NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP CHỊU HẠN BẰNG CÔNG NGHỆ KÍCH TẠO ĐƠN BỘI PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAI

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP CHỊU HẠN BẰNG CÔNG NGHỆ KÍCH TẠO ĐƠN BỘI PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAINGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP CHỊU HẠN BẰNG CÔNG NGHỆ KÍCH TẠO ĐƠN BỘI PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAINGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP CHỊU HẠN BẰNG CÔNG NGHỆ KÍCH TẠO ĐƠN BỘI PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAI

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN ĐỨC THÀNH

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP CHỊU HẠN BẰNG CÔNG NGHỆ KÍCH TẠO ĐƠN BỘI

PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2023

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN ĐỨC THÀNH

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ ĐƠN BỘI KÉP CHỊU HẠN BẰNG CÔNG NGHỆ KÍCH TẠO ĐƠN BỘI

PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ LAI

Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng

Mã số: 9620111

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Đặng Ngọc Hạ

2 PGS TS Nguyễn Thế Hùng

HÀ NỘI - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ dẫn của các thầy hướng dẫn và sự giúp đỡ của đồng nghiệp Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là hoàn toàn trung thực, các thông tin trích dẫn đều được ghi rõ nguồn gốc

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu đã công bố trong luận án

Tác giả

Nguyễn Đức Thành

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ngô, cán bộ Bộ môn Nông học, Bộ môn Chọn tạo giống ngô, Bộ môn Công nghệ sinh học đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho Tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Đặc biệt, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy hướng dẫn khoa học

TS Đặng Ngọc Hạ - Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Ngô PGS.TS Nguyễn Thế Hùng - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Hai Thầy đã giành thời gian, tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin cảm ơn Ban quản lý Dự án cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ kích tạo đơn bội trong chọn tạo giống ngô lai”, Ban quản lý Đề tài cấp bộ “Nghiên cứu chọn tạo giống ngô lai ngắn ngày, chịu hạn năng suất cao phục vụ chuyển đổi cây trồng cho vùng Trung du miền núi phía Bắc”, tập thể cán bộ Công ty cổ phần Giống cây trồng Nha Hố, Trung tâm Sản xuất giống cây trồng Nha Hố đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình và những người thân đã động viên giúp đỡ cả về vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Đức Thành

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng vi

Danh mục hình x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 4

1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam 4

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam 5

1.2 Những nghiên cứu tạo dòng ngô đơn bội kép bằng cây kích tạo đơn bội 7

1.2.1 Cơ sở di truyền của cây kích tạo đơn bội 7

1.2.2 Quá trình hình thành và phát triển của cây kích tạo đơn bội 8

1.2.3 Cơ chế tạo đơn bội 10

1.2.4 Nghiên cứu duy trì, phát triển và cải tiến cây kích tạo đơn bội 11

1.2.5 Nghiên cứu về các bước tạo dòng ngô đơn bội kép bằng công nghệ kích tạo đơn bội 13

1.2.6 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ kích tạo đơn bội tại Việt Nam 24

1.2.7 Đánh giá tiềm năng của các dòng ngô đơn bội kép được tạo ra bằng công nghệ kích tạo đơn bội 26

1.3 Khái niệm và cơ sở khoa học về khả năng chịu hạn ở ngô 27

1.3.1 Khái niệm và phân loại hạn 27

1.3.2 Cơ chế chống chịu hạn của cây trồng 29

1.3.3 Ảnh hưởng của hạn đến sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 30 1.3.4 Một số tính trạng sử dụng trong nghiên cứu khả năng chịu hạn

ở Ngô 33

1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền, dự đoán ưu thế lai dựa vào các chỉ thị phân tử SSR 37

1.5 Đánh giá khả năng kết hợp bằng phương pháp lai đỉnh và luân giao 38

1.5.1 Khả năng kết hợp 38

1.5.2 Đánh giá khả năng kết hợp bằng phương pháp lai đỉnh 39

1.5.3 Đánh giá khả năng kết hợp bằng phương pháp luân giao 40

1.5.4 Đánh giá tương tác kiểu gen với môi trường, tính ổn định giống và khả năng kết hợp bằng GGE Biplot 40

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Vật liệu nghiên cứu 43

2.2 Nội dung nghiên cứu 44

2.3 Phương pháp nghiên cứu 44

2.3.1 Phương pháp tạo dòng ngô đơn bội kép bằng cây kích tạo đơn bội 44

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học, khả năng chịu hạn của các dòng ngô đơn bội kép 46

2.3.3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và khả năng kết hợp của các dòng ngô đơn bội kép 50

2.3.4 Tạo, đánh giá các tổ hợp lai từ các dòng ngô đơn bội kép triển vọng 51

2.4 Quy trình chăm sóc và quản lý thí nghiệm đồng ruộng 51

2.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu thí nghiệm 52

2.5.1 Thu thập số liệu 52

2.5.2 Xử lý số liệu thí nghiệm 53

2.6 Sơ đồ nghiên cứu thực hiện đề tài luận án… ………54

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

3.1 Kết quả tạo dòng ngô đơn bội kép bằng công nghệ kích tạo đơn bội 54 3.1.1 Kết quả tạo hạt đơn bội và xử lý lưỡng bội hóa NST 54

3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn vật liệu, khung thời vụ đến tỷ lệ tạo hạt đơn bội 55

3.2 Đặc điểm nông sinh học và khả năng chịu hạn và của các dòng ngô đơn bội kép 59

3.2.1 Khả năng chịu hạn của các dòng ngô đơn bội kép 59

3.2.2 Đặc điểm nông sinh học và khả năng chống chịu của các dòng ngô đơn bội kép 81

3.3 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và khả năng kết hợp của các dòng ngô đơn bội kép vụ Xuân năm 2017 tại Viện Nghiên cứu Ngô 94

3.3.1 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và phân nhóm ưu thế lai cho các dòng ngô đơn bội kép bằng chỉ thị phân tử SSR 94

3.3.2 Khả năng kết hợp về năng suất của các dòng ngô đơn bội kép 103

3.4 Tạo các tổ hợp lai từ các dòng ngô đơn bội kép triển vọng, khảo nghiệm tác giả 130

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 134

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 136

TÀI LIỆU THAM KHẢO 137

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình

chiều dài đoạn nhân bản ASI Chênh lệch thời gian tung phấn và phun râu

Bộ NN & PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

CIMMYT Centro Internacional de Mejoramiento de Maiz y Trigo -

Trung tâm cải lương giống ngô và lúa mì quốc tế CV(%)

HMP Midparent heterosis - Ưu thế lai trung bình

HBP Heterobeltiosis- Ưu thế lai thực

Viết tắt Viết đầy đủ

NSTB Năng suất trung bình

IRRISTAT International Rice Research Institute statistical research

tool - Phần mềm quản lý nghiên cứu thống kê QTLs Quantitative trait locus Locus - tính trạng số lượng RNV Dạng hạt răng ngựa màu vàng

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình

chiều dài đoạn cắt giới hạn RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA - Đa hình các

đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên

TAIL Tropical adapted kích tạo đơn bội line - Dòng kích tạo

đơn bội thích ứng vùng nhiệt đới

TĐ Trong điều kiện tưới đủ

TGST Thời gian sinh trưởng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các phản ứng của cây trồng trong điều kiện hạn 30

Bảng 1.2 Tác động của thời tiết bất thuận tới 8 vùng ở Việt Nam 32

Bảng 1.3 Các vùng sinh thái thường xảy ra hạn ở Việt Nam 33

Bảng 2.1 Nguồn gốc, đặc điểm vật liệu làm mẹ để tạo hạt đơn bội 43

Bảng 2.2 Thời điểm tưới nước cho thí nghiệm tưới đủ và gây hạn 47

Bảng 2.3 Quy trình chăm sóc và quản lý thí nghiệm 52

Bảng 3.1 Kết quả tạo dòng ngô đơn bội kép trong vụ Thu Đông và Đông năm 2017 tại Đan Phượng - Hà Nội 54

Bảng 3.2 Tổng bình phương (SS) và bình phương trung bình (MS) tỷ lệ hạt đơn bội trong vụ Hè Thu và Thu Đông năm 2016 tại khu ruộng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Ngô 55

Bảng 3.3 Giá trị trung bình tỷ lệ hạt đơn bội thu được từ các nguồn vật liệu trong 2 vụ Hè Thu và Thu Đông năm 2016 tại khu ruộng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Ngô 57

Bảng 3.4 Tỷ lệ cây bị héo và cây phục hồi của các dòng ngô đơn bội kép vụ Hè Thu năm 2017 tại khu nhà lưới Viện Nghiên cứu Ngô 59

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hạn đến chỉ tiêu chiều dài thân lá, chiều dài rễ của các dòng ngô đơn bội kép vụ Hè Thu năm 2017 tại khu nhà lưới Viện Nghiên cứu Ngô 61

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hạn đến chỉ tiêu khối lượng thân khô và rễ khô (gram) của các dòng trong điều kiện tưới đủ và gây hạn trong nhà lưới vụ Hè Thu 2017 64

Bảng 3.7 Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô đơn bội kép trong điều kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân 2017 - 2018 67 Bảng 3.8 Đặc điểm hình thái của các dòng ngô đơn bội kép trong điều kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân 2017 - 2018 68 Bảng 3.9 Độ già hóa lá, độ cuốn lá của các dòng ngô đơn bội kép trong điều

kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân 2017 - 2018 71

Bảng 3.10 Các yếu tố cấu thành năng suất của 24 dòng ngô đơn bội kép

trong điều kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân

2017 - 2018 75 Bảng 3.11 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng ngô đơn bội kép

trong điều kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân

2017 - 2018 77 Bảng 3.12 Năng suất và chỉ số chịu hạn của các dòng ngô đơn bội kép trong

điều kiện tưới đủ và gây hạn tại Ninh Thuận vụ ĐX 2017 - 2018 79 Bảng 3.13 Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô vụ Đông năm 2017 và

Xuân năm 2018 tại Đan Phượng - Hà Nội 82 Bảng 3.14 Đặc điểm hình thái của 24 dòng ngô đơn bội kép Vụ Đông năm

2017 và Xuân năm 2018 tại Đan Phượng - Hà Nội 83 Bảng 3.15 Mức độ nhiễm sâu bệnh hại của 24 dòng ngô đơn bội kép trong

vụ Đông năm 2017 và Xuân 2018 tại Đan Phượng - Hà Nội 85 Bảng 3.16 Mức độ nhiễm sâu bệnh hại của 24 dòng ngô đơn bội kép trong

vụ Đông 2017 và Xuân 2018 tại Đan Phượng - Hà Nội 87 Bảng 3.17 Khả năng chống đổ rễ, trạng thái bắp, độ che kín bắp của 24 dòng

ngô đơn bội kép trong vụ Đông năm 2017 và Xuân 2018 88 Bảng 3.18 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của 24 dòng ngô

đơn bội kép trong vụ Đông năm 2017 tại Viện Nghiên cứu Ngô 90 Bảng 3.19 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của 24 dòng ngô

đơn bội kép trong vụ Xuân 2018 tại Viện Nghiên cứu Ngô 92 Bảng 3.20 Số allen, hệ số PIC và tỷ lệ khuyết số liệu của 23 mồi SSR 94 Bảng 3.21 Tỷ lệ khuyết số liệu (%M) và tỷ lệ dị hợp tử (%H) 24 dòng ngô

ngô đơn bội kép 98 Bảng 3.22 Ma trận hệ số tương đồng (Jacard) của 24 dòng ngô DH nghiên

cứu dựa trên 23 chỉ thị SSR 102 Bảng 3.23 Bảng phân tích phương sai gộp và riêng cho 4 điểm Hòa Bình,

Đồng Nai, Thái Nguyên và Hà Nội vụ Xuân 2018 1045

Bảng 3.24 Năng suất trung bình, giá trị khả năng kết hợp chung (KNKHC)

của 24 dòng ngô đơn bội kép với 2 cây thử tại 4 điểm vụ Xuân năm 2018 1056 Bảng 3.25 Năng suất trung bình (tạ/ha), giá trị khả năng kết hợp chung

(KNKHC) và giá trị khả năng kết hợp riêng (KNKHR) của 24 dòng ngô đơn bội kép với 2 cây thử tại 4 địa điểm vụ Xuân năm 2018 108 Bảng 3.26 Bảng phân tích phương sai tổng hợp và 2 điều kiện tưới đủ, gây

hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân năm 2017-2018 1101 Bảng 3.27 Năng suất trung bình, khả năng kết hợp chung (KNKHC) của 24

dòng ngô đơn bội kép về tính trạng năng suất trong điều kiện tưới

đủ và gây hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân năm 2017 - 2018 1112 Bảng 3.28 Khả năng kết hợp riêng của 24 dòng ngô đơn bội kép với 2 cây

thử trong 2 điều kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ ĐX năm 2017-2018 1145 Bảng 3.29 Năng suất hạt trung bình của 9 dòng ngô đơn bội kép trong điều

kiện tưới đủ (CT1) và gây hạn (CT2) tại Ninh Thuận vụ ĐX

2018 - 2019 116 Bảng 3.30 Năng suất trung bình của 36 tổ hợp luân giao giữa 9 dòng trong

điều kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ ĐX.2018-2019 117 Bảng 3.31 Khả năng kết hợp chung và riêng của 9 dòng ngô đơn bội kép trong

2 điều kiện tưới đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ ĐX.2018-2019 119 Bảng 3.32 Đánh giá ưu thế lai trung bình (HMP) và ưu thế lai thực HBP về

năng suất của 36 tổ hợp luân giao trong điều kiện tưới đủ và hạn

vụ Đông Xuân năm 2018 - 2019 tại Ninh Thuận 124 Bảng 3.33 Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học và khả năng chống

chịu của tổ hợp ngô lai TH32 vụ Xuân Hè và Thu Đông 2019 tại Phú Thọ 131

Bảng 3.34 Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học và khả năng chống

chịu của tổ hợp ngô lai TH2 vụ Xuân Hè và Thu Đông 2019 tại Phú Thọ 132 Bảng 3.35 Năng suất của 2 tổ hợp ngô lai TH2 và TH32 tại các điểm khảo

nghiệm vụ Hè Thu và Thu Đông 2019 133

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô thế giới giai đoạn 2014 - 2021 5 Hình 1.2 Diện tích năng suất sản lượng ngô Việt Nam giai đoạn 1990 - 2021 6 Hình 1.3 Hình ảnh bắp cây kích tạo đơn bội (kích tạo đơn bội) và phân loại

hạt đơn bội 14 Hình 1.4 Các bước xử lý lưỡng bội hóa bằng colchicine của CIMMYT 19 Hình 1.5 Các bước tạo dòng ngô đơn bội kép tại Viện Nghiên cứu Ngô 25 Hình 3.1 Tương quan khả năng kết hợp riêng với tỷ lệ hạt đơn bội của 10

nguồn vật liệu với 3 nguồn kích tạo đơn bội trong vụ Thu Đông

và Vụ Đông năm 2016 58 Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện sự suy giảm chiều dài thân lá, chiều dài rễ của 24

dòng ngô đơn bội kép trong điều kiện gây hạn vụ Hè Thu 2017 tại khu nhà lưới Viện Nghiên cứu Ngô 63 Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện sự suy giảm khối lượng thân khô, rễ khô của 24

dòng ngô đơn bội kép trong điều kiện gây hạn vụ Hè Thu 2017 tại khu nhà lưới Viện Nghiên cứu Ngô 65 Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện sự suy giảm chiều cao cây, cao đóng bắp của 24

dòng ngô đơn bội kép trong điều kiện gây hạn tại Ninh Thuận vụ

ĐX 2017-2018 70 Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện sự suy giảm chiều dài bắp (DB), đường kính bắp

(ĐKB) và số hàng hạt (SHH) của các dòng ngô đơn bội kép trong điều kiện hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân 2017 - 2018 74 Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự suy giảm hạt/hàng (H/H) và P.1000 hạt của

các dòng ngô đơn bội kép trong điều kiện gây hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân 2017-2018 76 Hình 3.7 Mối tương quan giữa năng suất hạt của 24 dòng ngô đơn bội kép trong

điều kiện tưới đủ và gây hạn nhân tạo với chỉ số chịu hạn DI 80

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR mồi phi101049 của 24 dòng ngô

trên gel polyacrylamide 4,5% 95 Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR mồi nc133 của 24 dòng ngô trên

gel polyacrylamide 4,5% 96 Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR mồi umc1862 của 24 dòng ngô

trên gel polyacrylamide 4,5% 97 Hình 3.11 Sơ đồ phân nhóm đa dạng di truyền của 24 dòng ngô đơn bội kép

dựa trên 23 mồi SSR theo phương pháp phân nhóm UPGMA 101 Hình 3.12 Giá trị khả năng kết hợp chung của các dòng tại 4 điểm Hòa

Bình, Đồng Nai, Thái Nguyên và Hà Nội, vụ Xuân 2018 106 Hình 3.13 Giá trị khả năng kết hợp chung gộp tại 4 điểm Hòa Bình, Đồng

Nai, Thái Nguyên và Hà Nội vụ, Xuân 2018 106 Hình 3.14 Giá trị khả năng kết hợp riêng của 24 dòng đơn bội kép tại Hòa

Bình, Đồng Nai, Thái Nguyên và Hà Nội vụ Xuân 2018 108 Hình 3.15 Tổng hợp giá trị khả năng kết hợp riêng của 24 dòng tại Hòa

Bình, Đồng Nai, Thái Nguyên và Hà Nội vụ Xuân 2018 108 Hình 3.16 Khả năng kết hợp chung của 24 dòng trong điều kiện tưới đủ và

hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân năm 2017 - 2018 111 Hình 3.17 Biểu đồ sắp xếp thứ tự KNKHC của 24 dòng đơn bội kép trong

điều kiện tưới đủ (site 1) và hạn (site 2) tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân năm 2017 - 2018 112 Hình 3.18 Khả năng kết hợp riêng (KNKHR) của 24 dòng trong điều tưới

đủ và hạn tại Ninh Thuận vụ Đông Xuân năm 2017 - 2018 113 Hình 3.19 Khả năng kết hợp chung của 9 dòng đơn bội kép trong điều kiện

hạn và tưới đủ tại Ninh Thuận 120 Hình 3.20 Tương quan khả năng kết hợp chung (KNKHC) và năng suất

hạt (tạ/ha) của 9 dòng ngô đơn bội kép trong thí nghiệm luân giao trong 2 điều kiện tưới đủ và gây hạn vụ ĐX.2018-2019 tại Ninh Thuận 121

Hình 3.21 Tương quan năng suất hạt (tạ/ha) và khả năng kết hợp riêng

(KNKHR) của 36 THL ở thí nghiệm luân giao trong 2 điều kiện gây hạn và tưới đủ vụ ĐX.2018-2019 tại Ninh Thuận 122 Hình 3.22 Tương quan giữa năng suất hạt và ưu thế lai trung bình của 9

dòng đơn bội kép trong điều kiện gây hạn và tưới đủ vụ ĐX.2018-2019 126 Hình 3.23 Tương quan giữa năng suất hạt và ưu thế lai thực của 9 dòng

đơn bội kép trong điều kiện hạn và tưới đủ vụ ĐX.2018-2019 126 Hình 3.24 Tương quan KNKHR và ưu thế lai trung bình 9 dòng ngô đơn

bội kép trong điều kiện tưới đủ và hạn vụ ĐX.2018-2019 127 Hình 3.25 Tương quan KNKHR và ưu thế lai thực 9 dòng ngô đơn bội kép

trong điều kiện tưới đủ và hạn vụ ĐX.2018-2019 128 Hình 3.26 Tương tác kiểu gen với môi trường (GGEbiplot), xếp hạng kiểu

gen tốt nhất trong 2 điều kiện tưới đủ và gây hạn, vụ ĐX.2018 -

2019 tại Ninh Thuận 129

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngô (Zea mays L.), là cây trồng có sản lượng hạt đạt cao nhất thế giới

đồng thời đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực, làm nguyên liệu cho chăn nuôi, chế biến, nhiên liệu sinh học trước những thách thức về sự gia tăng dân số thế giới Trong thế kỷ qua, năng suất ngô trên một đơn vị diện tích tăng hơn 7 lần nhờ những nỗ lực kết hợp giữa chọn tạo giống và cải tiến quy trình kỹ thuật canh tác Sản xuất ngô ở Việt Nam từ cuối những năm của thế kỷ 20 cũng không ngừng tăng liên tục về diện tích, năng suất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tích ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã tăng trên 1 triệu ha; năm 2018, diện tích ngô cả nước 900,673 nghìn ha, năng suất 49,37 tạ/ha, sản lượng gần 4,45 triệu tấn Tuy vậy, sản xuất ngô ở nước ta phát triển chưa tương xứng với tiềm năng, sản lượng chưa đủ cho nhu cầu tiêu thụ ngô trong nước Năm 2022, Việt Nam nhập khẩu ngô với số lượng là 9,57 triệu tấn, giá trị tương ứng 3,33 tỷ USD, giảm 4,5% về lượng, nhưng tăng 15,6% kim ngạch và tăng 21% về giá so với năm 2021

Cũng như nhiều nước trên thế giới, ở Việt Nam, hạn hán trong những năm qua đang là thách thức lớn, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất ngô, đặc biệt là ở những vùng trồng ngô chỉ nhờ nước trời, đất đồi dốc, hoàn toàn không có khả năng tưới Do vậy, chương trình ngô toàn cầu, các quốc gia trong đó có Việt Nam đã và đang nỗ lực trong nghiên cứu chọn tạo giống ngô

có năng suất cao, chịu hạn tốt thích ứng với biến đổi khí hậu ngày một gia tăng

Sự thành công trong công tác chọn tạo giống ngô lai phụ thuộc nhiều vào việc nghiên cứu chọn tạo các dòng thuần bố mẹ ưu tú Phương pháp chọn tạo dòng truyền thống cần 6 - 8 vụ để tạo ra dòng thuần, trong quá trình tự phối và tái hợp đã gây ra sự phân ly các tính trạng mà các nhà chọn tạo giống khó có thể kiểm soát, các tính trạng thường chịu ảnh hưởng của hiệu ứng liên kết chéo Những thập niên cuối thế kỷ 20, công nghệ tạo dòng ngô đơn bội kép đã được

nghiên cứu, ứng dụng thành công ở trung tâm cải tạo Ngô và lúa mỳ quốc tế - CIMMYT và một số quốc gia phát triển Trong số đó có thể kể đến công nghệ tạo dòng ngô đơn bội kép bằng công nghệ kích tạo đơn bội Công nghệ này có thể hạn chế được những nhược điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống,

có những ưu điểm như: 1) Thời gian tạo ra dòng thuần nhanh (chỉ mất 2 vụ), tiết kiệm được 2/3 thời gian tạo dòng so với phương pháp truyền thống, rút ngắn thời gian để tạo ra một giống ngô lai thương mại; 2) Các dòng được tạo ra là dòng DH,

có độ đồng hợp tử 100%; 3) Từ một nguồn vật liệu ban đầu có thể tạo ra nhiều dòng khác nhau; 4) Quy trình thực hiện đơn giản

Với những điều kiện về nguồn nhân lực và cơ sở vật chất, Việt Nam hoàn toàn có thể tiếp tiếp thu và ứng dụng công nghệ này trong các chương trình chọn

tạo giống ngô lai Từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu

tạo dòng ngô đơn bội kép chịu hạn bằng công nghệ kích tạo đơn bội phục

vụ chọn tạo giống ngô lai”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Chọn tạo được các dòng và tổ hợp lai ngô đơn bội kép chịu hạn bằng công nghệ kích tạo đơn bội

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Cung cấp thêm số liệu, kết quả nghiên cứu thực nghiệm về việc tạo dòng ngô đơn bội kép chịu hạn bằng phương pháp sử dụng cây kích tạo đơn bội

- Bổ sung thêm dữ liệu khoa học cho các nhà nghiên cứu chọn tạo giống nhằm khai thác hiệu quả phương pháp tạo dòng bằng cây kích tạo đơn bội

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Đã tạo ra được 24 dòng đơn bội kép từ 10 nguồn vật liệu ưu tú khác nhau và 3 cây kích tạo đơn bội

- Đã đánh giá đa dạng di truyền, phân nhóm ưu thế lai cho 24 dòng ngô đơn bội kép; Xác định được 9 dòng có khả năng chịu hạn tốt: D4, D6, D7, D8, D10, D14, D20, D22 và D23

- Đã chọn được hai tổ hợp ngô lai triển vọng D4xD7 và D14 x D22 có nhiều tính trạng nông học tốt, khả năng chịu hạn, năng suất cao, tiềm năng phát triển thành giống ngô lai chịu hạn, phục vụ cho nhu cầu của sản xuất

3.3 Những đóng góp mới của đề tài luận án

- Chọn tạo được 9 dòng ngô đơn bội kép chịu hạn, sinh trưởng phát triển

và khả năng kết hợp tốt;

- Từ 9 dòng triển vọng đã tạo được 2 tổ hợp ngô lai mới có khả năng chịu hạn, năng suất trung bình của tổ hợp lai TH32 từ 76,7 – 84,4 tạ/ha cao hơn giống đối chứng DK9901 từ 8,68 đến 14,22%, TH2 năng suất trung bình từ 74,6 tạ/ha đến 81,5 tạ/ha cao hơn giống đối chứng DK9901 từ 6,1 đến 11,17%

có tiềm năng phát triển, phục vụ sản xuất

4 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Các giống ngô lai thương mại NK67, NK4300, NK7328, DK8868, DK9901, CP333, 30Y87, VN8960, LCH9 sinh trưởng phát triển tốt, thích ứng rộng, có khả năng chịu hạn ngoài sản xuất được sử dụng làm vật liệu tạo dòng đơn bội kép Ba cây kích tạo đơn bội TAILP1, TAILP2 và TAILP1xTAILP2 được sử dụng làm cây kích tạo đơn bội để tạo hạt đơn bội Dòng 21CM (mẹ giống ngô lai VN8960), CH1 (mẹ giống ngô lai LCH9) được sử dụng làm dòng đối chứng cho thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô đơn bội kép Dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN61 Giống ngô NK7328 và DK6919 được sử dụng làm đối chứng trong thí nghiệm khảo sát tổ hợp lai đỉnh và luân giao

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Trong khuôn khổ đề tài luận án, phạm vi nghiên cứu được tập trung vào các vấn đề: 1) Sử dụng 10 nguồn vật liệu có khả năng chịu hạn và 3 cây kích tạo đơn bội nhập từ CIMMYT để tạo dòng ngô đơn bội kép chịu hạn; 2) Đánh giá đặc điểm nông sinh học, khả năng chịu hạn của các dòng ngô đơn bội kép; 3) Đánh giá đa dạng di truyền, khả năng kết hợp của các dòng ngô đơn bội kép; 4) Tạo, đánh giá tổ hợp lai từ các dòng ngô đơn bội kép

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Ngô cùng với lúa mỳ và lúa nước là 3 cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới Năm 1961, diện tích ngô toàn thế giới đạt 105,5 triệu ha, năng suất 19,4 tạ/ha, sản lượng 205 triệu tấn Năm 2011, diện tích trồng ngô thế giới đạt khoảng 172,7 triệu ha, năng suất bình quân 51,4 tạ/ha, sản lượng 887,8 triệu tấn. Năm 2016, diện tích trồng ngô thế giới đạt khoảng 194,3 triệu ha (tăng 12,5% so với năm 2011), năng suất bình quân 57,8 tạ/ha (tăng 12,5% so với năm 2011), sản lượng 1.123,7 triệu tấn (tăng 26,6% so với năm 2011) Năm

2021 diện tích trồng ngô là 205,9 triệu ha (tăng 6% so với năm 2016), năng suất đạt 58,8 tạ/ha (tăng 1,7% so với năm 2016), sản lượng 1.210,4 triệu tấn (tăng 7,7% so với năm 2016) Như vậy, so sánh 5 năm gần đây với 5 năm trước (giai đoạn 2011 - 2016) diện tích, năng suất và sản lượng ngô thế giới tăng trưởng chậm lại [168] Trong đó, Mỹ, Trung Quốc, Brazin là những nước đứng đầu về diện tích và sản lượng

Dân số thế giới ngày một tăng, năm 2011 là 7.013,4 triệu người, năm

2016 là 7432,7 triệu người (tăng khoảng 6% so với năm 2011) và đến năm

2021, tăng 12,5% so với năm 2016, chạm ngưỡng 8 tỷ người Như vậy, sự gia tăng dân số thế giới giai đoạn 2016 - 2021 tăng hơn 2 lần so với giai đoạn

2011 - 2016 [167] Để đáp ứng an ninh lương thực, thực phẩm và làm nguyên liệu cho thức ăn chăn nuôi, nhu cầu về ngô tiếp tục gia tăng trong những năm tiếp theo

Trên thế giới, cây ngô có vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp của nhiều nước, góp phần đảm bảo an ninh lương thực cho người, thức ăn chăn nuôi và chế biến thực phẩm Trước những thách thức về biến đổi khí hậu toàn cầu, thiên tai gây ra, nhu cầu con người ngày một tăng việc nghiên cứu, ứng

dụng các phương pháp hiện đại trong chọn tạo giống như công nghệ gen, ứng dụng chỉ thị phân tử, công nghệ kích tạo đơn bội nhằm tạo ra dòng/giống mới

có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống với những yếu tố bất lợi sinh học, phi sinh học đang được nghiên cứu thực hiện trong những năm gần đây [77]

Hình 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô thế giới giai đoạn 2014 - 2021

Nguồn: (FAOSTAT, 2023)[168]

1.1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Tại Việt Nam ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa nước

và là cây màu quan trọng nhất Ngô không những cung cấp lương thực cho người, làm thức ăn cho chăn nuôi mà còn cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến nhiên liệu sinh học, làm bánh kẹo, đóng đồ hộp, làm dược phẩm Ngành sản xuất ngô của Việt Nam tăng trưởng liên tục trong 25 năm qua Thành công đó có phần đóng góp quan trọng của chương trình phát triển giống ngô lai Việt Nam và các công ty giống đa quốc gia đưa vào trồng trên phạm vi cả nước

Năm 1991, diện tích trồng giống lai chiếm chưa đến 1% của hơn 447 nghìn ha trồng ngô, năng suất đạt 15,0 tạ/ha và sản lượng đạt 672 nghìn tấn Đến năm 2011, diện tích trồng ngô đạt 1.121,3 nghìn ha, năng suất đạt 43,13 tạ/ha, với sản lượng 4.835,7 nghìn tấn Năm 2016, diện tích trồng ngô Việt Nam đạt 1.151,8 nghìn ha (tăng 2,7% so với năm 2011), năng suất đạt 45,53 tạ/ha (tăng 5,6% so với năm 2011), sản lượng đạt 5.244,1 nghìn tấn (tăng 8,4% so với năm 2011)

Hình 1.2 Diện tích năng suất sản lượng ngô Việt Nam giai đoạn 1990 - 2021

(Nguồn: FAOSTAT, 2023)[168]

So với năm 2016, năm 2021 diện tích trồng ngô Việt Nam là 900,7 nghìn

ha (giảm 21,8%), năng suất đạt 49,37 tạ/ha (tăng 7,8%), với sản lượng 4.446,4 nghìn tấn (giảm 15,2%) So với năm 1990 khi chưa trồng giống lai thì năm

2021 diện tích tăng 2,0 lần, năng suất tăng 3,3 lần và sản lượng tăng 6,6 lần Tuy nhiên năng suất ngô Việt Nam chỉ bằng 83% so với năng suất ngô trung bình của thế giới [168]

447.6

730.2

1140.2 1151.81032.6

900.7 672

2005.9

4573.1

5244.1

4874.1 4446.4

15

27.5

40.1

45.5 47.2 49.4

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Như vậy, nhu cầu về ngô vẫn tiếp tục tăng trong những thập niên tiếp theo, không những trên phạm vi toàn cầu nói chung mà còn ở Việt Nam nói riêng Trong khi đó, việc tăng diện tích sản xuất ngô là có giới hạn, chương trình ngô toàn cầu và các chương trình quốc gia đang nỗ lực tập trung vào tăng năng suất, sản lượng Việt Nam, không nằm ngoài xu hướng chung đó, một trong những định hướng trong chương trình phát triển ngô ở Việt Nam là phát triển những giống ngô lai có khả năng chịu hạn, năng suất cao, ổn định phục vụ cho nhu cầu của sản xuất [4], [8], [17] Để chọn tạo giống ngô lai chịu hạn, có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như: Công nghệ chuyển gen chịu hạn, ứng dụng công nghệ sinh học, công nghệ đơn bội [166] Trong phạm vi nghiên cứu của

đề tài luận án này, tác giả đã lựa chọn ứng dụng công nghệ kích tạo đơn bội để tạo dòng ngô đơn bội kép chịu hạn Các phần sau sẽ giới thiệu chi tiết về công nghệ và những ứng dụng trong chọn tạo và phát triển giống ngô lai

1.2 Những nghiên cứu tạo dòng ngô đơn bội kép bằng cây kích tạo đơn bội 1.2.1 Cơ sở di truyền của cây kích tạo đơn bội

Khả năng kích tạo đơn bội được kiểm soát bởi đa gen [86] Để tìm hiểu

cơ sở di truyền của việc tạo ra thể đơn bội, một số nghiên cứu về lập bản đồ QTL giữa cây kích tạo đơn bội và cây ngô thông thường đã được thực hiện, các nhà nghiên cứu đã xác định được 8 QTL khác biệt của cây kích tạo đơn bội so với cây ngô thông thường [118] Deimling và cộng sự năm 1997 đã tiến hành lập bản đồ di truyền đầu tiên cho cây kích tạo đơn bội [62] Kết quả lập bản đồ

di truyền đã xác định được 2 QTLs trên nhiễm sắc thể (NST) số 1 và số 2 giải thích 17,9% sự khác biệt của phương sai kiểu hình và 1 QTL chính nằm trên NST số 1 được cho là ảnh hưởng lớn đến việc tạo ra thể đơn bội [31]

Để làm rõ hơn về cơ sở di truyền, một chương trình lập bản đồ với số

lượng lớn các quần thể, kết quả đã xác định QTL qhir1 nằm trên nhiễm sắc thể

số 1 (bin 1.04) và qhir8 trên nhiễm sắc thể số 9 (bin 9.01) được cho là gây ra

kích tạo đơn bội với kết quả phân tích phương sai kiểu gen ở mức 66% và

20%[117] Nghiên cứu kết hợp trên toàn bộ hệ gen (GWAS) đã sử dụng 53 dòng ngô kích tạo đơn bội và 1.482 nguồn ngô không phải là kích tạo đơn bội,

kết quả đã chia qhir1 thành 2 vùng, vùng qhir11 và qhir12, đánh giá tỉ lệ đơn bội của các kiểu gen của 2 vùng kết quả cho thấy chỉ có vùng qhir11 mới có

liên quan đáng kể đến việc gây ra kích tạo đơn bội [78], [110]

Trong vùng qhir11, một gen mã hóa phospholipase A được ba nhóm nghiên

cứu độc lập xác định là nguyên nhân gây ra đơn bội và được đặt tên là MTL [84], NLD [75] và ZmPLA1 [91] Những nghiên cứu gần đây đã xác định, gen ZmDMP

mã hóa protein DUF679 nằm trong QTL qhir8 là nguyên nhân làm thay đổi trình

tự nucleotide để tạo đơn bội [164] Nghiên cứu của Yuan Li năm 2021 đã xác định alen mất chức năng (ZmPLD3) cũng là một trong những nguyên nhân gây ra đơn bội [89] Đến nay, cơ sở di truyền để kích hoạt, tạo ra thể đơn bội tiếp tục được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và làm rõ

1.2.2 Quá trình hình thành và phát triển của cây kích tạo đơn bội

Stadler và Randolph là những người đầu tiên mô tả, phát hiện ra tỷ lệ đơn bội trong quần thể ngô tự nhiên [109] Khoảng hai thập kỷ sau, Chase đã tìm ra hạt đơn bội ở tần suất thấp khoảng 1/1.000 ở các nguồn vật liệu ngô khác nhau ở Mỹ [58] Các nhà nghiên cứu chọn tạo giống đã nhận thấy tiềm năng lớn của tạo đơn bội trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ngô Do vậy,

có nhiều công trình nghiên cứu tiếp theo được thực hiện với mục tiêu tạo ra cây kích tạo đơn bội mới (kích tạo đơn bội)[74]

Trong phương pháp tạo dòng bằng cây kích tạo đơn bội, các nguồn vật liệu ưu tú được sử dụng làm mẹ, dòng bố là cây kích tạo đơn bội được lấy phấn

để lai sang nguồn mẹ, thể đơn bội được tạo ra sẽ thừa hưởng toàn bộ nền di truyền từ tế bào chất và di truyền từ nhân của nguồn mẹ [56] Do vậy, sự đa dạng về di truyền của các dòng ngô đơn bội kép được tạo ra phụ thuộc vào nguồn mẹ, nguồn vật liệu khởi đầu tạo ra nguồn mẹ, phương pháp này có tiềm năng di truyền trong tạo dòng ngô đơn bội kép phục vụ cho chương trình chọn

tạo giống ngô lai Nguồn kích tạo đơn bội đầu tiên được tạo ra với tên gọi là Stock6 có thể gây kích tạo đơn bội với tỷ lệ trung bình đạt từ 1 - 3 % [43]

Những nghiên cứu tiếp theo với mục tiêu cải thiện tính thích ứng của cây kích tạo đơn bội trong các điều kiện khí hậu và nâng cao tỷ lệ tạo đơn bội (HIR) dựa trên nguồn kích tạo ban đầu Stock6 đã được thực hiện [133] Trong suốt hai thập kỷ, cây kích tạo stock 6 đã được sử dụng để phát triển ra cây kích tạo đơn bội mới với đặc tính nông học tốt và cho tỷ lệ hạt đơn bội cao, như hai nguồn kích tạo UH400, RWS được Röber và cộng sự năm 2005 tạo ra [125], MHI được Chalyk năm 1999 chọn tạo [53] và PHI đã được Rotarenco và cộng

sự năm 2010 nghiên cứu chọn tạo [127] Các nguồn kích tạo đơn bội mới này đều thích ứng tốt với nhiều điều kiện môi trường ôn đới khác nhau, tỷ lệ từ HIR trong khoảng 6-15%, từ đó các nhà nghiên cứu đã đưa ra định hướng tạo dòng đơn bội kép (DH) với quy mô lớn phục vụ cho các chương trình chọn tạo giống ngô lai thương mại

Trước năm 2012, cây kích tạo đơn bội có tỷ lệ đơn bội cao chỉ thích ứng tốt trong điều kiện ôn đới và chưa thích ứng và phổ biến với điều kiện nhiệt đới CIMMYT và trường Đại học Hohenheim của Đức đã cùng nhau phát triển thành công cây kích tạo đơn bội thích ứng vùng nhiệt đới với tên gọi (Tropically Adapted Kích tạo đơn bội Lines - TAIL) Thế hệ dòng kích tạo đơn bội thích ứng vùng nhiệt đới đầu tiên có đặc tính nông học tốt, cây khỏe hơn so với dòng kích tạo ôn đới và cho tỷ lệ tạo hạt đơn bội từ 6-9% [48] Nhận thấy tiềm năng

có thể cải tạo và phát triển tính thích ứng, khả năng chống chịu và nâng cao HIR, CIMMYT đã phát triển TAIL thế hệ thứ hai có tỷ lệ HIR từ 9 đến 14% và

có đặc điểm nông học tốt hơn so với TAIL thế hệ thứ nhất [51] Cây kích tạo đơn bội mang gen chỉ thị Anthocyanin có tính trội khi lai với các nguồn vật liệu

sẽ biểu hiện màu ở thế hệ con lai, giúp phân biệt được thể đơn bội và thể lai ở các giai đoạn khác nhau như ở hạt khô, hạt mầm, cây trưởng thành [49]

1.2.3 Cơ chế tạo đơn bội

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế tạo thể đơn bội và những giải thích quá trình hình thành thể đơn bội Tuy nhiên, đến nay cơ chế tạo ra thể đơn bội vẫn chưa được làm sáng tỏ [49] Khi lai cây kích tạo đơn bội vào nguồn

mẹ (vật liệu) phấn của cây kích tạo đơn bội là yếu tố để tạo ra hạt đơn bội, nghiên cứu hàng ngàn hạt phấn của cây kích tạo đơn bội nhiều nghiên cứu đã xác định

là phấn hoa từ cây kích tạo Stock 6 đều bình thường với 3 nhân [129]

Trong nội nhũ của hạt đơn bội được xác định là tam bội mà không phải là

tứ bội, đã loại trừ khả năng có hai tế bào tinh trùng đơn bội hoặc một tế bào lưỡng bội duy nhất thụ tinh cho tế bào trung tâm [129] Nghiên cứu hạt phấn trong phòng thí nghiệm, các hạt phấn của cây kích tạo được kích thích nảy mầm trong ống nghiệm đã tạo ra hai ống phấn thay vì một với tần suất cao hơn so với các nguồn không phải kích tạo đơn bội [114] Nghiên cứu về thời gian nảy mầm của hạt phấn đã xác định hạt phấn của cây kích tạo đơn bội nảy mầm chậm hơn so với hạt phấn ngô thường [149] Các vi bào tử dị bội được tìm thấy trong tinh trùng hạt phấn kích tạo đơn bội và xuất hiện với tần suất cao có thể do phân chia nhiễm sắc thể bất thường dẫn đến sự phát triển không bình thường của tinh trùng

dị bội, điều này được dự đoán có thể do sự phân chia nhiễm sắc thể bất thường dẫn đến sự hình thành, phát triển của tinh trùng dị bội [88]

Có hai giả thuyết trái ngược nhau kèm theo thực nghiệm được đưa ra để giải thích hiện tượng đơn bội: (i) thụ tinh đơn thay vì thụ tinh kép bình thường; (ii) loại bỏ nhiễm sắc thể của bố (kích tạo đơn bội) sau quá trình thụ tinh bình thường Kết quả đã chỉ ra tần suất cao của hiện tượng dị hợp tử và đào thải phôi khi trong quá trình tạo thể đơn bội, điều này cho thấy hiện tượng thụ tinh đơn

đã xảy ra mà không phải quá trình thụ tinh kép Quan sát bằng kính hiển vi về quá trình tạo phôi sau khi hạt phấn cây kích tạo được thụ phấn đã xác định các noãn được thụ tinh là đơn lẻ [138] Điều này đã đưa ra căn cứ trực tiếp để chứng minh cho quá trình thụ tinh đơn lẻ mà không phải là thụ tinh kép Những nghiên

cứu này chỉ ra hiện tượng đơn bội của mẹ là kết quả của quá trình thụ tinh bất thường trong đó một tinh trùng thụ kết hợp với nhân trung tâm hình thành nội nhũ, tinh trùng khác không kết hợp được với tế bào trứng để hình thành noãn

Trái ngược với những nghiên cứu ở trên, có những nghiên cứu đã chứng minh về quá trình thụ tinh kép bình thường khi cây mẹ sử dụng hạt phấn của cây kích tạo đơn bội Một số nghiên cứu đã khẳng định sự có mặt của các đoạn nhiễm sắc thể cây kích tạo đơn bội trong các thể đơn bội của mẹ, điều đó đã chứng minh cho quá trình thụ tinh kép sảy ra, sau đó nhiễm sắc thể của cây kích tạo đơn bội bị loại bỏ trong quá trình phát triển của phôi [120], [163] Khi sử dụng cây kích tạo đơn bội mang gen chỉ thị R1-nj (chỉ thị màu tím trên nội nhũ của hạt) kết hợp với chất đánh dấu dầu cao trong phôi thì phát hiện hạt đơn bội tạo ra có sắc tố màu trên nội nhũ sẽ mờ và phôi hạt đơn bội sẽ có nhiều dầu, điều đó đưa ra giả thuyết các đoạn nhiễm sắc thể đã được tích hợp vào hạt đơn bội [87] Khi cây kích tạo đơn bội có mang những dấu hiệu đã được đánh dấu lai với vật liệu mẹ thu được hạt đơn bội mang đi phân tích thì thấy các nhiễm sắc thể đã được đánh dấu xuất hiện với tần số thấp trong các hạt đơn bội, điều này đã minh chứng cho việc loại bỏ các nhiễm sắc thể cây kích tạo đơn bội khi hình thành hạt đơn bội [163] Nhiều nghiên cứu khác đã khẳng định quá trình thụ tinh kép đã xảy ra, nhiễm sắc thể bị loại bỏ trong tuần đầu tiên sau quá trình thụ tinh và được tìm thấy trong thể dị bội, nhiễm sắc thể bị lỗi trong trong phôi

và nội nhũ khi hình thành thể đơn bội, những nghiên cứu này đã chứng minh cho việc loại bỏ các nhiễm sắc thể cây kích tạo đơn bội trong quá trình hình thành thể đơn bội [88], [120]

1.2.4 Nghiên cứu duy trì, phát triển và cải tiến cây kích tạo đơn bội

Một trong những mục tiêu chính trong tạo dòng đơn bội kép bằng cây kích tạo đơn bội là cải thiện tỷ lệ hạt đơn bội (HIR), tích hợp các dấu hiệu mới

để thuận lợi cho việc xác định thể đơn bội và cải thiện đặc tính nông sinh học, khả năng chống chịu của cây kích tạo đơn bội Các nghiên cứu đã khẳng định

HIR có thể được cải thiện thông qua việc lựa chọn các quần thể cây kích tạo đơn bội đã phân ly, lựa chọn các cá thể/cây kích tạo đơn bội có HIR cao hơn so với bố mẹ [51] Để phát triển các cây kích tạo đơn bội mới có thể ứng dụng phương pháp chọn lọc phả hệ, bao gồm việc lựa chọn các cây riêng lẻ dựa trên các đặc điểm có khả năng di truyền cao ở thế hệ phân ly F2, sau đó là lựa chọn giữa các gia đình F2 cho HIR cao [85] Dùng phương pháp lai trở lại cũng có thể được sử dụng nếu mục tiêu là cải thiện các đặc tính thích nghi, đặc tính nông học mà không nhất thiết quan tâm tới HIR [51]

Một nhiệm vụ quan trọng trong chọn tạo cây kích tạo đơn bội ngoài việc duy trì tỷ lệ HIR thì cần duy trì chỉ thị đánh dấu gen R1-nj (mang sắc tố tím trên nội nhũ của hạt) trên cây kích tạo đơn bội, không để cây kích tạo đơn bội

bị phân ly, sắc tố màu tím bị nhạt hoặc mất màu trong quá trình duy trì dòng kích tạo Gần đây, các nhà khoa học sử dụng cây ngô không có tai lá (lg2, liguleless; gl gloss) mang gen lặn lai với cây kích tạo đơn bội để đánh giá tỷ lệ HIR của các nguồn vật liệu kích tạo đơn bội mới và cũ [101] Trong các phép lai thể đơn bội biểu hiện kiểu hình lặn, cây thử không tai lá mang kiểu hình lặn lai với nhau cho ra kiểu hình lặn (con lai không tai lá) từ đó sẽ dễ dàng tính tỷ

lệ đơn bội cho từng nguồn kích tạo Cây ngô không tai lá (lg) đã được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá cây kích tạo đơn bội mới [101]

Ứng dụng chỉ thị phân tử để đánh dấu vị trí gen qhir1, gen gây ra hiện tượng đơn bội để phát triển ra các dòng kích tạo đơn bội mới cho vùng nhiệt đới đang được nghiên cứu [51] Chỉ thị phân tử đánh dấu gen qhir1 rất hữu ích cho việc loại bỏ những cây hay gia đình không có chứa gen qhir1, hoặc có tỷ

lệ hạt đơn bội thấp, chỉ những gia đình, cây kích tạo mới có mang gen qhir1 được giữ lại, tránh hiện tượng phân ly do quá trình lai tạo [51]

Việc duy trì tỷ lệ hạt đơn bội của các dòng kích tạo cần được kiểm tra thường xuyên qua từng vụ vì quá trình chọn lọc tự nhiên luôn tác động và ảnh hưởng đến HIR [101] Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình chọn lọc tự nhiên

làm ảnh hưởng đến HIR dẫn đến các biến dạng và phân ly nguồn kích tạo đơn bội [110] Quá trình duy trì và chọn lựa các cây kích tạo đơn bội ngoài việc lựa chọn các chỉ tiêu chống chịu, chỉ tiêu nông sinh học thì cần loại bỏ các cây lẫn khác dạng bởi vì phấn của các cây lẫn có thể canh tranh và thụ phấn tốt hơn so với phấn của cây kích tạo đơn bội và sẽ làm giảm HIR [52]

1.2.5 Nghiên cứu về các bước tạo dòng ngô đơn bội kép bằng công nghệ kích tạo đơn bội

1.2.5.1 Nhận biết, phân loại hạt, cây đơn bội

Thể đơn bội được phân biệt với thể lưỡng bội ở giai đoạn hạt, cây con hoặc cây trưởng thành Vì các thể đơn bội thường xảy ra với tần suất thấp < 10%, nên hầu hết các hạt thu được từ lai giữa cây kích tạo đơn bội với nguồn vật liệu

ưu tú là hạt lưỡng bội và không được sử dụng để tạo dòng đơn bội kép (DH) Do

đó, việc phát hiện hạt đơn bội loại bỏ hạt lưỡng bội ở giai đoạn hạt sẽ giảm rất nhiều công sức, chi phí cho các giai đoạn sau [49] Phân biệt đơn bội/lưỡng bội dựa trên các dấu hiệu kiểu hình được tích hợp trong cây kích tạo đơn bội, chỉ thị sắc tố tím của hạt kích tạo đơn bội do gen R1-nj (Navajo), được sử dụng rộng rãi

để nhận dạng đơn bội Tất cả các các cây kích tạo đơn bội hiện nay đang được

sử dụng trên toàn thế giới đều mang gen chỉ thị R1-nj [46], [104] R1-nj kết hợp với các gen khác, chẳng hạn như A1, A2, C2, Bz1, Bz2 và C1 tạo ra màu tím trong lớp aleurone của nội nhũ và lớp vỏ của phôi ở thể lưỡng bội, thường được gọi là kiểu hình Navajo [111] Hạt đơn bội tạo ra chỉ biểu hiện sắc tố (anthocyanin) trên nội nhũ, không có trên phôi, điều này thuận lợi cho sự phân biệt giữa hạt đơn bội và lưỡng bội bằng mắt thường [111]

Hình 1.3 Hình ảnh bắp cây kích tạo đơn bội (kích tạo đơn bội)

và phân loại hạt đơn bội

Ghi chú: A: Bắp cây kích tạo đơn bội TAILP được phát triển từ UH400 và RWS; B: Phân biệt hạt đơn bội, hạt lai và hạt lẫn tạp dựa theo chỉ thị R1-nj trên hạt

Gần đây, việc phân loại hạt đơn bội đã được tối ưu hóa dựa trên phương pháp đánh dấu R1-nj bằng cách sử dụng kỹ thuật đa phổ [61], siêu phổ [145] và

kỹ thuật chụp ảnh huỳnh quang [36], với mục tiêu giảm thời gian và công lao động liên quan đến việc phân loại hạt đơn bội thông thường dựa trên chỉ thị màu tím trên nội nhũ, nhưng sai số trong phân loại bằng phương pháp này hiện tại là không có ý nghĩa Mặc dù chỉ thị R1-nj được sử dụng phổ biến nhất, tuy nhiên thực tế việc sử dụng chỉ thị này trong nhận dạng đơn bội gặp phải một số hạn chế Hạn chế quan trọng nhất là sự biểu hiện của R1-nj có thể bị ức chế do các gen ức chế anthocyanin lấn át khi nguồn vật liệu mẹ mang gen C1-I Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự biểu hiện của gen đánh dấu R1-nj bị ức chế ở một

tỷ lệ đáng kể (~ 30%) ở các nguồn vật liệu ưu tú vùng nhiệt đới [50]

Trong các quần thể có nguồn gốc tạo ra bằng phương pháp lai trở lại với các vật liệu ưu tú, khó xác định các thể đơn bội dựa trên biểu hiện của sắc tố Các thí nghiệm đánh dấu phân tử đã được phát triển bằng cách sử dụng sự biến đổi trình tự trong gen C1-I, cho phép dự đoán sự ức chế hoặc biểu hiện của gen chỉ thị R1-nj[50] Các thử nghiệm đánh dấu này giúp khoanh vùng các nguồn

Gen ức chế hoặc hạt lẫn tạp

Hạt lai

Hạt đơn bội

vật liệu có mang gen ức chế sắc tố anthocyanin có khả năng làm nhầm lẫn hạt đơn bội, lượng bội làm mất công và chi phí khi thực hiện [48]

Dựa trên hàm lượng dầu trên hạt đơn bội và lưỡng bội để phân biệt là một phương pháp đang được nghiên cứu và thử nghiệm Một số nghiên cứu đã chứng minh, hàm lượng dầu trung bình của hạt lưỡng bội nằm trong khoảng 3-4%, với > 85% lượng dầu nằm trong phôi, trong khi hạt đơn bội có hàm lượng dầu trung bình trong hạt khoảng 0,6-0,8%, với dấu hiệu này có thể dùng máy tự động phân tích hàm lượng dầu trong hạt để phân loại hạt đơn bội [103]

Tuy nhiên, các nhà khoa học đã chứng minh rằng hàm lượng dầu của đơn bội và lưỡng bội phân bổ không đều, chồng chéo, phụ thuộc vào nguồn vật liệu khác nhau và sự khác biệt nhỏ về hàm lượng dầu trung bình của đơn bội và lưỡng bội làm khó khăn cho việc phân loại [103] Các nguồn kích tạo đơn bội có hàm lượng dầu cao như CAUHOI (7,8% Hàm lượng dầu OC), CHOIL (~ 8,5% OC) (Dong et al 2014) và UH600 (10,8% OC) và UH601 (11,7% OC) đã được phát triển dựa trên nền tảng di truyền từ con lai của các cây kích tạo đơn bội ôn đới

có hàm lượng dầu cao [104]

Khi sử dụng cây kích tạo đơn bội có hàm lượng dầu cao, hạt đơn bội có hàm lượng dầu trung bình thấp hơn so với hạt lưỡng bội Hàm lượng dầu của cây kích tạo đơn bội ít nhất là 10% để đảm bảo phân tách rõ ràng cả hai phân số để phân biệt rõ ràng, không bị nhầm lẫn [103] Bằng phương pháp chụp cộng hưởng

từ hạt nhân, dựa trên khối lượng dầu hoặc hàm lượng dầu có thể phân loại hạt đơn bội và hạt hạt lưỡng bội [99],[102]

Phát triển cây kích tạo đơn bội có mang chỉ thị đánh dấu màu đỏ/tím ở

rễ và chỉ thị R1-nj (màu tím ở hạt) của cây kích tạo đơn bội đã được nghiên cứu [48] Khi sử dụng cây kích tạo đơn bội mang các chỉ thị này này lai với các nguồn vật liệu, rễ cây con lưỡng bội biểu hiện màu đỏ/tím trong khi rễ cây con đơn bội không biểu hiện sắc tố màu anthocyanin Chất chỉ thị màu đỏ/tím ở rễ

là kiểu hình rất hiếm gặp ở nguồn gen ngô và biểu hiện độc lập với chất đánh

dấu R1-nj [48] Tuy nhiên, do áp dụng phương pháp này ở giai đoạn cây con nên tốn chi phí, diện tích đất, công sức để xử lý lưỡng bội cũng như chăm sóc cây con ngoài vườn ươm Do vậy, chỉ áp dụng phương pháp này khi chỉ thị R1-

nj không được biểu hiện khi các nguồn vật liệu mẹ mang gen ức chế màu sắc anthocyanin [49]

Dựa vào phương pháp chuyển gen để chuyển các gen tích hợp các chỉ thị đánh dấu protein huỳnh quang màu xanh lá cây (EGFP) được điều khiển bởi chất kích thích 35S vào các nguồn kích tạo ôn đới, EGFP được ghi nhận

là đã biểu hiện trong nội nhũ, phôi, rễ và bao mầm của cây con lưỡng bội [155] Do đó, EGFP có thể được sử dụng ở cả giai đoạn trước và sau khi nảy mầm nhưng không phải ở giai đoạn hạt khô

Mặc dù các thể đơn bội được phân loại dựa trên biểu hiện của chỉ thị đánh dấu, nhưng việc áp dụng các cây kích tạo đơn bội chuyển gen khó thực hiện ở nhiều quốc gia do những hạn chế trong việc sử dụng các sản phẩm từ chuyển gen Các đặc điểm của cây con như chiều dài bao mầm, chiều dài rễ

và số lượng rễ của cây lưỡng bội thường cao hơn so với cây đơn bội do đó có thể áp dụng phương pháp này, tuy nhiên chi phí đầu tư lớn và chỉ áp dụng cho những nguồn vật liệu khi không biểu hiện chỉ thị sắc tố antocyanin[47]

Kích thước lỗ khí trung bình giữa cây con đơn bội và cây lưỡng bội có

sự khác nhau đáng kể và được đề xuất như một phương pháp để phân biệt cây đơn bội và cây lưỡng bội [59] Tuy nhiên, phương sai về độ dài khí khổng trung bình của từng cây riêng lẻ lớn, điều này gây khó khăn cho việc phân loại

và chỉ được khuyến nghị khi không thể dùng phương pháp khác và việc phân tích hình ảnh để đo khí khổng ít nhất được tự động hóa một phần [105] Trong các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và sinh sản, cây ngô đơn bội và cây lưỡng bội thể hiện sự khác biệt rất rõ về nhiều mặt Cây đơn bội thể hiện sức sống kém, lá mọc thẳng và xanh nhạt với chiều rộng lá nhỏ hơn, đồng thời không có hoặc bông cờ bị teo, hoặc không có bao/hạt phấn [90], [91], [147]

Tuy nhiên, việc xác định các thể đơn bội ở giai đoạn sinh dưỡng hoặc sinh sản với những đặc điểm này là rất kém hiệu quả và tốn kém

Sử dụng hình ảnh quang phổ (NIR) và chụp ảnh siêu phổ/cận hồng ngoại (HSI) kết hợp với phương pháp đa biến để xác định hạt đơn bội và lưỡng bội được đưa ra với độ chính xác khoảng 90% Quang phổ NIR rất phù hợp để phát hiện định lượng chất lỏng và bột được đặc trưng bởi thành phần chất đồng nhất, chẳng hạn như protein, dầu, đường và sắc tố [162].So với quang phổ NIR thông thường, công nghệ chụp ảnh siêu phổ (HSI) có thể thu được màu sắc, kích thước, kết cấu và các đặc điểm bên ngoài khác của hạt, cũng như các thành phần hóa học trong hạt với thông tin quang phổ và thông tin hình ảnh [73] Nhiều nghiên cứu đã sử dụng công nghệ NIR-HSI trong lĩnh vực này, ví dụ: để xác định tình trạng nấm mốc trong hạt ngô bảo quản [152]; để theo dõi sự nhiễm nấm của hạt ngô [137]; để điều tra độ cứng của hạt ngô [119]

Tỷ lệ hạt đơn bội thu được phụ thuộc vào từng nguồn vật liệu kích tạo, nguồn vật liệu làm mẹ và mùa vụ Đã có những công trình nghiên cứu đưa ra kết quả, khi sử dụng cùng một nguồn vật liệu kích tạo đơn bội có nguồn gốc ôn đới lai với cùng một nguồn mẹ ở vụ Đông cho tỷ lệ hạt đơn bội cao hơn và hạt lẫn tạp thấp hơn so với các thời vụ khác [82]

1.2.5.2 Lưỡng bội nhiễm sắc thể hạt đơn bội

Lưỡng bội NST bằng phương pháp nhân tạo

Cây đơn bội có nhiễm sắc thể (1n) do không có sự phân chia giảm phân nên không hình thành hợp tử và không có khả năng sinh sản [52] Do đó, các nhiễm sắc thể cần được nhân đôi để các nhiễm sắc thể tương đồng có thể bắt cặp và quá trình giảm phân diễn ra bình thường, dẫn đến khả năng sinh sản được phục hồi Tuy nhiên, một tỷ lệ cao các cây đơn bội (từ 97-100%) có thể tạo ra hạt khi được thụ phấn bằng phấn hoa từ các cây lưỡng bội bình thường, trong khi hầu hết các cây đơn bội là bất dục đực Do đó, việc khôi phục khả năng sinh sản của cơ quan đực đơn bội (HMF) thường được coi là một yếu tố hạn chế trong tạo các dòng đơn

bội kép (DH) [123], [147] Khôi phục khả năng sinh sản ở cây đơn bội có thể đạt được bằng phương pháp nhân đôi nhiễm sắc thể nhân tạo dựa vào một số hóa chất hoặc nhân đôi nhiễm sắc thể tự phát dựa vào khả năng tự phục hồi cơ quan sinh sản của cây ngô đơn bội để có khả năng sinh sản một cách tự nhiên

Colchicine được sử dụng rộng rãi để nhân đôi nhiễm sắc thể bằng phương pháp nhân tạo trong quy trình tạo dòng DH [100] Colchicine liên kết với β-tubulin và ngăn chặn sự hình thành các chất làm mờ tubulin, do đó ngăn ngừa sự hình thành các vi ống Thiếu vi ống trong quá trình nguyên phân ở các tế bào phân sinh của đỉnh chồi ngăn cản sự phân tách của các nhiễm sắc thể sao chép,

sự di chuyển về cực và phân chia tế bào, dẫn đến tế bào có số lượng nhiễm sắc thể tăng gấp đôi Quy trình tiêu chuẩn bằng cách ngâm mầm con có lá mầm dài khoảng 2 cm trong dung dịch colchicine (0,04-0,06%) với 0,5% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) trong 8-12 giờ [116]

Các quy trình này được gọi là phương pháp ngâm mầm và được mô tả vào những năm 1990 Trong quy trình này, hạt đơn bội được xếp đặt trên khăn giấy, cuộn thành ống, tưới đủ ẩm đảm bảo đủ điều kiện cho hạt nảy mầm, trong 96-

120 giờ cho đến khi lá mầm dài khoảng 2 cm Đầu lá mầm được cắt bỏ trước khi ngâm trong dung dịch xử lý để tạo điều kiện hấp thu các hóa chất để nhân đôi nhiễm sắc thể (NST) Sau đó, cây con được rửa sạch dưới vòi nước, trồng trong khay để trong điều kiện nhà kính để cây phục hồi cho đến giai đoạn ba lá sau đó được chuyển trồng trong vườn ươm DH [115] Phương pháp này cho tỷ lệ thành công có thể đạt được là 10-30% tùy thuộc vào từng nguồn vật liệu Tuy nhiên, colchicine độc hại và cần được xử lý và tiêu hủy theo đúng quy trình [100]

Do đó, việc thay thế colchicine bằng các chất hóa học ít độc hại hơn để lưỡng bội, nhân đôi nhiễm sắc thể là điều nên làm Gần đây, quá trình nhân đôi nhiễm sắc thể dựa trên thuốc diệt cỏ chống phân bào và khí nitơ oxit (N2O) đã được tối ưu hóa Một số thuốc diệt cỏ ức chế quá trình hình thành, kéo dài, hoặc ngăn cản quá trình lắp ráp vi ống và có thể chống phân bào [169]

Hình 1.4 Các bước xử lý lưỡng bội hóa bằng colchicine của CIMMYT

Ghi chú: A: Ngâm ủ hạt trên giấy ẩm; B, cắt bao lá mầm 2 mm; C: Đưa hạt đã cắt bao lá mầm vào túi lưới; D: Ngâm trong Colchicine 0,04 - 0,06% và 0,5% dimethyl sulfoxide (DMSO) trong 12 h; E: Cây D0 được trồng sau 2 tuần

Melchinger và cộng sự năm 2016 đã chứng minh hỗn hợp hóa chất gồm 0,5% dimethyl sulfoxide, 20 mg L−1 Amiprophos-methyl (APM) và 4 mg L−1 pronamide áp dụng cho cây con như mô tả ở trên để xử lý có thể mang lại tỷ lệ thành công gần bằng với colchicine Amiprophos-methyl và pronamide ít độc hơn nhiều so với colchicine [100] Thuốc diệt cỏ kháng vi ống oryzalin, trifluralin và flufenacet đã được thử nghiệm để tạo dòng đơn bội kép bằng nuôi cấy bao phấn và tạo dòng đơn bội kép bằng cây kích tạo đơn bội, nhưng đạt kết quả không cao [100] Mặc dù thuốc diệt cỏ chống phân bào cho thấy hiệu quả thấp hơn so với colchicine, nhưng việc ứng dụng để xử lý sẽ giảm thiểu rủi ro

về vấn đề sức khỏe cho những người thực hiện lưỡng bội hóa NST vì ít độc hại hơn và có thể giảm chi phí và không cần tuân thủ theo quy trình xử lý nghiêm ngặt như colchicine

Một giải pháp thay thế khác sử dụng N2O ức chế quá trình trùng hợp của

vi ống để thay thế cho xử lý lưỡng bội NST bằng colchicine [106] Khí oxit nitơ, được sử dụng làm thuốc mê hít trong nha khoa và làm khí đóng gói thực phẩm, tương đối an toàn hoặc về cơ bản không có tác động tiêu cực đến sức khỏe Phương pháp xử lý bao gồm các cây con có cùng kích thước như trong phương pháp xử lý colchicine được đặt trong buồng áp suất có canxi hydroxit

để hấp thụ carbon dioxide từ quá trình hô hấp của cây con N2O được bơm vào buồng với áp suất 0,6 MPa và cây con được xử lý ở 25°C trong 3 ngày Sau khi

xử lý, cây con được xử lý tiếp theo như đã mô tả đối với xử lý bằng colchicine

và thuốc diệt cỏ

So với xử lý bằng colchicine và thuốc diệt cỏ, xử lý N2O ít phụ thuộc vào các cơ sở chuyên môn hơn vì N2O không cần xử lý đặc biệt và có thể thải vào khí quyển ở khu vực thông thoáng N2O đã cho thấy tỷ lệ thành công tương

tự như colchicine Tuy nhiên, phương pháp xử lý này cần đầu tư xây dựng buồng áp suất có thể chịu được áp suất cao, tốn kém, chi phí đầu tư lớn [106]

Nhiều công trình nghiên cứu khác về lưỡng bội NST khác được đưa ra như dùng colchicine xử lý trực tiếp cho hạt giống [70], tiêm colchicine vào mô phân sinh đỉnh chồi mầm cây đơn bội đã được đưa ra thử nghiệm [157] hay bón 0,06% colchicine ở 18°C lên hạt bị cắt một phần nhỏ lông tơ làm tăng tỷ lệ nhân đôi nhiễm sắc thể cao hơn so với phương pháp xử lý nhúng cây con trong các thí nghiệm của Gayen và cộng sự năm 1994 [70] Tuy nhiên những thí nghiệm này được thực hiện lặp lại nhưng không cho kết quả như mong muốn [54]

CIMMYT đã dùng cách bôi colchicine ở các nồng độ khác nhau trong 5 giờ lên hạt ngâm trong nước trong 18 giờ, kết quả không có sự khác biệt về tốc

độ nhân đôi nhiễm sắc thể so với tốc độ nhân đôi nhiễm sắc thể tự phát, quy trình này đang tiếp tục nghiên cứu kết quả chưa được công bố Tiêm dung dịch colchicine 2-3 mm trên mô phân sinh chồi đỉnh nhưng tỷ lệ cây có khả năng sinh sản thấp hơn so với phương pháp nhúng cây con tiêu chuẩn [54] Xử lý rễ cây con 10-12 ngày tuổi bằng colchicine được đánh giá bởi Deimling và cộng

sự năm 1997 hay sử dụng thuốc trừ cỏ chống phân bào cho thấy hiệu quả kém hơn nhiều so với phương pháp xử lý ngâm mầm nghiên cứu bởi Melchinger và cộng sự năm 2016 [100]

Xử lý N2O đối với cây ngô trưởng thành ở giai đoạn phát triển phân hóa mầm hoa (giai đoạn V3-V8) với 0,6 MPa đã được công bố và sau đó được cấp bằng sáng chế [81] Mặc dù phương pháp này hứa hẹn trong việc nhân đôi NST

cây đơn bội, nhưng hiệu quả không cao vì việc xử lý ở giai đoạn cây trưởng thành đòi hỏi buồng lớn hơn và cây cần được trồng trong chậu

Lưỡng bội hóa NST dựa trên cơ chế tự nhân đôi NST phục hồi cơ quan sinh sản của cây ngô đơn bội

Bên cạnh giải pháp nhân đôi nhiễm sắc thể bằng hóa chất, giải pháp dựa vào cơ chế tự nhân đôi nhiễm sắc thể, tự phục hồi khả năng sinh sản cây đơn bội tự tạo ra hạt phấn, đang được nghiên cứu Năm 1949, Chaise là người đầu tiên phát hiện và mô tả hiện tượng tự phục hồi khả năng sinh sản của cây ngô đơn bội [57] Tỷ lệ tự nhân đôi nhiễm sắc thể được tính bằng tỷ lệ cây kết hạt sau khi tự thụ phấn trong tất cả các cây đơn bội và giá trị này tương tự như tỷ

lệ thành công tổng thể được mô tả trong phần trước để nhân đôi nhiễm sắc thể nhân tạo[85] Tỷ lệ tự phục hồi khả năng sinh sản phụ thuộc vào nguồn vật liệu, những nguồn vật liệu nhiệt đới ưu tú có tỷ lệ phục hồi trung bình cao hơn những nguồn có nguồn gốc nhiệt đới [85] Tỷ lệ xuất hiện bao phấn là thước đo hiệu quả về khả năng tự phục hồi sinh sản của cây ngô đơn bội [124], [147]

Ở các nguồn gen đa dạng của Hoa Kỳ và Trung Quốc, AER dao động từ 9,8 đến 89,8% [147] Trong hầu hết các nguồn gen ngô, tốc độ tự nhân đôi nhiễm sắc thể là quá thấp để tạo dòng đơn bội kép [85] Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy có nhiều vật liệu có biến dị di truyền lớn và khả năng di truyền cao đối với khả năng tự nhân đôi NST và phục hồi khả năng sinh sản nên việc áp dụng sẽ thông qua cải thiện và chọn lọc vật liệu [124]

Những năm gần đây, CIMMYT đã nghiên cứu về khả năng phục hồi khả năng tự phục hồi sinh sản ở các cây đơn bội có nguồn gốc từ 330 dòng cận huyết nhiệt đới cho thấy biến dị di truyền đáng kể và khả năng di truyền cao đối với các tính trạng sinh sản đơn bội [49] Một trong số các dòng cận huyết nhiệt đới nghiên cứu có khả năng tự nhân đôi nhân đôi nhiễm sắc thể và có tỷ

lệ phục hồi khả năng sinh sản vượt trội so với phương pháp nhân đôi nhiễm sắc thể bằng phương pháp nhân tạo Những dòng này có thể được sử dụng làm vật

liệu nền để cải thiện khả năng tự phục hồi sinh sản trong nguồn gen ngô nhiệt đới Molenaar và công sự, năm 2019 đã nghiên cứu và chứng minh có thể cải thiện khả năng tự nhân đôi NST cây ngô đơn bội thông qua việc chọn lọc vật liệu làm mẹ [105] Nghiên cứu chỉ ra rằng với ba chu kỳ chọn lọc lặp lại với tỷ

lệ tự nhân đôi NST thì tỷ lệ tự nhân đôi nhiễm sắc thể có thể tăng từ   5% lên 50% ở hai quần thể

Tỷ lệ tự phục hồi khả năng sinh sản của cây đơn bội là một hạn chế nên

đã được nhiều công trình nghiên cứu trong những năm gần đây Một nghiên cứu của Wu và cộng sự năm 2017 đã đưa ra kết luận, khả năng tự phục hồi sinh sản được kiểm soát bởi hai hoặc nhiều gen chính có hiệu ứng cộng gộp [147] Các nghiên cứu về lập bản đồ di truyền gần đây đã sử dụng các nguồn vật liệu

là bố, mẹ có tỷ lệ phục hồi cơ quan sinh sản bước đầu đã xác định được một số QTL quy định khả năng tự phục hồi cơ quan sinh sản cao ở một số nguồn vật liệu [124], [153]

Nguyên nhân gây ra cơ chế tự nhân đôi nhiễm sắc thể tự phát vẫn tiếp tục được nghiên cứu, những nghiên cứu về sự hợp nhất tế bào soma, nhân đôi NST và phục hồi nhân đã được nhiều công trình nghiên cứu trước đó đã công

bố [132] Tự nhân đôi nhiễm sắc thể thường dẫn đến hiện tượng khảm thực vật

và thường chỉ những phần nhỏ của của bông cờ có bao phấn bung và cho phấn [85] Do đó, những cây đơn bội tự phục hồi sinh sản thường kết hạt kém hơn

so với cây đơn bội được lưỡng bội NST bằng phương pháp nhân tạo Tuy nhiên, bằng cách chọn lọc lặp lai theo chu kỳ có thể cải thiện khả năng cho phấn và mức độ kết hạt [105]

Cây đơn bội sau khi xử lý lưỡng bội bằng colchicine thường yếu và dễ

bị tác động bởi yếu tố sinh học và phi sinh học do đó cần được chăm sóc trong môi trường tốt nhất, hạn chế ánh sáng có cường độ bức xạ mạnh, đất tơi xốp đủ

ẩm thuận lợi cho quá trình phát triển của cây D0 [94] Ở giai đoạn trỗ cờ tung phấn của cây D0, khi bao phấn bung, bông cờ cần được chụp bằng túi giấy có

phủ sáp nến để dễ dàng nhìn thấy bao phấn và hạt phấn, mỗi cây D0 sau khi chụp vào chiều ngày hôm trước sáng hôm sau cần tiến hành tự phối khi bông

cờ bung phấn, thụ phấn 2 - 3 lần/bắp để đảm bảo kết hạt tốt Mỗi bắp/cây D0

thu được là 1 dòng ngô đơn bội kép hoàn toàn đồng hợp tử, thường được gọi là thế hệ D1 Số hạt thu được trên mỗi cây D1 rất khác nhau trong cùng nguồn vật liệu hoặc khác nguồn vật liệu [85]

Trong thời gian gần đây, công nghệ tạo dòng ngô đơn bội kép bằng phương pháp sử dụng cây kích tạo đơn bội đang được nhiều nước nghiên cứu

và phát triển rộng rãi Ở mỗi bước thực hiện của phương pháp đã được cải tiến nhằm nâng cao hiệu quả của phương pháp

Các dòng ngô đơn bội kép được tạo ra giúp các nhà tạo giống rút ngắn thời gian tạo ra giống mới có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt hơn Hơn nữa, công nghệ này còn được ứng dụng để phân tích dạng di truyền ở các giống ngô địa phương, mở rộng nguồn gen trên cơ sở nguồn gen bản địa [34], [38], [99] Ngoài ra, các dòng đơn bội kép được tạo ra từ công nghệ đã trải qua quy trình xử lý hóa chất ở giai đoạn mầm để lưỡng bội NST sẽ được đánh giá, về khả năng thích ứng của những tính trạng nông học do gen quy định [142] Công nghệ chỉnh sửa gen gần đây đã gián tiếp ứng dụng cây kích tạo đơn bội (Kích tạo đơn bội Mediated Genome Editing - IMGE) và (HI-Edit) để chỉnh sửa các gen quy định tính trạng trên cây trồng [83], [144]

Những tiến bộ công nghệ trong nghiên cứu quy trình tạo dòng ngô đơn bội kép trên cây ngô đã được các nhà khoa học trên thế giới áp dụng sang các loài thực vật khác Ví dụ, chỉnh sửa bộ gen của mẫu hệ gen lúa bản địa (OsMATL) tạo ra đơn bội với tần suất 2-6% [154] Việc sử dụng các gen chuyển PsASGR-BBML từ các loài cỏ apomictic hoang dã đã được chứng minh

là tạo ra cây đơn bội ở cây lúa [44] Các hệ thống đơn bội dựa trên biến thể protein histone H3 đặc hiệu của tâm động đã được thiết kế (CENH3) chứng minh ở cây họ cải - Arabidopsis [122] và ở ngô đã đề cập ở phần trên và có thể

mở rộng áp dụng cho nhiều loài cây trồng [84] Mở rộng tìm kiếm các kiểu gen

có khả năng gây đơn bội trong số 4.000 nguồn vật liệu cao lương đã xác định các nguồn gây đơn bội với tỷ lệ HIR nằm trong khoảng 1-2% [79]

1.2.6 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ kích tạo đơn bội tại Việt Nam

Mặc dù công nghệ kích tạo đơn bội có nhiều ưu điểm, đang được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều quốc gia nhưng ở Việt nam có rất ít công trình nghiên cứu

về công nghệ để tạo dòng đơn bội kép Giai đoạn 2011 - 2015, thông qua nội dung của dự án “Phát triển giống ngô lai”, Viện Nghiên cứu Ngô đã hợp tác với CIMMYT chuyển giao quy trình “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ kích tạo đơn bội trong chọn tạo giống ngô lai” ở Việt Nam Năm 2012, Viện Nghiên cứu Ngô đã cử 3 cán bộ sang học tập quy trình công nghệ tại CIMMYT - Mexico và nhập 3 nguồn kích tạo đơn bội (TAILP1, TAILP2 và TAILP1xTAILP2) đã được CIMMYT nhiệt đới hóa từ các nguồn kích tạo có nguồn gốc ôn đới

Sau 3 năm thực hiện, Viện Nghiên cứu Ngô đã hoàn thiện và đưa ra quy trình duy trì cây kích tạo, chọn tạo dòng bằng cây kích tạo đơn bội Thế hệ dòng ngô đơn bội kép đầu tiên đã được tạo ra với 217 dòng ngô đơn bội kép từ nhiều nguồn vật liệu là các giống ngô lai đơn thương mại trong và ngoài nước

Cây kích tạo đơn bội nhập từ CIMMYT được đánh giá có khả năng thích ứng tốt với điều kiện khí hậu ở Việt Nam, cho tỷ lệ kích tạo trung bình đạt từ 6

- 8%, tùy thuộc vào nguồn vật liệu làm mẹ

Quy trình tạo dòng ngô đơn bội kép bằng phương pháp sử dụng cây kích tạo đơn bội áp dụng tại Viện Nghiên cứu Ngô gồm 3 bước: