tuyển chọn chủng vi khuẩn đất có khả năng sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn thuốc enterococci và streptococci

Trong nghiên cứu này, nhóm vi khuẩn đất sinh trưởng chậm được phân lập thông qua môi trường dịch chiết đất nhằm thu nhận được nguồn gen vi khuẩn mới tiềm năng cho phát hiện kháng sinh tự

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN MINH HẰNG

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ĐẤT CÓ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN KHÁNG THUỐC

ENTEROCOCCI VÀ STREPTOCOCCI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên, 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN MINH HẰNG

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ĐẤT CÓ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN KHÁNG THUỐC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của thầy giáo TS Nguyễn Mạnh Tuấn và TS Trương Phúc Hưng Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Mọi sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể đều được ghi nhận trong lời cảm ơn

Thái Nguyên, ngày… tháng… năm 2022

Học viên

Trần Minh Hằng

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và chân thành, tôi xin cảm ơn:

Quý thầy, cô Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học

Thầy TS Nguyễn Mạnh Tuấn, trường Đại học Nông Lâm; TS Trương Phúc Hưng, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã tận tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Ban Giám đốc Trung tâm Y tế huyện Đại từ, cùng tập thể cán bộ khoa

Xét nghiệm đã tận tình giúp đỡ tôi để tôi hoàn thành kết quả luận văn này

Tập thể các bạn lớp cao học K14A1 – Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học và làm luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2022

Học viên

Trần Minh Hằng

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tóm lược lịch sử khám phá kháng sinh 3

1.2 Đặc điểm sinh học của Enterococci và Streptococci 5

1.3 Cơ chế kháng thuốc của các chủng Enterococci và Streptococci 6

1.4 Cơ chế tác động của kháng sinh đến Enterococci và Streptococci 8

1.4.1 Ức chế sinh tổng hợp thành tế bào 8

1.4.2 Ức chế sinh tổng hợp protein 8

1.4.3 Ức chế sao chép DNA 9

1.4.4 Ức chế chuyển hóa axít folic 9

1.5 Kỹ thuật tách dòng phân tử trong nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh và

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Mẫu đất 19

2.1.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định 20

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 20

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu đất 20

2.3.2 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn đất 20

2.3.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh hoạt chất kháng khuẩn 21

2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA tổng số và nhân trình tự gen 16S rRNA của chủng phân lập 21

2.3.5 Phương pháp phân loại và xây dựng sơ đồ phả hệ 23

2.3.6 Phương pháp xác định đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45 23

2.3.7 Phương pháp tách chiết hoạt chất kháng khuẩn tổng số 24

2.3.8 Phương pháp đánh giá hoạt chất kháng khuẩn (MIC90) 24

2.3.9 Nhận diện hoạt chất KKTS bằng sắc ký bản mỏng và hệ thống sắc khối phổ 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh trưởng chậm có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn 26

3.2 Định danh phân tử chủng BPTC-45 28

3.3 Đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45 32

3.3.1 Khả năng sinh trưởng và mầu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, sắc tố tan 32

3.3.2 Môi trường thích hợp cho sinh hoạt chất kháng khuẩn 34

3.4 Tách chiết và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tổng số của của chủng

BPTC-45 35

3.5 Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng hệ thống sắc khí khối phổ (GC-MS) 37

3.5.1 Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng 37

3.5.2 Phân tích hoạt chất kháng khuẩn tổng số bằng GCMS 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 42

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

CCARM: Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes CFU: Colony Forming Units

ISEM: Intensive soil extract medium ISP: International Streptomyces Project

KKTS: Kháng khuẩn tổng số MDR: Multidrug Resistant

MIC: Minimum inhibitory concentration

MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

TLC: Thin-layer chromatography

VRE: Vancomycin-resistant Enterococcus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập bằng phương pháp cấy chấm điểm 26 Bảng 2 Kết quả so sánh mức độ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA của

chủng BPTC-45 với các loài đã công bố trên EzTxon 29 Bảng 3 Đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45 trên các loại môi trường khác nhau ở 21 ngày nuôi cấy ở 28oC 32 Bảng 4 Giá trị MIC90 của hoạt chất kháng khuẩn tổng số tách chiết từ dịch

lên men của chủng BPTC-45 36 Bảng 5 Các hoạt chất có trong dịch chiết KKTS của chủng BPTC-45 39

Hình 3 Sơ đồ phả hệ dựa vào trình tự gen 16S rRNA của chủng BPTC-45 với

các loài gần nhất của chi Streptomyces; Kitasatospora setae

KM-6054T (AB022868) là loài ngoài chi Streptomyces 31 Hình 4 Đặc điểm nuôi cấy của chủng BPTC-45 trên các loại môi trường ở

28oC, 21 ngày Thanh bar: 0,5 cm 33 Hình 5 Khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng BPTC-45 trong các

môi trường Dịch lên men (15 µl/khoanh giấy cho mỗi loại môi

trường) 34 Hình 6 Hoạt tính kháng khuẩn tổng số của chủng BPTC-45 (a), ức chế vi

khuẩn E faecium CCARM 5024 (b) 35 Hình 7 Phân tách các phân đoạn có trong hoạt chất KKTS bằng TLC 38 Hình 8 Nhận diện các hoạt chất tách chiết từ dịch lên men của chủng

BPTC-45 bằng GS-MS 40

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Enterococci và Streptococci thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, có mặt

ở trong ruột, da của vật chủ, là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn đường mật, viêm phúc mạc thứ phát, viêm bể thận cấp, , đặc biệt khả năng lây lan nhanh

ở các bệnh viện Hiện nay, các loài Enterococcus và Streptococci đa kháng

thuốc xuất hiện ở hầu hết các quốc gia/vùng lãnh thổ trên toàn thế giới Hậu quả để lại của tính kháng thuốc thường rất nghiêm trọng và là tác nhân gây ra các bệnh thứ phát Theo ước tính có khoảng 8,6 triệu người bị chết bởi các vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc hàng năm trên toàn thế giới; và dự đoán đến năm 2050 sẽ khoảng 10 triệu người chết/năm nguyên nhân đến từ vấn đề vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (de Kraker và cs, 2016).

Nước ta thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thuận lợi các các loài vi sinh vật sinh trưởng, trong đó có các các loài vi khuẩn gây bệnh Theo kết quả về tình hình kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện lớn ở nước ta cho thấy các loài của

Enterococci có khả năng kháng Ampicilin, Vancomycin, Erythromycin và

Ciprofloxacin lần lượt là 28,6; 5,3; 70; và 30%; trong khi có tới 71,4% số loài

Streptococci kháng penicillin và kháng erythromycin (chiếm 92.1%) (Vu và

cs, 2019; Vu và cs, 2021) Chính vì vậy, nước ta nằm trong các nước có tỷ lệ

kháng thuốc cao nhất thế giới, các “siêu vi khuẩn” Enterococci và Streptococci kháng thuốc xuất hiện ở hầu hết ở các bệnh viện trong cả nước

Hầu hết kháng sinh tự nhiên gốc từ vi khuẩn đất, mở ra thời kỳ “vàng” cho khám phá kháng sinh vào những năm 1950-1960 Tuy nhiên sau thời nay này số lượng các kháng sinh tự nhiên được phát hiện có xu hướng giảm mạnh, trong khi nguồn bệnh đa kháng thuốc lại cho chiều hướng ngược lại Giải pháp tìm kiếm các nguồn gen vi khuẩn đất tiềm năng mới được gợi ý cho việc thúc đẩy phát hiện các kháng sinh tự nhiên (Pham và Kim, 2012; Hug và công sự, 2016; Ling và cộng sự, 2015; Lewis, 2017)

Trong đất chứa đựng khoảng 107

~1010 tế bào vi khuẩn/gram Tuy nhiên, mới chỉ có khoảng 1% cộng đồng vi khuẩn đất được nuôi cấy thành công, cũng như xác định được các đặc tính sinh học trong trong phòng thí nghiệm (Hug và công sự, 2016; Ling và cộng sự, 2015) Sự thiếu các nhân tố cảm ứng của tự nhiên ở đó các vi khuẩn sinh sống trong môi trường nuôi cấy nhân tạo là một nguyên nhân chính cần được khắc phục để thu nhận được các nguồn gen vi khuẩn sinh kháng mới Các phương bổ sung các nhân tố tự nhiên trong môi trường nuôi cấy đã được thiết lập, tuy nhiên ở nhiệt độ khử trùng cao có thể làm biến tính các nhân tố hỗ trợ sinh trưởng (đặc biệt là các loại vitamin) cho các chủng vi khuẩn trong phòng thí nghiệm Kết quả là, thu nhận nguồn gen vi khuẩn tiềm năng mới cho nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn tự nhiên còn nhiều hạn chế

Trong nghiên cứu này, nhóm vi khuẩn đất sinh trưởng chậm được phân lập thông qua môi trường dịch chiết đất nhằm thu nhận được nguồn gen vi khuẩn mới tiềm năng cho phát hiện kháng sinh tự nhiên và từng bước kiểm

soát bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Enterococci và Streptococci gây ra

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn và xác định được đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn

đất sản sinh hoạt chất kháng Enterococci và Streptococci

Xác định được các hoạt chất sinh học sản sinh trong dịch lên men của

chủng vi khuẩn kháng Enterococci và Streptococci

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh trưởng chậm có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn

- Định danh phân tử chủng phân lập - Đặc điểm nuôi cấy của chủng phân lập

- Tách chiết và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tổng số

- Phân tích hoạt tính kháng khuẩn tổng số bằng sắc ký bản mỏng và hệ thống sắc khí khối phổi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tóm lược lịch sử khám phá kháng sinh

Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất được chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn

Theo quan niệm truyền thống, kháng sinh được định nghĩa là những chất do các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) tạo ra có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng sinh cũng thay đổi, hiện nay kháng sinh được định nghĩa là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học Với liều thấp nhất có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh (Bộ Y tế, 2015)

Chất kháng sinh (antibiotic) được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin, vào những năm 40 của thế kỷ XX Tuy nhiên, thực tế, từ lâu con người đã biết dùng nấm mốc (mold, milew) trên đậu phụ để đắp chữa các vết thương nhỏ Nhiều thế kỷ trước tại châu Âu, châu Mỹ, người ta đã biết cách dùng bánh mỳ, ngô hay giày da cũ đã lên mốc để điều trị các vết lở loét, lên mủ ở da Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì móc meo trên đậu phụ hay trên bánh mỳ thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết vi khuẩn, chân khuẩn là gì, lại càng không biết chất kháng sinh là gì

Năm 1928, Flemming là nhà vi khuẩn học làm việc tại Bệnh viện Saint Mary ở London Trong khi kiểm tra các đĩa nuôi cấy chứa vi khuẩn, ông phát hiện hiện tượng khác thường: nấm xuất hiện trên đĩa và phát triển thành các tảng nấm; xung quanh tảng nấm, những mảng vi khuẩn đã bị phá hủy Ông kết luận rằng, nấm này đã tạo 1 chất giết chết các vi khuẩn Loại nấm mọc

giống như dạng các bụi cây này sau được đặt tên khoa học là penicillium

notatum, còn chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn được đặt là pennicillin Ban

đầu, penicillin được dùng chữa các vết thương bề mặt, nó chỉ mang lại thành công nhất định vì trong penicillin thô có rất ít các hoạt chất Flemming đã cố gắng tách penicillin nguyên chất nhưng không thành công 10 năm sau, ở Oxford, dưới sự chỉ đạo của Howara Walter Florey - nhà giải phẫu bệnh học người Australia và Ernst Boris Chain đã nghiên cứu với mục đích là chế tạo penicillin trên quy mô công nghiệp Nhiều kỹ thuật như dùng tia cực tím, tia X và các chất hóa học tác động đến cấu trúc di truyền của nấm đều được sử dụng nhằm tạo ra chủng penicillin với sản lượng cao Năm 1943, dự án chế tạo penicillin đứng thứ nhì trong danh sách các công trình ưu tiên sau dự án Mahattan chế tạo bom nguyên tử

Sau Chiến tranh thế giới thứ 2, cùng với bước tiến lớn trong khoa học kỹ thuật, nhiều loại thuốc kháng sinh đã lần lượt được tạo ra và phát triển mạnh mẽ Chính penicilin đã hối thúc các nhà khoa học lao vào nghiên cứu, khám phá ra các loại thuốc kháng sinh mới Họ không sợ vất vả hay nguy hiểm để tìm chọn các loại khuẩn mới từ những nơi dơ bẩn nhất như trong đất mùn, nước cống rãnh hôi thối và đống rác sinh hoạt đã bốc mùi… bởi họ cho rằng càng ở những nơi như vậy thì mới càng có nhiều loại khuẩn ký sinh và việc thu thập hay chọn lựa mới mang lại nhiều hiệu quả Khi đó có thể được gọi là đã mở ra một “cơn sốt” tìm thuốc kháng sinh trong đống rác trên toàn thế giới, chủ yếu lúc bấy giờ là tại phương Tây Kết quả là chỉ trong một thời gian ngắn, nhiều loại thuốc kháng sinh đã ra đời, đáng kể đó là streptomycin, neomycin, erythromycin… Trên kinh nghiệm bào chế penicilin nên việc phát hiện và sản xuất các loại kháng sinh mới khác gặp nhiều thuận lợi Tuy vậy các nhà khoa học cũng đã bỏ ra khá nhiều công sức Có thể nói mỗi sản phẩm mới đều là sự nổ lực hết mình của họ Sự ra đời của streptomycin là một ví dụ, các nhà khoa học đã sàng lọc từ hơn 10.000 chủng vi khuẩn (Comroe, 1978).

Từ thập niên 60 của thế kỷ trước tới nay, nhiều công trình nghiên cứu thuốc kháng sinh phát triển theo chiều sâu Chloromycetin (pasaxin) là loại thuốc kháng sinh đầu tiên dùng phương pháp tổng hợp hóa học bào chế nên Từ thập niên 80 của thế kỷ trước, các công trình nghiên cứu bào chế kháng sinh đã có nhiều bước tiến vượt bậc và đã đưa vào sử dụng loại thuốc kháng sinh đa năng mới bằng phương pháp bán tổng hợp là cephalosperin (cynnematin) Chỉ riêng mỗi loại này hiện cũng đã có hơn 30 chủng khác nhau Hằng năm, số lượng các thuốc kháng sinh mới được đưa ra thị trường lên đến hàng chục và tính đến nay số loại kháng sinh có thể đến hàng ngàn Ước tính đến nay, con người biết được khoảng 8000 loại kháng sinh, trong đó khoảng 100 loại được sử dụng trong y học

1.2 Đặc điểm sinh học của Enterococci và Streptococci

Enterococci: là các cầu khuẩn gram dương thuộc Firmicutes, xếp

*

thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn Enterococci được biết tới là loài vi khuẩn

gây bệnh sinh trưởng nhanh, được tìm thấy trên cả cở thể người, động vật và trong muôi trường (đất, nước) (Byappanahalli và cộng sự, 2012) Các loài

Enterococci có khả năng thích nghi tốt với điều kiện sống bất lợi, sinh trưởng

từ 10-45oC, chống chịu được 6,5% muối Bên cạnh đó chủng có khả năng sống sót ở 60oC trong 30 phút (Byappanahalli và cộng sự, 2012; Wu và cộng

sự, 2021) Các chủng Enterococci kháng thuốc vancomycin (VRE,

vancomycin-resistant Enterococcus) là một trong những nguồn bệnh truyền nhiễm đặc biệt nghiêm trọng ở người cần phải có giải pháp hiệu quả quyết khẩn cấp (WHO, 2017)

Ampicillin, gentamicin, vancomycin, penicillin, hoặc tetracyclin là

những kháng sinh hiệu quả được sử dụng để điều trị bệnh truyền nhiễm nguyên

nhân bởi các chủng Enterococci gây bệnh Tuy nhiên, trong những năm trở lại đây, các chủng Enterococcus đã tiến hóa nhanh, cho phép chúng kháng lại hầu

hết các kháng sinh thuộc nhóm Beta-Lactam như ampicilin, penicilin, kể cả các kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ 3 và thứ 4 (WHO, 2017)

Streptococci: dạng hình cầu (hay còn gọi là liên cầu khuẩn), khuẩn lạc

*

đường kính 1 mm, Gram dương, thường xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau, có thể đứng đôi hoặc riêng lẻ Vi khuẩn không có tiêm mao, không tạo nha bào Nhiều chủng thuộc nhóm A và C tạo vỏ axit hyaluronic, kích thước 0,6-1 µm Liên cầu là những vi khuẩn hiếu kị khí tùy ý, chỉ phát triển tốt ở môi trường có máu hoặc có các dịch của cơ thể khác Những chủng gây bệnh thường đòi hỏi nhiều yếu tố phát triển Phần lớn liên cầu tan máu gây bệnh phát triển tốt ở 37oC Các liên cầu ruột phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ từ 10-40oC Ở môi trường lỏng vi khuẩn dễ tạo thành các chuỗi, sau 24 giờ vẫn trong và có những

hạt, những cụm dính vào thành ống sau đó lắng xuống đáy ống Streptococci

kháng hầu hết các loại kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam (kể cả kháng sinh thế hệ thứ 3 và 4) (Passàli và cộng sự, 2007; Hayes và cộng sự, 2020)

1.3 Cơ chế kháng thuốc của các chủng Enterococci và Streptococci

Cơ chế kháng với chất kháng khuẩn bởi Enterococci và Streptococci

diễn ra rất phức tạp và có thể xuất hiện trong cùng một chủng vi khuẩn thúc đẩy kiểu hình kháng đa thuốc, nhưng có các đặc điểm kiểu gen và kiểu hình chính có thể được phân nhóm sau đây:

(i) Bất hoạt enzym của kháng sinh, ví dụ, β-lactamase (Munita và cộng

sự, 2016; Vargiu và Nikaido, 2012; Blair và cộng sự, 2015);

(ii) Các sửa đổi của mục tiêu kháng khuẩn ngăn cản sự gắn kết hiệu quả của kháng sinh, thường là kết quả của các đột biến tự phát, bao gồm các biến thể gen và RNA (ví dụ, đột biến rRNA liên quan đến việc đề kháng với một số loại kháng sinh) (Malbruny và cộng sự, 2002; Gomez và cộng sự., 2017);

(iii) Ngăn cản kháng sinh tiếp cận mục tiêu, ví dụ do tế bào giảm hấp thu do giảm tính thấm màng ngoài trong các máy bơm dòng chảy Gram âm

hoặc tích cực làm tăng độ đào thải từ bên trong tế bào (Petchiappan và Chatterji, 2017)

Các yếu tố di truyền “di động” (MGE) của Enterococci và Streptococci

như plasmid được chứng minh là điểm mấu chốt dẫn đến sự xuất hiện của các chủng đa kháng thuốc (MDR) (Lehtinen và cộng sự, 2019) Các cơ chế chính của sự hấp thụ DNA ở vi khuẩn là tiếp hợp, tải nạp và biến nạp, các cơ chế này phải được theo sau bởi sự tái tổ hợp để cho phép đưa vào nhiễm sắc thể một cách ổn định Các MGE này là các yếu tố tự truyền phổ biến ở vi khuẩn Ngoài các gen liên quan đến khả năng di chuyển, điều chỉnh hoặc duy trì, MGE truyền tải các gen kháng thuốc kháng sinh và các yếu tố độc lực, chẳng hạn như ngoại độc tố (Haenni và cộng sự, 2010) Chuyển gen theo chiều ngang (HGT) có thể điều chỉnh sự tương tác giữa vật chủ và mầm bệnh và mở rộng phạm vi vật chủ Công cụ giải trình tự đã chứng minh về hoạt động của

HGT S pyogenes, sự trao đổi bên của các gen độc lực, qua trung gian lây

nhiễm của xạ khuẩn, là một yếu tố rất quan trọng trong việc đa dạng hóa loài Hơn nữa, các đại thực khuẩn có thể chuyển tải các gen cung cấp lợi thế chọn lọc cho vật chủ, do đó thúc đẩy sự kháng kháng sinh phổ biến của chúng (Colomer-Lluch và cộng sự, 2011; Von Wintersdorff và cộng sự, 2016)

Nhiều yếu tố quyết định khả năng kháng thuốc thường xuất hiện trên một plasmid R đơn lẻ (chứa một số gen kháng thuốc kháng sinh), do đó các vi khuẩn có thể chia sẻ nhiều yếu tố đề kháng trong trường hợp tiếp hợp đơn lẻ (Nikaido, 2009) Nhiều plasmid R này chứa các gen kháng lại các loại kháng sinh chính, như aminoglycosid, macrolid, phenicol và tetracycline (Nikaido, 2009)

Streptococcus chứa nhiều plasmid khác nhau liên quan đến việc chuyển

độc lực và kháng kháng sinh (Grohmann và cộng sự, 2003; Cook và cộng sự, 2013) Ngoài plasmid, nhiều loại chuyển vị đã được phân lập trong liên cầu khuẩn (Brenciani và cộng sự, 2007; Fléchard và Gilot, 2014), cụ thể là các chuyển vị họ Tn3, các chuyển vị tổng hợp và liên hợp Ví dụ, Tn916, mã hóa

tetM cho protein bảo vệ ribosome TET (M), liên quan đến việc chuyển độc lập tính kháng giữa nhiều chủng thông qua một plasmid, bao gồm

Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae (Haenni và cộng sự, 2010; Fléchar d và Gilot, 2014;

Osei Sekyere và Mensah, 2019), hoạt động như một ổ chứa các gen kháng kháng sinh chức năng

1.4 Cơ chế tác động của kháng sinh đến Enterococci và Streptococci

Đến nay có khoảng hơn 1000 loại hoạt chất kháng khuẩn được sử dụng trong y học, chúng tác động tới các nguồn bệnh theo các cơ chế sau đâu:

1.4.1 Ức chế sinh tổng hợp thành tế bào

Tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi một thành tế bào bởi peptidoglycan, bao gồm các polyme đường dài Peptidoglycan trải qua liên kết chéo của các sợi glycan do tác động của transglycosidase, và các chuỗi peptit kéo dài từ đường trong polyme và tạo thành các liên kết chéo, peptit này sang peptit khác Phần D-alanyl-alanin của chuỗi peptit được liên kết chéo bởi các gốc glyxin với sự hiện diện của các protein liên kết penicilin (PBP) Liên kết ngang này tăng cường sức mạnh của thành tế bào β-lactam và glycopeptide ức chế sự tổng hợp thành tế bào (Reynolds, 1989; Kahne và cộng sự, 2005)

1.4.2 Ức chế sinh tổng hợp protein

Đầu tiên, thông tin trong DNA của vi khuẩn được sử dụng để tổng hợp một phân tử RNA được gọi là RNA thông tin (mRNA) Sau đó, cấu trúc đại phân tử được gọi là ribosome tổng hợp các protein có trong mRNA, một quá trình được gọi là dịch mã Quá trình sinh tổng hợp protein được xúc tác bởi ribosome và các yếu tố tế bào chất Ribosome 70S của vi khuẩn bao gồm hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein, tiểu đơn vị 30S và 50S Các chất kháng khuẩn ức chế sinh tổng hợp protein bằng cách nhắm mục tiêu vào tiểu đơn vị 30S

hoặc 50S của ribosome vi khuẩn (Vannuffel và cộng sự, 1996; Johnston và Mukhtar, 2002)

1.4.3 Ức chế sao chép DNA

Các fluoroquinolones (FQ) ức chế enzyme DNA gyrase của vi khuẩn, enzyme này cắt DNA sợi đôi, tạo ra các siêu mạch âm tính và sau đó hàn gắn các đầu bị cắt lại Điều này là cần thiết để ngăn chặn sự chồng chất tích cực quá mức của các sợi khi chúng tách rời nhau để cho phép sao chép hoặc phiên mã DNA gyrase bao gồm hai tiểu đơn vị A và hai tiểu đơn vị B Tiểu đơn vị A thực hiện quá trình phân tách DNA, tiểu đơn vị B giới thiệu các siêu mạch âm tính, và sau đó tiểu đơn vị A nối lại các sợi FQ liên kết với một tiểu đơn vị có ái lực cao và gây trở ngại cho chức năng cắt và nối sợi của nó Ở vi khuẩn Gram dương, mục tiêu chính của hoạt động là topoisomerase IV, nó sẽ cắt và tách sợi DNA con của nó sau khi sao chép DNA Ái lực lớn hơn với enzym này có thể mang lại hiệu lực cao hơn chống lại vi khuẩn Gram dương Thay cho DNA gyrase hoặc topoisomerase IV, tế bào động vật có vú sở hữu topoisomerase II, có ái lực rất thấp với FQ, do đó độc tính thấp đối với tế bào (Wise, 1999; Higgins và cộng sự, 2003; Yoneyama và Katsumata, 2006)

1.4.4 Ức chế chuyển hóa axít folic

Kháng sinh ức chế các bước riêng biệt trong quá trình chuyển hóa axít folic Sự kết hợp của thuốc sulpha và trimethoprim hoạt động ở các bước riêng biệt trên cùng một con đường sinh tổng hợp cho thấy sức mạnh tổng hợp và giảm tỷ lệ đột biến đối với kháng thuốc Sulfonamit ức chế enzym tổng hợp dihydropteroat theo cách cạnh tranh có ái lực với enzym cao hơn so với cơ chất tự nhiên là axit p-amino benzoic Các tác nhân như trimethoprim hoạt động ở giai đoạn sau của quá trình tổng hợp axit folic và ức chế enzym dihydrofolate reductase (Yoneyama và Katsumata, 2006)

1.5 Sử dụng kỹ thuật phân tử trong phát hiện kháng sinh từ vi sinh vật

Không cần đến các chủng vi sinh vật thuần khiết, các nhà khoa học vẫn có thể khám quá các hoạt chất trao đổi tiềm năng trực tiếp từ môi trường tự nhiên thông qua: (1) Kỹ thuật metagenomic cho phép thu nhận hầu như tất cả DNA của các loài có trong môi trường tự nhiên (bao gồm cả các chủng thuộc nhóm “uncultured bacteria”), từ đó sàng lọc, phát hiện các gen/đám gen mã hóa (BGCs/biosynthetic gene clusters) cho các hoạt chất sinh học tiềm năng Kỹ thuật này được báo cáo đầu tiên bởi Handelsman và cộng sự (1998); (2) Hoặc thông qua kỹ thuật single cell sequencing, Raghunathan và cộng sự (2005) đã chứng mình hoàn toàn có thể khuếch đoại DNA mẫu được phân lập

từ một tế bào đơn (Escherichia coli ATCC 10798) lên hàng tỷ lần thông qua

phản ứng nhiều khuếch đại dịch chuyển (Multiple displacement amplification/MDA, được phát triển bởi Dean và cộng sự (2001), Dean và cộng sự (2002) Đây là những thành tựu nổi bật nhất, mở đường cho tìm kiếm các chất sinh học mà không cần đến các chủng nuôi cấy, phân lập thuần khiết

Thông qua các kỹ thuật phân tử được mô tả ở trên, các đoạn gen hoặc đám gen chức năng quan tâm được sàng lọc; một trong những vấn để tiếp theo là phải xây dựng thành công thư viện Mặc dù đa dạng hệ thống vecter tách dòng được phát triển cho phép chèn bất kỳ đoạn gen quan tâm tùy thuộc vào kích thước gen cần chèn như plasmid hoặc cosmid hoặc posmid hoặc nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC/Bacterial Artificial Chromosome) Tuy nhiên đối với các đoạn gen có kích thước lớn hơn 40kb thì công việc rất phức tạp, đòi hỏi kinh nghiệm lão luyện trong tách dòng phân tử (Daniel, 2005) Tiếp theo đó, vector chứa đựng gen mong muốn phải được biểu hiện thành công trong các vật chủ phù hợp như Escherichia coli hoặc các chủng

thuộc chi Streptomyces hoặc chi Pseudomonas hoặc các vật chủ khác Về mặt

lý thuyết, khoảng 40% gen được biểu hiện thành công (Gabor và cộng sự, 2004), nhưng trong thực nghiệm hiệu suất biểu hiện gen thường thấp và khó

kiểm soát, nó phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như sao chép số lượng bản sao (Daniel, 2005), sự hoạt động của promoter của vector với gen ngoại lai, (Miesel và cộng sự, 2003; Daniel, 2005; Galm & Shen, 2006), hoặc lựa chọn tế bào chủ thích hợp, sự điều khiển sinh tổng hợp protein trong tế bào chủ mới và môi trường lên men thích hợp (Galm & Shen, 2006) Mức độ mức tạp của công việc sẽ tăng lên theo kích thước đoạn gen chức năng hoặc số lượng các gen cùng mã hóa sinh tổng hợp cho một chất sinh học Chính vì sự phức tạp và đòi hỏi kỹ năng lão luyện của các nhà khoa học, đến nay thành tựu tiềm kiếm kháng sinh được tạo ra theo con đường này mới chỉ dừng lại ở mức độ nhất định; Wang và cộng sự (2000) đã tìm ra 5 loại kháng sinh mới (Terragine A/B/C/D và E) thông qua sàng lọc thư viện DNA trong đất, sử dụng tế bào

chủ Streptomyces lividans Hai năm sau, Gillespie và cộng sự (2002) đã sàng

lọc và biểu hiện thành công hai kháng sinh Turbomycin A và Turbomycin B; tuy nhiên nhóm tác giả đã phải tiêu tối khá nhiều thời gian, ngân sách, Cụ thể, để phát hiện hai loại kháng sinh này các nhà khoa học phải tiến hành sàng lọc từ hơn 24.000 gen trong thư viện tách dòng Ở đây, các gen được biểu hiện mã hóa cho sinh tổng hợp kháng sinh Terragine (Wang và cộng sự, 2000) và Turbomycin (Gillespie và cộng sự, 2002) đề cập ở trên có kích thước ngắn (<30 kb),

1.6 Tổng quan nghiên cứu trong nước và trên thế giới

1.6.1 Thế giới

Trong môi trường sống đất chứa đựng và cung cấp phức hợp các yếu tố (đa vi lương, vitamin, các yếu tố cảm ứng sinh trưởng và rất nhiều các yếu tố chưa biết) và dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh trưởng; nhưng lại thiếu trong các môi trường nhân tạo Dẫn đến phần lớn các chủng vi khuẩn không thể sinh trưởng trên các môi trường nhân tạo Sử dụng công cụ sinh phân tử hiện đại metagenomic hoặc pyrosequencing để khám phá mức độ đa dạng cộng đồng vi khuẩn trong đất thông qua phân tích các trình gen bảo thủ 16S

rRNA, các nhà khoa học đã đi đến kết luận rằng chúng ta mới chỉ nuôi cấy thành công dưới 1% trong tổng số cộng động vi khuẩn, phần lớn số còn lại

(>99%) các chủng vi khuẩn không thể sinh trưởng trong môi trường dinh

dưỡng đĩa thạch nhân tạo thông thường (Kaufmann, Schaible, 2005; Nguyen và công sự, 2018) Năm 2015, Ling và cộng sự đã tìm ra một kháng sinh mới, tên là Teixobactin được tách chiết từ một vi khuẩn đất thuộc lớp Beta-proteobacteria Đối chiếu với tiêu chuẩn quốc tế về hoạt tính kháng sinh theo Clinical and Laboratory Standards Institute/CLSI (2015), Teixobactin thể hiện hoạt tính nhạy cảm ức chế sinh trưởng đa dạng các loại vi khuẩn được kiểm tra, kể cả các chủng kháng thuốc, cụ thể Teixobactin có khả năng tiêu diệt

Staphylococcus aureus (MRSA/vi khuẩn kháng methicillin) ở 0,25 µg/ml; Enterococcus faecalis (VRE/vi khuẩn kháng vancomycin) ở 0,5 µg/ml; Enterococcus faecium (VRE) ở 0,5 µg/ml; Streptococcus pneumoniae (kháng penicillin) ở nồng độ ≤ 0,03 µg/ml; Streptococcus pyogenes (0,06 µg/ml); Streptococcus agalactiae (0,12 µg/ml); nhóm Streptococci (0,12 µg/ml); Bacillus anthracis (≤ 0,06 µg/ml); Clostridium difficile (0,005 µg/ml); Propionibacterium acnes (0,08 µg/ml); Mycobacterium tuberculosis H37Rv

(0,125 µg/ml), Teixobactin được các nhà khoa học và quản lý kỳ vọng sẽ có vai trò tích cực trong việc ngăn chặn vấn đề kháng thuốc hiện hành, cũng như nâng cao sức khỏe cộng đồng trong tương lại gần

Hughes và cộng sự (2020) đã phát hiện ra chất kháng khuẩn mới, được gọi là Novo29 thuộc loại depsipeptit mới, được tổng hợp từ vi khuẩn đất nhóm beta-proteobacterium chưa được nuôi cấy trước Novo29 ức chế tổng hợp peptidoglycan bằng cách thúc đẩy liên kết với lipid II và lipid III, đó là cơ chế hoạt động tương tự của teixobactin Thử nghiệm in vitro, giá trị MIC của Novo29 nằm trong khoảng từ 0,25 đến 2 µg/ml đối với nhiều bệnh nhiễm

trùng kháng thuốc bao gồm MRSA, VRE faecium, VRE faecalis, M tuberculosis, và các vi khuẩn Gram dương khác

1.6.2 Trong nước

WHO xếp Việt Nam vào nhóm các nước có tỉ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới (McKinn và cs, 2021) Chính do tình trạng sử dụng kháng sinh tại nhà tràn làn như vậy nên hiện nay ngay tại các bệnh viện tình trạng kháng thuốc đang rất phức tạp Có những loại thuốc mới đưa vào thị trường Việt Nam chưa đầy 10 năm đã giảm độ nhạy cảm với vi khuẩn và làm giảm hiệu quả điều trị với thuốc rất lớn

1.6.2.1 Hiện trạng kháng kháng sinh

Hiện nay, kháng thuốc không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi phải có sự nỗ lực tổng hợp nhằm giúp nhân loại tránh khỏi nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh Tổ chức Y tế Thế giới nhận định, chúng ta đang sống trong kỷ nguyên phụ thuộc kháng sinh và yêu cầu toàn cầu có trách nhiệm bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh quý giá cho thế hệ sau Một số nghiên cứu cho thấy:

Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong bệnh viện ở Việt Nam theo báo cáo của ASTS (Chương trình theo dõi kháng kháng sinh) của nước ta năm

2006 bao gồm các vi khuẩn: E Coli, Klebsiella, Streptococcus, Enterococuss, A baumannii, Staphylococcus aureus … Hiện nay các vi khuẩn nêu trên đã có tỷ lệ kháng rất cao với các kháng sinh thường dùng, cụ thể là với E Coli

các kháng sinh hay sử dụng để điều trị là gentamicin và cefotaxim đã bị kháng lần lượt là 51% và 50,3% Tụ cầu vàng kháng methiciline là 41,7%,

đây chính là các chủng MRSA (Staphylococcus aureus kháng methicillin) (Lê Thị Hiền và cs, 2014) Đặc biệt với A baumannii, một căn nguyên nhiễm

trùng 16 bệnh viện hàng đầu hiện nay thì tỷ lệ kháng kháng sinh đã ở mức báo

động đỏ cụ thể là với hơn 3.000 chủng A baumannii phân lập được tại 7 bệnh

viện lớn, đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam trong năm 2012-2013 Kết quả cho thấy vi khuẩn này đã có tỷ lệ kháng cao với hầu hết các kháng sinh thông thường dùng trong bệnh viện (tỷ lệ kháng trên 70% ở 13 trên tổng số 15

loại kháng sinh được thử nghiệm) Trong đó tỷ lệ kháng với nhóm carbapenem với 2 đại diện imipenem và meropenem lần lượt là: 76,5% và 81,3% Nhóm cephalosporin kháng trên 80%, trong đó kháng 83,9% với cefepim, 86,7% với ceftazidin, 88% với cefotaxim, 93,1% với ceftriaxone (Vi thị Đoan Chính và cs, 2007) Một nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và cộng sự tại 7 phòng thí nghiệm vi sinh của 7 bệnh viện tham gia nghiên cứu: Bệnh viện Đa Khoa Đà Nẵng, Bệnh viện Đa Khoa Cần Thơ, Bệnh viện An Bình, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định, Bệnh viện Nhi Đồng 1, và Bệnh viện Chấn thương chỉnh hình Trần Hưng Đạo cho thấy:

trên 235 chủng S Aureus phân lập được, trong đó có 110 chủng kháng

methicillin (MRSA) và 125 chủng nhạy methicillin (MSSA) Như vậy tỷ lệ

MRSA trong các chủng vi khuẩn S Aureus nghiên cứu là 47% Enterococci

có khả năng kháng Ampicilin, Vancomycin, Erythromycin và Ciprofloxacin lần lượt là 28,6; 5,3; 70; và 30%

Tỷ lệ phân lập và mức độ kháng kháng sinh của S pneumonniae gây

CAP nặng ở trẻ em tại Cần Thơ cần được cập nhật Bệnh phẩm dịch tỵ hầu ở

trẻ em đươc nuôi cấy, phân lập xác định S pneumoniae, đánh giá kháng sinh đồ và xác định MIC Kết quả 89 chủng S pneumoniae được phân lập từ 239

bệnh nhi CAP nặng Vi khuẩn hoàn toàn không nhạy penicillin với MIC90 là 64 mg/L, gấp 8 lần so với ngưỡng kháng theo CLSI (2017); đề kháng cao với erythromycin (96,6%), trimethoprim/sulfamethoxazole (89,9%), clindamycin và clarithromycin (cùng 88,8%); nhạy với chloramphenicol, levofloxacin, ciprofloxacin, ceftriaxone với tỷ lệ lần lượt là 94,4%, 80,9%, 59,6%, 46,1%; 100% các chủng nhạy cảm với vancomycin và linezolid

Một nghiên cứu về sử dụng kháng sinh trong các bênh viện Việt Nam cho thấy có khoảng 1/3 số bệnh nhân có chỉ định kê đơn kháng sinh không hợp lý Theo khảo sát mới đây nhất của Bộ Y tế thì tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh ở trên cả nước là đang đáng báo động Với >90% tình trạng sử

dụng kháng sinh là không được kê đơn bởi bác sĩ được điều trị các bệnh phổ biến như viêm họng, viêm phế quản, và các bệnh viêm nhiễm cơ bản Từ năm 2009 đến nay, số lượng thuốc kháng sinh ở Việt Nam bán ra ngoài cộng đồng đã tăng gấp 2 lần Nguyên nhân chính là do lạm dụng kháng sinh, có tới 88% kháng sinh tại thành thị được bán ra mà không cần kê đơn, ở nông thôn tỉ lệ lên đến 91% Nghiên cứu về kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện trong giai đoạn 2008 – 2009 cũng cho thấy tỉ lệ kháng thuốc ngày càng tăng lên Năm

2009 có 30-70% vi khuẩn gram âm đã kháng với cephalosporin thế hệ 3 và 4, gần 40-60% kháng với aminoglycosid và fluoroquinolon

Các chủng Streptococcus pneumoniae - một trong những nguyên nhân

thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp- kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm

2000-2001; 75% các chủng Streptococcus pneumoniae kháng với ba hoặc trên ba loại kháng sinh; 57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi khuẩn

phổ biến khác) phân lập từ bệnh nhi ở Hà Nội (2000-2002) kháng với ampicillin Tỉ lệ tương tự cũng được báo cáo ở Nha Trang Vi khuẩn phân lập từ trẻ bị tiêu chảy có tỉ lệ kháng cao Đối với hầu hết các trường hợp, bù nước và điện giải là biện pháp xử trí hiệu quả nhất đối với bệnh tiêu chảy, khoảng ¼ số trẻ đã được chỉ định kháng sinh trước khi đưa đến bệnh viện Các vi

khuẩn gram âm đa số là kháng kháng sinh (Enterococci): hơn 25% số chủng

phân lập tại một bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, theo nghiên cứu năm 2000-2001 Theo báo cáo của một nghiên cứu khác năm 2009 cho thấy, 42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic tại cả bệnh viện và trong cộng đồng

Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt Những năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng

Streptococcus pneumoniae kháng với penicillin Đến năm1999-2000, tỉ lệ này

đã tăng lên 56% Xu hướng tương tự cũng được báo cáo tại các tỉnh phía bắc Việt Nam Do tỉ lệ kháng kháng sinh cao, nhiều liệu pháp kháng sinh được khuyến cáo trong các tài liệu hướng dẫn điều trị đã không còn hiệu lực Do các bệnh nhiễm khuẩn vẫn là các bệnh phổ biến ở Việt Nam, việc tiếp cận với các kháng sinh có hiệu lực giữ vai trò rất quan trọng Tỉ lệ kháng kháng sinh gia tăng như hiện nay là mối hiểm họa đối với hiệu quả của các liệu pháp điều

trị bằng kháng sinh (Nhóm nghiên cứu Quốc gia của GARP- Việt Nam, Báo cáo phân tích thực trạng “Sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam”, 2010)

1.6.2.2 Thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sinh hoạt tính kháng khuẩn

Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về vi khuẩn đất sinh kháng sinh, tuy nhiên còn nhiều hạn chế Với tốc độ và khả năng kháng kháng sinh vẫn đang phát triển nhanh chóng thì việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh từ vi khuẩn đất là rất cần thiết

Đặng Ngọc Phương Uyên (2007)[7], Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, kết quả khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn E.Coli cho thấy chủng vi khuẩn phân lập đối kháng mạnh với E.coli ở nồng độ pha loãng canh E.coli là 10-3 tại thời điểm sau 24h ủ 37oC trong tủ ấm Thử nghiệm khả

năng đối kháng giữa Bacillus subtilis với E.Coli trên đối tượng chuột bạch cho thấy chủng B.subtilis làm giảm tỷ lệ chuột chết do nhiễm E.Coli O157:H7 đến 60% so với lô chuột không được sử dụng thức ăn có B.Subtilis

Báo cáo của Nguyễn Vân Hương và cs (2020) tiến hành phân lập các chủng xạ khuẩn cho thấy phân lập được 15 chủng xạ khuẩn, trong đó có 8/15

(53,3%) chủng kháng với các vi sinh vật kiểm nghiệm Enterococcus faecalis, Escherichia Coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, và Mycrosporum gypseum Chủng SS52 kháng tốt nhất, kháng với

tất cả vi sinh vật kiểm nghiệm, đường kính kháng từ 4 - 20 mm Từ kết quả

này cho thấy xạ khuẩn nội sinh SS52 có tiềm năng lớn từ trong lĩnh vực y học cũng như nông nghiệp

Vũ Thị Quyên và cs (2021) đã chọn được 2 chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất và có khả năng gây độc tế bào cao nhất ký hiệu là: HT03 và

HT06 Cả 2 chủng đều có hoạt tính đối kháng với Enterococcus faecalis

ATCC29212 (MICHT03= 32 μg/mL, MICHT06= 16 μg/mL), Stapphylococus aureus ATCC25923 (MICHT03= 64 μg/mL, MICHT06= 32 μg/mL) và Bacillus cereus ATCC 13245 (MIC= 16 μg/mL) Ngoài ra 2 chủng HT03 và HT06 còn có khả năng ức chế khá mạnh nấm men Candida albicans ATCC10231 với

MICHT03= 16 μg/mL, MICHT06= 8 μg/mL Đặc biệt hai chủng HT03 và HT06 đều thể hiện hoạt tính gây độc rất tốt trên cả 5 dòng tế bào ung thư (tế bào ung thư vú MCF-7; MDA-MB-231; tế bào ung thư phổi NCI-H1975; tế bào ung thư cổ tử cung HeLa; tế bào ung thư dạ dày AGS) ở cả hai nồng độ thử nghiệm 30 µg/mL và 100 µg/mL Hai chủng đã được nghiên cứu các đặc điểm hình thái nuôi cấy và phân tích trình tự gen 16S rRNA, kết quả cho thấy

chủng HT03 thuộc loài Streptomyces fradiae có độ tương đồng 99,93% với chủng Streptomyces fradiae ATCC và chủng HT06 thuộc loài Nocardiopsis synnemataformans có độ tương đồng 99,89% với chủng chuẩn của Nhật Bản Nocardiopsis synnemataformans DSM 44143 (NBRC 102581)

Trần Thị Thanh Hoa và cs (2020) đã phân lập được 61 chủng xạ khuẩn từ 80 mẫu sinh vật biển và trầm tích biển được thu thập từ đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi Các chủng được lên men trong môi trường A1, dịch lên men được chiết với ethyl acetate và làm bay hơi dung môi bằng cô quay chân không để tạo ra cặn chiết thô Hoạt tính kháng sinh của các cặn chiết được thực hiện trên 7 chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ), gồm ba chủng vi khuẩn Gram âm

(Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella enterica ATCC13076), ba chủng Gram dương (Enterococcus faecalis ATCC29212, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus

ATCC 13245), và nấm Candida albicans ATCC10231 Từ kết quả sàng lọc

hoạt tính, đã chọn được 3 chủng xạ khuẩn (G330, G336 và G361) có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, ức chế 5/7 chủng VSVKĐ với các giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 4 đến 256 µg/ml tùy thuộc vào từng chủng kiểm định

Cụ thể, cả ba chủng này đều ức chế C albicans ATCC10231 và ba chủng

Gram dương Ngoài ra, G330 và G336 còn thể hiện hoạt tính ức chế chủng

Gram âm S enterica ATCC13076 với giá trị MIC = 256 µg/ml và G361 có khả năng ức chế khá tốt đối với E coli ATCC25922 với giá trị MIC là 8

µg/ml Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen 16S rRNA,

kết quả cho thấy chủng G330 thuộc chi Streptomyces, các chủng G336 và G361 được xác định là thành viên của chi Salinispora, với độ tương đồng hơn

99% so với các trình tự gen 16S rRNA trên ngân hàng gen quốc tế Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường biển có tiềm năng lớn để phân lập các chủng xạ khuẩn cho mục đích tìm kiếm các chất kháng khuẩn cũng như các hoạt chất sinh học khác

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu đất

Đất nguyên thô (05 mẫu) bề mặt (độ sâu từ 5-10 cm) thu thập ở khu vực Mỏ sắt Trại Cau, Đồng Hỷ, Thái Nguyên,

Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:

Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ

sinh học cấp 2 Mỹ Máy khuấy từ Đức Máy ly tâm Đức Cân điện tử Đức Máy lắc Hàn Quốc Cân phân tích Anh Tủ lạnh Mỹ Máy đo pH Nhật

Máy PCR Biosystem, Mỹ Applied Kính hiển vi Đức

Máy ly tâm lạnh Sorvall RC5B, Mỹ Máy lắc ổn nhiệt New Jersey, Mỹ

Hóa chất sử dụng: Agar (Việt Nam), Môi trường R2A (Ấn Độ), Môi trường Potato dextrose (Merck), Glucose (Việt Nam), môi trường nutrient agar (Anh), Peptone (Merck), Môi trường trypticase soy agar (Ấn Độ), Yeast extract (Sigma), Malt extract (Trung Quốc), L-proline (Hàn Quốc), MgSO₄ (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), TES (Sigma)

2.1.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định

Các chủng kiểm định được cung cấp bởi Ngân hàng chủng giống của CCARM, Hàn Quốc (CCARM: Culture Collection of Antimicrobial Resistant

Microbes) bao gồm: Enterococcus faecalis CCARM 5168 (kháng tetracycline và gentamicin), Enterococcus faecalis CCARM 5171, Enterococcus faecalis CCARM 5025 (kháng oxacillin, quinupristin và dalfopristin), Enterococcus faecium CCARM 5024 (kháng ampicillin, oxacillin, teicoplanin và tetracycline), Streptococcus agalactiae CCARM 4504 (kháng clindamycin, clarithromycin và tetracycline) và Streptococcus pyogenes CCARM 4520

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm vi sinh và hóa sinh Viện Khoa học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ tháng 6/2020 - 9/2022

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu đất

Các mẫu (05) được thu nhận từ đất bề mặt nguyên thô, có độ sâu từ 5-10 cm với các dụng cụ đã tiệt trùng Mẫu được đựng riêng lẻ trong các túi nilon và được hong khô trong không khí 3-5 ngày, loại bỏ sinh khối thực vật và đá

2.3.2 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn đất

Cân 1g mẫu đất cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý 0,9% (w/v), lắc đều, tiếp đến 1 ml dịch huyền phù được pha loãng sang ống nghiệm mới chứa đựng 9 ml nước muối sinh lý, thu được nồng độ pha loãng 10-2 Quá trình pha loãng được tiếp tục tiến hành đến nồng độ pha loãng 10-6 Sau đó,

100 µl mỗi nồng độ dịch pha loãng (10-2 đến 10-6) được cấy trải lên trường thạch đĩa ISEM (Nguyen và cs, 2018) Các đĩa này được nuôi ở 28oC trong 3 tuần Các chủng xạ khuẩn được tinh sạch đến khi thu nhận được khuẩn lạc tinh khiết được bảo quản trong glycerol với nồng độ cuối cùng 10% (v/v) ở -80oC cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn đất sinh hoạt chất kháng khuẩn

Các chủng phân lập được cấy ria lên bề mặt môi trường R2A ở 28oC trong 2 ngày Tiếp đến, cấy chấm điểm các chủng phân lập trên bề mặt môi trường thạch đĩa Mueller Hinton chứa đựng các chủng vi khuẩn kiểm định Các đĩa môi trường được nuôi ở 28o

C trong 3 ngày và kiểm tra và xác định các đường kính vòng vô khuẩn theo công thức:

* Tách chiết DNA tổng số của chủng phân lập:

Chủng phân lập được nuôi cấy trong môi trường dịch thể Tryptic Soy Broth ở 28oC, 2 ngày Ly tâm thu sinh khối tế bào và được rửa 2 lần với nước cất khử trùng Các bước tiến hành tách chiết DNA tổng số:

Khoảng 10 mg tế bào được hòa trong 0,5 ml đệm TE, bổ sung thêm 20 µl dung dịch SDS 10% (sodium dodecyl sulfate) và 10 µl proteinase K (20 mg/ml), ủ 37oC trong 40 phút

i Sau 30 phút, bổ sung 15 µl lysozyme (10 mg/ml) và 5 µl ribonuclease (5 mg/ml), ủ 37oC trong 40 phút Tiếp đến, 100 µl NaCl 5M và 80 µl CTAB

(hexadecyltrimethylammonium bromide) 10%/NaCl (1:1, v/v) được bổ sung vào mẫu, ủ 65oC trong 10 phút

ii Hỗn hợp dung môi bao gồm phenol/chloroform/iso-amyl alcohol (25/24/1, v/v/v) được bổ sung bằng với thể tích mẫu, khấy đảo nhẹ trong 3 phút

iii Hỗn dịch ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, sẽ phân tách thành 03 pha, chỉ thu nhận pha trên cùng chứa DNA tổng số chuyển sang ống eppendorf mới

iv Tiếp đến, hai lần thể tích ethanol lạnh (-20oC) so với thể tích mẫu được bổ sung, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút DNA được rửa 03 lần trong ethanol 70% và làm khô ở 65oC trong 10 phút

v ADN tổng số được bảo quản ở -20oC

* Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng phân lập:

Mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng 27F-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG và 1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT (Lane, 1991) Thành phần và điều kiện chạy PCR được tiến hành theo mô tả của Klindworth và cộng sự (2013), cụ thể: 80 ng DNA mẫu; 0,3 mg/ml Bovine Serum Albumin; 250 µM dTNPs; 0,02U DNA Polymerases; dung dịch đệm 5× PCR có 1,5 mM MgCl2; 0,5 mM mỗi mồi; tổng thể tích phản ứng PCR là 50 µl Phản ứng PCR được tiến hành trong 25 chu kỳ, biến tính DNA mẫu ở 95o

C trong 5 phút, 25 chu kỳ ở 95oC trong 40 giây, gắn mồi 55oC và kéo dài 72oC trong 1 phút; chu kỳ cuối được kéo dài ở 72oC trong 7 phút

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,3% Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

2.3.5 Phương pháp phân loại và xây dựng sơ đồ phả hệ

Trình tự gen 16S rRNA của chủng phân lập được so sánh với dữ liệu EzTaxon và phân loại dựa vào kết quả so sánh sự tương đồng về gen 16S rRNA với các loài đã công bố (Browne và cs, 2016) Đồng thời, sơ đồ phả hệ của chủng phân lập được xây dựng thông qua CLUSTAL X (Thompson và cs, 1997) với giá trị bootstrap ở 1000 lần lặp lại cho các nhánh (Felsenstein, 1985), vị trí của các chủng phân lập và các chủng so sánh (Neighbor-joining) được dựng lên bằng sử dụng MEGA 7 (Kumar và cs, 2018)

2.3.6 Phương pháp xác định đặc điểm nuôi cấy của chủng Streptomyces sp BPTC-45

* Khả năng sinh trưởng, mầu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan:

Chủng Streptomyces sp BPTC-45 được nuôi cấy trên các loại môi

trường bao gồm Potato dextrose agar, Nutrient agar, Trypticase soy agar, Yeast extract–malt extract agar (ISP Medium 2), Inorganic salts–starch agar (ISP Medium 4), Glycerol–asparagine agar (ISP Medium 5) và Peptone Yeast Extract Iron Agar (ISP Medium 6) Khả năng sinh trưởng, sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố hòa tan được xác định sau 21 ngày ở 28oC theo phương pháp của Shirling và Gottlieb (1966)

* Xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sinh hoạt chất kháng khuẩn của Streptomyces sp BPTC-45

Chủng Streptomyces sp BPTC-45 được hoạt hóa trong môi trường

R2A ở 28oC, 2 ngày, 120 vòng/phút Sau đó 2% dịch nuôi cấy được cấy chuyển đến các môi trường TSB, R4, ISP 2 và được nuôi cấy ở 28oC, 7 ngày, 130 vòng/phút Tiếp đến ly tâm để lại bỏ sinh khối tế bào, 15 µl dịch lên men của mỗi loại môi trường được bổ sung vào khoanh giấy 6 mm và đặt lên môi

trường thạch đĩa Mueller Hinton chứa đựng E faecium CCARM 5024 ở mật

độ tế bào 105

CFU/ml Xác định vòng vô khuẩn ở 37oC, 24 giờ

2.3.7 Phương pháp tách chiết hoạt chất kháng khuẩn tổng số từ dịch lên men chủng Streptomyces sp BPTC-45

Chủng Streptomyces sp BPTC-45 được hoạt hóa trong môi trường

R2A ở 28oC, 2 ngày nuôi lắc ở 130 vòng/phút Tiếp đến, 2% dịch nuôi cấy được cấy chuyển đến môi trường thích hợp trong 7 ngày ở 28oC, sau đó lấy dịch đem li tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch lên men Hoạt chất kháng khuẩn tổng số (KKTS) có trong dịch lên men được tách chiết bằng ethyl acetate (dịch lên men cấy: dung môi với tỉ lệ 1:1, v/v), lắc trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và thu pha ethyl acetate Quá trình tách chiết KKTS được lặp lại 2 lần Tiếp đến dung môi ethyl acetate được loại bỏ bằng máy cô quay chân không ở 40oC Hòa cặn trong 80 ml dung môi acetonitrile lọc qua gel Sephadex LH-20 Thu nhận cặn sau khi bay hơi acetonitrile Cặn hoạt chất KKTS được hòa trong 15 ml nước khử ion và lọc qua màng lọc 0,22 µm và đông khô Bột hoạt chất KKTS được bảo quản ở -20o

C

2.3.8 Phương pháp đánh giá hoạt chất kháng khuẩn (MIC90) của hoạt chất kháng khuẩn tổng số tách chiết từ chủng Streptomyces sp BPTC-45

Quy trình xác định MIC được tiến hành theo phương pháp pha loãng của CLSI (2012) Các chủng vi khuẩn kiểm định được chuẩn bị ở mật độ 105 CFU/ml Kháng sinh cephalothin và norfloxacin được sử dụng là đối chứng dương Bột hoạt chất tách chiết tổng số của chủng phân lập và kháng sinh thương mại được chuẩn bị ở nồng độ 128, 64, 32, 16, 8 và 4 µg/ml

2.3.9 Nhận diện hoạt chất KKTS tách chiết từ chủng Streptomyces sp BPTC-45 bằng sắc ký bản mỏng và hệ thống sắc khối phổ

* Nhận diện hoạt chất KKTS bằng sắc ký bản mỏng (TLC)