nghiên cứu gen vta4 đến quá trình phát triển và gây bệnh của nấm verticillium dahliae

Kết quả chuyển gen tạo thể bổ trợ VTA4 trên nấm V.. Kiểm soát các gen i qu ế gi i ạ ầu quá trình lây nhiễm hư: ge tham gia vào quá trình bám dính, gen tham gia vào quá trình hình thành c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GEN VTA4

ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN VÀ GÂY BỆNH

CỦA NẤM VERTICILLIUM DAHLIAE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN, NĂM 2022

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GEN VTA4

ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN VÀ GÂY BỆNH

CỦA NẤM VERTICILLIUM DAHLIAE

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Nguyễn Phú Hùng

2 TS Nguyễn Thị Hương

Thái Nguyên, năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

T i xi y g tr h ghi u t i th hiệ ư i

s hư g PGS TS Nguyễ Phú Hù g v TS Nguyễ Thị Hươ g Mọi trí h tr g uậ vă ều ghi rõ guồ gố Cá số iệu, kết quả ghi u tr g uậ vă tru g th v hư từ g i g bố tr g ột công trình nào khác

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022

Tác giả

Nguyễn Thị Anh

LỜI CẢM ƠN

Lời ầu ti t i xi ược bày tỏ lòng biết ơ s u sắc t i PGS TS Nguyễn Phú Hùng, TS Nguyễn Thị Hươ g Kh C g ghệ Sinh học, Trườ g Đại học Khoa họ Đại học Thái Nguyên và các thầy cô tại phòng thí nghiệm Sinh học khoa Công nghệ Sinh họ trườ g ại học Nông Lâm Thái Nguyên ã tận tình hư ng d n, chỉ bảo v giúp ỡ tôi trong suốt thời gian

th c hiện và hoàn thành luậ vă y

Tôi xin chân thành cả ơ B giá hiệu, Ban ch nhiệm Khoa Công nghệ Sinh họ Trườ g Đại họ Kh họ - Đại họ Thái Nguy , ặc biệt là

s qu t , giúp ỡ c á h hị k thuật vi ph g thí ghiệ kh ã

tạ iều kiệ giúp ỡ tôi trong quá trình làm luậ vă thạ sĩ

Tôi xin cảm ơ gi ình và bạn bè luôn bên cạnh ng hộ, khuyến khích, ộng viên tạ ộng l ể tôi hoàn thành luậ vă y

Trong quá trình làm luậ vă kh g trá h khỏi những sai sót, tôi mong nhận ược s ó g góp quý báu từ phía thầy cô và bạ bè ể tôi hoàn thành bản luậ vă

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022

Tác giả

Nguyễn Thị Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọ ề tài 1

2 Mục tiêu nghiên c u 2

3 Nội dung nghiên c u 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Gi i thiệu nấm bệnh Verticillium dahliae 3

1.1.1 Nấm Verticillium dahliae gây bệnh trên cây trồng 3

1 1 2 Đặ iểm xâm nhiễm c a nấm Verticillium dahliae 4

1 1 3 Đặ iểm bệnh do nấm Verticillium dahliae 5

1 1 4 V g ời c a nấm Verticillium dahliae 7

1.2 Tổng quan nghiên c u nấm Verticillium dahliae trên thế gi i và trong ư c 8

1.2.1 Tổng quan về nấm Verticillium dahliae trên thế gi i 8

1.2.2 Tổng quan về nấm Verticillium dahliae tr g ư c 9

1.3 Protein bám dính và quá trình gây bệnh ở nấm bệnh 10

1.3.1 Protein bám dính ở nấm men 12

1.3.2 Protein bám dính ở hệ nấm sợi 13

1.3.3 Protein bám dính ở nấm Verticillium dahliae 13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên c u 15

2 2 Đị iểm và thời gian nghiên c u 15

2 2 1 Đị iểm nghiên c u 15

2.2.2 Thời gian nghiên c u 15

2 3 Phươ g pháp ghi u 16

2 3 1 Phươ g pháp ph tí h ti học 16

2 3 2 Phươ g pháp h ge v gắn nối 16

2 3 3 Phươ g pháp tạo thể xóa gen 17

2 3 4 Phươ g pháp tạo thể bổ trợ 17

2 3 5 Phươ g pháp huyển gen vào vi khuẩn A tumefaciens 17

2 3 6 Phươ g pháp huyển gen vào nấm Verticillium dahliae 18

2 3 7 Phươ g pháp tá h hiết DNA từ Verticillium 18

2 3 8 Phươ g pháp kiểm tra nấm chuyển gen bằng phản ng PCR hoặc lai phân tử 19

2 3 9 Phươ g pháp á h giá kiểu hình c a thể xóa gen và thể bổ trợ 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Kết quả thiết kế vector xóa gen và vector bổ trợ 22

3.1.1 Kết quả thiết kế vector xóa gen 22

3.1.2 Kết quả thiết kế vector bổ trợ 27

3.2 Kết quả chuyển gen tạo thể xóa gen và thể bổ trợ ở nấm V dahliae 32

3.2.1 Kết quả chuyển gen tạo thể xóa gen VTA4 trên nấm V dahlia 32

3.2.2 Kết quả chuyển gen tạo thể bổ trợ VTA4 trên nấm V dahlia 35

3.3 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g bá í h, si h trưởng, phát triển và gây bệnh c a nấm V dahliae 37

3.3.1 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g bá í h c a nấm V dahliae trên bề mặt nhân tạo 37

3.3.2 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ế quá tr h si h trưởng c a nấm V dahliae 39

3.3.3 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g tạo bào tử 44

3.3.4 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến quá trình xâm nhiễm và gây bệnh trên cây cà chua 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

1 Kết luận 48

2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Kết quả thiết kế vector xóa gen VTA4 22 Hình 3.2 Kết quả nhân dòng trình t phí trư c và phía sau gen VTA4 23 Hình 3.3 Kết quả kiểm tra vector xóa gen VTA4bằng enzyme cắt gi i hạn XhoI 24 Hình 3.4 Kết quả so sánh trình t DNA thu ược bằng mồi VTA4F1-F v i

trình t vector pKO211-VTA4 25 Hình 3.5 Kết quả so sánh trình t DNA thu ược bằng mồi VTA4F2-R v i

trình t vector pKO211-VTA4 26 Hình 3.6 Kết quả thiết kế vector bổ trợ gen VTA4 27 Hình 3.7 Kết quả h ạn trình t VTA4comp bằ g phươ g pháp PCR 28 Hình 3.8 Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp pGreen3-VTA4 bằng enzyme cắt

gi i hạn BamH1 29 Hình 3.9 Kết quả so sánh trình t DNA thu ược bằng mồi VTA4comp-F v i

trình t vector pGreen3-VTA4 30 Hình 3.10 Kết quả so sánh trình t DNA thu ược bằng mồi VTA4comp-R

v i trình t vector pGreen3-VTA4 31 Hình 3.11 Kết quả á h giá á thể xóa gen VTA4 bằng k thuật PCR 33 Hình 3.12 Kết quả kiểm tra thể xóa gen VTA4 bằ g phươ g pháp i

Southern blot 34 Hình 3.13 Kết quả kiểm tra thể bổ trợ VTA4 bằ g phươ g pháp i S uther

blot 36 Hình 3.14 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g bá

dính c a nấm V dahliae trên bề mặt plastic 38 Hình 3.15 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g si h

trưởng c a nấ V h i e tr i trường CDM 39 Hình 3.16 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g si h trưởng

c a nấ V h i e tr i trường v i các nguồn carbon khác nhau 41

H h 3 17 Đá h giá khả ă g si h trưởng c a các ch ng nấm V dahliae trên

i trường CDM v i chất oxi hóa khác nhau 43 Hình 3.18 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g tạo

vi bào tử 44 Hình 3.19 Kết quả á h giá ả h hưởng c ge VTA4 ến khả ă g x

nhiễm và gây bệnh trên cây cà chua 46

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Nấm Verticillium dahliae là một loại nấm bệnh nguy hại ở th c vật

Chúng là nguyên nhân chính gây lên bệnh héo và già s m ở nhiều loại cây trồng khác nhau và có khả ă g tồn tại tr g i trườ g ất ế 15 ă

Theo thống kê, loại nấm gây bệnh này có t i hơ 200 ại ký ch khác nhau

bao gồm nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế hư hu , kh i t y, ải bắp, súp ơ, t chuông

Biện pháp khống chế tác hại c a nấm Verticillium dahliae lên cây trồng

ã v g ược nghiên c u tại nhiều ư c trên thế gi i Tuy nhiên, hiện v n

hư t ược loại thuố ặc trị nấm bệnh này một cách hiệu quả mà ch yếu hiện nay v n sử dụng hóa chất ể diệt nấm Các loại hóa chất y thường gây

ả h hưởng t i cân bằng sinh thái, vật u i v gười

Nhằm phát triể phươ g pháp trị nấm mang lại hiệu quả , ít ộc hại

h gười và vật nuôi Gầ y á h kh họ ư r giả thuyết về khống chế nấm bệnh một cách hiệu quả bằ g á h gă hặn quá trình biểu hiện c a các gen quan trọ g i qu ế bư ầu quá trình xâm nhiễm vào cây trồng Kiểm soát các gen i qu ế gi i ạ ầu quá trình lây nhiễm hư: ge tham gia vào quá trình bám dính, gen tham gia vào quá trình hình thành cấu trúc xâm nhiễm, các gen th gi khá g ộc tố do vật ch tiết r …

ều có tác dụ g gă hặn s xâm nhập c a nấm vào vật ch Tuy hi , ể phát triể ược giả thuyết ói tr , ơ hế bư ầu c a quá trình xâm nhiễm

và gây bệnh cầ ược tìm hiểu rõ hơ Nghi u tươ g tá giữa nấm

Verticillium dahliae và Arabidopsis ã hỉ ra có 798 gen ở nấ y tă g

ường biểu hiện trong suốt quá trình lây nhiễm H i ươi b ge trong số ó ược cho là cần cho quá trình tạo vi bào tử c a nấm bệnh, cấu trúc thể nghỉ giúp nấm bệnh này kháng lại á iều kiện ngoại cảnh bất thuận Vai trò c a

các gen ói tr hư ược nghiên c u ở trên nấm bệnh nói chung và ở nấm

Verticillium dahlia nói riêng Việc nghiên c u vai trò c a các gen liên quan

ế bư ầu xâm nhiễm và tạo thể nghỉ này góp phầ rõ hơ ơ hế c a

quá trình xâm nhiễm và gây bệnh ở nấm Verticillium dahliae Xuất phát từ

th c tiễn trên, v i mục tiêu hiểu rõ hơ về các gen c a nấm Verticillium dahliae cầ h bư ầu quá trình xâm nhiễm vào một trong những ký ch

chính, cây cà chua, và ch ă g a chúng ở cấp ộ phân tử Chúng tôi th c

hiện ề t i: “Nghi u ả h hưởng c a gen VTA4 ến quá trình phát triển và gây bệnh c a nấm Verticillium dahliae”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xá ị h ược ả h hưởng gen VTA4 ến quá trình phát triển và gây bệnh c a nấm Verticillium dahliae

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo vector xóa gen VTA4 và vector bổ trợ cho thể xóa gen VTA4 ở nấm Verticillium dahliae

- Xóa gen VTA4 và tạo thể bổ trợ trên nấm Verticillium dahliae

- Đá h giá ặ iểm kiểu hình c a thể xó ge tr g á iều kiện khác nhau

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu nấm bệnh Verticillium dahliae

1.1.1 Nấm Verticillium dahliae gây bệnh trên cây trồng

Nấm Verticillium thuộc một chi nấm trong bộ Ascomycota, là loại nấm

bệ h iển hình ở th c vật Chúng là nguyên nhân chính gây lên bệnh héo và già s m, thiệt hại về ă g suất c a nhiều loại cây trồng ở tr hơ 200 ại ký

ch khác nhau: bao gồm nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế hư chua, khoai tây, cải bắp, súp ơ, t chuông [2] Có ba ch ng khác nhau c a

nấm Verticillium bao gồm Nấm V albo-atrum, V dahliae, và nấm V longisporum Mỗi ch ng có s ạng khác nhau về ký ch Ch ng V longisporum có ký ch rộ g hơ s v i hai dòng còn lại [2,32]

Nghiên c u về s phân bố c a nấm Verticillium, chỉ ra rằng nấm phân

bố rộng rãi gầ hư tr t thế gi i Nấm có thể phân bố rộng khắp hư vậy nên có khả ă g tạo thể nghỉ trong tất cả các bộ phận c a cây khi tấn công

v Người ta tìm thấy thể nghỉ c a nấm này trên thân, rễ, lá, hoa, quả và thậ hí ó ược tìm thấy cả trong hạt c a cây trồng Bên cạnh việc tạo

thể nghỉ ở tất cả các bộ phận c a cây, nấm Verticillium còn tạo thể nghỉ rất

nhỏ Đ y ột trong nhữ g ặ iểm giúp nó có thể dễ dàng phát tán theo

g ư c trên mặt ất khi gặp ư [2,16,32] S u khi ảy mầm nấm tồn tại

ở dạng sợi nấm Nấ Verticillium dahliae (V dahliae) tiết r pr tei khá g

khuẩ V AMP3 ể iều khiể hệ vi si h vật th vật hư ột tá h

g y hiệu g, á ph tử hiệu g hằ ụ ti u v á th h phầ hệ thố g iễ ị h vật h , ế hế iễ ị h Cá tá giả ã hỉ r rằ g

hữ g ụ ti u y ở rộ g ế á ư quầ xã vi si h ở vật h :

tr g quá tr h x hiế vật h , ph tử V AMP3 gă hặ á si h vật

ó í h tr g hệ vi si h vật th vật, ế rối ạ hệ vi si h vật h ặ rối ạ si h họ , ể ấ ó thể h th h v g ời h v tạ r thế

hệ háu ó thể y v bắt ầu quá tr h hiễ bệ h i Nhữ g phát

hiệ y h g i h rằ g á tá h g y bệ h sử ụ g á ph tử khá

h u ở á gi i ạ khá h u quá tr h bệ h ể iều khiể hệ vi sinh vật khỏe ạ h vật h ể g y bệ h Điều y h thấy rằ g iều qu trọ g phải h x hơ s tươ g tá hị ph giữ ầ bệ h v vật h

ếu hú g t uố hiểu về bệ h Th y v ó, hú g t ũ g phải tí h ế

chia thành 2 dạng, dạng 1 phát triể tr v tr g i trườ g i h ưỡng, dạng th 2 là phát triển trong không khí Dạng phát triển trong không khí thường rất yếu, nó dễ dàng bị gió thổi rạp xuống bề mặt i trường dinh

ưỡ g Chí h v ặ iểm có sợi nấm trong không khí nên nấ y ược xếp vào nhóm nấm mố Đầu c a các sợi nấm có thể có các chùm ch a nhiều bào

tử hình tr ng Bào tử y ó kí h thư c rất nhỏ, không có melanin nên và có màng rất mỏng Do vậy nó dễ phát tá v y h h tr ồng ruộng [2,4, 16,32] Bên cạ h ặ iểm về cấu tạ ặc biệt, ặ iểm xâm nhiễm c a nấm

s u ó phát triển theo hệ thống mô mạch c a cây rồi phát tán ra toàn bộ cây

trồng Thể nghỉ c a nấm V dahliae thườ g ó u e chất melanin có

ược tạo ra bên trong tế bào thể nghỉ Chất melanin này có tác dụng bảo vệ thể nghỉ khỏi tá ộng c a tia b c xạ mặt trời, các yếu tố i trường bất thuậ hư ồ g ộ axit cao[2,32]

Nấm V dahliae phát hiện ra vật ch thông qua khả ă g nhận biết ra

các dịch tiết từ rễ cây Bào tử nấm sẽ nảy mầm và ống nấm sẽ phát triển về

hư ng rễ c a vật ch , s u ó tạo thành cấu trú ể xâm nhiễm thông qua thành tế bào rễ Cấu trú y thườ g ó kí h thư t hơ sợi nấ , thường trươ g ể tạo áp l xuy qu th h tế bào c a vật ch Sau khi vào bên trong tế bào vật ch , nó sử dụ g i h ưỡng bên trong tế b ể tiếp tục phát triển và tấn công lên các phần khác c a cây trồng [2,4,32] Khi cây nhiễm bệnh chết chúng có khả ă g tạo thể nghỉ trên tất cả các bộ phận c a cây, một loại cấu trúc vi bào tử có l p melanin dày L p melanin này giúp

nấm V dahliae có khả ă g khá g ượ iều kiện ngoại cảnh bất thuậ hư

ánh sáng uv từ mặt trời, hóa chất diệt nấ , h y iều kiệ ù g ạnh [39], thậm chí còn giúp nấm bệnh có khả ă g số g sót s u khi i qu hệ tiêu hóa

c a vật nuôi [40] Do vậy, cấu trúc vi bào tử này có khả ă g tồn tại tr g ất

t i 15 ă kh g ần t i ký ch [2,19] Nghiên c u s phát tán c a nấm

V dahliae tr y hư g ươ g hỉ ra rằng chúng có thể tạo thể nghỉ trên tất

cả các bộ phận c a cây bao gồm cả hạt, một trong những sản phẩm c a cây

trồ g thườ g xuy ượ tr ổi trên thế gi i [19] Nấm V dahliae thường

tạo ra triệu ch g hé rũ ở cây bị bệnh[2,21,22,32]

1.1.3 Đặc điểm bệnh do nấm Verticillium dahliae

Bệnh héo Verticillium gây ra bởi nấm Verticillium dahliae tr g ất,

ược gọi là "bệ h u g thư" a cây trồ g, ã trở thành một trong những bệnh tàn phá nghiêm trọng nhất ở các vùng trồ g y ă quả, làm thiệt hại

á g kể sinh khối th c vật, ă g suất và chất ượng sản phẩm trên toàn thế

gi i D ặc tính gây bệnh rất ạng và s c sống mạnh mẽ nên việc kiểm

soát bệnh héo Verticillium v ù g khó khă Héo là một triệu ch g iển hình c a bệnh Mặc dù v g tr h uậ , hư g g y g ó hiều bằng ch ng ng hộ giả thuyết rằng triệu ch ng héo là do hoạt ộng c ộc

tố, ch không phải do tắc mạ h Độc tố do V dahliae tạo ra bao gồm ph c

hợp lipopolysaccharide protein có trọ g ượng phân tử , peptit g y ộc

th c vật và thấp các chất chuyển hóa trọ g ượng phân tử, ược coi là yếu tố

ộc l c quan trọng c a bệnh Giải ộc các chất ộc hiệ g ổi hư ột công cụ ể kiểm soát bệnh Tuy hi , gười ta còn biết rất ít về ơ hế phát

tán c ộc tố V dahliae, iều này làm hạn chế s hiểu biết c a chúng ta về

các quá trình gây bệnh c a bệnh

Nấm V dahliae là tác nhân gây bệnh cho nhiều loại cây, bao gồm cây

trồ g tr g h kí h hư hu v r u iếp, cả cây ô liu, cây cảnh và hoa, bông, khoai tây, và những loại cây khác Nghiên c u hiện tại cho thấy nấm này tiết ra protein kháng khuẩ V AMP3 ể iều khiển hệ vi sinh vật c a

th c vật hư ột tác nhân gây hiệu ng Bệnh héo do nấm V dahliae, một loài nấ ư trú tr g ất trồng xâm lấn các mô mạch c a cây Nấm V dahliae có phạm vi vật ch rộng, làm cho các mô mạch chuyển màu và làm chết héo nhiều loại cây trồng kinh tế Các bào tử do nấm V dahliae sản sinh

ra có thể tồn tại ở á iều kiệ i trường ruộng cây t i 14 ă kể cả khi thiêu vật ch Bào tử nấm nảy mầm trong vùng lân cận c a hệ rễ và tạo ra s

lây nhiễm Bệnh héo do nấm V dahliae phát triển mạ h hơ khi ó kh g khí

mát và nhiệt ộ ất cao

Do vậy, rất dễ nhận biết các cây trồng bị bệnh nặ g ặ iể hé rũ

c a cây bị bệ h Đối v i cây khỏe, gười t ũ g ễ dàng phân biệt ược so

v i các cây khỏe khi cắt ngang hoặc trẻ dọc gốc cây Cây bị bệ h thường có triệu ch ng hình thành vết e tr gốc cây do chất melanin từ cây tạo ra xung quanh sợi nấm Rễ cây bị bệ h thườ g ũ g phát triể ké hơ hiều so

v i cây khỏe Do vậy, cây bị bệnh chúng ta có thể dễ dàng nhổ lên khỏi mặt

ất Khi cây bị bệnh nặng, giải ph u cây cho thấy có thể tìm thấy dấu hiệu

bệ h hư tr ở hầu hết các bộ phận trên cây trồng Khi cây trồng bị bệnh

chết, nấm V dahliae sẽ tạo ra thể nghỉ trên tất cả các bộ phận c a cây trồng

[2,16,32] Các bào tử sẽ ược phát tán t tr g ất khi cây trồng mục và bắt ầu v g ời m i

1.1.4 Vòng đời của nấm Verticillium dahliae

Nấ Verticillium rất ạ g, v g ời ơ bả ầ bệ h tươ g t

h u giữ á i, g ại trừ ấu trú tồ tại hú g Cá ấu trú tồ tại

khá h u tùy the i v i V albo-atrum h h th h sợi ấ , ấ V dahliae hình thành microclerotia, V.nigrescens và V.nubilum h h th h b tử chlamydospores và V tricorpus tạ th h ả b ại tr Trong khi ghỉ gơi,

hiều yếu tố hư ất, hiệt ộ, hy r t hó , hệ ộ g vật vi si h v y trồ g

kh g phải ký h ều ó ả h hưở g ế khả ă g tồ tại ấu trú ghỉ

gơi V g ời c a nấm V dahliae tùy thuộc vào chu kỳ si h trưởng c a vật

ch , ược bắt ầu khi cảm biế ược s xuất hiện c a rễ cây trồ g ể nảy

mầ S u ó x hập vào vật ch thông qua rễ trư c khi phát triển lên các bộ phận phía trên c a cây Khi rễ y h , ế gầ ấu trú ghỉ (kh ả g 2 ),

ị h tiết r từ rễ thú ẩy s ảy ầ v ấ phát triể r khỏi ấu trú về phía cây, ấ sẽ ố gắ g i v hệ thố g ạ h ở b tr g y Vết thươ g ở

rễ t hi ườ g x hập ễ hất v hữ g vết thươ g y xảy r ột

á h t hi , g y ả ở hữ g y khỏe ạ h ất i rễ Nấ V dahliae người t ũ g qu sát thấy s x hập tr tiếp v rễ Một khi ầ

bệ h x hập v vật h , nấ ó thể y ư i ạ g sợi ấ qu y,

hư g ũ g ó thể y ư i ạ g b tử Đ i khi g hảy b tử sẽ bị

hặ ại bởi á ặt ắt g g xy e , v ở y b tử sẽ si h sả , v sợi

ấ ó thể vượt qu r ả tạ r hiều b tử hơ ở phí b ki C y bị hiễ bệ h ặ g ó thể kh g hố g họi ổi v i bệ h v hết

B ạ h việ tồ tại u tr g ất, ấ V dahliae ó thể y the

hiều á h Cá h phổ biế hất ể truyề kh ả g á h gắ th g qu tiếp xú từ rễ t i rễ tr g ất Rễ tr g iều kiệ t hi thườ g ó hữ g

tổ thươ g hỏ h ặ ỗ hổ g tr hú g ễ bị x ấ bởi ấ V dahliae từ

ột gố bị hiễ bệ h gầ ó Đã phát hiệ thấy b tử si h sả tr g kh g khí v qu sát thấy ột số khuẩ ạ , hư g hầu hết á b tử y khó phát triể tr ặt ất hữ g y khỏe ạ h Nếu kh g ó biệ pháp xử ý hạt giố g iệt ấ , hạt bị hiễ bệ h sẽ ễ g ượ vậ huyể v bệ h y

lan, và V dahliae ã ượ qu sát thấy v tồ tại ít hất 13 thá g tr ột

số hạt giố g Trồ g kh i t y giố g bị hiễ bệ h ũ g ó thể guồ truyề bệ h h ruộ g i Cuối ù g, trù g ũ g ã ượ h g i h

ó thể truyề bệ h Nhiều ại trù g b gồ rầy á kh i t y, g ắt

á, v rệp sáp ã ượ qu sát thấy truyề b tử ấ V dahliae v bởi

v hữ g trù g y ó thể g y hại h y trồ g

Để phát tán trong cây nấm Verticillium d a trên hai khả ă g Th nhất

nó hình thành sợi nấm rất nhỏ ể tấn công vào các tế bào Th hai, nó tạo ra các vi bào tử, có thể phát tán theo dịch c a cây trồ g i ến các bộ phận khác nhau c a cây từ ó phát triển tại ó trư c khi gây các triệu ch ng bệnh khi

cây gặp vấ ề bất thuận Khi cây ch yếu hoặc già, nấm V dahliae sẽ tạo thể

nghỉ bên trong thân cây ở tất cả các bộ phận c a cây Khi cây chết và mục, thể nghỉ này sẽ phát tá r tr g ất Chúng có thể tồn tại tr g ất ế 15 ă không cần vật ch Khi gặp vật ch m i nấm lại bắt ầu một v g ời m i [2,4,16,32,36]

1.2 Tổng quan nghiên cứu nấm Verticillium dahliae trên thế giới và

trong nước

1.2.1 Tổng quan về nấm Verticillium dahliae trên thế giới

Nấm Verticillium dahliae là một loại nấm dị ưỡng số g tr g ất có

thể d ến bệ h hé rũ th c vật gây ra thiệt hại kinh tế á g kể trên toàn thế

gi i Nă g suất thiệt hại trung bình c a cây bông do bệnh héo Verticillium gây

ra nhiều Vì việc kiể s át ă bệnh này là một nhiệm vụ cấp bá h ối v i nhiều quốc gia nên việc hiểu thêm về s tươ g tá giữa th c vật và nấm

Verticillium dahliae iều cần thiết Nấm có thể thú ẩy hoặc c chế s

phát triển c a th c vật, iều này rất quan trọng Tuy nhiên, mối quan hệ quan trọng nhất giữa th c vật và nấm là mối quan hệ vật ch - mầm bệnh Th c vật

có thể kháng lại nấm Verticillium dahliae th g qu á ơ hế ạ g hư

th y ổi thành tế bào, enzym ngoại bào, thụ thể nhận dạng m u, yếu tố phiên

ã v ường d n truyền tín hiệu liên qu ến axit salicylic (SA) / axit jasmonic (JA) / ethylene (ET)

Một số nghiên c u về ơ hế sinh lý và phân tử c a khả ă g khá g

nấm Verticillium dahliae c a th c vật ã ược th c hiện [34] Một loại

protein bảo vệ th c vật, protein c chế polygalacturonase (PGIP), có thể c chế ặc hiệu endo-polygalacturonase Hơ ữa, s thể hiện quá m c c a CkPGIP1 từ Cynanchum komarovii và GhPGIP1 từ G ssypiu ờm trong

bông có thể cải thiện s ề kháng c b g ối v i V Dahliae

1.2.2 Tổng quan về nấm Verticillium dahliae trong nước

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam từ u ã hận ra tầm quan trọng c a bệnh cây trong nông nghiệp Bộ có một mạ g ư i rộng

l n các trung tâm nghiên c u và một mạ g ư i cán bộ bảo vệ th c vật tại các cấp tỉnh và huyện trên khắp Việt Nam Những thành viên trong mạ g ư i này

hỗ trợ công tác chẩ á bệnh cây và cung cấp thông tin về các biện pháp phòng trừ bệnh Nhiệm vụ này là một thử thách l n, do s phong phú c a cây trồng, bệnh hại, và s ạng c a các vùng khí hậu ở Việt Nam Việc phòng trừ bệnh hại thành công phụ thuộc vào việ xá ịnh chính xác bệnh và tác nhân gây bệnh Một số bệ h th g thường có thể ược chẩ á hí h xá

tr ồng ruộng thông qua các triệu ch g iển hình Tuy nhiên, có nhiều bệnh có các triệu ch g kh g iể h h tươ g t h u ( hư hé rũ, i ọc,

vàng lá) Theo ghi nhận c a EPPO Global Database, nấm V dahliae phân bố

rộng rãi và phát triển tạo dòng m i trên toàn thế gi i ở những vùng có khí hậu

mát mẻ [2] Nhiều biến ch ng c a nấm V dahlia ược phân lập ở các vùng

khác nhau trên thế gi i bao gồ á ư c ở cả 5 châu lụ Đặc biệt có nhiều biến ch ng m i ược phân lập ở Trung Quốc, khu v c thuộc tỉnh Yunnan gần biên gi i phía bắ ư c ta [7] Theo ghi nhận c Burgess ă 2008, ở Việt

Nam, hiệ hư ó g bố về phát hiện ch ng Verticillium m i Tuy nhiên, gười t ã phát hiện ra một số ch ng Verticillium ượ ư từ ư c ngoài

v th g qu tr ổi nông sản từ nhữ g ă 2008 Bá á y ũ g hỉ ra

rằng nấm V dahliae nó thích hợp và phát triển mạnh tại một số khu v c tây

bắc và khu v Đắc Lắc c a Việt Nam [5] Th c trạng ả h hưởng c a nấm bệnh này lên nông sản c a Việt N hư ượ á h giá ụ thể Do vậy, biện

pháp phòng ngừ ũ g hư khống chế nấm bệ h y hư ược nghiên c u

1.3 Protein bám dính và quá trình gây bệnh ở nấm bệnh

Protein th c hiện rất nhiều ch ă g b tr g tế bào, bao gồm các phản g tr ổi chất có xúc tác, sao chép DNA, áp ng lại kích thích,

và vận chuyển phân tử từ một vị trí ến vị trí khác S u khi ượ si h r , á

pr tei hỉ tồ tại tr g ột kh ả g thời gi hất ị h trư khi bị phân giải v ượ tái si h bởi bộ áy tế b th g qu quá tr h quay vòng protein (protein turnover) V g ời ột pr tei ượ bằ g hu kỳ bá

rã v ằ tr g ột kh ả g giá trị rất Cá pr tei kh g b h thườ g

h ặ gập x ắ bị ỗi thườ g ượ ph giải h h hơ , ó thể hú g bị

á h ấu ể phá h y h ặ trở kh g ổ ị h

Giố g hữ g ại ph tử si h họ polysaccharide và acid nucleic,

pr tei th h phầ thiết yếu ơ thể si h vật v th gi v ọi quá trình bên trong tế b Nhiều pr tei hữ g enzyme hất xúc tác cho

á phả g hó si h v ầ thiết h tr ổi hất Pr tei ũ g ó h

ă g ấu trú h ặ vậ ộ g, hư actin và myosin ở ơ v pr tei trong bộ xươ g tế b , tạ hệ thố g á khu g ỡ giúp uy tr h h á g hất ị h tế b Cá pr tei khá th gi v tí hiệu tế b , áp g

iễ ị h, kết í h tế b , và hu kỳ tế b

S bán dính c a nấm lên bề mặt vật ch là một nhân tố quan trọng cho tất cả các loài nấm Nó giúp cho nấm có thể tồn tại trên bề mặt c a vật ch

ư i tác dụng c a s rử tr i v á tá ộng c i trường S bám dính

c a nấm V dahliae cần có s tham gia c a các protein bám dính Nó góp

phầ tă g iện tích tiếp xúc giữa nấm v i bề mặt vật ch Pr tei y ã ược nghiên c u nhiều ở nấm men [15,26] S xâm nhập c a bề mặt rễ cần các protein kết dính ở một số gi i ạ tr g quá tr h tươ g tá giữa vật ch - ký sinh [3,15] Một số ge ó g v i tr qu trọng trong khả ă g bá í h v

ộc l c S bá í h ược nghiên c u k ưỡng trong nấm men, trong khi kiến th c c a chúng ta về nấm sợi v n còn hạn chế Saccharomyces cerevisiae mang gen keo tụ mã hóa chất kết dính liên kết v i thành tế

bào FLO1 và FLO11 thú ẩy quá trình keo tụ hoặc kết dính chất nền FLO1 ược yêu cầu cho cả kết dính và keo tụ, trong khi FLO11 chịu trách nhiệm

cho s kết dính bề mặt b ầu cung cấp một số l p tế bào Cả h i ge ều

ược kích hoạt bởi yếu tố phiên mã FLO8, ược kiểm soát bởi ường d n

truyền tín hiệu cAMP / PKA [13,33] Ch g ại bỏ FLO8 xuất S cerevisiae S288C BY4742 (Euroscarf, Frankfurt, Đ ) kh g tạ r pr tei FLO8 h ă g v ó kh g thể tạ r á b g ke tụ FLO1 và FLO11

ầ thiết Ch g y ượ sử ụ g ể ph tá h s bá í h V dahliae v ph ập á ge ụ thể ầ thiết ể tu th , ó thể kiể s át s

y hiễ s y trồ g H i ươi h i ge , ó thể ập tr h ại gen không

bám dí h ể bá í h tr ĩ thạ h, có trong Verticillium longisporum i bộ

ge tươ g qu v i 19 ge ơ V dahliae Điều y b gồ sáu hất

kí h h ạt phi ã Verticillium á ge bá í h (VTA) h á yếu tố

phi ã giả ị h Chỉ có VTA2 ã hó ột pr tei gó t y kẽ C 2 H 2 và

ầ thiết h s x hập rễ, s phát triể ấ , s h h th h b tử

v phả g v i stress xy hó VTA3 ột rth g RFX1/CRT1 S cerevisiae RFX1 ấ g y bệ h th vật ó g v i tr qu trọ g tr g việ sử hữ tổ thươ g DNA, ồ g hất hó , s phát triể ấ v khả

ă g g y bệ h

Nghi u y h thấy S 1 v VTA3 kiể s át á ạ g i truyề

ối v i á bư tuầ t s bá í h rễ y, s x hập V dahliae trư khi ó ạ g ư i kiể s át VTA2 S 1 quy ị h s biểu hiệ VTA2, VTA3 và các gen VTA khác Nó ũ g ầ thiết h s bá í h

thành tế bào Protein kết dính ở nấm men Sacharomyces cerevisiae ã ược nhiều nhà khoa học nghiên c u Một nhóm gen (FLO) ược biết ến có vai

tr tr g bá í h Có h i hó ge bá í h ược biết ến Nhóm th nhất

có ch a một ạn PA14 bao gồm các gen FLO1, FLO5, FLO9 và FLO10

Tr g ó ạn trình t PA14 mã hóa một carbohydrate có vai trò bám dính

FLO1, FLO5 và FLO9 gen có s giống nhau về trình t FLO1 cần cho cả quá

trình bám dính và kết t a [10,13,24,38,39] Nhóm th hai bao gồm gen

FLO11, nó cần cho quá trình bám dính bề mặt c a tế bào Pr tei y ược

iều khiển biểu hiện bởi một số ge iều khiể hư FLO8 và STE12 Chúng cần cho s biểu hiện c a gen FLO11 Thiếu ge iều khiển FLO8 hoặc STE12 làm cho gen FLO11 không hoạt ộng [13,30] Protein bám dính ở nấm sợi

gầ y ũ g ược quan tâm nghiên c u

1.3.2 Protein bám dính ở hệ nấm sợi

Protein ở nấm sợi hư ược biết ến nhiều Chú g thường liên quan

ế quá tr h g y ộc c a nấm Cấu trúc xâm nhiễm c a nấm sợi vào vật ch ược cho là có vai trò quan trọng trong quá tr h bá í h v g y ộc Có môt số ge ược biết ế i qu ến quá trình hình thành cấu trúc xâm nhiễ , bá í h v g y ộc ở nấm Chu trình cAMP/PKA và Pmk1 MAPK protein i qu ến quá trình hình thành cấu trúc xâm nhiễm và gây bệnh ở nấm gây bệnh ở cây lúa [8,25] Mac1 protein cần cho quá trình hình thành cấu

trúc xâm nhiễm và hình thành bào tử Mất gen MAC1 nấm M oryzae không

có khả ă g h h th h ấu trúc xâm nhiễm và hình thành bào tử MoSom1

ũ g ần có quá trình bám dính, hình thành cấu trúc xâm nhiễm và gây bệnh

c a nấm M oryzae AfSom1, một pr tei tươ g ồng v i MoSom1 ở nấm A fumigatus, ũ g ượ h ó i qu ến s bám dính và gây bệnh [1,25,26] Protein bám dính ở nấm V dahliae gầ y ũ g ược quan tâm

nghiên c u

1.3.3 Protein bám dính ở nấm Verticillium dahliae

Nấm V dahliae không giố g hư á ấm bệnh khác, không hình thành

nên cấu trúc xâm nhiễm l n mà tr c tiếp tấn công vào tế bào vật ch sau khi hình thành vị trí bám trên bề mặt Có một số ge ã ược nghiên c u có liên

qu ến quá trình bám dính và gây bệnh ở nấm V dahliae

Đầu tiên có thể ói ến protein VdPls1 Protein này biểu hiện mạnh ở

sợi nấm và nó cần cho quá tr h h h th h iểm bám dính ở nấm V dahliae

Mất gen này, nấm mất khả ă g hiế ó g v tạo ra các triệu ch ng bệnh

trên cây bông Tiếp ế , pr tei M 1 ƣợc biết ế hƣ ột pr tei iều

khiể i qu ến quá trình hình thành bào tử và gây bệnh c a nấm V dahliae Thể xóa gen MCM1 giảm 80% khả ă g tạo bào tử và không hình

thành thể nghỉ Thể xó ge y ũ g bị mất i khả ă g bá í h tr bề mặt nhân tạo và gây bệnh trên cây cà chua [41,42] Các protein bám dính ở

nấm Verticillium longisporum ƣợc sàng lọc d a trên khả ă g phục hồi tính bám dính c a nấm men S Cerevisiae ột biến gen FLO8 Tác giả ã t r 6

ge iều khiển có khả ă g phục hồi tính bám dính c a nấm S cerevisiae ột biế Tr g ó, VTA1 ƣợc biết ế hƣ ột nhân tố iều khiển quá trình hình thành hợp chất th cấp và tạo màu c a thể nghỉ VTA2 ƣợc chỉ ra có

i qu ến s bám dính, hình thành bào tử và gây bệnh c a nấm V dahlia VTA3 kết hợp v i SOM1 iều khiển quá trình biểu hiện c a VTA1 và VTA2 [4,37] VTA4 và các protein còn lại hƣ ƣợc nghiên c u

1.3.4 Protein VTA4 và nghiên cứu về các đồng đẳng của nó

Trần và cộng s ã t thấy 6 ge iều khiển có khả ă g phục hồi tính

bám dính c a nấm S cerevisiae ột biế Tr g ó ả hai isogene c a gen VTA4 có khả ă g phục hồi tính bám dính c a ch ng nấ ột biến này (Trần, 2014) [34] Theo Bùi và cộng s , s biểu hiện c a gen VTA4 ƣợc kiểm soát

bởi nhân tố iều khiển phiên mã SOM1 Trong thể xóa gen SOM1, s biểu

hiện c a gen VTA4 giả i á g kể so v i thể hoang dại (Bùi và cộng s , 2019) [4] Ch ă g a gen VTA4 v á ồ g ẳng c a nó ở các sinh vật

khá hƣ ƣợc làm rõ

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu Đơn vị cung cấp

Nấm Verticillium dahliae JR2 Viện Vi sinh vật học phân tử, Trườ g Đại

học Tổng hợp Goettingen, Cộng hòa Liên

b g Đ c

Vi khuẩn E coli ch g DH5α Công ty Thermo scientific

Vi khuẩn A tumefaciens AGL1 Viện Vi sinh vật học phân tử, Trườ g Đại

học Tổng hợp Goettingen, Cộng hòa Liên

b g Đ c Cây cà chua MoneyMaker m n

cảm v i nấm V dahliae

Everswi ke , Đ Đ y giống cà chua

m n cảm v i nấm V dahliae Các bài báo

quốc tế yêu cầu phải sử dụng ch ng cà chua này trong các thí nghiệm về lây nhiễ ể có kết quả khách quan

Vector chuyển gen pKO211,

pGreen2 và pGreen 3

Viện Vi sinh vật học phân tử, Trườ g Đại học Tổng hợp Goettingen, Cộng hòa Liên

b g Đ c

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề t i ược th c hiện tại phòng thí nghiệm sinh học khoa Công nghệ sinh học Trườ g Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên c u từ tháng 10/2021- 6/2022

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân tích tin học

Ch ă g a protein nghiên c u ược d á bằ g hươ g tr h InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/), Pfam (https://pfam.xfam.org/)

và Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Vị trí protein trong tế bào ược d á bằ g hươ g tr h SeqNLS (http://mleg.cse.sc.edu/seqNLS/)

Dữ liệu về trình t gen sử dụng trong nghiên c u ược lấy từ ơ sở dữ liệu Ensemble fungi (http://fungi.ensembl.org/Verticillium_dahliaejr2/Info/Index) Cặp mồi ược sử dụ g tr g ề t i ược thiết kế d tr hươ g trình Primer3Plus

(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)

2.3.2 Phương pháp nhân gen và gắn nối

Đ ạn DNA nghiên c u sẽ ược nhân lên bằng phản ng PCR v i cặp mồi ặc hiệu có ch ầu treo là 17 nucleotit có trình t bổ sung v i trình t

h i ầu mở c a plasmid gố ã ược mở vòng bằng enzyme cắt gi i hạn

Đ ạn DNA sẽ ược gắn vào vector d a trên phản ng t cắt và nối c a enzyme T4 DNA polymerase v i thành phần và chu trình nhiệt hư s u:

Thành phần phản ng gắn nối sử dụng T4 DNA polymerase:

Chu trình nhiệt c a phản ng gắn nối:

- Đặt tr á 1 phút

- Chuyển sang bể ổn nhiệt 50oC 30 giây

- Đặt trên á 10 phút

2.3.3 Phương pháp tạo thể xóa gen

Đ ạn trình t 1,5 kb trư c gen và sau gen nghiên c u ược nhân lên

bằng phản ng PCR bằng enzyme Phusion high-fidelity DNA polymerase v i các cặp mồi ặc hiệu Đ ạn trình t phí trư c và phía sau lầ ượt ược gắn

vào giữa vị trí PacI/SacI và XbaI/SbfI trên vector pKO211 sử dụng enzyme T4

DNA polymerase Vector tái tổ hợp ược kiểm tra bằng phản ng PCR v i cặp mồi ặc hiệu và cắt v i enzyme cắt gi i hạ ặ trư g Ve t r ã ược kiểm tra

tiếp tụ ược biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens AGL1 ể chuyển vào nấm V dahliae Ch ng V dahliae thu ượ tr i trường chọn

lọc tiếp tụ ược phân tích bằ g phươ g pháp S uther hybri iz ti

2.3.4 Phương pháp tạo thể bổ trợ

Để tạo thể bổ trợ, toàn bộ trình t vùng mã hóa trừ bộ ba kết thúc c a gen nghiên c u và trình t trư ge 1,2kb ươ h v i cặp mồi ặc

hiệu S u ó, ạn trình t y ược gắn vào vector pGreen2 giữa vị trí KpnI

và SpeI bằng enzyme T4 DNA polymerase Vector tái tổ hợp ược kiểm tra

bằng phản ng PCR v i cặp mồi ặc hiệu và cắt v i enzyme cắt gi i hạ ặc trư g Ve t r ã ược kiểm tra tiếp tụ ược chuyển sang vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens AGL1 ể chuyển vào nấm V dahliae Ch ng V dahliae thu ượ tr i trường chọn lọc tiếp tụ ược phân tích bằng

phươ g pháp S uther hybri iz ti

2.3.5 Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn A tumefaciens

Tế bào khả biế v phươ g pháp huyể ge ược chỉnh sửa từ phươ g

pháp c a Jyothishwaran (Jyothishwaran et al., 2007) 1000 ng plasmid tái tổ

hợp ược trộn v i 200 ul c a tế bào khả biến A tumefaciens Ống ch a hỗn

hợp tr ượ ặt tr á tr g 10 phút, huyể v itơ ỏng 10 phút và sốc nhiệt ở 37oC 600 ul dung dị h SOC ược bổ sung vào ống ch a hỗn hợp tế bào khả biến và plasmid và nuôi ở 28oC trên máy lắc trong vòng 90 phút Cặn

tế bào sẽ ược thu bằng cách ly tâm dịch nuôi ở 10000 vòng/ phút trong 1 phút và cấy trải tr ĩ petri ó h i trường LB có bổ sung kháng sinh kanamycin Đĩ i trườ g y ược nuôi ở 25oC trong 3 ngày Ch ng vi khuẩ thu ược, ược kiểm tra bằng phản ng PCR v i cặp mồi ặc hiệu

2.3.6 Phương pháp chuyển gen vào nấm Verticillium dahliae

Phươ g pháp huyển gen vào Verticillium ược cải biến từ phươ g pháp

c a Timpner et al., 2013 và Tran et al.,2014 [37] Ch ng A tumefaciens có

ch a vector tái tổ hợp ượ u i tr g 5 i trường LB có ch a kháng sinh

k y i qu 500 u ị h u i ược chuyể s g i trường kích thích

có ch a acetosyringone (IMAS) (1X MM salts, 0.5% glycerol and 10 mM glucose) và nuôi ở 25oC trong vòng 5 giờ trên một máy lắc tố ộ 120 vòng/ phút S u ó ịch nuôi này sẽ ược trộn v i dung dịch ch a bào tử nấm (106

bào tử/ ml) theo tỷ lệ 1:1 Hỗn hợp y s u ó ược trải ều lên một giấy lọc (Sartorius, Gotti ge , Ger y) tr ĩ thạch có ch a môi trường kích thích

có thành phần giố g i trường lỏng ngoại trừ nó có ch a 5 mM glucose thay

v 10 M Đĩ y ược tiế h h ồng nuôi cấy ở trong tối 25o

C trong vòng 3

g y S u ó giấy lọ ược chuyể s g i trường PDA (potato dextrose agar) có ch a kháng sinh phù hợp v ef rt xi e ể sàng lọc các ch ng

chuyển gen và tiêu diệt toàn bộ vi khuẩn A tumefaciens Đĩ i trườ g ược

nuôi trong 2 tuần Các ch ng nấ thu ược, ược cấy ri tr ĩ i trường

ch a kháng sinh chọn lọc và kiểm tra bằ g phươ g pháp lai Southern

2.3.7 Phương pháp tách chiết DNA từ Verticillium

Bào tử c a nấm V dahliae ượ u i tr g 50 i trường PDB,

thời gian 7 ngày Sợi nấ ược thu bằng cách lọc v i màng lọc miracloth

(Calbiochem, Darmstadt, Germany) và nghiền thành bột mị tr g itơ ỏng Bột nấ ược sử dụ g ể tá h DNA Phươ g pháp tá h hiết ược cải biến từ phươ g pháp a Kolar Khoảng 1,0 g c a bột nấ ược cho vào ống eppendorf 2 ml 1 ml dung dịch tách DNA (50 mM Tris pH 7.2, 50 mM

bổ sung vào ống ch a bột nấm và trộ ều s u ó ở 65oC trong 1 giờ Hỗn hợp tr ược ly tâm v i tố ộ tối tr g 5 phút 800 u ịch nổi ược chuyển sang ống 2 ml m i và trộn v i 800 ul dung dịch phenol:chloroform (24:1) Hỗn hợp y ược ly tâm trong vòng 20 phút ở 13000 vòng/phút 400

ul dịch nổi ược chuyển sang ống 1,5 ml m i có ch a 600 ul dung dịch

is pr p v ả ều Hỗn hợp y ược ly tâm v i tố ộ tối tr g vòng 10 phút Cặn DNA sẽ ược làm khô ở 37oC tr g v g 30 phút s u ó ược hòa tan v i dung dịch TE RNA trong m u DNA thu ược sẽ ược loại

bỏ bằng cách bổ sung 4 ul dung dịch RNase (10 mg/ml) và trong 65oC trong

30 phút Chất ượng DNA sẽ ượ á h giá tr ge g r se v v i máy quang phổ Nanodrop

2.3.8 Phương pháp kiểm tra nấm chuyển gen bằng phản ứng PCR hoặc lai phân tử

Tất cả thể xóa gen và thể bổ trợ ều ược kiểm tra bằ g phươ g pháp lai phân tử DNA c a nấm 7 ngày tuổi ược thu thập bằ g phươ g pháp tá h chiết hư tr DNA ược sử dụng làm khuôn cho việc kiểm tra nhờ phản ng PCR hoặ ược cắt v i enzyme gi i hạ ặ trư g qu S u ó DNA ã ược cắt bởi enzyme gi i hạn, phân tách trên gel agarose 1% trong 2 giờ ở 90V DNA s u khi ược biến tính sẽ ược chuyển lên màng lai Amersham hybond-N (GE He th re, Br u s hweig, Ger y) th g qu phươ g pháp chuyể g qu DNA ược gắn chặt v i màng ư i tác dụng c a tia UV trong 3 phút cho mỗi mặt M u ặ trư g ược chuẩn bị v i bộ kít Amersham Alkphos Direct (GE He th re) the hư ng d n c a nhà sản xuất

S u ó ó ược lai v i DNA ã ược biến tính ở 65oC qu M u ược phát hiện trên màng v i k i ph sph s the hư ng d n c a nhà sản xuất

2.3.9 Phương pháp đánh giá kiểu hình của thể xóa gen và thể bổ trợ

Thí nghiệm nghiên c u ặ iểm kiểu hình c a thể xóa gen và thể bổ trợ ược bố trí ng u nhiên hoàn toàn v i 3 lần nhắc lại, 10 m u/ lần nhắc lại

2.3.9.1 Phương pháp đánh giá khả năng bám dính

Các ch ng nấm hoang dại, ột biến và bổ trợ ược nuôi cấy trên môi trườ g PDM tr ĩ 24 giế g tr g 7 g y S u 7 g y, i trường trong các

ĩ ược rử tr g kh y ư ến khi ít nhất một trong các ch ng thí nghiệm ược rửa sạch Chỉ tiêu theo dõi, mật ộ khuẩn cấy, số m u cấy, khả ă g

si h trưởng c a m u, số m u bám sau khi rửa v i ư c

2.3.9.2 Phương pháp đánh giá quá trình sinh trưởng

Các ch ng nấ ược hoang dại, ột biến, và thể bổ trợ ược nuôi trên

i trườ g i h ưỡ g CDM Đường kính vòng si h trưở g ược theo dõi ịnh kỳ 7 ngày một lần

2.3.9.3 Phương pháp đánh giá quá trình sinh trưởng trên các nền carbon khác nhau

Các ch ng nấ ược hoang dại, ột biến, và thể bổ trợ ược nuôi trên

i trườ g i h ưỡng CDM v i lầ ượt các nền carbon fructose, galactose,

g u se, se, r ffi se, v xy Đườ g kí h v g si h trưở g ược theo

õi ịnh kỳ 7 ngày một lần

2.3.9.4 Phương pháp đánh giá quá trình sinh trưởng trên môi trường chứa chất tạo stress khác nhau

Các ch ng nấ ược hoang dại, ột biến, và thể bổ trợ ược nuôi trên

i trườ g i h ưỡng CDM có bổ sung các chất tạo stress khác nhau NaCl,

S bit , EtOH, H2O2, SDS Đườ g kí h v g si h trưở g ượ the õi ịnh

kỳ 7 ngày một lần

2.3.9.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo bào tử

Các ch ng nấ ược hoang dại, ột biến, và thể bổ trợ có nồ g ộ giố g h u ược nuôi trên cùng một i trườ g i h ưỡng CDM tại các vị trí khác nhau Màu sắc c a khuẩn lạc, khả ă g tạo vi bào tử ược quan sát,

ã y hiễ ượ hă só tr ù g ột t sinh học Đặ iể si h trưởng

và triệu ch ng bệnh c y hu ược theo dõi

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả thiết kế vector xóa gen và vector bổ trợ

3.1.1 Kết quả thiết kế vector xóa gen

Vector tái tổ hợp ù g ể xóa gen VTA4 ược thiết kế trên phần mềm

SnapGen Viewer 3.2.1 Kết quả thiết kế vector trên phần mềm SnapGen Viewer 3 2 1 ược thể hiện trong hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả thiết kế vector xóa gen VTA4

Theo hình 3.1, trình t phí trư c (1,1 kb) c a gen VTA4 ược gắn vào trư c cấu trúc biểu hiện c a gen chọn lọc CroNAT Trong khi 1,1 kb trình t phí s u ge ược gắn vào phía sau cấu trúc gen sàng lọc CroNAT Khi ược chuyển vào tế bào nấm, cấu trúc này sẽ giúp cho việc thay thế gen VTA4 bằng cấu trúc c a gen sàng lọc CroNAT Từ ó ấm V dahliae ột biến có khả

ă g khá g khá g si h Cr NAT Để tiến hành gắ ược trình t phí trư c và

phía sau c a gen VTA4 v ve t r xó ge Trư c tiên các trình t này cần

phải ược khuế h ại bằng phản ng PCR v i các cặp mồi ặc hiệu F: ACGAATTCTTAATTAAGAGCTTCCGTCCAAGAACTGG/ VTA4F1-R: GC GCTGGTACCACTAGTGAAGCGAGAGCGAGAGAAAAAAGG;