Tuyển chọn chủng aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để thực tập Viện Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức cho tơi suốt năm học tập trƣờng Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà cịn hành trang q báu để tơi bƣớc vào đời cách vững tự tin Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Kim Dung – giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp tận tình định hƣớng hƣớng dẫn tơi suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin kính chúc thầy, giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp dồi sức khỏe, đạt đƣợc nhiều thành công sống nhƣ nghiệp nghiên cứu giảng dạy Tôi xin chân thành cảm ơn! Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực TS Vũ Kim Dung Trịnh Thị Thùy Linh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan hạt cà phê xanh axit chlorogenic 1.1.1 Hạt cà phê xanh 1.1.2.Acid chlorogenic 1.2 Tổng quan enzyme pectinase 1.2.1 Enzyme pectinase 1.2.2 Một số phƣơng pháp sản xuất enzyme pectinase 1.3 Tổng quan Aspergillus niger 15 1.3.1 Đặc điểm, phân bố 15 1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến thu nhận pectinase từ A niger 16 1.4 Các nghiên cứu liên quan nƣớc 16 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.2.Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Vật liệu nghiên cứu 22 2.3.1 Vật liệu 22 2.3.2 Hóa chất 22 2.3.3 Thiết bị 22 2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy 23 2.3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Tuyển chọn Aspergillus niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao 29 3.1.1 Hoạt hóa chủng Aspergillus niger 29 3.1.2 Tuyển chọn chủng A niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao 32 ii 3.2 Đặc tính pectinase từ chủng A niger CR 34 3.2.1 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính độ bền enzyme 34 3.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính độ bền enzyme 36 3.3 Kết thử nghiệm tách chiết CGA từ hạt cà phê xanh 38 3.3.1 Kết xây dựng đƣờng chuẩn CGA 38 3.3.2 Thử nghiệm chiết CGA từ hạt cà phê xanh 39 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tỉ lệ ứng dụng loại enzyme công nghiệp Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm xây dựng đƣờng chuẩn CGA 27 Bảng 3.1 Nguồn gốc đặc điểm chủng A niger 29 Bảng 3.2 Đƣờng kính khuẩn lạc A niger môi trƣờng chứa pectin 32 Bảng 3.3 Giá trị nồng độ CGA đo bƣớc sóng 324 nm 38 Bảng 3.4 Hàm lƣợng chlorogenic (CGA) 40 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo hạt cà phê Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo acid chlorogenic Hình 1.3 Tác động pectinase lên phân tử pectin Hình 1.4: Sơ đồ thu nhận en me thuật từ canh trƣờng nấm mốc 13 Hình 1.5: Hình ảnh nấm Aspergillus niger 15 Hình 2.1: Đồ thị đƣờng chuẩn monogalacturonan 25 Hình 3.1: chủng A niger đƣợc tuyển chọn môi trƣờng Czapeck 30oC 31 Hình 3.2 Hoạt độ pectinase chủng A niger 33 Hình 3.3: Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CR 35 Hình 3.4 Ảnh hƣởng pH đến độ bền pectinase từ A niger 36 Hình 3.5: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A niger CR 37 Hình 3.6: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A niger 38 Hình 3.7 Đƣờng chuẩn CGA 39 Hình 3.8 Sắc ý đồ sản phẩm thủy phân hạt cà phê xanh pectinase 39 v ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khác nhƣ pol galacturonase, pectinesterase, pectol ase,… xúc tác thủy phân phân tử pectin tạo sản phẩm khác Với vai trò quan trọng, pectinase đƣợc sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích lớn cơng nghiệp chế biến thực phẩm công nghiệp nhẹ Trƣớc đâ nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật động vật Ngày nay, nghiên cứu tìm nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng mang lại lợi ích kinh tế Một đặc điểm bật pectinase enzyme nà đƣợc dùng không giới hạn thực phẩm khơng ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời Bằng ƣu điểm dễ nuôi cấy, sinh trƣởng phát triển nhanh, cho nhiều enzyme thời gian ngắn, vi sinh vật lựa chọn hàng đầu nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng suất sản xuất lên cao Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp đƣợc thực chủ yếu từ Aspergillus niger (Yogesh, 2009) Cùng với acid chlorogen (CGA) hợp chất phenolic cà phê có tính chất chống ox hóa, háng huẩn, háng virut, chống đột biến, kích thích miễn dịch, điều hòa lƣợng đƣờng máu CGA na đƣợc chiết từ cà phê số loại thực vật phƣơng pháp hác nhau, tu nhiên sử dụng en m để phá hủ lớp vỏ quả, giải phóng CGA hạt phƣơng pháp thân thiện hiệu Trên sở đó, thực đề tài “Tuyển chọn chủng Aspergillus niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh” nhằm lựa chọn đƣợc chủng A niger có khả sinh tổng hợp enzyme pectinase cao để chiết tách CGA từ hạt cà phê xanh từ phục vụ nhu cầu sản xuất nƣớc mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan hạt cà phê xanh axit chlorogenic 1.1.1 Hạt cà phê xanh 1.1.1.1 Cấu tạo Hạt cà phê xanh đƣợc cấu tạo từ lớp vỏ nhân (hình 1.1) Hình 1.1 Cấu tạo hạt cà phê  Lớp vỏ trấu (Parchment): Là lớp phần hạt, tiếp xúc trực tiếp với phần vỏ quả, Parchment đƣợc hình thành từ ba đến bả lớp tế bào xơ cứng (tế bào sợi đóng vai trị thực vật) nên cịn đƣợc gọi vỏ trấu Các tế bào cấu thành vỏ trấu cứng dần trình trƣởng thành cà phê, hạn chế ích thƣớc cuối hạt nhân cà phê Trong cà phê Arabica, trọng lƣợng trung bình vỏ trấu với độ ẩm hoảng 11% nằm hoảng 3,8% tổng trọng lƣợng cà phê  Lớp vỏ lụa (Silver skin): Vỏ lụa đƣợc hình thành từ nucellus có màu trắng bạc sau hi phơi hơ, nên cịn đƣợc gọi vỏ bạc Lớp vỏ mỏng đƣợc bóc khỏi nhân q trình đánh bóng hạt Tuy nhiên, số nhà chế biến cà phê thƣờng để lại vỏ lụa hạt cà phê nhƣ lớp bảo vệ tự nhiên, lớp vỏ sau tự hủy trình rang cà phê Ở số vùng, tùy thuộc vào giống cà phê lớp vỏ lụa sẫm màu  Nhân cà phê Phần quan trọng quả, chịu trách nhiệm tích lũ chất dinh dƣỡng cho q trình nẩy mầm phơi Một cà phê thơng thƣờng có nhân ( cá biệt có nhân) Thành phần hóa học nhân vơ quan trọng đâ đƣợc xem tiền thân hƣơng vị mùi thơm sau nà cà phê rang Các hợp chất hóa học đƣợc tìm thấy nội nhũ kể đến bao gồm: - Các hợp chất tan nƣớc nhƣ caffeine, trigonelline, axit nicotinic (niacin), 18 axit chlorogen, thành phần cacbohydrat (mono-, di- oligosacarit) số protein khoáng chất axit carbox lic… - Trong hi thành phần hơng hịa tan nƣớc bao gồm cellulose, polysacaride, lignin hemicellulose, nhƣ số protein, khoáng chất lipid - Trong lớp nhân cà phê phôi (embryo) bao gồm trục phôi (hypocotyl) hai mầm dài từ 3-4 mm Khi hạt bắt đầu nảy mầm trục phôi éo dài đẩy hạt lên mặt đất Các mầm ban đầu dƣới lòng đất nga sau mầm hình thành 1.1.1.2.Thành phần hóa học hạt cà phê Nhóm chất sau đâ có mặt tất giống loài cà phê, nhiên tùy theo giống cà phê phụ thuộc vào điều kiện canh tác mà thành phần hóa học cà phê tha đổi - Nhóm chất hữu có cà phê  Nƣớc Cà phê tƣơi có độ ẩm tuyệt đối, với hàm lƣợng nƣớc cao loại nấm mốc phát triển mạnh làm hỏng hạt đồng thời rang tốn nhiều nhiên liệu thất thoát hƣơng nhiều Vì vậy, thơng qua phƣơng pháp chế biến cà phê hàm lƣợng nƣớc giảm xuống 10 - 12% cà phê đƣợc bảo quản lâu Hàm lƣợng nƣớc sau rang khoảng - 3% - Các loại cacbohydrat (glucid) cà phê Chiếm ½ tổng số chất hô, đại phận không tham gia vào thành phần nƣớc uống mà cho màu vị caramen Đƣờng có cà phê q trình thủ phân dƣới tác dụng axit hữu en im thủy phân Hàm lƣợng saccharose có cà phê phụ thuộc vào độ chín quả, chín hàm lƣợng cao Saccharosa bị caramen hóa q trình rang tạo thành hƣơng vị cho nƣớc cà phê - Thành phần protein cà phê Hàm lƣợng protein hơng cao nhƣng đóng vai trị quan trọng giúp hình thành hƣơng vị cà phê trình rang qua phản ứng Maillard với loại đƣờng có cà phê Bằng phƣơng pháp định tính ngƣời ta nhận thấy thành phần protein có axit amin nhƣ: c stein, alanie, phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine - Các Axit hữu  Axit chlorogenic (CGA) – Một loại axit quan trọng cà phê Chlorogenic acid nhóm hợp chất pol phenol hình thành thơng qua liên ết ester quinic acid với trans-cinnamic acid (chủ ếu caffeic acid, ferulic p-coumaric acid)  Axit axetic nhiều axit hữu đóng vai trò quan trọng chất lƣợng cà phê Nồng độ axit axetic cao hay thấp phụ thuộc vào phƣơng pháp chế biến ƣớt khơ, vậ đâ loại axit đƣợc sinh đáng kể trình chế biến khơng nhiều cà phê  Axit citric cà phê Đóng vai trò nhƣ hợp chất trung gian quan trọng chu trình trao đổi chất Trong cà phê xanh axit citric chiếm phần đáng kể tổng hàm lƣợng axit cà phê Khi rang, axit citric đạt mức tối đa hi rang nhiệt độ thấp nhanh chóng giảm hi tăng dần độ rang  Axit quinic cà phê Khi rang axit quinic dần tăng lên theo mức giảm axit chlorogenic (CGA) Trong trình rang, phần axit quinic tiếp tục phân hủ để tạo thành số hợp chất thứ cấp bao gồm phenol, catechol, hydroquinone, pyrogallol số diphenols – tiền chất quan trọng cấu thành hƣơng thơm cà phê  Axit photphoric Trong cà phê, axit photphoric chiếm 1% chất khô cà phê, nhiên không giống nhƣ số axit khác, axit photphoric có cƣờng độ mạnh 100 lần so với axit hác Nhƣ vậy, nhiều nhà nghiên cứu tin axit photphoric tác động mạnh mẽ đến hƣơng vị so loại axit cà phê - Nhóm chất hƣơng, chất khống  Chất thơm Trong cà phê hàm lƣợng chất thơm nhỏ, đƣợc hình thành tích lũ hạt Mặt khác, phần lớn mùi hƣơng cà phê mà ta nhận thấ đƣợc hình thành trình chế biến cà phê, đặc biệt trình rang Các chất thơm phức tạp bao gồm nhiều phân tử cấu thành nhƣ: acid, aldehid, ceton, rƣợu , ph nol, este… Các chất thơm cà phê dễ bị ba hơi, biến đổi dẫn đến tƣợng cà phê bị mùi thơm nên cần đựng bao bì kín tiêu thụ nhanh  Chất khoáng Chỉ từ khoảng - 5% chủ yếu kali, nito, magie, photpho, clo Ngồi cịn có chất nhôm, sắt, đồng, lƣu huỳnh… Những chất ảnh hƣởng không tốt đến mùi hƣơng cà phê Chất lƣợng cà phê cao khống chất thấp ngƣợc lại 1.1.2.Acid chlorogenic 1.1.2.1.Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học Hình 3.1: c c ch ng A niger ược tuyển chọn Czapec 30oC 31 ôi trường 3.1.2 Tuyển chọn ch ng A niger có khả inh tổng hợp pectinase cao Việc tìm kiếm chủng A niger có khả tổng hợp pectinase cao để chủ động tạo nguồn enzyme ứng dụng công nghiệp thực phẩm đặc biệt ứng dụng sản xuất axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh cơng việc có ý nghĩa Để chọn lọc đƣợc chủng A niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao, đề tài này, thí nghiệm đƣợc tiến hành qua ba bƣớc Bƣớc đầu, chủng đƣợc phân lập dựa đƣờng kính khuẩn lạc chủng phân lập môi trƣờng chứa chất pectin, bƣớc chủng đƣợc sàng lọc qua đƣờng kính vịng thủy phân hoạt độ pectinase sinh khối Bƣớc cuối cùng, chủng đƣợc lựa chọn theo hoạt độ pectinase cao 33 chủng A niger đƣợc nuôi cấ môi trƣờng chọn lọc Czapeckpectin 30oC Sau ngà nuôi quan sát xác định đƣờng kính khuẩn lạc Trong số 33 chủng A niger từ sƣu tập giống, có 15 chủng phát triển mơi trƣờng chứa pectin 1% với đƣờng kính khuẩn lạc > 4,0 cm (bảng 3.2) Lựa chọn 15 chủng cho bƣớc sàng lọc Bảng 3.2 Đƣờng kính khuẩn lạc A niger mơi trƣờng chứa pectin TT Tên chủng Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) A niger SLG 002B 4,5 ± 0,20 A niger 5021 4,3 ± 0,12 A niger Schot 5,0 ± 0,15 A niger SL328A 4,8 ± 0,21 A niger NGSL 002B 4,2 ± 0,20 A niger NG328A 4,6 ± 0,14 A niger 5053 4,7 ± 0,16 A niger 5016 4,3 ± 0,19 A niger 5008 4,0 ± 0,10 32 10 A niger KT15 4,9 ± 0,17 11 A niger KT13 5,1 ± 0,21 12 A niger KT10 4,3 ± 0,18 13 A niger 5002 4,7 ± 0,14 14 A niger CR 5,3 ± 0,16 15 A niger 2CF 4,8 ± 0,18 Từ 15 chủng tiến hành nuôi môi trƣờng lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase, kết đo hoạt độ pectinase 15 chủng (hình 3.2), chủng A niger CR cho giá trị hoạt độ cao (63,843U/g) Tên chủng Hoạt độ en me (U/ml ) A niger NG328A A niger SLG 002B A niger 5021 A niger Schot A niger SL328A A niger NGSL 002B A niger 5053 A niger 5016 A niger 5008 A niger KT15 A niger KT10 A niger KT13 A niger CR A niger 5002 A niger 2CF Hình 3.2 Hoạt 30,699 20,564 29,745 41 41,685 43,51 26,561 35,54 40,345 24,358 33,412 25.748 63,843 39,412 35,456 pectina e c a c c ch ng A niger Chủng tuyển chọn có khả sinh tổng hợp pectinase cao so với công bố số tác giả khác Huỳnh Ngọc Oanh cộng (2008) nuôi chủng A niger phân lập đƣợc môi trƣờng chứa chất cảm ứng bột cà rốt sau 48 hoạt độ pectinase đạt cao 30,1 U/g[1] 33 Tuy nhiên, phƣơng pháp tối ƣu điều kiện lên men, nhiều công bố tác giả cho thấy pectinase sinh tổng hợp từ A niger hoạt độ cao Từ chủng A niger IM09 Islam cộng thu đƣợc pectinase đạt 831 U/g [10] Motwani cộng lên men A niger phân lập từ đất môi trƣờng chứa cám lúa mỳ, thu đƣợc pectinase 368 U/ml sau ngày [15] Akhter cộng nuôi cấy A niger IM6 môi trƣờng chứa 9,68% pectin hàm ẩm 60% thu đƣợc pectinase với hoạt độ 144,42 U/g [3] Antier cộng phân lập đƣợc chủng A niger từ bã cà phê có khả sinh tổng hợp pectinase với hoạt độ 138 U/g nhƣng sau hi tối ƣu điều kiện nuôi cấy hoạt độ en me đạt 228 U/g[5] Khi nuôi cấ môi trƣờng lỏng, Martos cộng thu nhận pectinase từ chủng A niger 220 U/l sau 74 lên men pH 6.5 môi trƣờng chứa 20 g/l pectin [14]; Reginatto cộng thu đƣợc pectinase 14 U/ml từ chủng Aspergillus niger LB-02-SF[20] Do vậ , để thu đƣợc pectinase có hoạt độ cao phục vụ cho việc tách chiết axit Chlorogenic từ hạt cà phê xanh cần nghiên cứu tối ƣu điều kiện nuôi cấy nghiên cứu cải tạo chủng tuyển chọn đƣợc Nhƣ vậy, từ 33 chủng A niger từ sƣu tập giống tu ển chọn đƣợc chủng nấm mốc A niger CR có khả sinh tổng hợp pectinase 63,843 U/g môi trƣờng sau ngày nuôi cấy 3.2 Đặc tính pectinase từ chủng A niger CR 3.2.1 Ảnh hưởng c a pH ến hoạt tính bền enzyme pH ảnh hƣởng rõ rệt đến phản ứng enzyme pH ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa chất độ bền enzyme Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng pH đến hoạt tính pectinase A niger CR qua xác định đƣợc pH tối ƣu enzyme  pH tối ƣu pectinase từ A niger CR Để xác định pH tối ƣu, pectinase chủng A niger CR đƣợc phản ứng với chất đƣợc pha dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có giá trị 34 pH hác nằm hoảng từ pH 4,5 đến 7,0 thời gian 10 phút Mối quan hệ pH hoạt độ tƣơng đối en me thu đƣợc thể hình 3.3 80 Hoạt độ enzyme (U/g) 70 60 50 40 30 20 10 Series1 pH 4,5 pH pH 5,5 pH pH 6,5 pH 42,369 51,730 67,419 43,662 37,437 26,289 Hình 3.3: Ảnh hưởng c a pH ến hoạt enzy e pectina e t A.niger CR Kết hình 3.3 cho thấy enzyme pectinase từ chủng A.niger CR hoạt động trung vùng pH từ – hoạt độ en me thu đƣợc cao pH = 5,5 Ở pH này, hoạt tính pectinase tối đa tha đổi pH cao thấp làm hạ thấp đáng ể độ hoạt động enzyme Một số tác giả nghiên cứu đặc tính pectinase từ A niger tìm đƣợc dải pH thích hợp cho hoạt tính pectinase nằm khoảng từ 3,5 - 5,5 pH tối ƣu 4,5 – 5,5 [04, 05,06,11]  Xác định độ bền pH: - Khảo sát độ bền pH hoạt tính pectinase cách ủ enzyme 40oC dung dịch đệm pH từ 4,5 – 7, sau khoảng thời gian khác nhau, lấy mẫu xác định hoạt độ pectinase lại (với chất đƣợc pha dung dịch đệm pH = 4,5) Kết thu đƣợc thể hình 3.4 35 120 Hoạt độ enzyme (%) 100 80 60 40 20 0h 1h 2h 3h pH4,5 pH5 pH5,5 Hình 3.4 Ảnh hưởng c a pH ến pH6 4h pH6,5 5h pH7 bền c a pectinase t A niger Kết cho thấy pectinase từ chủng A.niger CR bền vùng pH – 5,5 Sau ủ 40oC đệm pH – 5,5 hoạt độ enzyme giữ 60% so với ban đầu [12] Ở pH - hoạt độ enzyme không ổn định giảm đáng ể sau 3.2.2 Ảnh hưởng c a nhiệt ến hoạt tính bền enzyme  Nhiệt độ tối ƣu pectinase từ A niger CR Mỗi en me có giá trị nhiệt độ tối ƣu mà hoạt tính đƣợc thể mạnh nhƣ có vùng nhiệt độ mà hoạt tính enzyme bị ảnh hƣởng gọi vùng bền nhiệt enzyme Với mục đích xác định đƣợc nhiệt độ tối ƣu pectinase từ A niger CR, dịch en me đƣợc giữ ổn nhiệt nhiệt độ 30 – 70oC 36 70 Hoạt độ enzyme (U/ml) 60 50 40 30 20 10 0h 30oC 40oC 50oC 60oC 70oC 40,765 61,750 35,650 30,368 20,652 Nhiệt độ Hình 3.5: Ảnh hưởng c a nhiệt ến hoạt peptina e t A niger CR Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính pectinase từ chủng A niger CR thấ hi tăng nhiệt độ từ 30oC – 40oC, hoạt độ enzyme tăng đạt cực đại 40oC Khi nhiệt độ lớn 40oC, hoạt độ enzyme giảm nhanh Nhƣ vậy, nhiệt độ tối ƣu pectinase từ A niger CR 40oC, cao so với nhiệt độ tối ƣu (35oC) peptinase từ Bacillus sp MFW7 [9], nhiệt độ pectinase từ A niger sử dụng nguồn cacbon từ vỏ cam [10]  Độ bền nhiệt: Dịch en me đƣợc giữ ổn nhiệt nhiệt độ 30 – 70oC pH 5,5 khoảng thời gian 5h, 1h tiến hành xác định hoạt độ enzyme biểu diễn kết hình 37 30o C 40oC 50oC 60oC 70oC HOẠT ĐỘ ENZYME (%) 120 100 80 60 40 20 0H 1H 2H 3H Hình 3.6: Ảnh hưởng c a nhiệt ến t ch ng A niger 4H 5H bền pectina e Kết khảo sát cho thấy pectinase từ chủng A niger CR enzyme không bền nhiệt Khi nhiệt độ tăng hoạt độ pectinase giảm dần enzyme bền 30 - 50ºC Khi nhiệt độ lớn 50oC hoạt độ enzyme giảm nhanh sau hoạt độ enzyme thấp 3.3 Kết thử nghiệm tách chiết CGA từ hạt cà phê xanh 3.3.1 Kết xây dựng ường chuẩn CGA Tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn CGA nồng độ từ 0,2 - 1,0 mg/ml thu đƣợc kết nhƣ sau (hình 3.7 bảng 3.3) Bảng 3.3 Giá trị nồng độ CGA đo bƣớc sóng 324 nm Ống ĐC Ống Ống Ống Ống VCGA (ml) 0,4 0,6 0,8 VNƣớc cất (ml) 0,6 0,4 0,2 OD324nm 0,335 0,569 0,702 0,825 0,942 38 0.9 OD 324nm 0.8 0.7 0.6 0.5 y = 0,6114x + 0,3322 R² = 0,9975 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 CGA (mg/ml) Hình 3.7 Đường chuẩn CGA 3.3.2 Th nghiệm chiết CGA t hạt cà phê xanh Hạt cà phê xanh (Rubusta) đƣợc nghiền nhỏ bổ sung enzyme theo tỉ lệ rắn : lỏng 1: 30 ủ ấm hỗn hợp 40oC thời gian 120 phút Sau đun sơi hỗi hợp lọc thu dịch lần 1, tiếp tục chiết CGA 30ml nƣớc cất thu đƣợc dịch lọc lần Các dịch lọc đƣợc chấm sắc ký mỏng (TLC) với hệ dung môi (n- butanol : acid acetic : nƣớc theo tỷ 6:2:2 ) nhằm kiểm tra có mặt CGA dịch thủy phân Kết chạy sắc ký mỏng đƣợc biểu hình 3.8 CGA M : Chlorogenic acid (CGA) D1: Dịch lọc thủy phân lần D2: Dịch lọc t hủy phân lần ĐC : Đối chứng Hình 3.8 ắc ý ản phẩ th y ph n hạt cà phê xanh pectina e 39 Kết từ ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (TLC) ( hình 3.8), băng ĐC – dịch lọc từ hạt cà phê xanh thủy phân nƣớc cất, không bổ sung enzyme pectinase cho thấy không xuất băng vị trí chất chuẩn (đƣờng chạy M) Trong hi đó, đƣờng chạy dịch lọc & (D1 & D2) xuất băng vị trí chất chuẩn CGA Điều chứng tỏ en me pectinase phân cắt pectin vỏ hạt cà phê xanh giải phóng CGA dịch lọc Thêm vào băng CGA dịch lọc & cho thấ chiết tách đƣợc CGA từ hạt cà phê xanh Để định lƣợng CGA dịch lọc cà phê xanh, dịch lọc hỗn hợp thu đƣợc đo bƣớc sóng UV= 324nm thu đƣợc kết bảng 3.4 Bảng 3.4 Hàm lƣợng chlorogenic (CGA) Dịch lọc Dịch lọc Hỗn Hợp OD324 0,587 0,548 0,573 Hàm lƣợng CGA (mg/ml) 3,59 ± 0,06 3,30 ± 0,04 3,46 ± 0,14 Thể tích (ml) 18 15 Tổng hàm lƣợng CGA 64,62 49,5 33 114,18 dịch (mg) Khối lƣợng mẫu ban đầu (g) 3g Hàm lƣơng CGA tách từ mẫu 32,688 (mg/g) Kết thí nghiệm cho thấ bƣớc đầu sử dụng pectinase từ chủng A niger CR để tách chiết CGA hạt cà phê xanh thu đƣợc 32,688mg/g nguyên liệu Theo nhƣ ết nghiên cứu bƣớc đầu Abebe Ayelign and Kebba Sabally hàm lƣợng CGA tách chiết từ hạt cà phê xanh thu đƣợc 46,144mg/g nguyên liệu cao Tuy nhiên để tăng hiệu suất chiết CGA từ hạt cà phê xanh cần có nghiên cứu sâu nồng độ enzyme, tỷ lệ rắn: lỏng, nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy thời gian thủy phân thích hợp 40 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu tuyển chọn chủng Aspergillus niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh, đề tài rút số ết luận sau: - Đã tìm đƣợc chủng thích hợp có khả sinh tổng hợp pectinase chủng A.niger CR (63,843U/ml ) - Đã xác định đƣợc đặc tính pectinase từ chủng A.niger CR: bền pH 4,5 - 5,5; 30 - 50ºC pH tối ƣu 5,5; nhiệt độ tối ƣu 40oC - Đã bƣớc đầu xác định đƣợc CGA có bổ sung enzyme trình thủ phân thu đƣợc hàm lƣợng CGA 32,688 (mg/g nguyên liệu) 4.2 Kiến nghị Do hạn chế thời gian nghiên cứu nên thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân thích hợp pectinase hạt cà phê xanh để thu nhận CGA chƣa đƣợc triển hai đề tài Vì vậ đƣa iến nghị sau : - Nghiên cứu tách chiết CGA nhiều nguồn cà phê xanh khác - Xác định điều kiện thủy phân thích hợp nhƣ: nồng độ enzyme, tỷ lệ rắn: lỏng, nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy thời gian thủy phân thích hợp 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Anh Dũng, Mai Thị Ngọc Lan Thanh, Trần Thị Ngọc Nhƣ –Nghiên cứu thu nhận pectinase từ A.niger nuôi cấy môi trường Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng (2008) Thu nhận enzyme pectinase từ Asp.niger - tinh phƣơng pháp lọc gel & lọc màng Science & Technology Development 11(08): 46 – 50 Abebe Ayelign and Kebba Sabally Determination of chlorogenic acids (CGA) in coffee beans using HPLC American Journal of Research Communication, 2013, 1(2): 78-91} Ahmeda I., Ziaa M.A., Hussaina M.A., Akramb Z., Naveedc M.T., Nowrouzi A (2016) Bioprocessing of citrus waste peel for induced pectinase production by Aspergillus niger; its purification and characterization Journal of Radiation Research and Applied Sciences 9(2): 148-154 Akhter N., Morshed M.A., Uddin A., Begum F., Sultan T., Azad K.A (2011) Producrion of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid state media International Journal of Biosciences 1(1): 33 - 42 Antier P., Minjares A., Roussos S., Raimbault M., Gustavo V.G (1993) Pectinase-hyperproducing mutants of Aspergillus niger C28B25 for solid-state fermentation of coffee pulp Enzyme and Microbial Technology 15(3): 254-260 Banu A.R., Devi M.K., Gnanaprabhal G.R., Pradeep B.V., Palaniswamy M (2010) Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium chrysogenum Indian Journal of Science and Technology 3(4): 377 - 381 Bai Z.H., Zhang H.X., Qi H.Y., Peng X.W., Li B.J (2004) Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance- Bioresource Technology 95(1): 49-52 Castilho L.R., Medronho R.A., Alves T.L.M (2004) Production and extraction of pectinases obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with Aspergillus niger Bioresource Technology 71(1): 45-50 10 Hannan A., Bajwa R., Latif Z (2009) Status of Aspergillus niger strains for pectinases production potential Pakistan Journal of Phytopathology 21(1): 77 - 82 11 Islam S., Feroza B., Alam A.K.M.R., Begum S (2013) Pectinase production by Aspergillus niger isolated from decomposed apple skin Bangladesh J Sci Ind Res 48(1): 25-32 12 Khatri B.P., Bhattarai T., Shrestha S., Maharjan J (2015) Alkaline thermostable pectinase enzyme from Aspergillus niger strain MCAS2 isolated from Manaslu Conservation Area, Gorkha, Nepal Springer Plus 4: 488 13 Maciel M.H.C., Herculano P.N., Porto T.S., Teixeira M.F.S., Moreira K.A., Souza-Motta C.M (2011) Production and partial characterization of pectinases from palm by Aspergillus niger URM4645 African Journal of Biotechnology 10(13): 2469 - 2475 14 Maldonado M.C., Saad A.M.S (1998) Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state systems Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology, 34- 38 15 Martos M.A., Vazquez F.M., Benassi F.O., Hours R.A (2009) Production of pectinase by A niger: Influence of fermentation conditions Brazilian Archives of Biology and Technology 52(3): 567 572 16 Motwani D.R., Meshram V.G., Jambhulkar V.S (2013) Partial characterization of pectinase produced by Aspergillus niger grown on wheat bran International Journal of Scientific & Engineering Research 4(12): 345 – 365 17 Mukesh kumar D.J., Saranya G.M., Suresh K., Andal Priyadharshini D., Rajakumar R., Kalaichelvan P.T (2012) Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp MFW7 using Cassava Waste Asian Journal of Plant Science and Research (3): 369-375 18 Mukadam D.S., Chavan A.M., Taware A.S., Taware S.D (2010) Isolation, cloning and molecular characterization of polygalacturonase I (pgaI) gene from Aspergillus niger isolation from mango Indian journal of Biotechnology 9: 153 - 159 19 Mrudula S., Anitharaj R (2011) Pectinases production in solid state fermentation by Aspergillus niger using orange peel as substrate Global Journal of Biotechnology & Biochemistry 6(2): 64 - 71 20 Phutela U., Dhuna V., Sandhu S., Chadha B.S (2005) Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels Brazilian Journal of Microbiology 36: 63 - 69 21 Reginatto C., Rossi C., Miglioranza B.G., Santos M., Meneghel L., Silveira M.M., Malvessi E (2017) Pectinase production by Aspergillus niger LB-02-SF is influenced by the culture medium composition and the addition of the enzyme inducer after biomass growth Process Biochemistry 58:1-8 22 Uzoma O.A., Ihuaku O.V., Joy O., Adedotun A.A., Albert E.O., Blessing O.M (2009) Pectinase production by UV-2DG resistant mutant of Aspergillus niger with a catabolite repression resistance activity FASEB Journal 23(1) 22 Yang sun cộng (2017) Ionic liquid-based enzyme-assisted extraction of chlorogenic acid from Flos Lonicera Japonicae 23 Fintelmann V Tác dụng hạ sốt lipid chiết xuất actiso - kết nghiên cứu lâm sàng hiệu khả dung nạp sở trƣờng Hepar-SL liên quan đến 553 bệnh nhân J Gen Med 1996; 2: 319 24 Gebhardt, R Các đặc tính chống oxy hóa bảo vệ chất chiết xuất từ actiso (Cynara scolymus L.) chống lại stress oxy hóa gây hydroperoxide tế bào gan chuột nuôi cấy Toxicol Appl Pharmacol 1997; 144 (2): 279-286 919441 25 Roscini, A R., Trinca, F., Gemelli, F., Vaudo, G., Mannarino, Lupattelli, G., Marchesi, S., Lombardini, R., E Nƣớc ép Actiso cải thiện chức nội mô bệnh mỡ máu Đời khoa học 12-31-2004; 76 (7): 775-782 15581909 ... Aspergillus niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh? ?? nhằm lựa chọn đƣợc chủng A niger có khả sinh tổng hợp enzyme pectinase cao để chiết tách CGA từ hạt. .. Tu ển chọn đƣợc chủng A .niger có sinh tổng hợp pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh 2.2.Nội dung nghiên cứu  Tuyển chọn chủng A niger có sinh tổng hợp pectinase cao. .. tuyển chọn chủng Aspergillus niger có khả sinh tổng hợp pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê xanh, đề tài rút số ết luận sau: - Đã tìm đƣợc chủng thích hợp có khả sinh tổng