT, HBeAg âm tính

- VGBMT, HBeAg d°¢ng tính th°ßng gÁp á ng°ßi nhißm HBV từ mẹ và gÁp vëi tỷ lá cao á các quác gia châu Á HÅu hÁt các bánh nhân VGBMT, HBeAg d°¢ng tính đÃu có HBV DNA g 105 copies/ml Tỷ lá chuyÅn đÁo huyÁt thanh HBeAg tự nhiên thành công khoÁng 10-20%/ nm Quá trình chuyÅn đÁo huyÁt thanh không th°ßng xuyên có mái liên quan vëi hián t°āng bùng phát và sinh hóa, nh°ng á tr°ßng hāp chuyÅn đÁo huyÁt thanh HBeAg thành công thì dÃu hiáu bùng phát sinh hóa th°ßng rÃt rõ ràng, mét sá tr°ßng hāp còn xuÃt hián cÁ IgM-Anti HBc và có khoÁng 2,5% bánh nhân có nãng đé AFP

(Alpha-fetoprotein) tng cao Các yÁu tá Ánh h°áng tích cực đÁn chuyÅn đÁo thành công HBeAg là tuåi cao, ho¿t đé ALT cao và genotype B

- VGBMT, HBeAg âm tính th°ßng gÁp á ng°ßi nhißm HBV trong quá trình tr°áng thành, á tuåi trên 40 và chiÁm tỷ lá cao á các quác gia vùng Đáa Trung HÁi HÅu hÁt bánh nhân VGBMT, HBeAg âm tính là do đét biÁn precore hoÁc đét biÁn vùng promotor core Mét sá tr°ßng hāp do tái ho¿t đéng từ ng°ßi nhißm HBV m¿n không ho¿t đéng Bánh nhân VGBMT, HBeAg âm tính th°ßng có tÁi l°āng virus HBV DNA g 104 copies/ml và thÃp h¢n nhóm HBeAg d°¢ng tính nh°ng biÁn chćng x¢ gan, ung th° tÁ bào gan l¿i có tÅn suÃt cao h¢n [19]

Bánh VGBMT th°ßng tiÁn triÅn âm thÅm, xen k¿ giāa nhāng đāt tiÁn triÅn là nhāng đāt ån đánh nh°ng bánh th°ßng không tự giëi h¿n đ°āc, hÃu quÁ th°ßng dÁn đÁn bánh lý gan mÃt bù, x¢ gan, ung th° tÁ bào gan và tÿ vong Theo nhiÃu sá liáu tháng kê cho thÃy, tỷ lá sáng sót sau 5 nm á bánh nhân VGBMT mćc đé nhẹ là 97%, mćc đé vừa là 86%, bánh nhân x¢ gan sau ho¿i tÿ là 55%; và t°¢ng tự sau 15 nm lÅn l°āt là 77%; 66%; 40% [22]

HÅu hÁt bánh nhân VGBMT có biÅu hián lâm sàng nghèo nàn nh° chß mát mßi thoáng qua, đôi khi chán n, đÅy băng , ho¿t đé AST, ALT không tng hoÁc tng nhẹ từ 2-5 lÅn ng°ÿng cao cąa giá trá bình th°ßng Ch¿n đoán xác đánh VGBMT á ng°ßi không có triáu chćng lâm sàng phÁi dựa vào kÁt quÁ mô bánh hãc vëi nhāng đÁc điÅm tån th°¢ng viêm và x¢ không t°¢ng xćng vëi lâm sàng

Tuy nhiên, có mét sá ít bánh nhân có biÅu hián lâm sàng giáng nh° viêm gan virus cÃp và hián t°āng này đ°āc gãi là đāt bùng phát cąa VGBMT Các triáu chćng lâm sàng th°ßng gÁp nh° sát nhẹ, mát mßi, kém n, ngą kém, gÅy sút cân, nôn, buãn nôn, đau tćc h¿ s°ßn phÁi, suy giÁm ho¿t đéng tình dăc á ng°ßi tr°áng thành, tiÅu vàng, da vàng, gan to chắc Bên c¿nh đó có thÅ thÃy có nhāng biÅu hián ngoài gan nh° đau mßi khëp, xuÃt huyÁt da do viêm quanh m¿ch, protein niáu do lắng đãng phćc hāp mißn dách gây viêm cÅu thÃn, viêm

nút quanh đéng m¿ch, ALT tng g 5 lÅn Mô hãc gan thÃy hình Ánh viêm và ho¿i tÿ nÁng, có thÅ gÁp ho¿i tÿ tiÅu thùy, ho¿i tÿ cÅu nái [23], [19]

1.3.2 Xơ gan do HBV

X¢ gan là bánh lý m¿n tính á gan vëi các tån th°¢ng đÁc tr°ng nh°: viêm gan B m¿n tính, mô x¢ phát triÅn lan tràn, cÃu trúc gan bá đÁo lén không hãi phăc, có nhiÃu căc tân t¿o [24]

X¢ gan do HBV hÅu hÁt xuÃt phát từ bánh nhân VGBMT, tuy nhiên mét sá tr°ßng hāp x¢ gan cũng có thÅ gÁp á ng°ßi mang HBV không ho¿t đéng hoÁc sau mắc viêm gan virus B cÃp tính nhiÃu nm Ng°ßi mang HBV m¿n tính lâu dài có nguy c¢ dÁn đÁn x¢ gan, HCC và tỷ lá mắc, tỷ lá tÿ vong liên quan đÁn x¢ gan cao h¢n so vëi nhóm chćng có HBsAg âm tính TÁi l°āng HBV DNA huyÁt t°¢ng ban đÅu trong nhiÃu nghiên cću đ°āc là mét yÁu tá dự báo chính cho sự thanh thÁi tự nhiên cąa HBeAg, HBsAg [25] Hián nay, trên ThÁ giëi có xÃp xß 300 triáu ng°ßi nhißm HBV m¿n tính, °ëc tính sau mçi 5 nm có khoÁng 12 - 20% sá bánh nhân VGBMT s¿ tiÁn triÅn thành x¢ gan, 20-23% bánh nhân x¢ gan còn bù tiÁn triÅn thành mÃt bù và 6 - 15% bánh nhân x¢ gan tiÁn triÅn thành ung th° gan nguyên phát Bánh nhân x¢ gan th°ßng có tiên l°āng xÃu, á bánh nhân x¢ gan còn bù tỷ lá sáng sau 5 nm khoÁng 85%, trong khi đó bánh nhân x¢ gan mÃt bù tỷ lá sáng thêm sau 5 nm chß còn 14 -35%, và sau 1 nm là 55-70% [21], [26]

X¢ gan do HBV còn gãi là x¢ gan nhu mô hay x¢ gan sau ho¿i tÿ, tån th°¢ng x¢ hóa xuÃt phát từ khoÁng cÿa tiÁn vào nhu mô gan thay thÁ tå chćc bá ho¿i tÿ Tå chćc gan tng sinh t¿o ra các căc tân t¿o đ°ßng kính to nhß không đÃu th°ßng > 3mm nh°ng chą yÁu là các căc lën do vÃy còn gãi là x¢ gan căc tái t¿o to

+ Bacon B.R cho rằng x¢ gan dựa vào kÁt quÁ mô bánh hãc và cũng có thÅ dựa vào các biÅu hián lâm sàng và biÁn chćng cąa bánh [24]

Lâm sàng cąa x¢ gan đ°āc quy vào hai héi chćng chính và nhāng thay đåi và hình thái gan

* Héi chćng tng áp lực t*nh m¿ch cÿa: thÅ hián d°ëi 3 triáu chćng kinh điÅn: - Cå tr°ëng tự do, dách thÃm

- Lách to

- Giãn các vòng nái cÿa chą: tuÅn hoàn bàng há d°ëi da ngực, băng, tr*, giãn t*nh m¿ch thực quÁn

* Héi chćng suy chćc nng gan: phă thuéc hoàn toàn vào mćc đé x¢ gan, có thÅ biÅu hián kín đáo, nghèo nàn nÁu x¢ gan còn bù hoÁc biÅu hián đÅy đą, nÁng nà nÁu x¢ gan mÃt bù Các triáu chćng bao gãm: rái lo¿n tiêu hóa, phù, xuÃt huyÁt, vàng da, héi chćng tng – giÁm đ°ßng máu, suy giÁm ham muán tình dăc, thay đåi bÃt th°ßng c¢ quan sinh dăc nh° vú to, to tinh hoàn á nam giëi, mãc râu, răng lông mu, mÃt kinh nguyát, teo vú á nā giëi, dÃu hiáu sao m¿ch, bàn tay son do tng estradiol, dÃu hiáu móng tay trắng, da khô x¿m, loãng x°¢ng, chuét rút, gÅy sút cân, thiÁu máu, da xanh, hay mát giÁm trí nhë, rái lo¿n giÃc ngą Xét nghiám thÃy giÁm cÁ ba dòng hãng cÅu, b¿ch cÅu, tiÅu cÅu Tỷ lá Prothrombin giÁm < 75%, protein máu giÁm, albumin giÁm, tỷ lá A/G < 1, có thÅ ALT, AST tng, Bilirubin máu tng trong đāt tiÁn triÅn

+ Tiên l°āng: x¢ gan do HBV gây ra không tự giëi h¿n đ°āc, bánh tiÁn triÅn ngày mét nÁng Bánh nhân th°ßng tÿ vong do: hôn mê gan, xuÃt huyÁt do giãn vÿ t*nh m¿ch thực quÁn, bánh gan mÃt bù, viêm phúc m¿c tự phát, ung th° gan nguyên phát [21]

1.4 Mçt sß dÃu Ãn cÿa HBV

1.4.1 HBV DNA

Trong thực hành lâm sàng, HBV DNA đóng vai trò quan trãng trong đánh giá sự nhân lên cąa virus, cũng nh° đ°a ra chß đánh và theo dõi điÃu trá thuác kháng virus HBV DNA cao kéo dài có liên quan mÃt thiÁt vëi gia tng nguy c¢ x¢ gan, ung th° gan HBV DNA đ°āc xem là mét trong các tiêu chí trong

đánh giá đáp ćng điÃu trá Ngoài ra, HBV DNA còn giúp xác đánh viêm gan virus B á các bánh nhân có HBsAg âm tính, anti HBc(+) hay còn gãi là nhißm HBV tiÃm ¿n Theo h°ëng dÁn ch¿n đoán và điÃu trá VGBMT cąa Hiáp héi gan mÃt Châu Âu (EASL 2017) nhāng tr°ßng hāp sau đây cÅn bắt đÅu điÃu trá [14]:

- VGBMT, HBeAg d°¢ng tính có HBV DNA g 2x105 copies/mL và ALT g 2 lÅn ng°ÿng cao giá trá bình th°ßng

- VGBMT, HBeAg âm tính có HBV DNA g 2x104 copies/ml và ALT g 2 lÅn ng°ÿng cao giá trá bình th°ßng

- Có biÅu hián x¢ hóa gan mćc trung bình đÁn nÁng vëi bÃt kỳ mćc ALT nào đÃu đ°āc cân nhắc điÃu trá

- ALT tng cao h¢n 5 lÅn giá trá bình th°ßng, nguy c¢ tiÁn triÅn thành viêm gan nÁng hoÁc mÃt bù

- Nhāng tr°ßng hāp có HBV DNA cao, ALT bình th°ßng kéo dài hoÁc tng tái thiÅu không nên điÃu trá mà cÅn đ°āc theo dõi, giám sát mçi 3-6 tháng Theo h°ëng dÁn cąa Hiáp héi Nghiên cću bánh gan Hoa Kỳ, giai đo¿n không ho¿t đéng cąa bánh, gãm: HBsAg (+) > 6 tháng, HBeAg (-), anti-HBe (+), HBV DNA < 2.000 IU/ml, ho¿t đé ALT/AST duy trì bình th°ßng Tuy nhiên mét sá nghiên cću cho thÃy, chß đánh l°āng HBV DNA không phÁi luôn xác đánh đ°āc rõ ràng giai đo¿n cąa bánh HBV DNA dao đéng (102 -104 IU/ml) khó phân biát tr¿ng thái mang virus không ho¿t đéng và ng°ßi bánh HBeAg (-) thÅ ho¿t đéng [27]

Trong viêm gan virus B cÃp, nhìn chung, ng°ßi ta đã ngh* rằng HBV bá lo¿i bß hoàn toàn á nhāng bánh nhân sau khßi bánh; tuy nhiên, dÃu vÁt cąa HBV DNA huyÁt thanh hoÁc trong mô gan có thÅ đ°āc phát hián vëi mét tỷ lá nhß bái nhāng xét nghiám phân tÿ có đé nh¿y cao Nhāng tr°ßng hāp đó gãi là nhißm HBV ¿n (Occult Hepatitis B virus infection) Do đó, khi dùng các thuác ćc chÁ mißn dách sau khi ghép t¿ng hoÁc hóa trá ung th° có thÅ dÁn đÁn kích ho¿t l¿i HBV còn l¿i trong tr°ßng hāp lâm sàng đÁc biát này Vì vÃy á nhāng ng°ßi bánh mắc các bánh lý mà đang đ°āc điÃu trá bằng hóa chÃt, thuác

ćc chÁ mißn dách, thuác sinh hãc&.cÅn đ°āc khÁo sát tÁi l°āng HBV DNA huyÁt thanh, HBcAb dù có HBsAg âm tính, thêm vào đó chß đánh điÃu trá thuác kháng virus có thÅ đ°āc bắt đÅu sëm đÅ đà phòng viêm gan bùng phát [28]

1.4.2 HBV pgRNA – HBV RNA

RNA tiÃn gen (pgRNA) là sÁn ph¿m phiên mã trực cąa cccDNA vòng kín céng hóa cąa virus viêm gan B, đóng vai trò quan trãng trong quá trình khuÁch đ¿i và sao chép bé gen cąa virus PgRNA có thÅ bá enzym HBV DNA polymerase phiên mã ng°āc thành rcDNA đÅ l¿i tiÁp tăc mét chu kỳ sáng mëi Do đó, viác ngn chÁn phiên mã ng°āc s¿ không làm Ánh h°áng đÁn viác t¿o ra pgRNA vào huyÁt thanh [29] Khác vëi HBsAg huyÁt thanh, pgRNA huyÁt thanh khái l°āng phân tÿ 3,5 kb chß đ°āc sÁn xuÃt từ cccDNA, do đó, nó có thÅ phÁn ánh chính xác tình tr¿ng phiên mã cąa HBV cccDNA trong nhân tÁ bào gan [30]

HBV d°ëi d¿ng các h¿t Dane xâm nhÃp vào tÁ bào gan bằng cách gắn vào vß virion nhß mét sá yÁu tá đÁc hiáu trên bà mÁt tÁ bào gan Màng HBV hòa màng vëi màng tÁ bào gan đÅ xâm nhÃp vào tÁ bào gan Vào tÁ bào gan, HBV trút bß lëp vß và vào nhân d°ëi d¿ng rcDNA, rcDNA này đ°āc chuyÅn đåi thành cccDNA nhß enzym DNA polymerase cąa virus CccDNA đóng vai trò nh° mét khuôn mÁu phiên mã cho tÃt cÁ các bÁn sao cąa virus, bao gãm 3,5kb mRNA tr°ëc lõi (precore mRNA: pcRNA) và 3,5kb pgRNA, các 2,4kb và 2,1kb mRNA bà mÁt (surface mRNAs) và 0,7kb mRNA (8) PgRNA là khuôn mÁu cho cÁ phiên mã ng°āc và dách mã cąa enzym polymerase cąa virus

(Pol) và các protein lõi [31], [32]

Tr°ëc đây ng°ßi ta cho rằng sự tr°áng thành cąa các nucleocasid và sự đóng vß cąa virus đòi hßi sự tång hāp HBV DNA Tuy nhiên, mét sá nghiên cću đã chß ra sự tr°áng thành cąa nucleocapsid có thÅ không phă thuéc vào sự tång hāp DNA Viác phát hián các virion không chća gen cąa HBV trong huyÁt thanh bánh nhân VGBMT ąng hé cho sự tãn t¿i cąa con đ°ßng đóng gói HBV kèm pgRNA mà không cÅn thiÁt phÁi có sự tång hāp DNA Các pgRNA đã đóng

gói đ°āc bao bãc trong bào t°¢ng tÁ bào gan và giÁi phóng ra huyÁt thanh cąa bánh nhân, HBV RNA phát hián đ°āc trong huyÁt thanh chß có d¿ng pgRNA [33] Nghiên cću cũng chß ra rằng HBV RNA huyÁt thanh là pgRNA đ°āc trình bày trong các h¿t giáng virion và pgRNA huyÁt thanh đ°āc t¿o ra bái sự phiên mã cąa cccDNA bên trong tÁ bào gan [34] Và lý thuyÁt, sau khi các pgRNA đ°āc đóng gói và xâm nhÃp vào tÁ bào gan, chúng tham gia quá trình phiên mã ng°āc đÅ t¿o thành rcDNA và cccDNA và quá trình này cuái cùng dÁn đÁn tái nhißm HBV Tuy nhiên, cÅn có nhiÃu bằng chćng m¿nh m¿ h¢n đÅ chćng minh khÁ nng lây nhißm thông qua các h¿t virion chß chća HBV RNA [35]

HBV RNA không chß là khuôn mÁu cho cÁ phiên mã ng°āc DNA và tång hāp protein cąa virus, mà còn đóng mét vai trò quan trãng trong c¢ chÁ bánh sinh liên quan đÁn các thÅ bánh nhißm HBV GÅn đây, nhiÃu nghiên cću cho thÃy, bÁn thân HBV RNA góp phÅn trực tiÁp và gián tiÁp vào sự tiÁn triÅn cąa VGBMT Bên c¿nh vai trò trong dißn biÁn tự nhiên cąa nhißm HBV, HBV RNA còn có vai trò quan trãng trong quá trình theo dõi, điÃu trá VGBMT bằng các chÃt t°¢ng tự NA [35], [36] Viác điÃu trá này làm giÁm virus thông qua viác ćc chÁ quá trình phiên mã ng°āc cąa HBV từ DNA sāi âm thành sāi d°¢ng mà không tác đéng vào cccDNA, do đó cccDNA không bá Ánh h°áng và ho¿t đéng phiên mã vÁn tiÁp tăc và sÁn sinh ra HBV RNA Vì vÃy, á mét sá bánh nhân VGBMT, mÁc dù HBV DNA đ°āc duy trì á mćc thÃp bằng thuác kháng virus nh°ng mét sá tr°ßng hāp vÁn tiÁn triÅn đÁn các biÁn chćng nh° x¢ gan

và HCC [37], [38] 1.4.3 cccDNA

- Con đường hình thành cccDNA: Các c¢ chÁ phân tÿ xác đánh sự tãn t¿i

cąa HBV đã đ°āc nghiên cću từ rÃt lâu tuy nhiên vÁn có nhiÃu điÅm ch°a đ°āc hiÅu biÁt đÅy đą cccDNA trong nhân tÁ bào gan và sự bÃt lực cąa há tháng mißn dách trong viác lo¿i bß HBV đÃu đ°āc cho là nhāng c¢ chÁ chính cąa tình tr¿ng nhißm HBV m¿n tính Viác chāa khßi HBV thực sự đòi hßi phÁi làm s¿ch

cccDNA khßi tÁ bào gan bá nhißm bánh, hiÅu rõ các c¢ chÁ liên quan đÁn quá trình sinh hãc, điÃu hòa và ån đánh cccDNA là điÃu bắt buéc đÅ đ¿t đ°āc măc tiêu lo¿i trừ HBV

Sau khi xâm nhÃp vào tÁ bào gan, các rcDNA đ°āc giÁi phóng và chuyÅn vào nhân tÁ bào gan qua phćc bé các lç á màng nhân, từ đây rcDNA đ°āc biÁn đåi thành cccDNA cąa HBV t¿o thành mét d¿ng genome DNA ån đánh rcDNA cąa HBV bên trong capsid có cÃu trúc đÁc biát chća bán trình tự riêng biát: (1) POL cąa HBV polymerase liên kÁt céng hóa trá vëi đÅu 5′ cąa chuçi âm thông qua liên kÁt tyrosylphosphodiester; (2) mét trình tự dự phòng đÅu cuái (r) bao gãm mét nắp DNA m°ßi nucleotide (nt) trên chuçi âm; (3) đo¿n mãi RNA có đÅu 5′; và (4) khoÁng tráng DNA sāi đ¢n (ssDNA) trên sāi d°¢ng [39] BÁn chÃt không hoàn thián cąa rcDNA khiÁn nó không đą khÁ nng đóng vai trò là khuôn mÁu đÅ t¿o ra tÃt cÁ các mRNA cąa virus HBV mà nó cÅn đ°āc chuyÅn đåi thành cccDNA đÅ thiÁt lÃp sự lây nhißm Quá trình hình thành cccDNA từ rcDNA trÁi qua 4 giai đo¿n: (1) Lo¿i bß polymerase á đÅu 5’ cąa m¿ch DNA (-), (2) Cắt bß các đo¿n khoÁng 10 nt DNA lÁp l¿i trên m¿ch DNA (-), (3) Lo¿i bß đo¿n RNA primer gắn á đÅu 5’ cąa m¿ch DNA (+), (4) Hoàn chßnh chiÃu dài cąa m¿ch DNA (+) và nái các đÅu m¿ch thẳng DNA thành m¿ch vòng và t¿o ra cccDNA [3] Sá l°āng cąa cccDNA có trong bÃt kỳ tÁ bào gan bá nhißm nào đÃu biÁn thiên m¿nh nh°ng th°ßng trong khoÁng từ 10-50 bÁn sao trên mçi tÁ bào gan [40] CÁ sự tãn t¿i kéo dài cąa cccDNA và viác há tháng mißn dách không có khÁ nng t¿o ra các phÁn ćng mißn dách hiáu quÁ cháng l¿i HBV đ°āc coi là nguyên nhân gây ra sự thÃt b¿i trong viác đào thÁi virus và tái phát sau khi ngừng điÃu trá Vì vÃy, đÅ chāa khßi nhißm HBV m¿n tính thực sự, cccDNA cÅn phÁi đ°āc lo¿i bß khßi các tÁ bào gan bá nhißm [41] Quá trình sinh hãc cccDNA thông qua tái nhÃp nucleocapsid thÁ há con

đ°āc gãi là khuÁch đ¿i néi bào, qua đó cccDNA đ°āc hình thành thông qua nucleocapsid từ virion đÁn trong quá trình lây nhißm

Ngoài ra cccDNA còn là khuôn mÁu phiên mã cho các RNA, nó là sÁn ph¿m cÅn thiÁt cho viác t¿o ra các kháng nguyên virus và hç trā cho sự nhân lên cąa virus, sau đó dißn ra trong tÁ bào chÃt sau khi sao chép ng°āc cąa pgRNA trong các nucleocapsid mëi hình thành [42] Các nucleocapsid tr°áng thành, có chća rcDNA sau đó đ°āc bao bãc và giÁi phóng vào máu d°ëi d¿ng virus hoàn chßnh HBV d°ßng nh° đã phát triÅn các chiÁn l°āc tinh vi cho phép virus ngăy trang bé gen cąa chúng d°ëi d¿ng minichromosome, chiÁm quyÃn điÃu khiÅn bé máy sao chép tÁ bào chą cho nhu cÅu sao chép cąa nó và che giÃu viác sÁn xuÃt virion mëi bên trong nucleocapsid

ĐÅ tránh phÁi sinh thiÁt gan, ho¿t đéng phiên mã cąa cccDNA kỳ vãng có thÅ đ°āc xác đánh gián tiÁp bằng cách đo nãng đé các thành phÅn khác cąa HBV có l°u hành trong máu nh° HbsAg, HBV DNA, HBcrAg HBV RNA nhằm măc đích đánh giá tiÁn triÅn bánh hoÁc đánh giá đáp ćng điÃu trá Trong sá đó, HBV RNA đã trá thành ćng cÿ viên tiÃm nng trong nhāng nm qua Ngoài các h¿t virus chća HBV DNA, HBV RNA có trong huyÁt t°¢ng cąa bánh nhân nhißm HBV m¿n tính rÃt có thÅ là RNA tiÃn gen đ°āc bao bãc trong các h¿t virus pgRNA huyÁt thanh đã đ°āc chćng minh là phÁn ánh l°āng pgRNA có trong toàn bé gan và do đó nãng đé cąa nó trong huyÁt thanh có thÅ đóng vai trò là dÃu hiáu thay thÁ đÅ °ëc tính sự hián dián cąa cccDNA [34]

- Thßi gian bán hąy cąa cccDNA ch°a đ°āc xác đánh rõ ràng Tuy nhiên, các nghiên cću in vitro khác biát chß ra rằng minichromosome cąa virus rÃt ån đánh trong các tÁ bào gan không phân chia á ng°ßi, n¢i nó d°ßng nh° tãn t¿i trong vòng đßi cąa tÁ bào Do đó, viác lo¿i bß cccDNA khßi gan bá nhißm bánh là mét thách thćc lën và d°ßng nh° cÅn phÁi phá hąy tÁ bào gan bá nhißm bánh hoÁc gây ra sự mÃt ån đánh đáng kÅ cąa cccDNA [41]

Hình 1.4 Quá trình hình thành cccDNA từ rcDNA

- Tính ån đánh cąa cccDNA

Các nghiên cću và sự lây nhißm đ°āc thực hián á vát và chim gõ kiÁn vëi các lo¿i Hepadnavirus liên quan đÁn HBV t°¢ng ćng cąa chúng (DHBV và virus viêm gan chuét chũi -WHV), cho thÃy rằng cccDNA có thÅ đ°āc thiÁt lÃp từ các nucleocapsid chća rcDNA mëi đ°āc tång hāp đ°āc nhÃp vào nhân tÁ bào đÅ hình thành cccDNA (tái nhÃp néi bào) ĐiÃu đáng chú ý là c¢ chÁ khuÁch đ¿i cccDNA néi bào này đã đ°āc chćng minh là đóng mét vai trò quan trãng trong giai đo¿n đÅu cąa quá trình lây nhißm á tÁ bào gan vát và chuét chũi, trong đó th°ßng phát hián đ°āc sá l°āng bÁn sao cao cąa các phân tÿ cccDNA (1-17 phân tÿ/tÁ bào á vát) và lên tëi 50 phân tÿ/tÁ bào á chuét gç Ng°āc l¿i, các nghiên cću in vitro chß ra rằng so vëi các virus liên quan đÁn HBV, sự hình thành cccDNA và khuÁch đ¿i cccDNA néi bào kém hiáu quÁ h¢n trong tÁ bào ng°ßi Mét nghiên cću thực nghiám phćc t¿p liên quan đÁn các thí nghiám chuyÅn gen giāa các loài đã cung cÃp bằng chćng cho thÃy HBV chuyÅn đåi rcDNA thành cccDNA kém hiáu quÁ h¢n DHBV trong cùng nÃn tÁ bào ng°ßi cho thÃy rằng không chß vÃt chą mà cÁ bÁn thân virus cũng kiÅm soát đéng lực hãc cccDNA và nhóm cccDNA kích th°ëc tÁ bào gan ng°ßi bá nhißm bánh ĐiÃu này cũng có thÅ phÅn nào giÁi thích sá l°āng bÁn sao cccDNA trên

mçi tÁ bào th°ßng đ°āc phát hián á bánh nhân thÃp h¢n so vëi chim chuét và vát Tuy nhiên, viác đánh l°āng chính xác sá l°āng bÁn sao cccDNA trên mçi tÁ bào là rÃt khó khn vì có thÅ có nhāng biÁn đåi từ tÁ bào này sang tÁ bào khác hoÁc trong các giai đo¿n lây nhißm khác nhau Các nghiên cću trên chuét và vát th°ßng liên quan đÁn gan, n¢i nhißm trùng không bá h¿n chÁ và mãi tÁ bào gan đÃu bá nhißm bánh, trong khi á bánh nhân có thÅ chß có mét tỷ lá tÁ bào gan bá nhißm bánh Tuy nhiên, trên chuét nhắt, tinh tinh á gan bá nhißm HBV vëi tình tr¿ng nhißm trùng không h¿n chÁ á mãi tÁ bào gan, sá l°āng cccDNA trên mçi tÁ bào vÁn á mćc thÃp (chą yÁu chß từ 1 đÁn 3 bÁn sao/tÁ bào) ngay cÁ khi nhißm trùng lâu dài [40]

- Vai trò chćc nng cąa cccDNA

+ cccDNA là mét trong nhāng thành phÅn quan trãng nhÃt cąa HBV, có thÅ tãn t¿i trong các tÁ bào gan bá nhißm HBV và có vai trò làm khuôn mÁu cho sự nhân bÁn cąa virus và đóng vai trò chính trong vòng đßi cąa virus cccDNA đ°āc t¿o ra từ rcDNA trong nhân tÁ bào gan, d°ëi d¿ng nhißm sắc thÅ nhß vëi khoÁng 3 đÁn 50 bÁn sao trên mçi tÁ bào bá nhißm bánh, sá l°āng này giÁm đi khi tÁ bào gan phân chia do sự phân bá cccDNA giāa các tÁ bào con không đãng đÃu

+ Sự khuÁch đ¿i cąa cccDNA xÁy ra trong quá trình quay vòng néi bào có thÅ đóng vai trò quan trãng trong nhißm HBV giai đo¿n đÅu

+ PgRNA đ°āc t¿o ra từ cccDNA cũng có thÅ đ°āc phiên mã ng°āc đÅ t¿o thành rcDNA đÅ nhân bÁn virus Chćc nng cccDNA đ°āc điÃu hòa mét cách m¿nh m¿ bái protein HBx và viác ćc chÁ protein HBx s¿ làm giÁm khÁ nng phiên mã cąa HBV

+ cccDNA cũng đóng mét vai trò trong viác nhißm HBV dai dẳng hoÁc tái phát viêm gan sau khi ngừng điÃu trá bằng các thuác kháng virus vì cccDNA rÃt bÃn vāng trong tÁ bào gan ng°ßi không phân chia H¢n nāa, cccDNA có thÅ

tãn t¿i trong toàn bé vòng đßi cąa tÁ bào gan, do đó nó đ°āc coi nh° là mét å chća virus dai dẳng

+ Sự dai dẳng kéo dài cąa HBV cccDNA trong gan cũng đóng mét vai trò chą yÁu trong nhißm HBV tiÃm ¿n (occult HBV infection: OBI), là tình tr¿ng thái HBV DNA có thÅ phát hián đ°āc hoÁc không thÅ phát hián đ°āc trong huyÁt thanh cąa nhāng ng°ßi xét nghiám âm tính vëi HBsAg Trong giai đo¿n nhißm HBV đÁc biát này, cccDNA á tr¿ng thái nhân bÁn thÃp, tr¿ng thái tiÃm ¿n này cąa HBV là kÁt quÁ cąa sự bÃt ho¿t biÅu sinh cąa cccDNA [40]

1.5 Các ph°¢ng pháp đånh l°ÿng HBV RNA và cccDNA

1.5.1 Một số phương pháp định lượng HBV RNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân VGBMT

Các kỹ thuÃt đánh l°āng HBV RNA đ°āc sÿ dăng hián nay c¢ bÁn đÃu dựa trên nÃn tÁng kỹ thuÃt Polymerase chain reaction – PCR và các kỹ thuÃt cÁi tiÁn dựa trên nguyên lý phÁn ćng PCR, kÁt hāp vëi phÁn ćng phiên mã ng°āc (Reverse Trancription – RT) đÅ tång hāp cDNA, nh° RT-PCR, RT-qPCR&

Nguyên lý kỹ thuật PCR truyền thống: là phÁn ćng chuçi khuÁch đ¿i vÃt

chÃt di truyÃn DNA trong áng nghiám (in-vitro) sÿ dăng hai mãi (primer) xuôi và ng°āc Thành phÅn phÁn ćng s¿ bao gãm các mãi, DNA khuôn, enzyme Taq polymerase, dNTP và các chÃt t¿o môi tr°ßng đám kèm các chÃt phă gia khác Chu trình phÁn ćng s¿ bao gãm 03 b°ëc biÁn tính, gắn mãi và kéo dài, các chu kỳ này đ°āc lÁp đi lÁp l¿i trong há tháng máy luân nhiát chuyên dăng PhÁn ćng chuçi này cho phép nhân sá l°āng đo¿n gen quan tâm theo hàm mũ luỹ thừa cąa 2 sau mçi chu kỳ (từ mét chuçi thành mét tỷ chuçi sau 30 chu kỳ) SÁn ph¿m cąa phÁn ćng PCR truyÃn tháng đ°āc phát hián/phân tích sau khi kÁt thúc toàn bé phÁn ćng SÁn ph¿m cąa phÁn ćng PCR có thÅ dùng cho nhiÃu măc đích khác nhau nh° xác nhÃn sự có mÁt cąa tác nhân gây bánh, giÁi trình tự gen trực tiÁp, t¿o dòng phân tÿ [44]

Nguyên lý phương pháp realtime PCR định lượng: Realtime PCR đánh

l°āng dựa trên viác đo tín hiáu quang liên tăc sau mçi chu kỳ trong quá trình dißn biÁn cąa phÁn ćng PCR huỳnh quang, qua đó xác đánh đ°āc nãng đé cąa l°āng DNA khuôn ban đÅu Trong phÁn ćng PCR này, bên c¿nh 2 mãi xuôi và ng°āc đÅ khuÁch đ¿i đo¿n gen quan tâm nh° trong ph°¢ng pháp PCR thông th°ßng còn có thêm mét mÁu dò đÁc hiáu có khÁ nng phát ra tín hiáu huỳnh quang khi xÁy ra phÁn ćng PCR MÁu dò đÁc hiáu này đ°āc khoá đÅu 3’ đÅ ngn không cho nó kéo dài chuçi trong phÁn ćng PCR MÁc dù, mét đÅu cąa mÁu dò này đ°āc gắn vëi mét phân tÿ phát ra tín hiáu huỳnh quang vëi b°ëc sóng xác đánh, nh°ng trong điÃu kián bình th°ßng tín hiáu huỳnh quang này bá hÃp thă hoàn toàn bái mét phân tÿ khác á đÅu còn l¿i cąa mÁu dò Trong b°ëc kéo dài chuçi cąa phÁn ćng PCR, ho¿t tính 5’-3’ exonuclease cąa enzym Taq phân cắt làm tách xa 2 đÅu cąa mÁu dò đÁc hiáu này, nhß đó mà đÅu FAM cąa mÁu dò này mëi có thÅ phát ra tín hiáu huỳnh quang mà chúng ta có thÅ đo l¿i liên tăc sau mçi chu kỳ phÁn ćng

Mét sá kỹ thuÃt că thÅ đã và đang đ°āc ćng dăng trên thÁ giëi trong các công bá và HBV RNA, gãm có:

- Kỹ thuÃt PCR/Realtime PCR dựa trên nguyên lý 3’ RACE - Kỹ thuÃt RT-qPCR

- Kỹ thuÃt Droplet digital PCR

- Mét sá kỹ thuÃt khác nh° QuantiGene, Kỹ thuÃt đánh l°āng gián tiÁp&[44], [31]

1.5.2 Một số phương pháp định lượng cccDNA trong tế bào gan

Sự tãn t¿i cąa cccDNA trong tÁ bào gan vÁn là trá ng¿i lën đái vëi viác phát triÅn các chiÁn l°āc điÃu trá triát đÅ nhißm HBV Bên c¿nh đó, viác đánh l°āng cccDNA hián vÁn còn nhiÃu thách thćc lën: (1) cccDNA có trình tự DNA giáng hát vëi các d¿ng DNA HBV néi bào và ngo¿i bào khác, bao gãm rcDNA,

Nhāng d¿ng cÃu trúc khác nhau cąa HBV DNA gây nên nguy c¢ cao cho kÁt

quÁ xét nghiám d°¢ng tính giÁ; (2) Trong mét sá tr°ßng hāp, chß có mét sá l°āng nhß tÁ bào bá nhißm bánh (ví dă: bánh nhân âm tính vëi HBeAg) hoÁc có thÅ do sá l°āng mô ít (ví dă: sinh thiÁt bằng kim nhß), cccDNA có thÅ hián dián á mćc rÃt thÃp (<1 phân tÿ cccDNA trên 1000 tÁ bào), do vÃy ph°¢ng pháp xét nghiám cÅn phÁi có đé nh¿y cao [46]; (3) Do cÃu trúc céng hóa trá bÃn vāng khép kín, cccDNA có thÅ cháng l¿i sự biÁn tính do nhiát và do đó khó đánh l°āng chính xác bằng phÁn ćng chuçi polymerase (PCR) hoÁc ph°¢ng pháp lai [47] Sá l°āng quy trình đánh l°āng cccDNA HBV và các ph°¢ng pháp đánh l°āng chúng trong tÁ bào gan đ°āc nghiên cću và công bá trên thÁ giëi hián vÁn còn h¿n chÁ

1.5.2.1 Định lượng cccDNA trực tiếp

NhiÃu kỹ thuÃt hián nay đã đ°āc phát triÅn đÅ phát hián và đánh l°āng cccDNA (bao gãm cÁ d¿ng không ho¿t đéng phiên mã), làm cho xét nghiám có đé nh¿y và đé chính xác cao h¢n so vëi các ph°¢ng pháp gián tiÁp Tuy nhiên, nhāng lo¿i xét nghiám này có tính xâm lÃn cao (lÃy mÁu mô gan) và tán nhiÃu thßi gian h¢n đÅ tiÁn hành

Hình 1.5 Mét sá ph°¢ng pháp đánh l°āng trực tiÁp cccDNA

Mét sá ph°¢ng pháp đã đ°āc sÿ dăng kÁt hāp đÅ đánh l°āng trực tiÁp cccDNA (hình 1.5) B°ëc đÅu tiên là làm giàu cccDNA HBV: tÁ bào đ°āc ly giÁi và lo¿i bß protein, DNA đ°āc tách chiÁt theo ph°¢ng pháp tąa hoÁc ph°¢ng pháp cét silica DNA đ°āc làm giàu sau đó có thÅ đ°āc đánh l°āng bằng ph°¢ng pháp lai Southern blot (phân tách DNA HBV dựa trên khÁ nng di đéng khác nhau bằng đián di trên gel agarose, sau đó chuyÅn lên màng nitrocellulose và lai vëi đÅu dò ssDNA) Ngoài ra, qPCR có thÅ đ°āc sÿ dăng đÅ đánh l°āng cccDNA trực tiÁp từ DNA tång sá, DNA đ°āc làm giàu hoÁc DNA sau khi xÿ lý enzyme (plasmid-safe DNase - PSD, exonuclease T5, exonuclease I/III hoÁc thông qua cinqPCR) cccDNA cũng có thÅ đ°āc phát hián trực tiÁp bằng ph°¢ng pháp lai huỳnh quang in situ (FISH): các tÁ bào mÁu đ°āc cá đánh và gắn kÁt tr°ëc khi xÿ lý đÅ lai DNA vëi đÅu dò đánh dÃu huỳnh quang, quan sát d°ëi kính hiÅn vi mißn dách huỳnh quang

FISH Có thÅ quan sát vá trí cąa

cccDNA - Tán thßi gian và phćc

qPCR Đ¢n giÁn, đé nh¿y cao,

rẻ Phát hián không đÁc hiáu các d¿ng trung gian cąa HBV

[50], [51] qPCR + PDS Lo¿i bß hiáu quÁ

dslDNA Không hiáu quÁ trong viác lo¿i bß rcDNA và DNA

- ThiÁu DNA bé gen ng°ßi đÅ sÿ dăng cho quá trình chu¿n hóa sá bÁn copy

[51]

Ph°¢ng pháp ¯u điÃm Nh°ÿc điÃm Nguán

- ThiÁu DNA bé gen ng°ßi đÅ sÿ dăng cho quá

Làm giàu DNA: Mét sá kỹ thuÃt s¿ cÅn đ°āc sÿ dăng đÅ làm giàu cccDNA cąa

HBV, qua đó cÁi thián tính đÁc hiáu khi sÿ dăng các ph°¢ng pháp xét nghiám đánh l°āng cccDNA HBV DNA tång sá th°ßng đ°āc tách chiÁt bằng cách ly giÁi tÁ bào và tiêu hóa protein, sau đó tách DNA khßi RNA và protein (ví dă: ph°¢ng pháp phenol/chloroform hoÁc ph°¢ng pháp cét silica) Nh° vÃy, nÁu bß qua quá trình xÿ lý proteinase K, các d¿ng DNA gắn protein (ví dă nh° rcDNA HBV) s¿ đ°āc lo¿i bß trong quá trình tách chiÁt

Bên c¿nh đó, quy trình tách chiÁt theo ph°¢ng pháp Hirt cũng th°ßng đ°āc sÿ dăng trong đánh l°āng cccDNA HBV Ph°¢ng pháp Hirt là ph°¢ng pháp tách chiÁt có chãn lãc DNA trãng l°āng phân tÿ thÃp, không chća protein, bao gãm cccDNA và rcDNA bá khÿ protein Ph°¢ng pháp này bao gãm viác ly giÁi tÁ bào trong dung dách đám ly giÁi/kÁt tąa muái không có proteinase K và tách chiÁt DNA từ phÅn dách nåi phía trên bằng phenol/chloroform, sau đó là kÁt tąa DNA bằng ethanol Mét sô nghiên cću cũng cÁi tiÁn quy trình Hirt ban đÅu