Nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trên mô hình thực nghiệm của cây ngải cứu

Do đó, nghiên cứu và phát triển càng nhiều các thành phần có mặt trong thảo dược tự nhiên đồng thời kết hợp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở để kiếm nghiệm dược liệu giúpnền y học dân gian có t

Bộ CÔNG THƯƠNG

KẾT QUẢ THựC HIỆN ĐÈ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÁP TRƯỜNG

Tênđề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trên mô hình thực nghiệm của cây Ngải cứu(Artemisia vulgarisL.).

Mã số đềtài: 22/2HHSV03

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Lan Anh

Đơnvịthựchiện: Khoa Công Nghệ Hóa Học và Viện Khoa Học Vật Liệu ứngDụng

LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học có thể nói là một trong những cột mốc quan trọng Đây không chỉ là sân chơi giúp chúng em làm quen với các hoạt động nghiên cứu, trang bị những kỹ năng còn thiếu và cung cấp những kiến thức quý báu Cũng nhờ sự quan tâm, giúp đỡ tận tình và động viên đến từ nhiều các nhân để chúng em có kết quả như ngày hôm nay Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến mọi người.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Trần Nguyễn Minh Ân và PGS.TS Lê Tiến Dũng Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, thầy đã luôn hỗ trợ, hướng dẫn tận tình và phổ cập kiến thức giúp em hiểu rõ hơn về đề tài của mình Chúng em luôn biết ơn vì thầy đã truyền đạt cho em nhữngkiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý giá trong quá trình làm nghiên cứu khoa học củathầy.

Chúng em xin cảm ơn đến Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em về địa điểm làm thí nghiệm, thiết bị và dụng cụ phục vụ cho quá trình nghiên cứu.

Chúng em xin trân trọng cám ơn.

PHẦN I THÔNGTIN CHUNGI Thông tíntổngquát

1.1.Tênđề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm hoát tính kháng viêm trên mô hình thực nghiệm của cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.).

1.2.Mã SỐ:22/2HHSVO3

1.3.Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

(họchàm, học vị) Đơnvị công tácVai trò thựchiện đề tài 1 Nguyễn Lan Anh KhoaCôngNghệ Hóa Công Nghệ Việt Nam

Thành viên tham gia

1.4.Đonvị chủtrì:1.5.Thòi gian thựchiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 03 năm 2024 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm

1.5.3 Thựchiện thực tế: từtháng 03 năm 2023 đến tháng 1 năm 2024

1.6.Những thay đổiso vóithuyết minh ban đầu (nếu có):

(về mụctiêu, nội dung, phươngpháp, kết quả nghiêncứu và tổ chức thực hiện;Nguyênnhân; Ý kiến của Cơ quanquảnlý)

1.7.Tổng kinh phíđược phê duyệt củađề tài: 10.000.000 triệu đồng.

II.Kết quả nghiên cứu1.Đặt vấn đề

Với sự triển ngày càng tiến bộ và hiện đại ngày nay, mọi vấn đề đều được quan tâm và giải quyết theo hướng phù hợp, an toàn nhất mà đặc biệt là vấn đề sức khỏe con người Nổi bật là sự pháttriển của ngành công nghiệptổng hợp hữu cơ, trong đó thuốc tổng hợp đã và đang có nhiều đóng góp hiệu quả trong việc cung cấpthuốc chữa bệnh với giárẻ và phổ biến Tuy nhiên, song song với lợi ích trị bệnh thì chúng có một nhược điểm chưa được khắc phục triệt để, đó là gây tác dụng phụ khi sử dụng Vì vậy, với tinh thần sống “Hướng về thiên nhiên” việc sử dụng dược liệu có trong tự nhiên ngày càng được quan tâm và nghiên cứu bởi chúng rất thân thiện với sức khỏe, phù hợp với sự phát triển sinh lí của cơ

Dưới góc nhìn khoa học, ngoài ý nghĩa sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, các nhóm hợp chất tự nhiên trong dược liệu còn có thể dùng làm mẫu thử, chất dẫn để tổng hợp các loại thuốc mói.

Khác vói tây y, thảo dược thường tồn tại với nhiều thành phần hóa học phức tạp Do đó, nghiên cứu và phát triển càng nhiều các thành phần có mặt trong thảo dược tự nhiên đồng thời kết hợp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở để kiếm nghiệm dược liệu giúpnền y học dân gian có thể tiến gần những tiêu chí khoa học cần thiết, cung cấp đầy đủ cơ sở để khai thác và sử dụng nguồn dược liệu an toàn hiệu quả hơn.

Một điểm đáng chú ý làtừ thành phần hợp chất dã phân lập được chúng ta đồng thời cũng phát hiện những hoạt tính sinh học có giá trị để trị bệnh như kháng ung thư, kháng viêm, kháng oxy hóa hoặc ứng chế emzyme Tất cả đều góp phần cho việc sử dụng các cây thuốc cổ truyền một cách khoa học và phổ biến.

Hiện nay, các bệnh lý về cơ xương khớp đang gia tăng nhanh chóng và là nguyên nhân hàng đầu Nhóm bệnh này được xếp ngang hàng với các bệnh lý Tim mạch, nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho con người Viêm khớp có nhiều phương pháp điều trị khác nhau, tuy nhiên chưa có phương pháp nào điều trị khỏi hẳn và một số loại tây dược gây tác dụng phụ ngoài ý muốn Người bệnh phải kiên trì điều trị lâu dài và có xu hướng tìm đến các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ít tác dụng phụ với giá cả hợp lý Trong y học cổ truyền, có rấtnhiều loài trị về đau xương khớp rất tốt mà nổi bật là câyNgải cứu (Artemisiavulgaris L.) Đây là loài cây quen thuộc dễ trồng nhưng hiệu quả chữa bệnh rất cao, lành tính cũng như chi phí lại rấtphù hợp với yêu cầu củanhân dân hiện nay.

Do đó, trong nghiên cứu lần này chũng tôi sẽ đánh giá hoạt tính kháng viêm khớp từ các chát phân lập được, áp dụng mô hình sàng lọc ảo để tìm ra tiềm năng ứng dụng, từ đó định hướng để bàochế sản phẩm trị viêm khớp, phục vụ cho sức khỏe con người.

2.Mục tiêu

- Phân lập 2-3 chấttừ cây Ngải cứu.

- Đánh giá hoạt tính kháng viêm khớp củacao chiết và các chất phân lập được trên mô hình in vitro và in vivo.

3 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu lý thuyết: Thu thập, phân tích, tổng hợp kiến thứctừ tài liệu Điều chếcác cao chiết: phương pháp ngâm

Phương phápphân lập chất tinh khiết: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng Phương pháp xác địnhcấu trúc : NMR

Phương pháp kháng viêm in vitro : đánh giá khả năng ức chế NO trên đại thực bào RAW 264.7 bị kích thích viêm bới LPS

Phương pháp kháng viêm in vivo : gây viêm trên chuột băng carragenan 1% và theo dõi mứcđộ phù chân chuột.

- Chúng tôi đã phân lập thành công vàxác định 3 chất từ phân đoạn ethyl acetate của cây Ngải cứu là vitexin (AV12), astragalin (AVI3) và rutin (AV14), đánh giá được hoạt tính kháng viêm trên các loại cao tổng và các phân đoạn đãphân lập được.

- về thử nghiệm kháng viêm in vivo cho thấy caocồn Ngải cứu có tác động kháng viêm.

5 Đánh giá cáckétquả đã đạt được và két luận

Trong nghiên cứu này, chũng tôi đã phân lập thành công 3 chất từ cao ethyl acetate của cây Ngải cứu và xác định được các chất đó là vitexin (AV12), astragalin (AV13) và rutin (AV14) Tiến hành các thí nghiệm khảo sát các hoạt tính kháng viêm in vitro trên các cao tổng và các cao phân đoạn và cho thấy kết quả cao ethyl acetate của Ngải cứu và phân đoạn AV12 là những chất có khả năng kháng viêm tốt nhất trên Ngải cứu Đồng thời cũng tiến hành khảo sát in vivo trên chuột để kiểm tra khả năng kháng viêm của Ngải cứu từ đó thấy được Ngải cứu là loài cây có tiềm năng trong việc phát triển thuốc để điều trị các bệnh về viêm khớp.

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Tómtắt Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) là một loại thảo dược được sử dụng phổ biến trong nhân gian với nhiều công dụng như kháng viêm, chống ung thư hay kháng nấm, Tuy Ngải cứu cónhiều công dụng nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loại cây này chưa được phổbiến trong nước Vì thế để góp phần vào các nghiên cứu của cây Ngải cứu nên thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng viêm thực hiện trên chuột và phân lập chất được tiến hành thực nghiệm Trong nghiên cứu từ phân đoạn cao chiết Hexan trên cây Ngải cứu phân lập được hợp chất ílanovoid và cấu trúc của chất này bằng cách sử dụng sắc kí cột và sắc kí bản mỏng TLC, đồng thời thực hiện đo đe xác định chất trên phổ NMR và khảo sát hoạt tính kháng viêm cũng được thực hiện từ các phân đoạn chiết trên cao Ngải cứu và thực hiện trên chuột.

Abstract ArtemisiavulgarisL. is an herb commonly used in human life for its various benefits, such as antinociceptive, anti-cancer, and antifungal effects, etc Despite its many uses, studies on the chemical composition and biological functions of this plant are not prevalent in the country Therefore, to contribute to the research on Mugwort, an experiment should be conducted to examine its anti-inflammatory properties in mice and isolate the active substance In the Hexane fraction study on Artemisia vulgaris L. that integrated flanovoid and its structure by Adsorption liquid chromatography on columns, TLC, Simultaneously, the structures have been determined by NMR and to make an observation the anti-inflammatory nature done from hexane fraction of Artemisia vulgaris L. and done on mouse.

III Sảnphẩm đề tài, công bố và kếtquả đàotạo3.1 Kết quả nghiêncứu( sảnphẩm dạng1,2,3)

Yêu cầukhoa họchoặc/vàchỉ tiêu

ĐăngkýĐạt được

2 Hội nghị khoa học trẻ ự Đã tham dự, abstract book hội nghị khoa học

Tên chuyên để nếulà NCS

Tên luậnvăn nếulà Cao học

2 Nguyên, nhiên vật liệu, cây con 3,510,000 3,510,000

PHẢN II BÁOCÁOCHITIẾT ĐÈ TÀI NGHIÊNcứu KHOA HỌC

(báo cáo tổngkết sau khi nghiệm thu, đã bao gồm nội dung góp ýcủahộiđồng nghiệmthu)

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 14

1.1 Tổng quan vềNgải cứu 14

1.1.1 Tên gọi - Vị trí phân bố khoa học 14

1.1.2 Phân bố 14

1.1.3 Đặc tính thực vật 15

1.1.4 Giátrị sử dụng của Ngải cứu 16

1.1.4.1 Côngdụngdân gian 16

1.1.4.2 Dược tính của Ngải cứu 16

1.1.5 Các nghiên cứu về câyNgải cứu 17

1.1.5.1 Nghiên cứu về dược lý 17

1.1.5.2 Thành phần hóa học 18

1.2 Tổng quan phương pháp điều chếcác loại caovà phân lập các chấttừ cây Ngải cứu20 1.3 Tổng quan về viêm xương khớp 20

1.4 Tổng quan về mô hình lọcảo in silico 23

1.4.1 Tình hình và lợi ích khi sử dụng mô hình sànglọc ảo 23

1.4.2 Phương pháp docking phân tử 24

2.3.1 Quytrình điều chếcác loại cao chiết 27

2.3.2 Quytrình phân lập các hợp chất 29

2.3.3 Phuong phápđánh giá hoạt tính kháng viêm 29

2.3.4 Thử hoạt tính kháng viêm bằng phưong pháp ứcchế sản sinhNO 29

2.4 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: 30

2.5 Docking phân tử ( in silico docking study) 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả phân tíchtinhdầu Ngải cứu 34

3.1.1 Thành phần tinh dầu theo phưong pháp lôi cuốn hơi nước 34

3.1.2 Thành phần tinhdầu theo phương pháp head space 36

3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của tinhdầu: 38

3.3 Kết quả điều nồng độ tối thiểu ức chếvi khuẩn (MIC)bằng phương pháp vi phaloãng trong môi trường lỏng 40

3.4 Kết quả nồng độ tối thiểu diệt vi khuẩn (MBC)bằng phương pháptrải đĩa 41

3.5 Kết quả điều chế các loại cao chiết và phân lập các chất từ câyNgải cứu 41

3.6 Kết quả đánh giáhoạt tính kháng viêm 43

3.7 Thảo luận 43

3.7.1 Định danh cấu trúc ba hợp chấtphân lập được từ Ngải cứu 43

3.7.2 về đánh giá hoạt tính kháng viêm khớp của cao chiết vàcác hợp chất phân lập từ dược liệu Ngải cứu 48

LPS Lipopolysaccharide Tác nhân gây viêm DMSO Dimethyl sulfoxide

Multiple Bond Cohenrence

Phổtươngtác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

DANH MỤC BẢNG

3.1 Cáccấu tử chiếm nhiều trong tinhdầu Ngải cứu theo phưong pháp lôi cuốn hơi nước

3.2 Cáccấu tử chiếm nhiều trong tinhdầu Ngải cứu theo phương pháp head space

3.5 Kết quả điều chếvà phân lập các chấttừ dược liệu Ngải cứu 41 3.6 Kết quả đánh giáhoạt tính kháng viêm của 4 cao

3.7 Ket quảđánh giáhoạtchất phân lập của AV12,AV13 vàAV14 43

3.11 Các kết quả docking quan trọng của hợp chấtVitexin(AV12) và Atragalin (AV13) đến 4WCUenzyme

51

DANH MỤC HÌNH ẢNH

2.1 Trích ly tinh dầu theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển 27 2.2 Sơ đồ quy trình điều chếcácloại cao chiếttừNgải cứu 28 2.3 Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất mới 29 2.4 Sơ đồ quy trình thử nghiệm hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp ức

chế NO

2.5 Sơ đồ chung của quá trình docking của một pose (cấu dạng tối ưu của 1 một phân tử hữu cơ hay gọi là ligand đến emzyme hay mục tiêu đích ( receptor) đượcmô tảtrong hình.

3.4 Phổ khối của hợp chất Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one-l,7,7-trimethyl-(lS)-Pinocarvone

3.10 Hoạt tính kháng khuấn của tinh dầu ở nồng độ 10 pL/lmL (a) và của Penicilin ở nồng độ 64 pg.mL'1 (b) kháng trở lại vi khuẩn gram dương,

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus-MRSA

3.11 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu (a) ở nồng độ 10 pL/lmL và của củaPenicilin ở nồng độ 64 pg.mL"1 (b) kháng trở lại vi khuẩn gram âm,

39

3.12 Cấu trúc hợp chấtAV12 42

3.15 Các tương tác hydrogen quan trọng hình thành từ các amino acid hoạt động còn lại trên 4WCU và các nguyên tử có hoạt tính trên Vitexin (AVI2) hoặc pose 155.

3.16 Cácliên kết hydrogen trong không gian 3 chiều hình thành từ cácamino acid hoạt động còn lại trên 4WCU và các nguyên tử có hoạt tính trên Vitexin (AVI2) hoặcpose 155.

3.17 Các tương tác H- bond cho và nhận xung quanh pose 155 với các amino acidhoạt động còn lại trên 4WCU

3.18 Vùng kỵ nước (Hydrophobicity)hình thành xung quanh pose 155 54 3.19 Một sơ đồ 2D trình bày các tương tác ligand quan trọng giữa Vitexin

(AV12) hoặc pose 155 và 4WCU

3.20 Một sơ đồ 3D trình bày các tương tác ligand quan trọng giữa Vitexin (AV12) hoặc pose 155 và 4WCU.

3.21 Bản đồ lignad trình bày nhưng tương tác thứ cấp giữ pose 155 và các amino acid hoạt tínhtrên enzyme4WCU.

3.22 Một sơ đồ 2D trình bày các tương tác ligand quan trọng giữa pose 326/ Atragalin (AV13) và 4WCU.

3.23 Một bản đồ ligand trình bày các tương tác thứ cấp giữa pose 326/ Atragalin (AV13) và 4WCU.

56

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Ngải cúu

1.1.1 Tên gọi - Vị trí phân bố khoa học

Ngảicứu có tên khoa học làArtemisia vulgaris L Bên cạnh đó,loài cây này còncó tên thường gọi khác : thuốc cứu,Ngải diệp, quá sú (H mông), cỏ linhli ( Thái),

Một số tên nước ngoài : Mugwort( Anh), Wormwood, Absinth Armoise commune (

Loài: Artemisia vulgaris

Hình 1.1 Cây Ngải cứu

1.1.2Phân bố

Ngải cứu có nguồn gốctừ vùng ôn đới ấm châu Âu hoặc châu Á và được du nhập vào Bắc Mỹ vào đầu thế kỷ 16 Hiện nay ngải cứu phân bố rộng rãi khắp thế giới, đặcbiệt phát triển ở những vùng nhiệt đới Nam Á, Đông - Nam Á và Ân Độ, Pakistan, Srilanca, Bangladesh, Lào,Thái Lan, Indonesia, TrungQuốc [2]

Ở ViệtNam, loài cây đã được trồng từ rất lâu về trước, trải dài khắp các tỉnh từNam ra Bắc Ở các noi có độ cao từ khoảng 800m trở lên như ở Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu, Yên Bái, Lạng Son, Hà Giang cây Ngải cứu mọc dại rất nhiều trong tự nhiên.[12]

Ngải cứu được trồng trên quy mô công nghiệp ở các nước Ý, Pháp, Brazil, Nhật Bản hay các vùng miền núi của Ân Độ và Srilanca Ở ViệtNam, Ngải cứu thường được trồng quy mô nhỏ trong các vườn gia đình, chủ yếu dùng như một loại rau để ăn hoặc trong vườn thuốc của các co sở y học dân tộc Hiện nay, vẫn chưa tìm thấy mô hình trồng trọt và thu hoạchở quy mô lớn

1.1.3Đặc tínhthực vật

Ngải cứu là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao khoảng 50-60cm, có khi lên đến 2,5m, với mộtthân cứng hóa gỗ Thân to có rãnh dọc, thường nhuộm màu đỏ tía.

Hình 1.2 Thân củacây Ngải cứu.

Lá: Các lá dài 5-20 cm, rộng, mọc so le, màu xanh lá cây tham, có nhiều hình dạng: hình mũi giáo, lá dưới xẻ thùy lông chim, với các sợi lông trắng dày đặc hai mặt trên, dưới Lá Ngảithườngcó mùi thơmnồngvà có vị hơi đắng hoặc rấtđắng tùy theomùa [2] [3]

Hoa: Hoa ngải cứu nhỏ (dài ~ 5 mm) đối xứng, màu vàng lục nhạt hoặc điểm đỏ sẫm Cụm hoa hẹp và rất nhiều thành chùm,thường nở vào mùa thu (tháng 7 đến tháng 9).[12]

Toàn cây Ngải cứu chứatinhdầu cómùi thơm nồng đặc trưng.

Hình 1.3 Hình ảnhhoa và lá Ngải cứu

1.1.4 Giá trị sử dụngcủa Ngảicứu1.1.4.1 Công dụngdân gian

Từ lâu Ngải cứu được coi là một cây thuốc dân gian với nhiềucông dụng trong cuộc sống và sử dụng trong nhiều bài thuốc, các mónăn làm kích thích vị giác và việc chếbiếnmónăn từNgải cứu sẽ không làm mất đi hiệu quả trị bệnh Dùng làm rau ăn, tốt cho cơ thể, thanh mát, dễ ăn [13][14][15]

Trong ngành châm cứu (nhấtlà trongnền y học dân gian của Trung Quốc và Nhật Bản), người ta sử dụng Ngải cứu đốt trực tiếphoặc gián tiếp tại các huyệt đạo và các bộ phận cụ thể khác của cơ thể để điều trị hoặc ngăn ngừa bệnh, giúp điều khí, khai thông huyệt đạo, sức nóng lan vào sâu đến huyệt tạo cảm giác thoải mái Đặc biệt mùi hương Ngải cứu còn có tác dụng an thần và tịnh tâm.[16][17][18]

Ngải cứu còn được sử dụng như loại thuốc bổphận, chất làm longđờm, có khả năng làm giảm chứng đầy hơi, đau bụng do hệ tiêuhóa kém, chữa các bệnhvề mãn kinh, đau bụng kinh.

Một số kinh nghiệm dân gian cho thấy Ngải cứu có hoạt tính kháng khuẩn giúp đẩy nhanhquá trình phục hồi, ngăn ngừa nhiễm trùng vàcho thấy hiệu quả trong việc chữa bệnh trì Hơn thế nữa, cây Ngải cứu còn được gọi là “siêu thảo dược” vì khả năng chống lại ký sinh trùng sốt rét và chống lại bệnh ung thư vú ở phụ nữ Theo ỵ học cổ truyển, Ngải cứu còn chữa các bệnh nhưbệnhhuyết trắng, dọa sẩy thai, ho ra máu, nôn mửa, đau bụng, thấp khớp và chốc lở [19]

1.1.4.2Dưực tính của Ngải cứu

Dược tính đa dạng của Ngải cứu được chứng minh thông qua nhiều nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trongy học Vói cây Ngải cứu thì bộ phận quan trọng thường được sử dụng vói nhiều dược lí quan trọng làlá.

Loàicây này cónhiềuđặctínhchữa các bệnh : chống (sốtrét, viêm, oxy hóa, khối u, tăng huyết áp, co thắt, nhiễm trùng), hỗ trợ hệ miễndịch, bảo vệ gan Đặc biệt đối với phần tinh

dầu chứa các hợp chất giúp khử khuẩn tốt, vì hàm lượng thujone trong tinh dầu đáng kể có thể dẫn đến ngộ độccấp tính nếu sửdụng quá liều Do thujone có tác dụng kích thích nãobộ thông qua ức chế Gamma- aminobutyric acid (GABA)- chat có tác dụng dẫn truyền ức chế hệ thần kinh trung ưong nên khi sử dụng quá nhiều Ngải cứu sẽ dẫn đến tình trạng hưng phấn quá mức, co giật vàgây ra ảo giác [20] [21]

Trong nền y học cổ truyền thì Ngải cứu là loài thảo dược rất có ích và có giátrị khoa học quan trọng kể cảtrong nền y học hiện đại ngàynay.

1.1.5 Các nghiên cứuvềcây Ngải cứu1.1.5.1 Nghiêncứuvề dược lý

Nghiên cứu trong nước

Nám 2017, bác sĩNguyễn Đức Minh đánh giá tác dụng giảm đau của phương pháp điện châm kết hợp Đai hộp Ngải cứu Việt trong điều trị đau vai gáy thể phong hàn, cho ra kết quả tốt, chưa thấy trường hợp xảy ra các triệu chứng tác dụng phụ nào trong lâm sàng [4]

Năm 2018, Theo Luận Văn Thạc Sỹ Hóa Học củaTống Thị Hoa dưới sự hướng dẫn của TS.Mai Thanh Nga “Nghiên cứu thành phần hóa học của loài ngải cứu (Artemisia Vulgaris L.) ở thành phố Thái Nguyên” cho ra kết quả là 3,5,7,4’-tetrahydroxy flavones có tác dụng tích cực trong việc chống ung thư và bệnh tim mạch, chống động kinh, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống co thắt, trị đái tháo đường, giảm đau và làm giảm ho [5]

Năm 2018, Mai Thanh Nga, Nguyễn Thị Thanh Hương (2018) bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng đã phân lập và xác định được cấu trúc của hai chất (E)-phytol và kaempferol từ cặn chiết chloroform, ethyl acetate của dịch chiết từ lá ngải cứu thu hái tại Thái Nguyên Theo các kết quả nghiên cứu cho thấy cả hai hợp chất này đều có tác dụng chống ung thư, đặc biệt là (E)-phytol có thể gây ức chế trên một số dòng té bào ung thư khác nhau [6]

Nghiên cứu ngoài nước

Năm 2011, Baixiao Zhao và cộng sự (Trung Quốc) đã thử nghiệm trên nhóm những người tình nguyện khỏe mạnh trong độ tuổi từ 22 đén 28 tuổi và không có tiền sử bệnh mãn tính để khảo sát tác động của khói Ngải cứu đến hệ thần kinh Kết quả nhận thấy là hoạt động của hệ thần kinh tự chủ được cải thiện, giảm đáng kể về HR (sựthay đổi nhịp tim của người) và các thay đổi đángchú ýtrong các thông số HRV(nhịp tim) [22].

Trong năm 2013, Công bố báo cáo của Gayan s Bamunuarachchi và cộng sự cho thấy việc uống chiết xuất từ lá Ngải cứu có tác dụng chống sốt rét mạnh và an toàn Nên, những chiếtxuấttừ câyNgải cứu này có tiềmnăng trởthành thuốc có nguồn gốctừ thực vật rẻ tiền trong tương lai [23].

Năm 2015, K Abedulla Khan đãthực hiện một nghiên cứu trên loài chuột trắng với mục mong muốn đánh giá hoạt động làm giảm lipid trong máu của dịch chiết từ rễ của Ngải cứu Kết quả thu được từ nghiên cứu cho thấy tác dụng làm giảm lipid máu rõ rệt, giúp ngăn ngừa các chứng xơ vữa động mạch, thiếu máu não và các bệnh mạch ngoại biên Những phát hiện này của tác giả đã cũng cấp một số cơ sở hóa sinh trong việc ứngdụng rễ cây Ngải cứu làm thuốc hạ huyết áp [24]

1.1.5.2 Thành phần hóahọc

Năm 2000, A Camat, A Heitz, D Fraisse và cáccộng sự đã phân lập mới từ ngọn của hoaNgải cứu chứanhóm caffeoylquinic acids là 3,5-di-O-caffeoylquinic acid và 1,5-di-O-caffeoylquinicacid [25].

Năm 2006, J Wang, F Zhu và các cộng sự bằng sử dụng phương pháp sắc ký GC kết hợp với GC-MS đã xác định được 45 cấu tử có trong tinh dầu lá ngải cứu, chiếm khoảng 97% hàm lượng tinh dầu của cây Các cấu tử này chủ yếu thuộc các nhóm monoterpene, secquiterpene và diterpene bao gồm 1,8-cineole (khoảng 46,50%), bomeol (khoảng 10,17%), piperitol (khoảng 9,52%), ơ-cadinene (khoảng 8,92%), camphor (khoảng 6,22%), humulene (khoảng 5,47%) và 1,4-cineole (khoảng 4,25%) [26],

1,4- Cineole

Năm 2017, nhóm tác giả Pandey PB, Thapa R, ưpreti A đã nghiên cứu thành phần hóa học của ngải cứu trong dịch chiết methanol bằng phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp sử dụng đầu dò uv cho thấy có sự hiện diện của 2 flavonoid khác nhau là morin và luteolin [27].

1.2Tổng quanphương phápđiều chếcác loạicao và phân lậpcác chất từcâyNgải cứu

Sử dụng kỹ thuật chiết lỏng- lỏng để chiết các cao chiết phân đoạn củaNgải cứu

Cao tổng ban đầu chứa hầu hết các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vì thế rất khó cô lập riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sáttiếptheo Đầu tiên cần pha cao tổng vào hexan và cho thêm một ít methanol để dễ hòatan Sau đó chohết phần cao vào phễu chiếtvà cho lần lượt các dung môi từ phân cực đến không phân cực chạy qua

Mỗi dung môi hữu cơ được chiết nhiều lần, mỗi lần sử dụng một lượng nhỏ dung môi cho đến khi dung môi không còn hòatan được nữa sẽ chuyển tới dung môi có tính phân cực hơn Dịch sau chiếtsẽ được cô cạn thành các cao chiết tương ứng.

Sau khi chiết được một số cao chiết thành phần, để phân lập các hợp chất tinh khiếtbằng một số phương pháp sắc kí:

• Sắc ký lớp mỏng một chiều • Sắc ký cộtáp suất thường • Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sau đó để phân các chất phân lập khi ở dạng đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^-NMR, 13C-NMR với các kỹ thuật HMBC, HSQC tùy theo từng chất cụ thể tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên -Đại học Quốc gia TP.HCM, địa chỉ 227 Đ.Nguyễn Văn Cừ, Phường 4, Quận 5, Thành phố HồChí Minh.

1.3Tổng quan về viêm xươngkhóp1.3.1 Định nghĩa viêmkhớp

Viêm khớp có tên khoa học là arthritis một thuật ngữ dùng để chỉ tấtcả các rối loạn liên quan đến cấu trúc và hoạt động của khớp trong cơ thể Trên thực tế thì đây là căn bệnh thường gặpởtấtcả các đối tượng và độ tuổi Trongđó phổ biến nhấtlà ở những phụ nữ trên 65 bị dư thừacân, béo phì Đồngthời bệnh còn có thể gây ảnh hưởng xấu đến trẻ em và trẻ vị thành niên.[28]

Khi gặp tình trạng đau ởcác khớp xương, người bệnh sẽ gặp rấtnhiều khó khăn khi sinh hoạt, lao động trong công việc và cuộc sống do sưng, nóng, nhức mõi, đau tại cáckhớp, các cơ liên quan.

Điều trị viêm khớp còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: nguyên nhân gây bệnh, các dạng viêm khớp đang gặp Nhìn chung các biện pháp điềutrị chỉ có tác dụng hỗ trợ cải thiện các triệu chứng và nâng cao khảnăng chống chọi củangười bệnh.

1.3.2 Bệnh thườnggặp:

Theo các chuyên gia đầu ngành, các chứng bệnh liên quan đến viêm xương khớp vô cùng đa dạng trong đó có viêm khớp đơn thuần và viêm khớp ảnh hưởng đến cơ quan khác như:

Đi sâu hơn mộtvề bệnh viêm khớp dạng thấp

VKDT làtình trạngbệnh xảy ra khi hệ miễn dịch tấn công nhầm vào các mô liên kết và gây viêm nhiễm, đồng thời tạo ra các phức hợp miễn dịch tại màng hoạt dịch khớp gây viêm tại khớp với sự hoạt hóa hàng loạt tế bào gâytăng sinh màng hoạt dịch khớp, hoạt hóa hủy cốt bào, gây phá hủy sụn khớp, đầu xương dưới sụn, dẫn đến xơ hoá, dính và biến dạng khớp Nếu bệnh không được kiểm soáttốt, thì tình trạng thấp khớp kéo dài sẽ dẫn tới thoái hóa khớp rất nguy hiểm [9] [29] [30] [31 ]

Ngoài ranếu bệnh xảy ra cùng lúc ởnhiều vị trí khớp thì người tagọi là đakhớp thấp Theo các chuyên gia, căn bệnh này có thể xuất hiện ở mọi đối tượng, tuy nhiên phổ biến nhất là độ tuổi 40-50, trong đó nữ giới caogấp 2-3 lần nam giới.[32]

Cơ thể khi bị kháng nguyên xâm nhập vào, thì các tế bào trình diện kháng nguyên (đại thực bào, các tếbàođuôigai, tế bào diệt tựnhiên) sẽ ngay lập tức đánh bắt, xử lý kháng nguyênvà trình diện cho các tế bào lympho T Khi tiếp xúc, các tế bào lympho T CD4 (T help) sẽ tiết ra các cytokine (IL-2, IL-17 và IFN-ỵ) xâm nhập vào màng hoạt dịch Vai trò của các cytokine giúp sự kích thích các tế bào lympho B tăng sinh và biệt hoá thành các tương bào sản xuất ra các imunoglobulin có bản chất là tựkháng thể Tại mô đích, sự kết hợp giữa kháng nguyênvói kháng thể tạo thành phức hợp miễn dịch lắng đọng trên bề mặt màng hoạt dịch khớp đồngthời gây tổn thương khớp [10]

Các cytokine cũng hoạt hóa đại thực bào gây ra sự kích thích các tế bào màng hoạt dịch, tế bào sụn, nguyên bào xơ khi số lượng tế bào tăng lên nhanh chóng, dẫn đến sự xâm lấn vào vùng tiếp giáp sụn tạo thành màng máu, giúp giải phóng ra các enzyme như collagenase, stromelysin, elastase góp phần phá hủy sụn khớp.

Ngoài ra, các cytokine viêm nhưTNF-a, IL-1 và IL-6 cũng được tìm thấy nhiều ở màng hoạt dịch khớp, làm hoạt hoácác tế bào nội mô mao mạch màng hoạtdịch, chính vì vậy sản xuất ra các phân tử kết dính và thu hút các loại tế bào viêm đến tập trung ở khoang khớp Đồng thời, các tế bào viêmgiải phóng ra các cytokine khác, gây nên các tổn thương đối với xương, khớp, dẫn đến dính và biến dạng khớp.[33]

Hình1.5 Cơ chế sinh bệnh củaVKDT

1.3.3.2Điều trị

VKDT là một loại bệnh rất khó để điều trị dứt điểm Một khi mắc phải bệnh nhân cần phải kiên trì và có một sinh hoạt lành mạnh kết hợp với các biện pháp tây y thì mới mau khỏi Hiện nay có hai phuong pháp điều trị khá phổ biến đó là:

• Điều trị nội khoa: Dùng thuốc giảm đau, chống viêm nằm trong nhóm kháng viêm steroid ( NSAIDs), thuốc chống thấp khóp thay đổi đuợc bệnh (DMARD), Thuốc tác nhân sinh học đuợc chiếc xuất từngãi cúu,

• Điều trị ngoại khoa: tiến hành các phẫu thuật cầnthiết để giúp loại bỏ viêmkhớp truớc tình trạng bệnh chuyển biến quá xấu.[l 1][34]

1.4Tỗng quan về mô hình lọc ảo in silico

1.4.1 Tình hình vàlợiíchkhi sử dụng mô hình sàng lọc ảo

Dùng các công cụ công nghệ để nghiên cứu cho các nghành hóa - sinh đã phát triển từ rất lâu đời ( từ cuối nhũng năm 1950 cho đến nay ) Song vẫn còn rất nhiều khó khan và hạn chế Điền hình là trong các nghiên cúu về các hợp chất tụ nhiên truớc kia, các họp chất mới đuợc phân lập chr đuợc sàng lọc ngẫu nhiên qua các mô hình đon giản chỉ đánh giá đuợcmột số các hoạt tính sinh học nhukhángsinh, gây độc tế bào,

Tuy nhiên ngày nay, với sự pháttriển vượtbậc củacon người, các sàng lọc hiện đại này đã cho phép phát hiện chính xác các họp chất chưa các hoạt tính sinh học mong muốn trong nghiên cứu, góp phần đon giản hóa các bước nghiên cứu cũng như tiết kiệm được thời gian, kinh tế và công sức nhưng vẫn mangđến hiệu quả vô cùng cao.

Trong nghiên cứu lần này, chúng tôi thực hiện trên mô hìnhsàng lọc ảo in siỉico một mô hình hiện đại có vai trò quan trọng trong khoa học hiện nay Đây là phưong pháp sử dụng phần mềm máy tính phân tích dữ liệu về mối quan hệ giữa hoạt tính vàcông thức cấu tạo của một hợp chất hóa học Sử dụng tương tác giữ thụ thể và hợp chất để tìm ra cấu trúc ligand dự đoán khảnăng liên kết với thụ the (Receptor - ligand) tốt nhất (mang mức năng lượng tự do AG thấp nhất).Với hướng nghiên cứu sàng lọc trên nền tảng cấu trúc chất (SBVS) sử dụng cấu trúc bachiều của đích sinh học để mô phỏng tương tác ảo với các hợp chất có tiềm năng dẫn truyền thuốc tốt bằng phương pháp docking phân tử với phần mềm sử dụnglà Autodock

1.4.2 Phươngpháp dockingphântử

Docking phân tử (Molecular Docking hay Protein docking) là phương pháp nhằm dự đoán vị trí mà khả năng liên kết thụ thể với hợp chất mang cấu trúc ligand có thể gắn vào phân tử Protein đích (được cung cấp bởi ngân hàng dữ liệu protein RCSB).MÔ phỏng được thực hiện bằng phương pháp lắp ghép hàng loạt GRIP Việc lắp ghép GRIP sử dụng chức năng tính điểm PLP theo một cách mới để thu nhận nhanh chóng và chính xác sự bắt nguồn từ các protein Trong phương pháp gắn kếtGRIP bao gồm các tương tác như liên kết hydro, tương tác steric, tương tác Vanderwaal, tương tác kỵ nước và tương tác tĩnh điện Điểm PLP được thiết kế để cho phép kếtnối linh hoạt các phối tử đế thực hiện tìm kiếm vị trí và cấu trúc đầy đủ trong một liên kết cứng Các hợp chất mục tiêu và thuốc đối chứng được tiến hành ở chế độ gắn kết phân tử silico để ức chế cấu trúc tinh thể của enzyme gây viêm 4WCU: mã PDB , tương ứng AutoDockTools-

1.5.6rc3 được sử dụng để gắn mọi phối tử vào một enzym đích Thụ thể thực hiện để xóa các phân tử nhỏ, phối tử và dị nguyên tử Đối với các phối tử, chúng được tạo ra năng lượng tối ưu của hình dạng thông qua phương pháp MMFF94, được thực hiện bởi gói Avogadro Các phân tử nước bị loại bỏ và hydro được thêm vào cấu trúc tinh thể của protein, đượctinh chế bằng cách hoàn thành các phần dư chưa hoàn chỉnh và phần dư còn thiếu Sau đó, hydro chuỗi bên được thêm vào cấu trúctinh thể vàcác vị trí của nó được tối ưu hóabằng cách tập hợp phần còn lại của thụ thể Thụ thể đượctối ưu hóa sau đó được lưu dưới dạng tệp mol và được sử dụng để mô phỏng docking, cấu trúc 2D của các hợp chấtthửnghiệm được xây dựng và sau đó chuyển đổi thành 3D.

Mục tiêu: Phân tử cơchất được dịch chuyển trongkhông gian xung quanh vùng hoạt dộng dự đoán của protein Một ligand dẫn truyền thuốc tốt là một ligand nhận diện đủ ba phần:

• Phần nhận diện protein: (vùng thơm, dị vòng ) thông qua các amino acid

• Phần Linker: tương tác ligand thông qua các liên kết carbon hydro hoặc Vander Waal

• Phần nhận diện nhóm chức: các tươngtácưanước hydrogen

CHƯƠNG 2 THựCNGHIỆM

2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị2.1.1 Hóa chất, dụng cụ

- Hóachất

• n-Hexane(Chemsol-Việt Nam) • Ethylacetate (Chem sol-ViệtNam) • Methanol (Chemsol-ViệtNam) • Ethanol (Chemsol-ViệtNam) • HC1 (Chemsol-Việt Nam)

• Nước cất(Viện khoa học Vật liệu ứngdụng) - Dụngcụ:

• Các dụng cụ thí nghiệm thường quy (vải lọc, bông, giấy lọc, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, đũa thủytinh,pitpet ),

Cân phân tíchAB 265 - s, cân kỹ thuậtPB 602-S, Cân xác định độ ẩm AND MF-50 Hệ thống cô quay, hệthống đun hoàn lưu

Tủ sayBinder FD115, Lò nungnabertherm

2.2 Phương pháp chưngcấtlôi cuốn hơi nước cổ diễn

Lá của được đem cân 300g sau khi xử lý, cắt nhỏ, cho vào bình cầu chưng cất dung tích 2 lít của hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước, thêm vào 1200ml nước cất, tiến hành ly trích trong năm giờ Phần hỗn hợp tinh dầu và nước được lấy ra rồi tiến hành tách tinh dầu ra khỏi nước bằng cách chiết hỗn hợp này nhiều lần với diethyl ether, rồi làm khan tinh dầu thu được bằng Na2SƠ4, sau đó cô quay để đuổi dung môi diethyl ether Thí nghiệm lập lại ba lần, lấy giátrị trung bình Ket quảđược trình bày ởphần nghiên cứu và kết quả.

Nguyêntắc hoạt động: nguyên liệu thái nhỏ, cho vàobình cầu sau đó thêm vào lượng nước thích hợp rồi đun nóng Hơi nước xuyên thấm vào nguyên liệu cùng với lượng nước có sẳn của nguyên liệu sẽ lôi kéo các chất dễbay hơi trong nguyên liệu ra khỏi nguyên liệu dạng hơi Hỗn hợp hơi này bay lên gặp lạnh từ hệ thống làm lạnh, ngưng tụ lại bởi ống sinh

nước sẽ nổi lên trên, nước nặng hơn ở phần dưới Nếu tinh dầu nặng hơn nước sẽ chìm xuống dưới nước Ngườita dùng một bình riêng đê thư hỗn họp này Saư đó dùngdung môi thích hợp để 11 trích tinh dầu và phươngpháp thích hợp đế thu hồi dung môi Hoặc cho thêm muối ăn vào hỗn hợp tinh dầu-nước để tăng tỉ trọng của nước, làm cho tinh dầu nổi lên nhiều hơn rồi để yên một thời gian trong bình lóng sẽ có sự tách giữa hai pha tinh dầu và nước, sau đó chiết đê thu tinh dầu.

Phương pháp thựchiện

Dùnglá tươi được chọn ở trên, saư khi xử lý, cân mỗi mẫu 300g, cắt nhỏ rồi cho vào bình cầu 2 lít của hệ thống chưng cất lôi cuốn với 1201111 nước, tiến hành chưng cất trong cùngkhoang thời gian nhất định (5g) , lập lại mỗi mẫưba lầnrồi lấy giá trị trung bình Chiết tinh dầu bằng dung môi diethyl ether, làm khan bằng Na2SƠ4, rồi cô quay thu tinh dầu và thu hoi diethyl ether.

Hình 2.1 Trích ly tinh dầu theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nướccổ điên

2.3 Phương pháp điều chế các loại cao chiết vàphânlập các chấttừ cây Ngải cứu2.3.1 Quy trình điều chế các loạicao chiết

Phơi khô cây Ngải cứu tươi hoàn toàn VỚI tròi mát không để ẩm, mốc đến khối lượng không đổi chiết kiệt nguyên liệu đã xaynhỏ (1 kg) vói EtOH (98°), đuổi dung môi dướimáycất quaychânkhông thu được caotoàn phần Các cao phân đoạn và các chấttinh khiết phânlập được ly trích từ cao tổngvói phươngpháp sắckí.

Mầu Ngải cứu sau khi xay nhỏ được cho vào ngâm trong các bình thủy tinh lớn có nắpđậy Rót ethanol vào bình cho đến khi được hai phần ba bình ngâm Giữ yênở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, để cho dungmôi xuyên thấm vảo cấutrúc tế bàothựcvậtvà hòatan các họp chất thiên nhiên Sau 24 giờ, dung dịch chiết được qua giấy lọc, cô quay thuhồi dung môi Lặp đi lặplại nhiều lẩn cho đếnkhi chiết kiệt hếtcác chất trongnguyên liệu bột tathu được cao EtOH dạngsệt (100g) Cao EtOH được chiếtlỏnglỏng với các dung môi Hexane, Etyl acetate và nước tạo thành các cao Hexane( AVH), cao etyl acetat (AVEa), cao Methanol (AVM).

2.3.2Quy trình phân lậpcác hợp chất

Cao AVEA

Hình 2.3 Sơđồ quy trìnhphân lập các họp chất mới

2.3.3Phương pháp đánh giá hoạt tínhkháng viêm

Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát hoạt tính kháng viêm từcáo cao chiết phân đoạn đươc điềuchế ở mục 2.2.1 và các hợp chất mới phân lập ở mục 2.3.2 Lưuý rằng, các mẫu cao dùng đánh giá hoạt tính được bay hơi hết dung môi để đông khô.

2.3.4Thửhoạt tính khángviêm bằng phương pháp ức chế sản sinh NO

Hoạttính kháng viêm được đánh giá qua tác dụng ứcchế sản sinh gốc tự do *NO Gốc tự do •NO được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Phản ứng này đòi hỏi NO3’ đượcchuyển thành NO2’ sau đó phát hiện và phân tích thông qua phản ứng tạo phức màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2’với thuốc thửGriess.

Hình 2.4 Sơ đồ quytrình thử hoạttính kháng viêm bằng phương pháp ức chế NO Khả năng ức chế sản sinhNO được xác định theo công thức:

Trong đó: [Xtb] là nồng độ NOtrung bình tính dựatrên đường chuẩn NaNƠ2.

Mầu đối chứng âm làtế bào không xử lí thuốc, không xửlí LPS Đối chứng dương là tế bào xử lí LPS, không xử lí thuốc.

Phântích số liệu, xây dựng đồ thị và tính toán giá trị IC50 bằng cách xác định theo phương pháp hồi quy khôngtuyến tính

2.4Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn:

Các chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 33591, do Bộ môn Vi sinh - Ký sinh, Khoa Dược, Đại học Nguyễn TấtThành cung cấp.

Phương phápsàng lọc hoạt tính kháng khuẩn

Mau tinh dầu được tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa,MRSAtheo phương pháp giếng khuếch tán.

- Chuẩn bị chất thử: Tinh dầu được pha loãng trongDMSO 10 %với nồng độ 10 pl/mL - Chuẩn bị môi trường: Môi trường sau khi được pha và hấp tiệt trùng, cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4 mm Thể tích

thí nghiệm, nếu chưa sử dụng thì để trong tủ lạnh từ (4-8) oc Khi sử dụng, nếu đĩa ướt, phơi đĩa trong laminar tối đa30 phútcho đĩa khô hoàn toàn.

- Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm: Sau khi cấy hoạthóa trên đĩa thạch BHI, ủ ở37 oc trong 24 giờ, vi khuẩn được pha trong dung dịch nước muối sinh lý có thêm 0,05 % tween 80 vàphân tán đều bằng máy vortex Huyền dịch vi khuẩn được điều chỉnh về giá trị OD (0,08-0,12) tại bước sóng 625 nm Giá trị này tương đương với khoảng (1-2) X 108 CFU/mL.

- Tiến hành: Huyền dịch vi khuẩn đượctrải đều trên mặtthạch bằng que bông vô trùng Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay đĩa 600 Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để vi khuẩn được trải đều Đục lỗ đường kính 5 mm trong đĩa thạch bằng que đục lỗ thép không rỉ Cho vào mỗi lỗ 50 pL chất thử Đe yên khoảng 15 phút cho các chất thử khuếch tán vào lớp môi trường Mỗi chất thử nghiệm được lặp lại 3 lần ủ đĩa thạch trong tủ ấm ở (35-37) 0C.

- Đọc kết quả: Đọc kết quả sau (16-18) giờ và chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh lỗ Đo và ghi nhận đường kính vòng ức chế bằng thước kẹp có độ chia nhỏ nhất bằng 0,01 mm Mức độ kháng vi sinh vật được đánh giá sơ bộ theo dựa theo đường kính vòng kháng được chia làm 3 mức độ: mạnh (> 14 mm), vừa (10-14 mm), yếu (7-9mm) và không kháng(6 mm)[12].

Xácđịnh nồngđộ ức chế tốithiểu (MIC)

Sau khi sàng lọc, mẫu cao chiết có tác động ức ché vi khuẩn hiệu quả nhất sẽ được thử nghiệm tìm nồngđộ ức chếtối thiểubằng phương pháp phaloãng trong môi trường lỏng, sử dụng đĩa 96 giếng được qui định tại hướng dan M07 - A10 của CLSI.

- Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm: Tương tự thí nghiệm trên Sau đó, huyền dịch trên tiếp tục được pha loãng 100 lần Vi khuẩn/nấm sau khi được pha phải được sử dụng trong vòng 30 phút.

- Thuốc thử: Resazurin ởnồng độ 0,15 mg/ml trongmôi trườngthử - Môi trường: MHB (Mueller-Hinton Broth)

- Tiến hành:

Bước 1: Cho vào giếng thử nghiệm (Al) 60 iiL môi trường thử nghiệm và 40 pL cao chiết (nồng độ 100 mg/mL) Giếng chứng dương (B1): 8 pL Amikacin 2,5 mg/mL và 92 pL môi trường Giếng chứng âm (C1): 40 pL DMSO 10 % và 60 pL môi trường.

Bước 2: Hút 50 11L môi trường vào mỗi giếng từ cột2 đến cột 12.

Bước 3: Tiến hành pha loãng cao theo từng dãy hàng ngang sao cho nồng độ giảm dần một nửa so với giếng trước nó từ số 1 đến số 12, ta có dãy nồng độ của chất thử Al đến A12 giảm dan Vi, từ 20 mg/mL đến 0,009 mg/mL và nồng độ kháng sinh ở dãy chứng dương BI đến B12 từ 100 pg/mL đến 0,048 8 pg/mL.

Bước 5: Cho 50 pL vi khuẩn đã được huyền phù vào tất cả các giếng từ dãy số 1 đến số 12 Đậy nắp khay, ủ bảng 96 giếng trong tủ ấm 37 °C trong 24 giờ.

Bước 6: Thêm vào mỗi giếng 30 pL thuốc thử resazurin có nồng độ 0,015 %, ủ thêm (2-4) giờ rồi đọc kết quả.

- Đọc kết quả: Giếng chứng âm không có hoạt tính kháng khuẩn, vi khuẩn tăng trưởng sẽ làm thay đổi màu chỉ thị resazurin sang màu hồng hoặc trắng hồng Những giếng không có vi khuẩn vẫn giữ nguyên màu xanh dương của chỉ thị, giá trị MIC được xác định là giếng cuối cùng cónồng độ cao chiếtthấpnhấtức chế sự tăngtrưởng củavi khuẩn[13].

2.5 Docking phân tử(in silico docking study)

Docking của ligand Atragalin (pose 326) hoặc AV13 và Vitexin (pose 155) hoặc hợp chất AV12 to4WCU enzyme để giải thích hoạt tính kháng viêm trong môhình in silico docking

Sự ức chế enzyme tương ứng với sự ức chế sản xuấtNO đồng nghĩa với việc hợpchất giải thích được khả năng kháng viêm Quá trình docking tuân thủ sơ đồ Hình 3.4 bên dưới Đối với ligand được tối ưu bằng phần mềm Avogadro theo phương pháp trường lực phân tử MMFF94 và lưu file dưới dạng *.pdb Đối với enzyme được loại bỏ các phân tử nước và các ligand nhỏ hoạt tính trong enzyme và lưu file dưới dạng *.pdb Tâm hoạt tính của ligand được xác định bằng phần mem Discovery studio Vusualiazer V21.1.0.20298 Tâm hoạttính được trên 4WCU: pdb (download từ ngân hàng dữ liệu protein databank) có tọa độ (X=29,286, Y=-50.843, -26.674), file tham số hộp lưới cóthông số space = 0,5 Â, sồ phầtử trên trục X,Y vàz là 60, 60, 60 và lưu trong file dock.gpf số lần chạy của mô hình là 500 mô hìnhđượclưu trongtham so dock (dock.dpf).

Xây tkmgỉÊt qvâbangphânmêm:Discovery studio, Visualnex, Molegro Mobcxỉar Vỉe««r; Đánh

giá gia trịmo hinh(RMSD)

I ĩ

Hình 2.5 Sơđồ chung của quá trình docking của mộtpose (cấu dạng tối ưu của 1 một phân tử hữu cơ hay gọi là ligand đến emzyme hay mụctiêuđích (receptor) được mô tả trong

hình.

CHƯƠNG 3.KẾTQUẢ VÃ THẢO LUẬN

3.1Kết quả phân tích tinh dầu Ngải cứu

3.1.1 Thành phần tinh dầu theo phưong pháp lôi cuốnhoi nước

Hình 3.1.Sắc kýđồ định lượngcấư tửcó trong tinh dầu Ngải cứu.

Bảng 3.1 Các cấu tửchiếmnhiều trong tinh dầu Ngải cứu theo phươngpháplôi cuốn hơi

1'1'1|l|lff I Tff 1111111 yiy ffl1"TlFĩllĩlT"|""ri

AAlAA MA 11A i/A lAAMAMA AiA A/AAAA MA MAMA MAMA íAA ÍAAHA i/A ÍAA

Hình3.2. Phổ khối của hợp chất Alpha pinene (-)

SW6 Foimula:C10H16OCAS:46442 Mol%tìghi:152 ReiWa:112l

II'.HA r AAAA 1'1 irwvrii 1'1

Hình 3.4 Phổ khối của hợp chất Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one-l,7,7-trimethyl-(lS)-Pinocarvone

Hình3.5 Phổ khối của cáchợp chất(L)- Bomeol

3.1.2 Thành phần tính dầutheo phương pháp head space

Theo phương pháp head space thì ta thu được các cấu tử chiếm phần trăm cao theo bảng dưới đây:

Bảng 3.2 Các cấu tử chiếm nhiều trong tinh dầu Ngải cứu theo phương pháp head space

39 (+)-2-Bomanone 15.408 25.04

SI:97 Fomiula:C5H10OCAS.-96-17-3 MolWeight:86Retlndex:643

CompName:ButanaJ 2-methyk ss Butyraldehyde, 2-methyl- $$.alpha.-Methylbutanal s$.alpha.-MelhylbutjTaldehyde $$ alpha.-MethylbutyTicaldehyde$5

Hình3.6 Phô khôi của các hợp chât2-Methylbutanal

stwFommliClO HI6CASM-5Mo]Wághi:l36 RctluàxO

ConipXanieianiphi'ik' JS Bicyclữí 2.2.1 ]hcptíme (CAS).' ’•Dink’thy]-2-mcthvlcnenortx)mancSỉ 2.2-Dintíhyl-?4Mhyk'[Kiioil

Hình 3.7 Phổ khối của các hợp chất Camphene