Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong bacillus subtilis bd170 tái tổ hợp

Bên cạnh ưu điểm sản xuất protein ngoại bào mạnh, vi khuẩn thuộc chi Bacillus còn sử dụng sản xuất các protein tái tổ hợp không glycosyl hóa do đặc tính di truyền của chúng được nghiên c

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ ANH THƯ

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HUẾ, 2024

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ ANH THƯ

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Lời Cảm Ơn

Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án, em đã nhận được rçt nhiều sự quan tåm, giúp đỡ của quý ban lãnh đäo, quý thæy cô giáo, quý đồng nghiệp và các anh chị học viên và sinh viên Em xin chân thành câm ơn sự giúp đỡ quý giá đó

Đặc biệt, em xin bày tô lòng biết ơn chån thành và lời câm ơn såu sắc đến Thæy giáo GS TS Nguyễn Hoàng Lộc đã tận tình chỉ bâo và nhẫn näi với em trong suốt quá trình làm luận án, đã giúp đỡ em hoàn thành luận án này Nếu không có sự giúp đỡ của thæy, thật sự em không thể có được như ngày hôm nay

Em xin câm ơn các thæy cô giáo täi bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đäi học Khoa học, Đäi học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài, đã động viên em chån thành và đæy cởi mở ngay từ những ngày đæu tiên

Em xin cám ơn phòng Đào täo Sau đäi học trường Đäi học Khoa học, Đäi học Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu, täo mọi điều kiện tốt nhçt để em hoàn thành luận án này

Em muốn gửi lời câm ơn đến Thæy giáo TS Nguyễn Minh Trí, Thæy đã giúp đỡ em rçt nhiều trong việc hoàn thành các thủ tục hồ sơ giçy tờ để em có thể bâo vệ thành công luận án

Em xin gửi lời câm ơn đến Ban Giám đốc, Ban Đào täo và Công tác Sinh viên Đäi học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Tổ chức Hành chính và Thanh tra Pháp chế, quý đồng nghiệp Khoa Cơ bân, Trường Đäi học Y - Dược, Đäi học Huế đã luôn täo những điều kiện tốt nhçt để em có điều kiện hoàn thành luận án này

Tôi xin chån thành cám ơn các bän học viên, sinh viên ngành Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ rçt nhiều trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của luận án, đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian làm luận án

Con xin gửi đến ba mẹ yêu quý của con những lời biết ơn chån thành nhçt Cám ơn ba mẹ luôn ở bên cänh con để chia sẻ, động viên con trong những ngày con làm luận án

Cuối cùng xin gửi lời câm ơn đến người chồng yêu quý và hai con đã luôn bên cänh động viên, khuyến khích Thật sự đåy là những động lực to lớn để tôi có thể đi đến thành công này

Một læn nữa xin câm ơn tçt câ với lòng biết ơn và chån thành nhçt!

Thừa Thiên Huế, tháng 2 năm 2024

Nguyễn Thị Anh Thư

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Nguyễn Thị Anh Thư

ATP Adenosine triphosphate

ATPS Aqueous two-phase system Hệ hai pha nước

BDNF Brain-derived neurotrophic factor Yếu tố thần kinh nguồn gốc từ não BSA Bovine serum albumin

cAMP Cyclic adenosine monophosphate EDTA Ethylene diamine triacetic acid

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật sinh hóa được dùng trong miễn dịch học

GFP Green fluorescent protein

IGF-1 Insulin-like growth factor-1 Yếu tố tăng trưởng giống Insulin-1 IPTG Isopropyl

β-D-1-thiogalactopyranoside JAK1 Janus kinase 1

LB Luria Bertani ORF Open reading frame

PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PEG polyethylene glycol

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

RBS Ribosome binding site SBTI Self-Directed Biological

SRP Signal recognition particle

STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1

TCA Trichloroacetic acid

TGF-β Transforming growth factor beta

uPA Urokinase-type plasminogen activator

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới YPD Yeast peptone dextrose

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NATTOKINASE 4

1.1.1 Đặc điểm của nattokinase 4

1.1.2 Nguồn sản xuất nattokinase 6

1.2 HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Bacillus subtilis 18

1.2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 18

1.2.2 Hệ thống vector biểu hiện ở Bacillus 19

1.2.3 Hệ thống tiết ở Bacillus 20

1.3 ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG SẢN XUẤT ENZYME TÁI TỔ HỢP 23

1.3.1 Nattokinase 23

1.3.2 Các enzyme khác 25

1.4 TINH SẠCH ENZYME BẰNG HỆ 2 PHA NƯỚC 27

1.4.1 Cấu tạo và đặc tính của hệ hai pha nước 28

1.4.2 Ứng dụng hệ hai pha trong tinh sạch enzyme 31

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.2.1 Phân lập gen mã hóa nattokinase từ các chủng B subtilis C10 và N05 37

2.2.2 Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong tế bào E coli TOP10 38

2.2.3 Biến nạp vector pHT43/nat05 và pHT43/natC10 vào Bacillus subtilis BD170 40

2.2.4 Biểu hiện nattokinase bằng hệ thống vector pHT43 41

2.2.5 Xác định hoạt tính nattokinase 43

2.2.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin 44

2.2.7 Thử nghiệm khả năng phân giải fibrin trong máu thỏ bằng nattokinase tái tổ hợp 45

2.2.8 Tinh sạch nattokinase tái tổ hợp bằng hệ hai pha nước 45

2.3 XỬ LÝ THỐNG KÊ 47

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48

3.1 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis……….48

3.1.1 Khuếch đại gen mã hóa nattokinase từ các chủng B subtilis 48

3.1.2 Tạo dòng gen nattokinase giả định trong vector pCR®2.1 49

3.1.3 Xác định trình tự gen nattokinase giả định từ các chủng B subtilis 51

3.2 TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG Bacillus subtilis BD170 54

3.2.1 Tạo dòng gen nat05 và natC10 vào vector pHT43 54

3.2.2 Biến nạp vector pHT43 tái tổ hợp vào B subtilis BD170 56

3.3 BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP TRONG Bacillus subtilis BD170 57 3.3.1 Xác định dòng B subtilis BD170 biểu hiện nattokinase mạnh 57

3.3.2 Đặc điểm của nattokinase tái tổ hợp ở dòng R4 59

3.4 TINH SẠCH NATTOKINASE BẰNG HỆ HAI PHA NƯỚC 63

3.4.1 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử PEG 63

3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ potassium phosphate 65

3.4.3 Thu hồi enzyme 66

3.4.4 Xác định khối lượng phân tử của nattokinase tái tổ hợp 67

Chương 4 THẢO LUẬN 69

4.1 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis 69

4.2 TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG VECTOR BIỂU HIỆN pHT43 70 4.3 BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP Ở Bacilus subtilis 71

4.3.1 Biểu hiện gen mã hóa nattokinase 71

4.3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin 74

4.3.3 Thử nghiệm khả năng phân giải cơ chất của nattokinase 77

4.4 TINH SẠCH NATTOKINASE BẰNG HỆ HAI PHA NƯỚC 79

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

1 KẾT LUẬN 81

2 KIẾN NGHỊ 81

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chủng vi khuẩn Bacillus sản xuất được phân lập từ thực phẩm

lên men truyền thống 6

Bảng 1.2 Nguồn sinh vật sản xuất enzyme thủy phân fibrin 11

Bảng 2.1 Trình tự các primer dùng để khuếch đại PCR gen nattokinase từ B subtilis C10 và N05 38

Bảng 3.1 Hoạt độ protease của các dòng B subtilis BD170 tái tổ hợp 58

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính nattokinase của Nat05 60

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính nattokinase của Nat05 61

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các ion kim loại và chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính nattokinase của Nat05 62

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của PEG 2000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase 64

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của PEG 6000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase 64

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của PEG 10000 và PP 20% đến sự phân tách nattokinase 65 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của PP 15% đến sự phân tách nattokinase 65

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của PP 25% đến sự phân tách nattokinase 66

Bảng 3.10 Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzyme khi sử dụng hệ hai pha nước của B subtilis BD170 tái tổ hợp 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc không gian 3 chiều của nattokiase 5

Hình 1.2 Cơ chế hoạt động của nattokinase trong chống đông máu 14

Hình 1.3 Hình ảnh kính hiển vi điện tự quét tế bào B subtilis 168 19

Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn hệ thống mạng lưới các con đường tiết protein của B subtilis 21

Hình 1.5 Sơ đồ mô tả hệ thống tiết protein theo con đường Sec và các thành phần tham gia ở B subtilis 23

Hình 1.6 Sơ đồ phân tách quá trình chuyển hóa sinh học bằng hệ hai pha 28

Hình 1.7 Các giai đoạn phân tách và tinh sạch enzyme bằng hệ hai pha PEG/muối 30

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tách nattokinase bằng hệ 2 pha 47

Hình 3.1 Khuếch đại PCR với cặp mồi NatF và NatR từ DNA tổng số 48

Hình 3.2 Tinh sạch sản phẩm PCR 49

Hình 3.3 Kiểm tra khuẩn lạc mang sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu 50

Hình 3.4 Sơ đồ vector pCR®2.1 mang gen mã hóa nattokinase 50

Hình 3.5 So sánh trình tự của các gen nat05 và natC10 phân lập được với trình tự gen aprN từ chủng B subtilis MTCC 7164 53

Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn của các gen phân lập được với trình tự nattokinase từ chủng B subtilis MTCC 7164 54

Hình 3.7 Kiểm tra sự hiện diện gen mã hóa nattokinase trong vector pHT43 ở chủng vi khuẩn E coli TOP10 bằng phản ứng PCR 55

Hình 3.8 Sơ đồ vector pHT43 mang gen mã hóa nattokinase 55

Hình 3.9 Kiểm tra sự hiện diện của vector pHT43 tái tổ hợp trong B subtilis BD170 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 56

Hình 3.10 Vòng phân giải sữa tách béo của các dòng B subtilis BD170 tái tổ hợp khi cảm ứng IPTG ở nồng độ 1 mM 57

Hình 3.11 Vòng phân giải fibrinogen của dòng R4 khi đƣợc cảm ứng với IPTG ở các Hình 3.14 Điện di sản phẩm tinh sạch trên polyacrylamide gel 12% 68 Hình 3.15 Điện di sản phẩm tinh sạch trên polyacrylamide gel có bổ sung cơ chất 68

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nhồi máu cơ tim và các bệnh tim mạch là những bệnh rất nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và là nguyên nhân chính gây đột tử ở người Theo thống kê của WHO, khoảng 17,7 triệu người chết mỗi năm trên thế giới liên quan đến bệnh tim mạch, trong đó chủ yếu bệnh thiếu máu cục bộ, cao huyết áp và các bệnh mạch máu não Nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu, tắc nghẽn phổi, cục máu đông tĩnh mạch là các chứng bệnh do rối loạn đông máu gây ra Ở người bình thường, sự tích tụ fibrin và phân hủy fibrin trong máu được duy trì cân bằng, tuy nhiên khi fibrin không bị phân hủy gây nên sự mất cân bằng, dẫn đến nhồi máu cơ tim và các rối loạn đông máu khác Khi đó, máu đông sẽ hình thành trong thành mạch [119]

Phân giải fibrin đóng vai trò quan trọng trong liệu pháp điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu Do bản chất fibrin là các protein nên chúng sẽ bị phân hủy bằng protease Các protease thường được sử dụng trong điều trị gồm có nattokinase, urokinase, streptokinase và plasmin Urokinase và plasmin luôn hiện diện trong cơ thể người nhưng sự tích lũy plasmin có thể gây ra hiện tượng xuất huyết trong Streptokinase có nguồn gốc từ vi sinh vật, có giá thành sản xuất rẻ, tuy nhiên gây ra đáp ứng miễn dịch khi đưa vào cơ thể, tạo ra hiệu ứng không mong muốn như xuất huyết trong và dị ứng Hiện nay, nattokinase là liệu pháp chính được sử dụng để chống lại các bệnh máu đông [91, 99]

Natto là một sản phẩm lên men từ đậu nành được người Nhật sử dụng trên 2000 năm như thuốc tự nhiên phòng và trị các bệnh tim mạch Thành phần chính của Natto là nattokinase, đây là một serine protease [102] Nattokinase phân hủy máu đông trực tiếp thông qua thủy phân sợi fibrin và cơ chất plasmin, chuyển đổi prourokinase nội sinh đến urokinase, phân hủy tác nhân ức chế lên plasminogen và tăng mức độ hoạt hóa plasminogen ở mô qua đó tăng cường hoạt tính thủy phân fibrin [119, 126] Ngoài ưu điểm ít tác dụng phụ lên mạch máu, nattokinase dễ dàng được hấp thụ qua đường ruột và có hoạt tính rất mạnh sau khi hấp thụ trong tá tràng

Những ưu điểm này giúp nattokinase dễ sử dụng và hoạt tính thủy phân fibrin có thể áp dụng chống lại bệnh máu đông [35, 45] Ngoài ra, nattokinae còn được sử dụng trong điều trị huyết áp [28] hay được sử dụng trong nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer [31]

Công nghệ DNA tái tổ hợp đã góp phần tạo ra một lượng lớn enzyme công

nghiệp như protease, amylase, và lipase từ vi khuẩn Gram dương và nấm Bacillus

là một trong những nhóm vi sinh vật được ứng dụng nhiều nhất để sản xuất enzyme, phụ gia thực phẩm, vitamin, kháng sinh và thuốc diệt côn trùng Bên cạnh ưu điểm

sản xuất protein ngoại bào mạnh, vi khuẩn thuộc chi Bacillus còn sử dụng sản xuất

các protein tái tổ hợp không glycosyl hóa do đặc tính di truyền của chúng được nghiên cứu rất kỹ và dễ dàng kiểm soát quá trình sinh tổng hợp thông qua các kỹ thuật di truyền [29] Bên cạnh đó, trình tự tín hiệu peptide của chúng có thể được sử dụng trong sản xuất các protein dung hợp Đặc biệt, các trình tự tín hiệu peptide dễ dàng được tối ưu cho từng loại protein đích, vì vậy tăng cường đáng kể hiệu quả sản xuất ngoại bào các protein tái tổ hợp [15]

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu

điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ

hợp” nhằm mục đích cung cấp nguồn dược chất tự nhiên cho các ứng dụng trong

lĩnh vực y dược học

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, tạo dòng gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên và biểu hiện thành công nattokinase tái tổ hợp trong chủng B subtilis BD170

Nattokinase tái tổ hợp được biểu hiện mạnh và có khả năng phân hủy cục máu đông

3 Nội dung và phạm vi nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập gen mã hóa nattokinase từ các chủng B subtilis tự nhiên - Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong B subtilis BD170

- Biểu hiện nattokinase tái tổ hợp trong B subtilis BD170

- Tinh sạch nattokinase bằng hệ hai pha nước

Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

4 Đóng góp mới của luận án

Luận án đã phân lập và tạo dòng các gen mã hóa nattokinase từ các chủng

Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10, biểu hiện thành công trong chủng B subtilis

BD170 Nattokinase tái tổ hợp đã được thu hồi, tinh sạch bằng hệ 2 pha nước, phân tích đặc điểm và bước đầu thử nghiệm phân hủy cục máu đông mạnh với enzyme

được kết tủa bằng acetone

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án

Nattokinase là enzyme có vai trò quan trọng trong y học, đặc biệt trong việc bảo vệ sức khỏe tim mạch Nattokinase thường được sản xuất dưới dạng thực phẩm chức năng và được sử dụng phổ biến ở những người mắc các bệnh lý tim mạch như bệnh tim, tăng huyết áp, mỡ máu, đột quỵ, đau thắt ngực, huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ vữa động mạch, … Vì vậy, nghiên cứu sản xuất nattokinase bằng công nghệ DNA tái tổ hợp nhằm tăng khả năng sản xuất enzyme này là việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, góp phần vào việc phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NATTOKINASE 1.1.1 Đặc điểm của nattokinase

Nattokinase được mã hóa bởi gen aprN và được sinh tổng hợp ở dạng tiền chất

với tín hiệu peptide và trình tự propeptide nằm ở đầu tận cùng NH2 trong cấu trúc

enzyme [83] Phần lớn các nghiên cứu cho thấy nattokinase từ Bacilus subtilis là

một serine protease có khối lượng phân tử khoảng 27-29 kDa và pI khoảng 8,6 [52, 83, 84, 115] Gần đây, nhiều nattokinase khác đã được phân lập và công bố, chẳng

hạn, Pinontoan và cs (2021) đã phân lập được 6 nattokinase từ chủng B subtilis G8,

các enzyme này có khối lượng phân tử từ 13,7 đến 42 kDa, trong đó enzyme có khối lượng phân tử 20 kDa thể hiện hoạt tính mạnh nhất [96] Minh và cs (2022)

nhận thấy sau khi tinh sạch nattokinase từ B subtilis TH9, có 3 băng với khối lượng

phân tử khoảng 21, 27 và 37 kDa thể hiện hoạt tính thủy phân fibrin [76]

Phân tích cấu trúc 3 chiều cho thấy, nattokinase từ chủng B subtilis natto là

một chuỗi polypeptide đơn không chứa liên kết disulfide Enzyme chứa 9 chuỗi xoắn α, 9 vị trí gấp cuộn β (Gln2, Asp41, Leu75, Asn77, Ile79, Val81, Ala169, Tyr171, Thr174) và 2 vị trí gắn Ca2+ Trung tâm hoạt động của enzyme là Asp32-His64-Ser221, trong khi vị trí gắn cơ chất chứa các amino acid là Ser125, Leu126, Gly127 (Hình 1.1) Tương tự các serine protease khác, 7 vị trí gấp cuộn β của nattokinase nằm gần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme, 2 vị trí gấp cuộn khác nằm gần đầu tận cùng NH2 9 gấp cuộn β nằm ngược với 9 cấu trúc xoắn α, trong đó có 7 xoắn α có bề mặt tương tự nhau [127]

Cơ chế xúc tác của nattokinase hiện nay chưa được công bố Từ mô hình cấu trúc 3 chiều cũng như so sánh với các protease khác cho thấy cơ chế phân tử của nattokinase cũng tương tự như các alkaline serine protease khác [127] Cấu trúc

nattokinase tương đồng cao với subtilisin E trong họ serine protease của Bacillus

[91] Nattokinase là một protease không có cysteine, vì vậy không có liên kết

disulfide giữa các amino acid Khi có sự hiện diện của PMSF, nattokinase mất hầu hết hoạt tính enzyme tương tự như các enzyme khác trong họ serine protease Mặc dù được xếp vào nhóm sublitisin trong họ protease nhưng nattokinase khác với subtilisin ở đặc tính tác dụng mạnh trên cơ chất fibrin [91, 124]

Hình 1.1 Cấu trúc không gian 3 chiều của nattokiase [127] A Vị trí liên kết

calcium (màu vàng), B Cấu trúc không gian 3 chiều, C ba vị trí xúc tác của nattokinase (His-64, Asp-32 và Seb-221)

Nghiên cứu đột biến điểm định hướng và động học phân tử của các mô hình cấu trúc 3D cho thấy liên kết hydrogen giữa các amino acid Ser33, Asp60, Ser62 và Thr220 giúp ổn định phản ứng, các amino acid Ser125, Leu126 và Gly127 đóng vai trò liên kết với cơ chất Trong khi đó, các amino acid Ser3, Gly100, Ser101 và Leu126 chịu trách nhiệm hoạt tính thủy phân fibrin [121]

Nghiên cứu đánh giá độc tính nattokinase lên mô hình động vật thí nghiệm cũng như người cho thấy nattokinase an toàn, không gây đột biến di truyền ở điều

kiện thí nghiệm in vitro Bên cạnh đó, nattokinase không gây ra sự khác biệt nào

sau 28 ngày thí nghiệm trên chuột ở mức bổ sung 157 mg/kg/ngày và 90 ngày với mức 1000 mg/kg/ngày Các phân tích ở mức độ tế bào cũng không cho thấy có tổn thương nào Kiểm tra trên người với mức bổ sung 10 mg/kg/ngày liên tục trong 4 tuần cho thấy nattokinase không gây ra bất kỳ sự thay đổi nào Nghiên cứu đã cho thấy nattokinase không có hoặc có độc tính ở mức độ rất thấp khi sử dụng với liều lượng 10 mg/kg/ngày [58]

1.1.2 Nguồn sản xuất nattokinase

1.1.2.1 Vi khuẩn Bacillus

Nattokinase được sản xuất từ các nguồn vi sinh vật khác nhau, chủ yếu từ thực phẩm lên men như Natto của Nhật Bản, Chungkook-jang và Meju của Hàn Quốc, Gembus của Indonesia, Douchi của Trung Quốc Natto là một sản phẩm đậu nành lên men được xem là nguồn nguyên liệu tốt nhất để sản xuất nattokinase Chungkook-Jang cũng là sản phẩm lên men từ đậu nành và cũng là nguồn nguyên liệu phổ biến cho sản xuất nattokinase (Bảng 1.1) [91, 92, 99]

Bảng 1.1 Một số chủng vi khuẩn Bacillus sản xuất được phân lập từ thực phẩm lên men

truyền thống [91]

Chủng vi khuẩn Nguồn phân lập Tên enzyme

B natto Natto, Nhật Bản Nattokinase, NK

B amyloliquefaciens DC-4 Douchi, Trung Quốc Subtilisin DFE

Bacillus sp CK Chungkook-jang, Hàn Quốc CK

Bacillus sp DJ-4 Doen-jang, Hàn Quốc Subtilisin DJ-4

Bacillus sp DJ-2 Doen-jang, Hàn Quốc bpDJ-2

Bacillus sp KA38 Jeot-gal, Hàn Quốc Jeot-gal enzyme

B subtilis QK02 Đậu nành lên men, Hàn Quốc QK-1 và QK-2

Bacillus firmus NA-1 Natto, Nhật Bản -

B subtilis IMR-NK1 Natto, Đài Loan -

Bacillus sp KDO-13 Bơ đậu, Hàn Quốc -

Fujita và cs (1993) đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin từ thực phẩm lên men Natto gọi là nattokinase Nattokinase được tách chiết từ Natto bằng dung dịch muối sinh lý, sau đó được tinh sạch theo trình tự sắc ký kỵ nước, sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel Nhóm nghiên cứu đã giải trình tự enzyme cho thấy có 275 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 27,78 kDa Trình tự enzyme này tương đồng cao với nhóm enzyme subtilisin Nattokinase tinh sạch ngoài đặc tính thủy phân sợi fibrin còn có khả năng thủy phân nhiều cơ chất peptide tổng hợp khác nhau Trong số các peptide tổng hợp được khảo sát thì trình tự peptide Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA cho hiệu quả thủy phân cao nhất Enzyme bị ức chế mạnh bởi PMSF

ở cả 2 đặc tính thủy phân fibrin và thủy phân peptide cho thấy nattokinase thuộc họ serine protease [34]

Wei và cs (2012) đã phân lập chủng vi khuẩn sinh nattokinase từ sản phẩm đậu nành lên men để sản xuất nattokinase làm thực phẩm chức năng Kết hợp phương pháp hóa sinh xác định hoạt tính enzyme và giải trình tự gen 16S rDNA,

nhóm tác giả đã định danh được một chủng thuộc B subtilis và đặt tên là LSSE-22

Hoạt độ nattokinase đạt giá trị 356,25 FU/g cơ chất Nattokinase sau đó được tách chiết với ethanol 50% và kết tủa với ethanol 70%, hỗn hợp sau kết tủa có hoạt tính nattokinase 4000 FU/g [118]

Chủng vi khuẩn B subtilis ICTF-1 phân lập từ nước biển và được xác định có

sản xuất nattokinase nhờ phương pháp thử hoạt tính với fibrin Enzyme sau đó được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion để khảo sát đặc tính Băng protein của enzyme tinh sạch có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa trên hình ảnh điện di SDS-PAGE pH tối ưu cho hoạt tính enzyme từ 7-11 với giá trị tối ưu là pH 9 Nhiệt độ tối ưu của enzyme từ 50-60oC Hoạt tính enzyme giảm mạnh khi có mặt PMSF, Zn2+, Fe3+ và Hg2+ [71]

Chủng vi khuẩn B subtilis RJA19 được phân lập từ đậu nành lên men và định

danh phân tử bằng trình tự gen 16S rDNA Chủng RJA19 sản xuất nattokinase cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy ở 50oC và pH 9 Cơ chất lactose và peptone giúp tăng khả năng sản xuất enzyme Nattokinase sau khi thu nhận từ dịch nuôi cấy được phân tích SDS-PAGE cũng như khảo sát các đặc tính của nó Kết quả cho thấy enzyme có khối lượng phân tử khoảng 35 kDa, hoạt động ổn định trong khoảng pH 9,5-11 (tối ưu là 9,5) Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzyme là 65oC và độ bền nhiệt lên đến 85oC [56]

Các chủng vi khuẩn có hoạt tính nattokinase cũng được phân lập từ đậu nành lên men truyền thống của Trung Quốc bằng phương pháp sàng lọc đĩa fibrin Từ

những nghiên cứu đó, chủng vi khuẩn B subtilis MX-6 đã được tuyển chọn có hoạt tính nattokinase rất mạnh Gen aprN mã hóa nattokinase cũng được khuếch đại, tạo

dòng, giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank Nattokinase từ dịch nuôi cấy được kết tủa bằng ammonium sulfate sau đó được tinh sạch bằng phương

pháp sắc ký Enzyme tinh khiết được phân tích SDS-PAGE cho một băng protein có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa Chủng MX-6 cho hiệu quả sản xuất nattokinase cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy với vòng phân hủy fibrin đạt 21,6 mm [72]

Bên cạnh việc thu nhận nattokinase, các nghiên cứu tối ưu hóa sản xuất

enzyme này từ B subtilis cũng đã được quan tâm trong những năm qua Mahajan và cs (2012) đã nghiên cứu tối ưu hóa thành phần môi trường cho chủng B subtilis

ICTF-1 phân lập từ đất ven biển Các tác giả khảo sát ảnh hưởng của 8 yếu tố lên hoạt tính thủy phân fibrin bao gồm: pH môi trường, nồng độ maltose, peptone đậu nành, dịch chiết nấm men, K2HPO4, MgSO4, CaCl2 và NaCl trong 18 thí nghiệm khác nhau Kết quả cho thấy nồng độ MgSO4 và CaCl2 có ảnh hưởng lớn nhất đến lượng enzyme thu được trong khi pH có ảnh hưởng không đáng kể Tăng nồng độ maltose kết hợp với K2HPO4 và MgSO4 cũng cải thiện hiệu suất enzyme Bên cạnh đó, peptone đậu nành, dịch chiết nấm men, CaCl2 và NaCl khi sử dụng ở nồng độ thấp cho hoạt tính enzyme cao nhất Dựa trên các kết quả thu được, môi trường tối

ưu cho chủng B subtilis ICTF-1 sản xuất nattokinase được đề xuất gồm có 30 g/L

maltose, 5 g/L peptone đậu nành, 15 g/L dịch chiết nấm men, 1,5 g/L K2HPO4, 1,25 g/L MgSO4, 0,25 g/L CaCl2 và 10 g/L NaCl (pH 8) cho hoạt độ enzyme lên tới 8.814 U/mL [71]

Unrean và cs (2012) đã tối ưu hóa quá trình sản xuất nattokinase từ vi khuẩn

B subtilis K-C3 trong hệ lên men mẻ có bổ sung dinh dưỡng Sau khi khảo sát và

tối ưu các nguồn cơ chất ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme kết quả cho thấy glycerol là nguồn cơ chất tốt nhất để sản xuất nattokinase đồng thời hạn chế sự hình thành các sản phẩm phụ Quá trình tối ưu hóa ở hệ lên men sử dụng mô hình động học với tốc độ sinh trưởng đặc trưng (specific growth rate) được cố định thông qua kiểm soát lượng glycerol bổ sung Kết quả thu được sinh khối cực đại đạt 73,47 g/L và hoạt tính nattokinase là 9198,5 U/mL sau 28 giờ nuôi cấy Lượng enzyme trung bình thu nhận được là 61,36 U/g Hiệu suất nattokinase thu được trong hệ lên men đạt 545,95 U/giờ, cao hơn 20 lần so với lên men mẻ [112]

Chủng B subtilis RJAS19 phân lập từ thực phẩm lên men Natto cũng đã được

sử dụng để sản xuất nattokinase và khảo sát đặc tính của enzyme sau tinh sạch

Thành phần môi trường bao gồm nguồn carbon (saccharose, lactose, glucose, tinh bột, fructose, mannose), nguồn nitrogen (dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, peptone, ammonium chloride, sodium nitrate, ammonium carbonate) và điều kiện nuôi cấy như thời gian, pH, nhiệt độ đã được khảo sát và tối ưu Kết quả cho thấy lactose là nguồn carbon tốt nhất trong khi saccharose, glucose và fructose làm giảm lượng enzyme thu nhận Trong số các nguồn nitrogen được nghiên cứu, peptone cho sinh khối tế bào và hoạt độ enzyme cao nhất, trong khi dịch chiết thịt bò, ammonium chloride, ammonium nitrate cho hoạt độ enzyme thấp Lượng enzyme thu được đạt cực đại sau 72 giờ nuôi cấy ở 50oC với pH 9 [56]

Zhang và cs (2021) đã phân lập được chủng B subtilis JNFE0126 từ sữa lên

men có thể hiện hoạt tính thủy phân thrombin Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của nattokinase là 40oC và pH 7,0 Hoạt độ thủy phân thrombin của enzyme trong dịch lên men sữa là 215,1 U/mL sau 8 giờ lên men Khả năng lên men sữa của chủng

JNFE0126 được đánh giá là tương tự các chủng truyền thống như Lactobacillus

bulgaricus và Streptococcus Việc sử dụng chủng JNFE0126 để lên men sữa còn có tác

dụng làm giảm hiện tượng máu đông khi thử nghiệm trên chuột [131]

Bacillus subtilis 13932 là chủng có khả năng sản xuất nattokinase mạnh Li và

cs (2021) đã tối ưu quy trình sản xuất nattokinase từ chủng B subtilis 13932 bằng

cách sử dụng nguồn nitrogen từ nước thải chế biến tofu Tác giả đã thành công trong việc sản xuất ở quy mô 7L và 100L, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường do hoạt động sản xuất tofu gây ra đồng thời hạ giá thành sản xuất nattokinase [60] Zhang và cs (2023) tiếp tục tối ưu quá trình sản xuất nattokinase từ chủng này sử dụng hạt cây gai dầu làm cơ chất trong lên men thể rắn Nuôi cấy ban đầu được thực hiện với tỷ lệ cơ chất: nước là 1:2, độ dày cơ chất 2,9 cm, tỷ lệ cấy giống 10% và độ ẩm là 75,2%, nhiệt độ 35oC với thời gian lên men 20 giờ Các tác giả đã thu được enzyme có hoạt độ 7067,12 IU/g [130]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu tối ưu sản xuất nattokinase từ B subtilis cũng đã

được thực hiện Phương pháp tối ưu hóa bề mặt đã được Trần Quốc Tuấn và cs

(2014) sử dụng để tăng cường sản xuất nattokinase từ chủng vi khuẩn B subtilis BD104 mang gen mã hóa nattokinase aprN trên plasmid pBG01-aprN và được cảm

ứng bằng IPTG Bảy nguồn nitrogen (peptone, peptone đậu nành, cao nấm men,

tryptone, (NH4)2SO4, NaNO3 và glutamate) và năm nguồn carbon (glucose, fructose, xylose, maltose và saccharose) khác nhau được khảo sát kết hợp MgSO4, CaCl2 và K2HPO4 Kết quả nghiên cứu cho thấy nguồn nitrogen hữu cơ cho hoạt tính nattokinase cao hơn nitrogen vô cơ, và cao nhất là peptone đậu nành, đạt 92 FU/mL Trong khi đó bổ sung maltose vào môi trường nuôi cấy sẽ cho hoạt tính enzyme cao nhất đạt 85 FU/mL Sử dụng nguồn nitrogen peptone đậu nành và maltose làm nguồn carbon, các yếu tố khác ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme như MgSO4, CaCl2, K2HPO4, NaCl với các mức nồng độ khác nhau cũng được thử nghiệm Kết quả cho thấy môi trường tối ưu cho quá trình nuôi cấy có thành phần 10 g/L pepton đậu nành, 0,88 g/L MgSO4 và 5 g/L NaCl Hoạt tính nattokinase cao nhất thu được là 152 FU/mL sau 16 giờ nuôi cấy [6]

Bui và cs (2020) đã tối ưu quá trình sản xuất nattokinase từ B subtilis natto

bằng nuôi cấy lên men rắn Điều kiện tối ưu cho quá trình lên men là cơ chất dày 3 cm, tỷ lệ tiếp giống theo tỷ lệ 1:50, thời gian lên men 42 giờ Tại điều kiện tối ưu,

hoạt độ enzyme thu được là 16,55 U/mL chủng B subtilis natto có thể được tái sử

dụng với hoạt độ cao n hất thu được là 14,10 U/mL [16]

Bên cạnh B subtilis, nhiều loài thuộc chi Bacillus khác cũng có khả năng tiết ra nattokinase Peng và cs (2003) đã phân lập chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens

DC-4 từ Douchi Chủng này tiết enzyme có hoạt độ riêng 407 U/mg protein tổng số Enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin đã được tinh sạch và khảo sát các đặc điểm lý hóa của chúng Kết quả điện di SDS-PAGE và phân tích điểm đẳng điện cho thấy enzyme có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa và pI = 8 pH tối ưu cho hoạt động enzyme có giá trị khoảng 9 và nhiệt độ tối thích là 48oC Enzyme tinh khiết có thể phân hủy fibrin tự nhiên cũng như một số cơ chất tổng hợp nhân tạo khác PMSF ức

chế hoàn toàn hoạt tính enzyme [90] Chủng B polyfermenticus được phân lập từ

Meju, sản phẩm giống cho quá trình lên men đậu nành trong chế biến món ăn Kochujang và Doenjang của Hàn Quốc Phân tích hoạt tính thủy phân fibrin cho

thấy B polyfermenticus mạnh hơn so với các chủng vi khuẩn Bacillus khác của hỗn

hợp Gen mã hóa enzyme cũng được phân lập và có độ tương đồng cao với gen

nattokinase của vi khuẩn B subtilis natto [78]

Từ sáu mẫu mắm tôm thu nhận tại ba miền Bắc, Trung và Nam của Việt Nam, Anh và cs (2015) đã kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrin cũng như sàng lọc các

chủng vi khuẩn có liên quan Kết quả phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus sp từ

mẫu mắm tôm miền Trung có hoạt lực cao nhất Nghiên cứu sản xuất nattokinase từ

chủng Bacillus sp phân lập bằng phương pháp tối ưu hóa bề mặt cho kết quả lượng

enzyme đạt cao nhất là 6,85 FU/mL trong môi trường chứa 1,5% bột tôm và 1,44% NaCl với thời gian nuôi cấy là 32 giờ ở 33oC [7]

Để tăng cường khả năng sản xuất nattokinase từ chủng B licheniformis BL11, Li và cs (2023) đã knockout gen pgsC nhằm hạn chế sinh tổng hợp sản phẩm trung

gian là poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ biểu hiện các gen tăng lên đáng kể Hoạt độ nattokinase cao nhất thu được là 2522,2 FU/mL sau 54 giờ lên men [62]

1.1.2.2 Các nguồn sinh vật khác

Bên cạnh chi Bacillus còn có nhiều loại vi sinh vật khác có khả năng sản xuất

enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin như các loài vi khuẩn khác, xạ khuẩn, nấm, tảo biển, giun đất được trình bày ở bảng 1.2

Các chủng vi sinh vật từ sữa bò được phân lập dựa trên hoạt tính β-hem, sau đó được sàng lọc hoạt tính nattokinase Kết quả cho thấy trong số 10 chủng vi khuẩn có hoạt tính β-hem có một chủng có hoạt tính nattokinase Định danh phân tử

cho thấy đó là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và được đặt tên chủng là CMSS

Chủng CMSS sản xuất nattokinase mạnh nhất ở pH 7 và nhiệt độ 25oC với hoạt độ

enzyme thu được khoảng 1500 U/mL P aeruginosa CMSS sản xuất nattokinase

mạnh trong môi trường có bổ sung bột vỏ tôm đạt giá trị 2524 U/mL Thí nghiệm thủy phân sợi huyết cho thấy nattokinase có khả năng tiêu huyết sau khoảng 2 giờ phản ứng Nattokinase được tinh sạch một phần và điện di trên SDS-PAGE cho băng protein có khối lượng phân tử khoảng 21 kDa [18]

Bảng 1.2 Nguồn sinh vật sản xuất enzyme thủy phân fibrin [53, 91]

Vi khuẩn

Streptococcus hemolyticus Vết thương

Staphylococcus aureus Da người

Treponema denticola Nướu răng

Tên sinh vật Nguồn phân lập

Chryseobacterium taeanense TKU001 Đất

Pseudomonas sp TKU015 Đất

Paenibacillus polymyxa EJS-3 Rễ cây Stemona japonica

Xạ khuẩn

Actinomyces thermovulgaris T-54 Thư viện vi sinh vật

Streptomyces sp NRC 411 Thư viện vi sinh vật

Streptomyces sp Y405 Thư viện vi sinh vật

Streptomyces megaspores SD5 Suối nước nóng

Streptomyces sp CS624 Đất

Nấm

Flammulina velutipes Thư viện nuôi cấy

Cochliobolus lunatus Thư viện nuôi cấy

Penicillium chrysogenum H9 Đất

Fusarium pallidoroseum Đất

Ganoderma lucidum Thư viện nuôi cấy

Fusarium oxysporum Thư viện nuôi cấy

Enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cũng được tìm thấy trên nấm Fusarium

sp BLB phân lập từ lá atiso đỏ và có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa trên điện di SDS-PAGE Enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 9,5 và nhiệt độ 50oC, độ bền pH cao với khoảng pH từ 2,5 đến 11,5 trong khi độ bền nhiệt dưới 50oC DFP và PMSF ức chế mạnh hoạt tính enzyme như hầu hết các serine protease khác [109]

Xạ khuẩn Streptomyces cũng được xem là nguồn sản xuất enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin từ chủng S rubiginosus VITPSSM đã được phân

lập và xác định khối lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE và điện di cơ chất Kết quả cho thấy có băng protein với khối lượng phân tử khoảng 45 kDa Ở điều kiện tối ưu với nguồn cơ chất bột đậu nành, glycerol, pH 7,2 và nhiệt độ 37oC, S

rubiginosus sản xuất enzyme đạt giá trị cao hơn 2 lần ở điều kiện nuôi cấy bình

thường [27]

Bên cạnh vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc, enzyme thủy phân fibrin còn được

tìm thấy ở tảo biển Matsubara và cs (2000) đã phân lập được loài tảo biển Codium

divaricatum có khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin Enzyme này phân hủy mạnh

chuỗi α-fibrin nhưng lại rất yếu đối với chuỗi β- và γ-fibrin Đặc tính này tương tự như enzyme có trong nọc độc của rắn, hoạt tính protease cao nhất ở pH 9 và bị ức chế hoàn toàn bởi DFP và PMSF cho thấy nó là một serine protease có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa [110]

Lumbrokinase, một enzyme có hoạt tính phân hủy fibrin được tìm thấy ở loài

giun đất Lumbricus rubellus Nghiên cứu cho thấy enzyme không những phân hủy

fibrin giàu plasminogen mà còn phân hủy fibrin không có plasminogen Hoạt tính thủy phân fibrin trung bình khoảng 100 đơn vị plasmin và 250 đơn vị urokinase trên 1 g khối lượng tươi tế bào Khối lượng phân tử enzyme khoảng 20 kDa với điểm đẳng điện 3,4 Lumbrokinase có độ bền nhiệt cao và khả năng hoạt động trong dải pH rộng Các chất như DFP và SBTI ức chế mạnh hoạt tính enzyme nhưng chất kháng plasmin t-AMCHA gần như không ảnh hưởng đến hoạt tính lumbrokinase [75]

1.1.3 Ứng dụng của nattokinase

1.1.3.1 Ứng dụng trong chống đông máu

Nattokinase được xem là thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên, có tác dụng mạnh và kéo dài, giá thành rẻ, được sử dụng để hỗ trợ cho quá trình điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch, cao huyết áp [28] Các thử nghiệm trên mô hình động vật và người đã chứng minh chúng có thể hỗ trợ hệ tuần hoàn nhờ thu nhỏ thành mạch máu và hòa tan các khối huyết bám trên thành mạch máu Cơ chế hoạt động chống đông máu của nattokinase được trình bày ở hình 1.2 Nattokinase hòa tan cục máu đông bằng cách phân hủy fibrin và cơ chất plasmin Nattokinase xúc tác chuyển pro-urokinase nội sinh thành urokinase, phá hủy yếu tố ức chế hoạt hóa plasminogen (PAI-1) đồng thời tăng mức độ biểu hiện của yếu tố kích hoạt plasminogen trong mô (t-PA) [119]

Hình 1.2 Cơ chế hoạt động của nattokinase trong chống đông máu [119]

Nattokinase đã được Xu và cs (2014) ứng dụng để chống hiện tượng đông

máu ở điều kiện in vivo trên mô hình chuột bị cảm ứng chất đông máu Nhóm tác

giả tiêm hợp chất K-carrageenan vào chuột mô hình và theo dõi sự đông máu ở các cá thể được tiêm Sau đó, bổ sung nattokinase vào thức ăn của chuột và kiểm tra khả năng chống đông máu của chúng Nhóm tác giả cũng sử dụng phương pháp

ELISA để đo sản phẩm thủy phân fibrin nhằm xác định hoạt tính thủy phân fibrin của nattokinase Kết quả cho thấy máu của nhóm chuột sử dụng thức ăn bổ sung nattokinase có sản phẩm của quá trình phân hủy sợi fibrin ở mức cao hơn so với nhóm chuột đối chứng Hoạt tính thủy phân fibrin của nattokinase tương tự như khi sử dụng kinase từ nọc độc rắn [123]

Nghiên cứu của Ji và cs (2014) đã đưa ra cơ chế bảo vệ mạch máu não khỏi

tắc nghẽn của nattokinase qua các thử nghiệm in vitro và in vivo Nhóm tác giả kết

luận nattokinase có khả năng loại bỏ các gốc tự do, tăng mức độ biểu hiện chu trình vận chuyển tín hiệu Janus kinase (JAK1) mRNA tại những điểm bị thương ở vùng não giữa trên chuột thí nghiệm, qua đó ức chế biểu hiện chu trình vận chuyển tín hiệu và kích hoạt phiên mã 1 STAT1 mRNA Tăng cAMP bảo vệ não thông qua ức chế sự tăng nồng độ ion Ca2+ nội bào tiểu cầu, làm nhẵn thành mạch máu thông qua tổng hợp và giải phóng NO, giảm ion Ca2+ trong dòng máu Nattokinase cũng tham gia bảo vệ tế bào thành mạch máu nhờ hoạt tính thủy phân fibrin và thúc đẩy phản ứng nội phân thrombrin [49]

Nghiên cứu trên động vật của Jang và cs (2013) cho thấy nattokinase tăng tốc độ dòng chảy của máu thông qua ức chế sự ngưng kết tiểu cầu và hình thành khối huyết Dung dịch giàu tiểu cầu thỏ được ủ với nattokinase sau đó phân tích collagen cảm ứng ngưng kết tiểu cầu, hình thành sợi huyết và tốc độ ngưng kết tiểu cầu Kết quả cho thấy nattokinase ức chế collagen và sợi huyết gây ngưng kết tiểu cầu Nattokinase cũng giảm lượng thromboxane B2 hình thành từ collagen hoạt hóa của tiểu cầu Nhóm tác giả cũng thử nghiệm trên mô hình chuột được bổ sung nattokinase vào khẩu phần ăn trong 1 tuần và giải phẫu hệ động mạch để kiểm tra cục máu đông Kết quả phân tích cho thấy nattokinase làm chậm tắc nghẽn động mạch và phụ thuộc vào lượng nattokinase bổ sung ban đầu Ở lượng bổ sung 500 mg/kg, nattokinase ngăn chặn hoàn toàn hiện tượng tắc nghẽn động mạch tương tự như khi xử lý chuột với aspirin ở nồng độ 30 mg/kg Từ đó, nhóm nghiên cứu rút ra kết luận nattokinase ức chế sự ngưng kết tiểu cầu thông qua cơ chế khóa sự hình thành thromboxane, theo đó làm chậm ngưng tụ máu bằng cách oxi hóa thành động mạch bị tổn thương [46]

Hitosugi và cs (2015) nghiên cứu đánh giá hiệu quả sử dụng Natto lên các triệu chứng gây ra bởi tắc nghẽn mạch máu trên nhóm bệnh nhân nữ mạn tính Nhóm bệnh nhân được bổ sung nattokinase trong 4 tuần và theo dõi các triệu chứng đau nhức vai, đau lưng, cảm lạnh Kết quả cho thấy những người có bổ sung nattokinase giảm số lần xuất hiện triệu chứng đau nhức vai từ 42,3 xuống còn 32,4 lần, xuất hiện đau lưng giảm 25,5 xuống 18,8 lần, triệu chứng cảm lạnh giảm từ 33,1 xuống còn 25,7 lần Trong khi đó, triệu chứng đau đầu không có sự thay đổi giữa những người theo dõi Sử dụng nattokinase làm thực phẩm bổ sung giúp giảm các triệu chứng liên quan đến tác nghẽn mạch máu trên người bệnh mãn tính [39]

Các nghiên cứu ở Bắc Mỹ cho thấy có sự liên quan giữa sử dụng nattokinase với hạ huyết áp và yếu tố von Wilebrand (một chỉ thị của bệnh tim mạch) Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ngẫu nhiên trên 79 người có triệu chứng cao huyết áp và được điều trị sử dụng nattokinase trong 8 tuần Kết quả cho thấy huyết áp nhóm bệnh sử dụng nattokinase giảm trên cả bệnh nhân nam và nữ, trong đó nhóm bệnh nữ có sự điều hòa tốt hơn Mức độ huyết áp trung bình giảm từ 87 mmHg về 84 mmHg ở nhóm bệnh nhân sử dụng nattokinase, trong khi nhóm bệnh không sử dụng nattokinase vẫn duy trì huyết áp trung bình 87 mmHg Đặc biệt trên nhóm bệnh nhân nữ, huyết áp giảm xuống còn 81 mmHg Sự giảm yếu tố von Wilebrand cũng được ghi nhận trên nhóm bệnh nhân nam Từ các kết quả trên, nhóm nghiên cứu đưa ra kết luận nattokinase làm giảm huyết áp người bệnh ở Bắc Mỹ, sự giảm huyết áp và yếu tố von Wilebrand phụ thuộc vào giới tính [47]

1.1.3.2 Các ứng dụng khác

Bên cạnh ứng dụng phân hủy cục máu đông, chống đông máu và tác nghẽn mạch máu, nattokinase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác Nattokinase được nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer’s trên mô hình chuột Chuột được nuôi có bổ sung AlCl3 trong 45 ngày gây ra các triệu chứng của bệnh Alzheimer như tăng hoạt độ acetylcholinesterase não (AchE), yếu tố sinh trưởng β (TGF-β), Fas và interleukin-6 đồng thời làm giảm yếu tố trung hóa não (BDNF), yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF-1) và bất hoạt biểu hiện các metalloproteinase

9 (ADAM9) và metalloproteinase 10 (ADAM10) của não Sau đó, chuột được bổ sung nattokinase vào khẩu phần ăn và tiếp tục theo dõi các thông số trên Kết quả cho thấy nattokinase giảm hoạt tính AchE, TGF-β, Fas và IL-6 đồng thời tăng biểu hiện BDNF và IGF-1 Cùng với đó, mức độ biểu hiện gen ADAM9 và ADAM10 tăng trên mô não chuột Các kết quả trên đã chứng tỏ sự thay đổi các triệu chứng trên mô não chuột trong điều kiện có và không có nattokinase, qua đó cho thấy nattokinase có khả năng điều hòa các triệu chứng của bệnh Alzheimer’s [30]

Wei và cs (2014) ứng dụng nattokinase phủ lên vật liệu kết hợp với nano bạc Kết quả đã tạo ra vật liệu có khả năng chống đông máu và kháng khuẩn mạnh Vật liệu nattokinase-nano bạc sau đó được kết hợp với polyethylenimine tạo nên lớp phủ cho các thiết bị y tế Phân tích quang phổ cho thấy hỗn hợp đã bao phủ tốt trên vật liệu Màng nattokinase-nano bạc và polyethylenimine thể hiện hoạt tính chống đông máu và hoạt tính kháng khuẩn mạnh Nghiên cứu cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của màng trong sản xuất các thiết bị y tế [117]

Nattokinase cũng được ứng dụng trong xử lý thu hồi tế bào gốc trung mô từ nuôi cấy trên sợi gel fibrin 3 chiều Tế bào gốc trung mô thường được nuôi cấy đơn lớp trên đĩa plastic, tuy nhiên có thể giảm hiệu suất Hệ thống nuôi cấy 3 chiều cung cấp môi trường sinh lý phù hợp hơn cho dòng tế bào qua đó tăng hiệu quả quá trình nuôi Vì vậy, sợi huyết được sử dụng để tạo môi trường nuôi cấy 3 chiều cho dòng tế bào gốc trung mô Tuy nhiên, phương pháp có giá thành cao và khó thu hồi tế bào Do đó, nhóm tác giả Carrion và cs (2014) đã nghiên cứu ứng dụng nattokinase trong thu nhận tế bào gốc trung mô trên môi trường nuôi cấy 3 chiều sợi huyết Kết quả nghiên cứu cho thấy nattokinase phân hủy sợi fibrin 3 chiều nhưng không gây tổn thương tế bào, đặc biệt ở quá trình hình thành màng tế bào trong 6 giờ đầu tiên Sau 30 phút ủ với nattokinase, gần 100% tế bào được thu hồi Ở thí nghiệm tương tự nhưng sử dụng trypsin, nhóm tác giả nhận thấy hiệu suất thu hồi bị giảm sút [17]

Như vậy, các nghiên cứu về phân lập, đặc điểm và chức năng của enzyme nattokinase đã được nghiên cứu và công bố khá đầy đủ Tuy nhiên, các nghiên cứu được triển khai ở Việt Nam chưa nhiều, đặc biệt là phân lập các chủng có khả năng sản xuất nattokinase ở khu vực miền Trung

1.2 HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Bacillus subtilis 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí, tạo bào tử, được đặt tên vào năm 1872

bởi Cohn B subtilis thuộc nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi Chúng có thể được tìm thấy trong đất, nước và không khí B subtilis thuộc giới vi khuẩn, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus, loài Bacillus subtilis B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt

màu tím Gram (+), kích thước 0,5-0,8 µm × 1,5-3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8-12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8-1,8 µm Thành tế bào vi khuẩn có cấu trúc peptidoglycan (Hình 1.3) [22, 133]

Hình thành bào tử là một đặc tính quan trọng của B subtilis và được chia

thành 2 loại khác nhau: nội bào tử và tế bào mẹ Bào tử đóng vai trò quan trọng

trong chu trình phát triển của B subtilis, giúp vi khuẩn chống chịu các điều kiện bất

lợi của môi trường, chống chịu được tia tử ngoại, các chất oxi hóa mạnh, nhiệt độ

cao, enzyme thủy phân, chịu khô hạn Trạng thái bào tử giúp B subtilis tồn tại trong

thời gian dài [74, 103]

Trình tự genome của B subtilis được giải mã hoàn chỉnh gồm có 4214810 bp

chứa 4100 gen mã hóa Trong số đó, 53% chỉ biểu hiện cho một loại protein trong khi khoảng ¼ genome thuộc về các họ gen tham gia vào quá trình nhân bản gen Họ

gen lớn nhất chứa 77 gen mã hóa protein vận chuyển liên kết ATP Hệ gen B

subtilis chứa 5 gen mã hóa peptidase cắt tín hiện peptide cũng như hàng loạt gen mã

hóa cho các yếu tố trong con đường tiết protein Hệ gen cũng chứa nhiều gen tham gia vào các chu trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp bao gồm kháng sinh [57]

Hình 1.3 Hình ảnh kính hiển vi điện tự quét tế bào B subtilis 168 [133]

1.2.2 Hệ thống vector biểu hiện ở Bacillus

Hệ thống vector biểu hiện cho Bacillus, đặc biệt cho B subtilis được chia

thành hai nhóm chính: Nhóm vector biểu hiện là các plasmid tồn tại độc lập với hệ gen vật chủ, có cơ chế tự nhân đôi, phiên mã và dịch mã riêng; nhóm vector biểu

hiện mang các trình tự tương đồng với một vị trí đích trên genome của B subtilis từ đó có thể dung hợp và tồn tại cùng với genome của B subtilis thông qua cơ chế tái

tổ hợp tương đồng [94]

Promoter là yếu tố rất quan trọng trong việc phát triển các hệ thống biểu hiện

mạnh cho B subtilis Phần lớn promoter được sử dụng hiện nay là promoter SPAC (Pspac) được tạo ra bằng cách dung hợp trình tự 5’ từ promoter SPO1 của B subtilis và trình tự 3’ từ promoter lac của E coli Promoter Pspac hoạt động ổn định trong cấu trúc plasmid và nhiễm sắc thể, đặc biệt khi tồn tại ở nhiều bản sao có thể sản

xuất được protein đích chiếm tỷ lệ lớn trong protein tổng số Tuy nhiên, promoter

Pspac không thực sự quá mạnh và tốn nhiều chi phí cho chất cảm ứng khi sản xuất

công nghiệp [97] Promoter cho hệ thống biểu hiện ở B subtilis vẫn được tiếp tục

phát triển dựa trên cơ sở các plasmid đã được thiết kế trước đó Phan và cs (2006)

đã phát triển vector biểu hiện cho B subtilis dựa trên promoter mạnh phụ thuộc yếu

tố σA nằm phía trước operon groE của B subtilis dung hợp với lac operator tạo thuận lợi cho việc cảm ứng bằng IPTG Để giúp B subtilis tiết protein tái tổ hợp ra ngoài môi trường, vector được gắn với tín hiệu peptide của gen amyQ mã hóa cho

một α-amylase từ B amyloliquefaciens Nhờ đó vector mang gen tái tổ hợp sau khi được biến nạp vào B subtillis có thể sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp ngoại bào [93] Chen và cs (2010) đã sử dụng hệ thống biểu hiện T7 cho B subtilis Nhóm tác

giả đã dung hợp vector có chứa gen mã hóa T7 RNA polymerase dưới sự điều khiển

của promoter Pspac và dung hợp với genome của B subtilis ở vị trí cố định nhờ quá trình tái tổ hợp tương đồng Kết quả cho thấy chủng B subtilis tái tổ hợp có khả

năng sản xuất vượt mức enzyme tái tổ hợp [19]

Cheng và cs (2016) đã phát triển promoter cảm ứng tự động cho B subtilis dựa trên promoter điều khiển nhân tố quorum-sensing srfA (PsrfA) Trình tự nucleotide trên promoter PsrfA cũng được đột biến để kiểm tra ảnh hưởng của chúng đến mức độ biểu hiện gen Sử dụng gen chỉ thị huỳnh quang GFP để phân tích mức độ biểu hiện, nhóm nghiên cứu đã tìm ra được một promoter đặt tên là P10 có thể tăng mức độ biểu hiện lên 1,5 lần so với promoter gốc Kiểm tra mức độ biểu hiện promoter P10 trên các gen khác như nattokinase và endoglucanase cũng cho các kết quả tương tự [20]

1.2.3 Hệ thống tiết ở Bacillus

Một trong những ưu điểm của B subtilis và các loài thuộc chi Bacillus khác là

khả năng tiết một lượng lớn protein ra môi trường Điều này cho phép thương mại

hóa Bacillus như một nhà máy sản xuất enzyme ngoại bào Phân tích sâu về hệ

thống tiết của 4 con đường sản xuất protein từ tế bào chất cho thấy có khoảng 300 protein tham gia vào quá trình này Phần lớn protein tham gia vào con đường vận

chuyển Sec (Hình 1.4) Trong khi đó, con đường vận chuyển arginine đôi, con

đường phát triển khả biến và hộp vận chuyển bám ATP có thể xem là những con đường vận chuyển đặc biệt khi mà chỉ có một số ít các protein sử dụng Bên cạnh đó, nhóm tín hiệu peptide trực tiếp, protein vận chuyển màng, peptidase cắt tín hiệu peptide cũng như các thành phần khác của con đường đóng vai trò rất quan trọng

trong hệ thống tiết của B subtilis [33]

Hình 1.4 Sơ đồ biểu diễn hệ thống mạng lưới các con đường tiết protein của B subtilis [33]

1.2.3.1 Tín hiệu peptide

Tín hiệu peptide là yếu tố điều hòa nằm ở vị trí đầu amine (-NH2) của protein tiết và đóng vai trò tối quan trọng trong nhận biết chính xác bộ máy vận chuyển từ tế bào chất ra môi trường Mặc dù phân tích tín hiệu peptide khác nhau không cho thấy có sự bảo thủ ở các vị trí amino acid, tín hiệu peptide vẫn có 3 vùng cơ bản bao gồm: vùng tích điện dương ở đầu NH2, vùng kỵ nước nằm ở giữa và vùng chứa vị trí cắt ở đầu carboxyl (COOH) Đặc biệt, trong tín hiệu peptide của con đường Sec, vị trí tích điện dương ở đầu NH2 luôn có hai hoặc ba lysine hoặc arginine chịu trách nhiệm nhận diện định hướng tín hiệu peptide trên màng [97] Vùng trung tâm kỵ nước thường có trình tự bảo tồn glycine hoặc proline ở vị trí -4 hoặc -6 liên quan đến vị trí cắt của chuỗi helix Vùng trung tâm đóng vai trò nhận diện chuỗi α-helix trên màng và tham gia vào giai đoạn đầu của quá trình tiết protein [128] Trong khi đó, đầu COOH đóng vai trò kết thúc cho vị trí nhận biết cho enzyme cắt qua trình tự alanine-X-alanine [107] Các phần mềm nhận diện tín hiệu peptide được phát triển dựa trên ba vùng đặc trưng trên và được ứng dụng rộng rãi [51]

1.2.3.2 Tiểu phần nhận diện tín hiệu

Tiểu phần nhận diện tín hiệu có hệ ribonucleoprotein bảo thủ cao, đóng vai trò nhận diện trình tự tín hiệu peptide của chuỗi polypeptide mới tạo thành và định

hướng nó đến màng tế bào (Hình 1.5) Ở B subtilis tổ hợp vùng tiểu phần nhận diện

tín hiệu được cấu thành từ một RNA tế bào chất nhỏ, hai GTPase và 1 protein giống

histone [81, 82] Bên cạnh đó, một SRP receptor (FtsY) có trình tự bảo thủ cao trong họ SRP-GTPase cũng đóng vai trò thiết yếu trong vận chuyển phức hợp ribosome-protein mới tổng hợp đến kênh vận chuyển [87]

1.2.3.3 Các yếu tố điều hòa

Để hoàn thiện một quá trình tiết hiệu quả cũng như cuộn xoắn gấp khúc protein đúng, cần phải có sự tham gia của nhiều phân tử khác như chaperone,

foldase và protease để kiểm soát chất lượng biểu hiện trong B subtilis B subtilis có

hai loại phân tử chaperone tồn tại trong tế bào chất và ngoài tế bào chất Chaperone trong tế bào chất như GroE và DnaK đóng vai trò hỗ trợ protein cuộn xoắn, hạn chế sự kết tụ và giữ preprotein ở trạng thái ổn định chờ vận chuyển Bên cạnh đó, một chaperone tế bào chất (CsaA) được dự đoán có tương tác đặc biệt với con đường

vận chuyển SecA-ATPase và preprotein CsaA tăng vận chuyển in vitro preprotein

đến màng tế bào khoảng 2 đến 3 lần [33] Yếu tố chaperone ngoài tế bào chất PrsA là một lipoprotein cần thiết cho sự cuộn xoắn gấp khúc của protein hoàn chỉnh sang trạng thái ổn định và hoạt hóa Ở mỗi tế bào vi khuẩn Gram dương có khoảng 20000 phân tử lipoprotein PrsA liên kết màng tế bào [33, 51]

Quá trình gắn liên kết disulfide ở B subtilis đóng vai trò trong quá trình ổn

định và hoạt hóa protein Để tăng cầu nối disulfide ở các protein tương đồng, điều hòa quá trình khởi động hay thay đổi các thiol-disulfide oxidoreductase rất hữu ích

khi mà rất ít cầu disulfide tồn tại trong con đường tiết protein ở B subtilis Nhiều protein có các cầu nối disulfide đã được biểu hiện thành công trong B subtilis bằng

cách cảm ứng thiol-disulfide oxidoreductase [54, 55]

Hình 1.5 Sơ đồ mô tả hệ thống tiết protein theo con đường Sec và các thành phần tham

gia ở B subtilis Hai con đường vận chuyển chủ yếu CsaA-SecA (mũi tên đứt đoạn) và

SRP-SecA (mũi tên liền) Phân tử mRNA có màu đỏ Phức hợp ribosome có màu xanh dương và chuỗi peptide vừa được tổng hợp có màu đen Các tiểu phần nhận diện tín hiệu, CsaA, FtsY, SecA và peptidase cắt tín hiệu peptide có màu xanh lục Protein điều hòa liên quan đến sự cuộn xoắn của protein tiết (PrsA, BdbB/C/D) và phân hủy các protein cuộn xoắn lỗi có màu cam Cầu disulfide của protein hoạt động có màu đỏ [51]

Như vậy, B subtilis hội đủ các yếu tố cần thiết để trở thành vật chủ trong sản

xuất protein tái tổ hợp như dễ nuôi cấy, đầy đủ các hệ thống di truyền cho sản xuất protein/enzyme ngoại bào, dễ tác động về mặt di truyền và dễ tối ưu điều kiện nuôi cấy trong sản xuất protrin tái tổ hợp

1.3 ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG SẢN XUẤT ENZYME TÁI TỔ

HỢP

1.3.1 Nattokinase

Hiện nay, nattokinase đã được biểu hiện thành công nhiều vật chủ như E coli,

Lactobacillus, Bacillus và Pichia pastoris E coli là vật chủ được nghiên cứu rộng

rãi nhất trong biểu hiện nattokinase [127] Tuy nhiên, trong các vật chủ đã được sử

dụng hiện nay thì B subtilis thể hiện tiềm năng cao nhất do có thể sản xuất lượng

vượt mức và tiết trực tiếp protein tái tổ hợp ra môi trường nuôi cấy [84]

Từ lâu, sản xuất nattokinase tái tổ hợp dựa vào B subtilis đã được nhiều tác giả thực hiện và công bố Gen mã hóa subtilisin DFE từ chủng vi khuẩn B

amyloliquefaciens DC-4 đã được phân lập, sau đó dung hợp với trình tự peptide

AmyP của gen α-amylase cũng từ chủng DC-4, gắn vào vector pSUGV4 và biểu

hiện trong chủng B subtilis WB600 Phân tích hoạt tính thủy phân fibrin cho thấy

enzyme tái tổ hợp có hoạt tính đạt 200 U/mL trong khi đối chứng không có hoạt tính này Tín hiệu peptide AmyP tăng mức độ biểu hiện lên 4 lần so với sử dụng tín hiệu peptide của gen gốc Điện di SDS-PAGE và phân tích Western blot cho thấy có băng protein tái tổ hợp với khối lượng phân tử khoảng 28 kDa, tương tự kích

thước enzyme tự nhiên tiết ra từ chủng DC-4 Kết quả này chứng tỏ chủng B

subtilis WB600 tái tổ hợp đã loại bỏ trình tự AmyP và pro-peptide của protein dung

hợp trước khi tiết enzyme ra ngoài môi trường [122]

Chen và cs (2010) đã tạo được chủng B subtilis PT5 tái tổ hợp chứa gen mã hóa nattokinase và endoglucanase E1 từ Thermononospora fusca sử dụng promoter

T7 Sau 24 giờ nuôi cấy và cảm ứng bằng IPTG, chủng tái tổ hợp tiết nattokinase và endoglucanase ra môi trường với hoạt độ lần lượt là 10960 CU/mL và 8,4 U/mL Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của hệ thống biểu hiện dung

hợp genome với B subtilis sản xuất các protein tái tổ hợp [19]

Gen mã hóa enzyme thủy phân fibrin aprE2 từ B subtilis CH3-5, aprE176 từ

B subtilis HK176 và gen aprE179 đột biến từ gen aprE176 được gắn vào plasmid

pDG1662 và dung hợp với genome B subtilis 168 không có sự hiện diện gen kháng

kháng sinh Các thể tái tổ hợp được chọn lọc và kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho từng gen Phân tích hoạt tính thủy phân fibrin cho thấy chủng tái tổ hợp sản xuất lượng enzyme lớn hơn ít nhất 3,2 lần so với chủng không biến nạp khi được nuôi cấy trên môi trường LB Các chủng tái tổ hợp sau đó được sử dụng để sản xuất sản phẩm Cheonggukjang, hoạt độ enzyme đo được sau 72 giờ ủ

là 4,6 U/g đối với chủng B subtilis 168 tự nhiên, 10,8 U/g đối với chủng mang gen

aprE2, 7 U/g đối với chủng mang gen aprE176 và 8 U/g đối với chủng mang gen aprE179 [48]

Một promoter liên quan đến quorum-sensing srfA (PsrfA) được Cheng và cs

(2016) sử dụng để tạo ra hệ thống biểu hiện cảm ứng tự động ở B subtilis nhằm sản

xuất protein tái tổ hợp Trong thư viện đột biến promoter thu nhận được, promoter mạnh nhất P10 có khả năng tiết protein huỳnh quang (GFP) gấp 1,5 lần so với promoter bình thường PsrfA Gen mã hóa aminopeptidase và nattokinase dưới sự điều khiển của P10 cho mức độ biểu hiện mạnh hơn 3,6 lần và 1,5 lần so với khi sử dụng promoter gốc PsrfA [20]

Hai đoạn gen aprN và pro-aprN từ chủng B subtilis natto đã được Tian và cs (2019) tạo dòng vào vector pHT43 và biểu hiện thành công trong vật chủ Bacillus

subtilis WB800N Sau khi tối ưu điều kiện cảm ứng (1 mM IPTG ở 37°C, pH 7,5,

mật độ tế bào OD600 = 0,6), hoạt độ enzyme ngoại bào cao nhất thu được là 848,52 IU/mL sau 4 giờ lên men Môi trường cảm ứng để sản xuất enzyme tái tổ hợp cũng đã được tối ưu, nattokinae sau đó được kết tủa bằng muối và siêu lọc để tinh sạch enzyme Hệ số tinh sạch của dịch enzyme từ môi trường nuôi cấy là 6,63 với tỷ lệ thu hồi là 80%, hoạt độ riêng của enzyme sau khi tinh sạch là 11507,92 IU/mg [105] Nhóm tác giả cũng đã thành công trong việc tối ưu quá trình lên men để sản xuất nattokinase từ chủng taistoor hợp PSP2 Môi trường lên men bao gồm 1,0% trypsin, 1,0% dịch protein thủy phân hàu, 2,0% maltose, và 0,5% NaCl (pH 7,0) Hoạt độ nattokinase thu được cao nhất là 390,23 FU/mL sau 72 giờ lên men [106]

Ngan và cs (2022) đã tinh sạch nattokinase tái tổ hợp từ B subtilis R0H1 bằng

cách lọc qua màng lọc 2 lần Enzyme được thu hồi hơn 80% và hoạt độ tăng lên 3,2 lần so với khi chưa tinh sạch Nattokinase có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa và thể hiện hoạt tính thủy phân fibrin trên hình ảnh điện di zymogram pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme là 8,5 và 55°C Enzyme được cải thiện hoạt độ nhờ các ion Mg2+ và Ca2+ đồng thời bị ức chế bởi Co2+, Zn2+, Fe2+ và SDS Sử dụng fibrin là cơ chất, giá trị Km và Vmax của enzyme đạt 3,08 mM và 6,7 nmol/min Tác giả nhận thấy có thể sử dụng hệ thống màng lọc để tinh sạch nattokinase ở quy mô pilot [84]

1.3.2 Các enzyme khác

Khoảng 60% enzyme thương mại được sản xuất từ các loài thuộc chi Bacillus do khả năng tiết enzyme ngoại bào rất mạnh Bên cạnh đó, tiềm năng sử dụng B

subtilis sản xuất các protein có dược tính cũng được nghiên cứu nhiều trong những

năm qua [33, 61] Lin và cs (2016) đã tạo dòng gen mã hóa γ-polyglutamic acid

synthetase (pgsBCA) từ chủng B subtilis 168 và biểu hiện trong chủng B subtilis WB600 Gen pgsBCA được gắn vào vector biểu hiện pWB980 với sự điều khiển của promoter P43 Kết quả phân tích hoạt tính cho thấy chủng B subtilis tái tổ hợp

có khả năng tổng hợp polyglutamic acid (PGA) ở mức 1,74 g/L Sản phẩm γ-PGA từ dịch lên men được thu nhận, tinh sạch và khảo sát các tính chất Biểu hiện

gen γ-PGA synthetase trong hệ thống B subtilis cho thấy tiềm năng ứng dụng cao

trong lĩnh vực công nghiệp [65]

Zhang và cs (2017) đã biểu hiện gen mã hóa β-cyclodextrin

glycosyltransferase trong B subtilis CCTCC M 2016536, trong đó 9 plasmid mang

promoter đơn đã được sàng lọc để tìm ra promoter tối ưu Kết quả cho thấy plasmid mang promoter PamyQ cho lượng enzyme ngoại bào thu được cao nhất (24,1 U/mL) Đối với promoter kép, PHpaII-PamyQ cho lượng enzyme thu được cao hơn 3,7 lần (90,7 U/mL) [129]

Gen mã hóa lignin peroxidase từ chủng vi khuẩn Rhodococcus jostii RHA1 và laccase từ chủng vi khuẩn Bacillus megaterium O1 được tạo dòng vào plasmid pMA0911 và biểu hiện vào chủng B subtilis WB800 Lignin peroxidase và laccase tái tổ hợp từ chủng B subtilis WB800 có pH tối ưu là 4 và 4,5; nhiệt độ hoạt động

tối ưu cho 2 enzyme lần lượt 35oC và 60oC Chủng B subtilis tái tổ hợp được sử

dụng xử lý tẩy trắng giấy, kết quả cho thấy hỗn hợp enzyme tăng độ sáng của giấy làm bột gỗ thông và bột gỗ thải loại lên 66,45% và 64,67% [88]

Các chủng B subtilis WB600 và WB800 được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa pullulanase từ B naganoensis Gen mã hóa các trình tự tăng cường DegQ, DegU và DegS được gắn với plasmid pMA0911-PsacB-pul mang promoter PsacB,

tín hiệu peptide LipA và gen mã hóa pullulanase Ở điều kiện tối ưu, chủng B

subtilis WB800 tiết pullulanase đạt giá trị 26,5 U/mL, cao hơn 5,9 lần so với chủng B subtilis WB800 tái tổ hợp không có trình tự tăng cường DegQ Mức độ biểu hiện

enzyme tái tổ hợp trên chủng B subtilis WB600 sử dụng hệ biểu hiện tối ưu cho kết

quả tăng 1,8 lần so với hệ thống biểu hiện không có trình tự tăng cường DegQ

Kiểm tra điện di SDS-PAGE protein tái tổ hợp trên 2 chủng B subtilis cho thấy

băng protein có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa [26]

Wang và cs (2018) đã tạo dòng gen saccharose phosphorylase từ chủng vi

khuẩn Bifidobacterium adolescentis và biểu hiện tái tổ hợp trong B subtilis Gen

được gắn với vector pBSMuL3-SPase mà không sử dụng tín hiệu peptide Kết quả cho thấy enzyme tái tổ hợp được tiết ra ngoài môi trường Ở quy mô sản xuất hệ lên men 3 L, enzyme đạt giá trị hoạt độ 5,3 U/mL với khối lượng 7,5 g/L Phân tích SDS-PAGE cho thấy enzyme tái tổ có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme là pH 7 và nhiệt độ 50oC [116]

Ma và cs (2018) nhận thấy mức độ sản xuất lipase tái tổ hợp từ B subtilis 168

có nhiều hạn chế vì những khó khăn hệ thống biểu hiện và tiết Từ chủng vi khuẩn

tự nhiên B subtilis 168 với hoạt tính lipase ngoại bào rất thấp, nhóm tác giả đã sử

dụng các công cụ sinh học phân tử để tăng mức độ biểu hiện Nhóm sử dụng promoter điều khiển mới là P43 và PAE Kết quả cho thấy hoạt tính lipase ngoại bào tăng hơn 100 lần so với đối chứng trong đó, chủng tái tổ hợp mang gen được điều khiển bằng promoter PAE cho hiệu suất cao hơn 1,6 lần so với promoter P43 Phức hệ promoter-gen sau khi được gắn với vector pHP13 cho hiệu quả tiết tăng hơn 10 lần Tăng cường biểu hiện các yếu tố cấu thành hệ thống tiết như secDF và prsA cũng góp phần tăng mức độ sản xuất enzyme tái tổ hợp lên đến 49% [70]

Từ các kết quả đã công bố cho thấy, B subtilis là vật chủ phù hợp để sản xuất

nattokinase cũng như các enzyme tái tổ hợp khác, nhiều enzyme đã được sản xuất tái tổ hợp thành công

1.4 TINH SẠCH ENZYME BẰNG HỆ 2 PHA NƯỚC

Hệ hai pha nước (aqueous two-phase system-ATPS) thường được biết đến như một kỹ thuật tạo ra các sản phẩm có độ tinh sạch cao, dễ thực hiện và giá thành thấp Kỹ thuật này được dùng để tinh chế các phân tử sinh học như protein, nucleic acid, enzyme, virus, Hiện nay, chiết xuất hai pha nước (aqueous two-phase extraction-ATPE) được xem là chuyển chất tan từ pha nước này sang pha nước khác Trong ATPE, để thu hồi các phân tử sinh học, các hệ thống polymer-polymer

và polymer-muối thường được sử dụng Những vấn đề liên quan đến thu hồi các phân tử sinh học bằng ATPS đã được nghiên cứu, bao gồm cơ chế kiểm soát sự hình thành pha, các điều kiện phân chia chất tan trong các quá trình ATPS và các yếu tố ảnh hưởng đến ATPS như nồng độ và khối lượng phân tử của polymer, loại muối, pH và nhiệt độ phân tách pha [100]

1.4.1 Cấu tạo và đặc tính của hệ hai pha nước

Hệ hai pha nước (ATPS) được tạo thành nhờ sự kết hợp giữa hai polymer hoặc giữa polymer với một muối vô cơ

Hệ hai pha nước polymer-polymer được tạo thành do sự kết hợp giữa polyethylene glycol (PEG), dẫn xuất carboxylate của PEG, polyethylene glycol ester, polyethyleneimine, trimethylamino-polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone…với một polymer khác như dextran, methycellulose, dextran-sulphate… Hoặc do sự kết hợp giữa một polymer và một muối vô cơ là các hợp chất có chứa các cation: sodium, potassium, magnesium, amonium, và các anion: sulphate, carbonate, citrate, chloride, phosphate Khi kết hợp các thành phần trên hệ sẽ tạo thành hai pha riêng biệt [2]

Hình 1.6 Sơ đồ phân tách quá trình chuyển hóa sinh học bằng hệ hai pha [4] P: sản phẩm

của chuyển hóa, E: enzyme, S: cơ chất, T: pha trên, D: pha dưới

Hệ hai pha nước polymer/polymer hoặc polymer/muối đã và đang được sử dụng rộng rãi trong phân tách và tinh sạch những đại phân tử sinh học mang lại hiệu quả cao Sự phân tách được thực hiện bằng việc thay đổi vị trí hợp chất đích trong hệ và thể tích giữa hai pha Nhờ thể tích nước cao trong cả hai pha và sức căng bề mặt chung giữa hai pha thấp, những hệ này cung cấp những điều kiện ôn hòa đặc biệt thích hợp cho sự phân tách những đại phân tử sinh học [2]