Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong các mẫu hạt họ Đậu .... Hàm lượng lipid tổng và các lớp chất lipid của 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu .... Thành phần và hàm lượng
Trang 1LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Đoàn Lan Phương và GS.TS Phạm Quốc Long
Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác
Tác giả luận án
Nguyễn Thị Thủy
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Đoàn Lan Phương và GS.TS Phạm Quốc Long là những người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án
Tôi xin cảm ơn tập thể phòng Hóa sinh hữu cơ, phòng phân tích hóa học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện cơ sở vật chất giúp tôi hoàn thành nghiên cứu
Tôi cũng cám ơn đề tài nghị định thư Việt Nam - Liên Bang Đức số 44/2014/HĐ-NĐT giữa Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Bộ Khoa học và Công nghệ do PGS.TS Đoàn Lan Phương làm chủ nhiệm đã tài trợ cho các nghiên cứu trong luận án này
Đồng thời, tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, khoa Khoa học cơ bản, bộ môn Khoa học tự nhiên và anh, chị, em đồng nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu
Cuối cùng, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, những người đã tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình làm luận án
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 12 năm 2022
Tác giả luận án
Nguyễn Thị Thủy
Trang 3MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ix
DANH MỤC CÁC HÌNH xi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN 4
1.1 Phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố của một số loài thực vật thuộc họ Đậu 4
1.1.1 Phân loại họ Đậu 4
1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng của quả, hạt thực vật của 11 loài thực vật thuộc họ Đậu ở Việt Nam 4
1.2 Tình hình nghiên cứu về thành phần lipid và hoạt tính chống oxi hóa các hạt thực vật thuộc họ Đậu trên thế giới và trong nước 9
1.2.1 Tổng quan về thành phần lipid hạt thực vật 9
1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 24
1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 37
1.3 Tổng quan về hóa tính toán 39
1.3.1 Phương trình Schrödinger 39
1.3.2 Các phương pháp bán thực nghiệm (semi-empirical methods) 39
1.3.3 Các phương pháp ab initio (Ab inito methods) 40
1.3.4 Các phương pháp phiếm hàm mật độ (density functional theory, DFT): 41
1.3.5 Tình hình ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của acid phenolic 42
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44
2.1 Đối tượng nghiên cứu 44
2.2 Phương pháp nghiên cứu 46
2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng 46
2.2.2 Phương pháp phân tích thành phần lipid trong các mẫu hạt họ Đậu 46
2.2.3 Phương pháp phân lập và nhận dạng các phospholipid 48
2.2.4 Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 50
Trang 4Chương 3 THỰC NGHIỆM 53
3.1 Chiết tách và xác định hàm lượng lipid tổng các mẫu hạt họ Đậu 53
3.2 Xác định thành phần lipid trong các mẫu hạt họ Đậu 54
3.2.1 Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong các mẫu hạt họ Đậu 54
3.2.2 Xác định thành phần và hàm lượng acid béo trong các mẫu hạt họ Đậu 54
3.2.3 Xác định thành phần và hàm lượng tocopherol 54
3.2.4 Xác định thành phần và hàm lượng phytosterol 55
3.2.5 Xác định thành phần và hàm lượng triacylglycerol 55
3.2.6 Xác định thành phần và hàm lượng phenolic tổng 55
3.3 Phân lập và nhận dạng các phospholipid 56
3.3.1 Xác định thành phần, hàm lượng các lớp chất phospholipid 56
3.3.2 Xác định các dạng phân tử các phospholipid của lipid hạt Sưa 56
3.4 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 57
3.4.1 Xác định hoạt tính chống oxi hóa theo DPPH 57
3.4.2 Khảo sát tiềm năng chống oxi hóa bằng phiếm hàm mật độ (DFT) hiệu năng cao 58
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59
4.1 Hàm lượng lipid tổng và các lớp chất lipid của 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu 59
4.1.1 Hàm lượng lipid tổng 59
4.1.2 Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid 60
4.1.3 Thành phần và hàm lượng acid béo 65
4.1.4 Thành phần và hàm lượng tocopherol 70
4.1.5 Thành phần và hàm lượng phytosterol 76
4.1.6 Thành phần và hàm lượng triacylglycerol 80
4.1.7 Thành phần và hàm lượng các phenolic 83
4.2 Thành phần và hàm lượng phospholipid của 11 mẫu hạt họ Đậu 86
4.2.1 Thành phần và hàm lượng các phospholipid trong 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu 86
4.2.2 Xác định các dạng phân tử phospholipid của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 88
4.3 Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa 107
4.3.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của 11 mẫu lipid hạt họ Đậu nghiên cứu bằng phương pháp DPPH 107
Trang 54.3.2 Kết quả khảo sát tiềm năng chống oxi hóa của một số acid phenolic bằng
phiếm hàm mật độ (DFT) hiệu năng cao 111
KẾT LUẬN 124
1 Kết quả về hóa học 124
2 Kết quả khảo sát tác dụng sinh học 125
KIẾN NGHỊ 126
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO 129
Trang 6DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ionization
2,2’-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)
2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)
spectrometry
chromatography
Trang 7STT Ký hiệu Diễn giải Tiếng anh
spectrometry
hỗ trợ bởi chất nền
Matrix assisted laser desorption ionization
Trang 8STT Ký hiệu Diễn giải Tiếng anh
proton tuần tự
Sequential proton loss - electron transfer
electron tuần tự
Sequential electron transfer - proton transfer
Trolox
Trolox Equivalent Antioxidant Activity
Trang 9DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng của 11 loài thực vật được
nghiên cứu thuộc họ Đậu ở Việt Nam 5 Bảng 1.2 Hàm lượng trung bình tocopherol tổng và tocotrienol tổng trong các
phân họ Đậu nghiên cứu 29 Bảng 2.1 Danh sách 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu 44 Bảng 4.1 Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid chính trong hạt 11 loài
thuộc họ Đậu nghiên cứu 63
Bảng 4.2 Thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid ha ̣t của 11 loài họ
Đậu nghiên cứu (% so với tổng acid béo) 66
Bảng 4.3 Thành phần và hàm lượng các tocopherol trong lipid ha ̣t của 11 loài
họ Đậu nghiên cứu 71 Bảng 4.4 So sánh tương quan giữa hàm lượng γ-tocopherol với acid α-linolenic
(18:3(n-3)) và α-tocopherol với acid linoleic (18:2(n-6)) 74
Bảng 4.5 Thành phần và hàm lượng các phytosterol trong lipid ha ̣t của một số
loài họ Đậu nghiên cứu (mg/kg) 77
Bảng 4.6 Thành phần và hàm lượng các triglyceride trong lipid ha ̣t một số loài
họ Đậu nghiên cứu (% so với tổng TG) 82 Bảng 4.7 Thành phần và hàm lượng các hợp chất phenolic trong lipid ha ̣t 11
loài họ Đậu nghiên cứu (mg/kg) 84 Bảng 4.8 Thành phần và hàm lượng các phospholipid trong lipid tổng của 11
mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu 87 Bảng 4.9 Tín hiệu của ion phân tử [M-H]- của các dạng phân tử có mặt trong
lớp chất phosphatidylethanolamine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trên phổ MS1 90 Bảng 4.10 Dữ liệu phổ MS/MS[E-] của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm [M-H]
-tại giá trị m/z 714,5006 (PE 16:0/18:2) 91
Bảng 4.11 Thành phần và hàm lượng các dạng phân tử phosphatidylethalnolamine
trong mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 95
Trang 10Bảng 4.12 Tín hiệu của ion phân tử [M+H]+ của các dạng phân tử có mặt trong
lớp chất phosphatidylcholine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis
Prain) trên phổ MS1 97 Bảng 4.13 Dữ liệu phổ MS1, MS2, MS3 của dạng phân tử PC có tín hiệu ion
dương [M+H]+ tại giá trị m/z 758,5691 98 Bảng 4.14 Các dạng phân tử phosphatidylcholine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia
tonkinensis Prain) 101
Bảng 4.15 Tín hiệu của ion phân tử [M-H]- của các dạng phân tử có mặt trong
lớp chất phosphatidylinositol của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis
Prain) trên phổ MS1 102 Bảng 4.16 Dữ liệu phổ MS2 của các dạng phân tử PI 103
Bảng 4.17 Các dạng phân tử phospholipid trong mẫu hạt Sưa (Dalbergia
tonkinensis Prain) 105
Bảng 4.18 Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa DPPH của một số hạt Đậu
nghiên cứu (dịch chiết methanol) 107 Bảng 4.19: Quan hệ giữa hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng tocopherol 109 Bảng 4.20: Các thông số phản ứng nội tại bao gồm hiệu chỉnh năng lượng điểm 0
(ZPC) của các acid phenolic 116 Bảng 4.21: Năng lượng tự do Gibbs tiêu chuẩn (rG0) 119 Bảng 4.22: Năng lượng hoạt hóa tự do Gibbs (ΔG#,1M, tính bằng kcal/mol) 121
Trang 11DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Một số acid béo no 11
Hình 1.2 Một số acid béo không no một nối đôi 12
Hình 1.3 Một số acid béo không no đa nối đôi 13
Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của triacylglycerol (TAG) 15
Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo của glycerophospholipid 16
Hình 1.6 Một số glycerophospholipid phổ biến 16
Hình 1.7 Công thức tổng quát của sphingophospholipid 18
Hình 1.8 Một số tocopherol thường gặp trong lipid hạt thực vật họ Đậu 20
Hình 1.9 Khung cấu trúc của steroid 21
Hình 1.10 Một số phytosterol thường gặp trong lipid hạt thực vật họ Đậu 22
Hình 1.11 Cấu trúc cơ bản của acid phenolic 24
Hình 2.1 Quá trình đo MSn 49
Hình 2.2 Cấu trúc của 8 acid phenolic với các vị trí nguyên tử được đánh số 51
Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu chung 53
Hình 4.1 Hàm lượng % lipid tổng trong 11 mẫu hạt họ Đậu 61
Hình 4.2 Bản mỏng TLC và sắc ký đồ các lớp chất lipid một số loài họ Đậu 62
Hình 4.3 Phần trăm acid béo no và không no trong 11 mẫu lipid hạt họ Đậu nghiên cứu 67
Hình 4.4 Tương quan giữa hàm lượng γ-tocopherol với acid α-linolenic (18:3(n-3)) và acid linoleic (18:2(n-6)) 75
Hình 4.5 Hàm lượng % β-sitosterol (so với phytosterol tổng) 80
Hình 4.6 Hàm lượng PC, PE, PI trong lipid tổng của 11 mẫu hạt họ Đậu 87
Hình 4.7 Sắc ký đồ HRMS [E-] lớp chất phosphatidylethanolamine mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 89
Hình 4.8 Phổ HRMS [E-] của lớp chất phosphatidylethanolamine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trên phần mềm xử lý v.3.60.361 90
Hình 4.9 Sắc ký đồ phổ MS[E-] và MS[E+] của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm [M-H]- tại giá trị m/z 714,5006 90
Trang 12Hình 4.10 Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E-] của dạng phân tử PE có tín
hiệu ion âm tại m/z 714,5006 (PE 16:0/18:2) 91
Hình 4.11 Sự phân mảnh của ion phân tử PE có tín hiệu ion âm tại m/z
714,5006 92 Hình 4.12 Sắc ký đồ phổ MS[E-] và MS[E+] của dạng phân tử PE có tín hiệu
ion âm [M-H]- tại giá trị m/z 716,5344 92
Hình 4.13 Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E-] của dạng phân tử PE có tín
hiệu ion âm tại m/z 716,5344 (PE 16:0/18:1) [M-H]- 738,5053 93 Hình 4.14 Sắc ký đồ phổ MS[E-] và MS[E+] của dạng phân tử PE có tín hiệu
ion âm [M-H]- tại giá trị m/z 738,5053 93
Hình 4.15 Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E-] của dạng phân tử PE có tín
hiệu ion âm tại m/z 738,5053 (PE 18:2/18:2) 93
Hình 4.16 Sắc ký đồ phổ MS[E-] và MS[E+] của dạng phân tử PE có tín hiệu
ion âm [M-H]- tại giá trị m/z 740,5298 94
Hình 4.17 Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E-] của dạng phân tử PE có tín
hiệu ion âm tại m/z 740,5298 (PE 18:1/18:2) 94
Hình 4.18 Sắc ký đồ phổ MS[E-] và MS[E+] của dạng phân tử PE có tín hiệu
ion âm [M-H]- tại giá trị m/z 742,5452 94
Hình 4.19 Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E-] của dạng phân tử PE có tín
hiệu ion âm tại m/z 742,5452 (PE 18:0/18:2) 95
Hình 4.20 Sắc ký đồ HRMS [E+] lớp chất phosphatidylcholine mẫu hạt Sưa
(Dalbergia tonkinensis Prain) 96
Hình 4.21 Sắc ký đồ phổ MS[E-] và MS[E+] của dạng phân tử PC có tín hiệu
ion dương [M+H]+ tại giá trị m/z 758,5691 97 Hình 4.22 Sự phân mảnh của ion phân tử PC có tín hiệu ion dương tại m/z
758,5691 98 Hình 4.23 Sự phân mảnh trong phổ MS2 và MS3 [E-] của dạng phân tử PC có
tín hiệu ion âm [M+HCOO]- tại m/z 802,5536 99
Hình 4.24 Sự phân mảnh trong phổ MS2 [E-] của dạng phân tử PC có tín hiệu
ion âm [M-CH3]- tại m/z 742,5305 (PC 16:0/18:2) 99
Trang 13Hình 4.25 Sắc ký đồ phổ MS[E-] và MS[E+] của dạng phân tử PC có tín hiệu
ion dương [M+H]+ tại giá trị m/z 782,5676 100
Hình 4.26 Sự phân mảnh trong phổ MS2 và MS3 [E-] của dạng phân tử PC có
tín hiệu ion âm [M+HCOO]- tại m/z 826,5629 100
Hình 4.27 Sự phân mảnh trong phổ MS2 [E-] của dạng phân tử PC có tín hiệu
ion âm [M-CH3]- tại m/z 766,5450 101
Hình 4.28 Sắc ký đồ HRMS [E-] lớp chất phosphatidylinositol mẫu hạt Sưa
(Dalbergia tonkinensis Prain) 102
Hình 4.29 Sự phân mảnh trong phổ MS2 [E-] của dạng phân tử PI có tín hiệu
ion âm [M-H]- tại m/z 833,5123 103 Hình 4.30 Sự phân mảnh của ion phân tử PI có tín hiệu ion âm tại m/z
833,5123 104 Hình 4.31 Sự phân mảnh trong phổ MS2 [E-] của dạng phân tử PI có tín hiệu
ion âm [M-H]- tại m/z 861,5467 104
Hình 4.32 Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa theo DPPH của 11 mẫu hạt họ
Đậu nghiên cứu 108 Hình 4.33 Cấu trúc tối ưu của các acid phenolic đã nghiên cứu được tính
toán trong pha khí theo mức lý thuyết LC- PBE/6-311++G(d, p) 112 Hình 4.34 Năng lượng các obital biên (EL và EH ) và chênh lệch năng lượng
hai orbital biên (EL-H = EL - EH) của các acid phenolic được nghiên cứu 113 Hình 4.35 Trạng thái chuyển tiếp (TS) của phản ứng HAT giữa GALA,
CAFA, CHLA và FERA với gốc tự do HOO• trong pha khí 120
Trang 14MỞ ĐẦU
Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Theo ước tính của IUCN (Hiệp hội Quốc tế về Bảo tồn Thiên nhiên) có khoảng trên 380.000 loài thuộc giới thực vật trên trái đất; trong đó chủ yếu là các loài thuộc ngành thực vật hạt kín (Angiospermae) [1] Sự đa dạng sinh học của ngành thực vật hạt kín có thể được giải thích bởi sự tương tác giữa chúng và môi trường dẫn đến sự chọn lọc tự nhiên
so với các loại cây trồng khác Tuy nhiên khi xã hội ngày càng phát triển kéo theo
đó là các vấn nạn môi trường ngày càng tăng cao như tình trạng ô nhiễm môi trường, suy thoái môi trường cũng như sự cố môi trường Những vấn nạn này đã và đang làm cho môi trường sống của sinh giới nói chung, thực vật nói riêng đang bị tàn phá nghiêm trọng, thậm chí một số loài đã và đang bị đe dọa tuyệt chủng ngoài
tự nhiên Tiếc rằng trong đó còn nhiều loài có giá trị kinh tế và khoa học cao, nhiều loài cây có chứa hợp chất lipid và các hợp chất có hoạt tính sinh học cao mới được nghiên cứu rất ít hoặc chưa được nghiên cứu
Theo số liệu thống kê, hệ thực vật bậc cao Việt Nam có trên 10.000 loài, trong đó có khoảng 564 loài là các cây có dầu [2] Nhiều loài thực vật có chứa lipid thuộc một số họ như: Bầu bí - Cucurbitaceae; Đậu - Fabaceae; Bồ hòn - Sapindaceae; Hồng xiêm - Sapotaceae; Thầu dầu - Euphorbiaceae; Chè - Theaceae; Thị - Ebenaceae; Cúc - Asteraceae; Măng cụt - Clusiaceae, Thông - Pinaceae; Na - Annonaceae; Hoa hồng - Rosaceae, Long não - Lauraceae; Đào lộn hột - Anacardiaceae;… Trong đó họ Đậu (Fabaceae) là một họ thực vật trong bộ Đậu, đây là một trong ba họ thực vật có hoa lớn trên thế giới
Lipid họ Đậu cũng bao gồm một số hợp chất của lipid thực vật như: các acid béo, phospholipid, tocopherol, triacyclycerol, sphingolipid và những phytosterol… Các hợp chất này có hoạt tính sinh học cao, đó không chỉ là nguồn nguyên liệu có giá trị sử dụng làm thực phẩm mà còn là nguồn nguyên liệu cần thiết cho nhiều lĩnh vực khác: nguyên liệu thiết yếu cho công nghiệp chế biến sơn, xà phòng, thực phẩm, mỹ phẩm,… đặc biệt còn được sử dụng trong dân gian như các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh viêm nhiễm, chống lão hóa và một số căn bệnh hiểm nghèo [1]