Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VŨ THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT PHENOLIC TRONG CHÈ XANH TÂN CƯƠNG - THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC TỰ NHIÊN Tra
Trang 1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
Trang 2ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Hướng dẫn khoa học: TS Vũ Ngọc Phan
PGS.TS Dương Thị Tú Anh
THÁI NGUYÊN - 2022
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đã thực hiện việc kiểm tra mức độ tương đồng nội dung luận văn qua phần mềm Turnitin một cách trung thực và đạt kết quả mức độ tương đồng 22% Bản luận văn kiểm tra qua phần mềm là bản cứng đã nộp để bảo vệ trước hội đồng Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm
Thái Nguyên, tháng 05 năm 2022
TÁC GIẢ CỦA SẢN PHẦM HỌC THUẬT
Vũ Thị Hải Yến
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Để luận văn được hoàn thành và có kết quả như ngày hôm nay, em xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Dương Thị Tú Anh, TS Vũ Ngọc Phan đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các Thầy Cô giáo Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên em và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu
Do thời gian có hạn và bản thân cũng có nhiều hạn chế, luận văn của em không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý quý báu của các Thầy,
Cô để luận văn được hoàn thiện hơn
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 05 năm 2022
Tác giả
Vũ Thị Hải Yến
Trang 5MỤC LỤC
Trang Trang bìa phụ
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN 3
1.1 Giới thiệu về chè xanh 3
1.1.1 Nguồn gốc cây chè 3
1.1.2 Ứng dụng của chè xanh trong đời sống 3
1.1.3 Thành phần hóa học của chè xanh 4
1.2 Các hợp chất phenolic trong chè xanh 5
1.2.1 Giới thiệu về Caffeine 6
1.2.2 Giới thiệu về Theobromine 7
1.2.3 Giới thiệu về Theophylline 7
1.3 Giới thiệu về chè ở Tân Cương, Thái Nguyên 8
1.4 Các công trình nghiên cứu về hợp chất phenolic trong chè xanh ở trong nước và trên thế giới 9
1.4.1 Các công trình nghiên cứu về hợp chất phenolic trong chè xanh ở trong nước 9
1.4.2 Các công trình nghiên cứu về hợp chất phenolic trong chè xanh trên thế giới 11
1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 13
Chương 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 16
Trang 62.1.1 Thiết bị, dụng cụ 16
2.1.2 Hóa chất 17
2.2 Thực nghiệm 18
2.2.1 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình xác định đồng thời TB, TP và CF bằng phương pháp HPLC 18
2.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình xác định đồng thời TB, TP và CF trong mẫu chè bằng phương pháp HPLC 20
2.2.3 Đánh giá phương pháp phân tích 20
2.3 Phân tích mẫu thực 24
2.3.1 Địa điểm và thời gian lấy mẫu 24
2.3.2 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 26
2.3.3 Quá trình xử lý và phân tích mẫu chè 27
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28
3.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình xác định đồng thời TB, TP và CF bằng phương pháp HPLC 28
3.1.1 Khảo sát lựa chọn detector 28
3.1.2 Khảo sát lựa chọn pha tĩnh 28
3.1.3 Khảo sát lựa chọn bước sóng và thời gian lưu 28
3.1.4 Khảo sát lựa chọn pha động và tỷ lệ pha động 29
3.1.5 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng pha động 33
3.1.6 Khảo sát lựa chọn pH pha động 35
3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình xác định đồng thời TB, TP và CF trong mẫu chè bằng phương pháp HPLC 37
3.3 Đánh giá phương pháp định lượng 41
3.3.1 Đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký 41
3.3.2 Đánh giá khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn xác định đồng thời TB, TP và CF 42
3.3.3 Giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD) 44
Trang 73.3.4 Giới hạn định lượng (Limit of Quantification - LOQ) 44 3.3.5 Độ chụm (độ lặp lại) 45 3.3.6 Độ thu hồi 45 3.4 Xác định một số chất phenolic trong chè xanh bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 47 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
Trang 8DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN
Sắc kí lỏng hiệu năng cao
với Detector mảng diod
High Performance Liquid Chromatography with Detector Diod
Array
HPLC-DAD
Chiết xuất có hỗ trợ lò vi
Trang 9DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC 21
Bảng 2.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC 24
Bảng 2.3 Vị trí, địa điểm và thời gian lấy các mẫu chè tại Tân Cương, Thái Nguyên 25
Bảng 3.1 Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích peak 32
Bảng 3.2 Diện tích peak và thời gian lưu của TB, TP và CF ở các tốc độ dòng khác nhau 35
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH pha động đến thời gian lưu và diện tích peak của các chất phân tích 37
Bảng 3.4 Thời gian lưu và diện tích peak của TB, TP, CF sau thời gian rung siêu âm khác nhau 39
Bảng 3.5 Các điều kiện tối ưu cho phép xác định theobromine, theophylline, caffein trong chè xanh bằng phương pháp HPLC 41
Bảng 3.6 Kết quả đo 10 lần lặp lại của hỗn hợp TB, TP và CF 41
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của TB, TP và CF 42
Bảng 3.8 Giới hạn phát hiện của phép đo 44
Bảng 3.9 Giới hạn định lượng của phép đo 44
Bảng 3.10 Kết quả lặp lại của phép đo 45
Bảng 3.11 Kết quả phép đo thêm chuẩn TB 46
Bảng 3.12 Kết quả phép đo thêm chuẩn TP 46
Bảng 3.13 Kết quả phép đo thêm chuẩn CF 47
Bảng 3.14 Kết quả hàm lượng TB, TP và CF trong búp chè xanh 48
Bảng 3.15 Kết quả hàm lượng TB, TP và CF trong lá bánh tẻ chè xanh 50
Trang 10DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hệ thống HPLC Acquity Arc 16 Hình 2.2 Máy rung siêu âm Elmasonic S 100 H 16 Hình 2.3 Vị trí, địa điểm lấy các mẫu chè tại Tân Cương, Thái Nguyên 25 Hình 3.1 Sắc ký đồ của TB, TP và CF với detector PDA 28 Hình 3.2 Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (250mm × 4,6mm ×
5μm) 28 Hình 3.3 Bước sóng hấp thụ quang cực đại và thời gian lưu của TB, TP và
CF 29 Hình 3.4 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 5 : 95 (v/v) 29 Hình 3.5 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 15 : 85 (v/v) 30 Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 25 : 75 (v/v) 30 Hình 3.7 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 35 : 65 (v/v) 30 Hình 3.8 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 45 : 55 (v/v) 30 Hình 3.9 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 55 : 45 (v/v) 31 Hình 3.10 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 65 : 35 (v/v) 31 Hình 3.11 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 75 : 25 (v/v) 31 Hình 3.12 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 85 : 15 (v/v) 31 Hình 3.13 Sắc ký đồ của hỗn hợp TB, TP, CF tỉ lệ pha động Na2HPO4 : ACN
= 95 : 5 (v/v) 32
Trang 11Hình 3.14 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở tốc độ dòng pha động 0,5
mL/phút 33
Hình 3.15 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở tốc độ dòng pha động 0,6 mL/phút 33
Hình 3.16 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở tốc độ dòng pha động 0,7 mL/phút 34
Hình 3.17 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở tốc độ dòng pha động 0,8 mL/phút 34
Hình 3.18 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở tốc độ dòng pha động 0,9 mL/phút 34
Hình 3.19 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở tốc độ dòng pha động 1,0 mL/phút 34
Hình 3.20 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở pH = 3 của pha động 36
Hình 3.21 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở pH =4 của pha động 36
Hình 3.22 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở pH = 5 của pha động 36
Hình 3.23 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở pH = 6 của pha động 36
Hình 3.24 Sắc ký đồ của TB, TP, CF ở pH = 7 của pha động 36
Hình 3.25 Sắc ký đồ của TB, TP, CF trong mẫu chè khi không rung siêu âm 37
Hình 3.26 Sắc ký đồ của TB, TP, CF trong mẫu chè khi rung siêu âm 10 phút 38
Hình 3.27 Sắc ký đồ của TB, TP, CF trong mẫu chè khi rung siêu âm 20 phút 38
Hình 3.28 Sắc ký đồ của TB, TP, CF trong mẫu chè khi rung siêu âm 30 phút 38
Hình 3.29 Sắc ký đồ của TB, TP, CF trong mẫu chè khi rung siêu âm 40 phút 38
Hình 3.30 Sắc ký đồ của TB, TP, CF trong mẫu chè khi rung siêu âm 50 phút 38
Trang 12Hình 3.31 Sắc ký đồ của TB, TP, CF trong mẫu chè khi rung siêu âm 60
phút 39 Hình 3.32 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak TB vào thời gian
rung siêu âm 39 Hình 3.33 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak TP vào thời gian
rung siêu âm 40 Hình 3.34 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak CF 40 vào thời gian rung siêu âm 40 Hình 3.35 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
peak của theobromine 43 Hình 3.36 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
peak của theophylline 43 Hình 3.37 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
peak của caffein 43 Hình 3.38 Sắc kỳ đồ 10 lần đo lặp của TB, TP và CF 45 Hình 3.39 Kết quả hàm lượng TB, TP và CF trong búp chè ở các xóm khác
nhau 49 Hình 3.40 Kết quả hàm lượng TB trong búp chè ở các xóm khác nhau 49 Hình 3.41 Kết quả hàm lượng TP trong búp chè ở các xóm khác nhau 49 Hình 3.42 Kết quả hàm lượng CF trong búp chè ở các xóm khác nhau 50 Hình 3.43 Kết quả hàm lượng TB, TP và CF trong lá bánh tẻ chè 51 Hình 3.44 Kết quả hàm lượng TB trong lá bánh tẻ chè ở các xóm khác nhau
51 Hình 3.45 Kết quả hàm lượng TP trong lá bánh tẻ chè ở các xóm khác
nhau 52 Hình 3.46 Kết quả hàm lượng CF trong lá bánh tẻ chè ở các xóm khác
nhau 52
Trang 13MỞ ĐẦU
Chè xanh là một thức uống bổ dưỡng, chứa nhiều hợp chất polyphenol có lợi cho sức khỏe nên được con người sử dụng hàng ngày Chè xanh gồm nhiều thành phần hóa học như: cafein, cacbohydrat, tanim, vitamin, acid amin, các polyphenol,… [24], [32], [34] Trong đó, các polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong chè xanh vì hàm lượng của chúng tương đối cao và có nhiều tác dụng đối với con người Nhiều kết quả nghiên cứu [6], [13], [14], [16], [27], [28], [32], [41] cho thấy hợp chất polyphenol trong chè xanh có hoạt tính sinh học như: hoạt tính chống oxy hóa, chống
xơ vữa động mạch, chống các bệnh về tim mạch, ngăn chặn sự phát triển của khối u, đặc biệt là ung thư da, bảo quản thực phẩm Bên cạnh, hoạt tính kháng oxi hóa, nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng, polyphenol có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây ngộ độc và gây thối hỏng thực phẩm Tuy nhiên, việc đẩy mạnh các nghiên cứu cơ chế và tìm cách ứng dụng các hoạt chất phenolic trong chè xanh vào
y học hiện đại mới chỉ bắt đầu từ nửa sau thế kỷ 20 Từ những năm 2000, các cơ sở nghiên cứu trong nước cũng bắt đầu tổ chức triển khai nghiên cứu công nghệ chiết xuất polyphenol từ chè xanh
Trong World atlas 2016, Việt Nam đứng thứ 6 trên thế giới về sản lượng chè được sản xuất hàng năm, trong đó tạo được công việc cho hơn ba triệu lao động Về xuất khẩu, Việt Nam nằm trong top 10 về xuất khẩu sản phẩm chè trên thế giới [23]
Tỉnh Thái Nguyên được mệnh danh là “Đệ nhất danh trà” Đất Thái Nguyên có nhiều điều kiện cho cây chè phát triển và nó thực sự trở thành một sản phẩm mang tính đặc thù của quê hương Khác với các vùng đất trồng chè khác trong nước, chè Thái Nguyên đã trở thành một “thương hiệu” nổi tiếng được người tiêu dùng đánh giá cao Chính vì vậy, việc đẩy mạnh đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đa dạng hóa sản phẩm chế biến, đồng thời cần nghiên cứu, chiết tách các chất có hoạt tính sinh học cao như polyphenol nhằm xác định và khẳng định nguồn gốc, xuất xứ chè xanh Thái Nguyên, nâng cao tính ổn định, phát triển sản xuất và nâng cao giá trị của cây chè Thái Nguyên là một việc làm hết sức cần thiết
Xuất phát từ các lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện luận văn “Nghiên
cứu xác định một số chất Phenolic trong chè xanh Tân Cương - Thái Nguyên”
Trang 14Mục đích của luận văn
Nghiên cứu, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xác định một số hợp chất phenolic (Caffeine, Theophylline, Theobromine) bằng phương pháp HPLC
Xác định được hàm lượng một số hợp chất phenolic (Caffeine, Theophylline, Theobromine) trong 20 mẫu chè xanh khu vực Thái Nguyên
Nội dung nghiên cứu
1 Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép phân tích xác định đồng thời Caffeine, Theophylline, Theobromine bằng phương pháp HPLC như: dung môi pha động, bước sóng, thời gian lưu, tốc độ dòng, thời gian rung siêu âm,…
2 Đánh giá độ đúng, độ chụm, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp thông qua việc phân tích mẫu chuẩn
3 Tiến hành phân tích hàm lượng Caffeine, Theophylline, Theobromine trong một số mẫu chè xanh tại khu vực Tân Cương – Thái Nguyên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trang 15Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về chè xanh
1.1.1 Nguồn gốc cây chè
Nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp, cho đến nay có nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sở lịch sử, khảo cổ học và thực vật học Một số quan điểm được nhiều người công nhận nhất là:
Một, cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam – Trung Quốc Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của cây chè là ở Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ấm; cách đây trên 4000 năm người Trung Quốc đã biết dùng chè làm dược liệu và sau đó là để uống
Hai, cây chè có nguồn gốc ở vùng Atxam - Ấn Độ Năm 1823, R Bruce đã phát hiện được những cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: nguyên sản của cây chè là ở vùng Axtam chứ không phải ở Vân Nam – Trung Quốc
Ba, cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam Những công trình nghiên cứu của Ddjemukhataaze (1961-1976) về phức catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau,
so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã rút ra kết luận nguốc gốc cây chè chính là ở Việt Nam
Tuy có sự khác nhau nhưng những quan điểm trên đều cho rằng: cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm [5]
1.1.2 Ứng dụng của chè xanh trong đời sống
Chè xanh được dùng làm đồ uống trong văn hóa ẩm thực châu Á Chè là sản phẩm chế biến từ búp, cuộng và các lá non thu hái từ cây chè
Trước đây, các tác dụng của chè thường được quy cho thành phần caffeine và vitamin C Từ khoảng thập niên 1970, các nghiên cứu sâu về hóa sinh và hợp chất thiên nhiên đã chứng minh những tác dụng về mặt dược lý và sinh lý của nhóm các hợp chất catechin trong chè Đã có nhiều công bố về tác dụng của các polyphenol chè xanh đối với các bệnh ung thư, tim mạch, tiết niệu, tiêu hóa, Alzheimer, bệnh Parkison, ; ngoài
ra polyphenol chè xanh còn có tác dụng làm giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phóng
Trang 16Theo nghiên cứu của các nhà khoa học ở trung tâm dinh dưỡng Unilever (Vlaerdingen, Hà Lan), một số bệnh viện đã đưa chè vào danh sách những thực phẩm có tính năng bảo vệ sức khoẻ Các nhà khoa học nhận thấy sau khi uống đều đặn mỗi ngày
3 chén nước chè, “khối lượng” và phạm vi hoạt động của gốc tự do oxy hóa trong huyết thanh của cơ thể đã giảm đi rõ rệt [32] Chè xanh có tác dụng giải khát, tăng cường chất dinh dưỡng và ngăn ngừa bệnh nhờ vào các chất có hoạt tính sinh học cao có trong lá chè Nó đã trở thành nguyên liệu quan trọng để chế biến nhiều loại thức ăn, đồ uống khác nhau như các loại bánh kem chè xanh, bánh gato chè xanh, sandwich chè xanh, được tiêu thụ mạnh ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ, Úc Trong đó, Nhật Bản là nước có nhiều loại đồ uống và thức ăn được chế biến với chè xanh nhất [25], [37] Trong
lá chè có chứa tới 20% tamin là một chất có tác dụng làm săn da, sát khuẩn mạnh Ngoài
có tác dụng như một vitamin P vì đây là hỗn hợp của các catechin và dẫn xuất của catechin có cấu trúc hóa học của vitamin P Chè được dùng pha nước uống, làm thuốc kích thích do cafein và chữa lỵ theo kê đơn thuốc đông y [6]
1.1.3 Thành phần hóa học của chè xanh
Thành phần hóa học của chè biến đổi rất phức tạp, nó phụ thuộc vào giống, điều kiện đất đai, địa hình, kĩ thuật canh tác; bao gồm tannin, caffeine, theobromine, theophylline, proteine, tinh dầu, men, sắc tố, pectin, vitamine, chất khoáng, axit hữu cơ, ; trong đó, tannin, caffeine, sắc tố, dầu thơm, pectin là những thành phần quan trọng quyết định màu sắc, hương vi ̣của sản phẩm [6], [42]
Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè, thường chiếm từ 75 - 82% trọng lượng búp Hàm lượng nước trong búp thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác và tiêu chuẩn thu hái,
Trong lá chè có chứa tới 20% tannin là một chất có tác dụng làm săn da, sát khuẩn mạnh [5] Tannin là tên chung để chỉ hỗn hơp̣ các chất polyphenol mà catechin
là thành phần chủ yếu Tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của gallic acid và digallic acid ở dạng tự do cũng như kết hợp với glucose Tannin trong chè tồn tại chủ yếu là dạng pyrocatechin Pyrocatechin là hỗn hợp polymer của catechin và leucoanthocyanidin
Trang 17Polyphenol là thành phần quan trọng nhất, quyết định chính đến màu sắc, hương
vị và tính chất dược lý của nước chè pha Thành phần chính của polyphenol chè là các hợp chất catechin Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của polyphenol chè không giống nhau mà thay đổi theo từng giống, tiêu chuẩn và mùa vụ thu hái, điều kiện vĩ độ, thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác, Các hợp chất polyphenol từ lâu đã được xem như là một trong các thông số quan trọng đầu tiên hay còn được coi là các chất chỉ thị của chè [33]
Tinh dầu trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè tươi vào khoảng 0,007 – 0,009% và trong chè bán thành phẩm khoảng 0,024 – 0,025% Protein chiếm khoảng 18% chất khô và có khoảng 17 loại amino acid Protein trong lá chè chủ yếu là dạng glutelin hoà tan trong kiềm Trong quá trình chế biến, protein và amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương và vị của nước chè pha Glucid trong chè rất
đa dạng, bao gồm các monosacharide (chiếm khoảng 1 - 2%) và các polysaccharide (chiếm 10 – 12%) Ở chè, các dạng đường tan trong nước có hàm lượng không nhiều nhưng rất cần thiết cho việc hình thành chất lượng đặc trưng của chè thành phẩm [11]
Trong chè có nhiều loại alkaloid - nhóm hợp chất vòng hữu cơ có chứa nitrogen trong phân tử Phần lớn các alkaloid là những chất không màu, có vị đắng và ít hòa tan trong nước Trong lá chè, người ta tìm thấy các alkaloid chủ yếu là caffeine, theobromine
và theophylline Trong đó, caffeine chiếm khoảng 2 – 5% lượng chất khô; theobromine và theophylline với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng của caffeine, chiếm khoảng 0,33% khối lượng chất khô Tuy vậy, vai trò của theobromine và theophylline trong dược tính của cây chè quan trọng hơn so với caffeine [18] Nhóm ankaloid này cũng góp phần tạo nên hương vị đắng của chè Mức độ của các hợp chất phụ thuộc vào giống,
độ tuổi và khí hậu của chè được sử dụng
1.2 Các hợp chất phenolic trong chè xanh
Các hợp chất phenolic là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật, rất đa dạng
về cấu trúc và chức năng Trong cây, nhìn chung hàm lượng của chúng ở các bộ phận khác nhau là khác nhau Các phenolic không hòa tan trong nước (lignin, hydroxycinnamic acid, ) thường là thành phần của thành tế bào, trong khi loại hòa tan thường cư trú ở không bào Nhóm các hợp chất phenolic là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong chè Nhờ các hợp chất này mà chất chiết từ chè xanh có những đặc
Trang 18tính quý giá như khả năng chống ung thư, chống oxy hóa, giảm cholesteron trong máu… Các hợp chất polyphenol trong chè chủ yếu là các hợp chất flavonoid, trong đó chia thành 5 nhóm chính: hợp chất catechin, hợp chất anthoxanthin, hợp chất anthocyanin, hợp chất leucanthocyanidin, các axit phenol cacboxylic và một số chất
khác
1.2.1 Giới thiệu về Caffeine
1,3,7-trimethylxanthine, nằm trong nhóm hợp chất Alkanloid Caffeine có thể coi là một hoạt chất chính của chè xanh, chủ yếu được tổng hợp từ lá chè chiếm khoảng 3-5% trọng lượng khô và hàm lượng ít biến đổi trong quá trình phát triển lá chè
Công thức cấu tạo:
Caffeine là một hoạt chất có dược tính Caffein kích thích não bộ và thúc đẩy trạng thái kích thích, tỉnh táo và tập trung Bởi vì nó ảnh hưởng đến não nên caffein thường được gọi là một loại thuốc thần kinh và có xu hướng phát huy tác dụng nhanh chóng Nó không tích tụ trong cơ thể theo thời gian sử dụng, thường bài tiết và thải ra ngoài sau vài giờ sử dụng
Caffein góp phần làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về não như Alzheimer và Parkinson; hỗ trợ tăng cường trao đổi chất và tăng tốc độ giảm cân; hỗ trợ tăng cường trao đổi chất và tăng tốc độ giảm cân; góp phần bảo vệ chống lại bệnh tim và tiểu đường loại 2 Caffeine cũng có thể làm tăng hiệu quả diệt tế bào ung thư của thuốc chống ung thư Các chất gây phá hủy DAN và có thể hỗ trợ trong việc khắc phục kháng thuốc tự nhiên Ngoài ra, caffein còn có nhiều tác dụng trong bảo vệ gan, bảo vệ da, tăng tuổi thọ, giảm nguy cơ mắc đa xương cứng, [21], [36]
Nếu sử dụng quá nhiều caffein sẽ gây nghiện, tạo ra cảm giác lo lắng, bồn chồn, run rẩy, nhịp tim không đều và khó ngủ Nó cũng có thể gây đau đầu, đau nửa đầu, huyết áp cao ở một số người, gây ra sự hoang mang, ảo giác, nôn hoặc có thể dẫn đến
tử vong do co giật Việc sử dụng đồng thời chất caffeine và thuốc lá cũng tạo thành một mối nguy hại đối với thai nhi phát triển Caffein có thể dễ dàng vượt qua nhau thai,
Trang 19có thể làm tăng nguy cơ sảy thai hoặc nhẹ cân, do đó phụ nữ mang thai nên hạn chế tiêu thụ caffein [26]
Ngoài ra, caffein làm giảm lượng paracetamol do đó làm giảm độc tính cho gan Caffeine cũng làm tăng epinephirine trong huyết tương, tăng tiêu thụ oxy và chuyển hóa carbonhydrate trong khi giảm quá trình chuyển hóa lipid Caffeine có rất nhiều tác dụng có lợi nhưng cũng có tác dụng phụ không mong muốn, do đó cần phải sử dụng caffein một cách hợp lí (tiêu thụ 400 mg caffein mỗi ngày) [35]
1.2.2 Giới thiệu về Theobromine
hợp chất Alkanloid
Công thức cấu tạo:
Theobromine là một chất kích thích thần kinh trung ương nhẹ, nhưng có tính lợi tiểu mạnh hơn, kích thích tim và làm giãn nở động mạch vành mạnh hơn caffein [34] Một nghiên cứu năm 2004 được công bố bởi Imperial College London kết luận theobromine có hiệu lực giảm ho vượt trội so với codeine bằng cách ức chế hoạt động của thần kinh phế vị [22], [45] Theobromine còn ức chế sự tăng doxorubicin từ các tế bào u, tăng nồng độ doxorubin trong u và nâng cao hiệu quả chống u của doxorubicin
Theobromine ức chế mạnh mẽ các tác nhân sinh u từ gốc urethane
Theobromine và theophyline cùng sinh ra hoạt tính chống viêm cao, chống lại
sự viêm cấp tính do acid acetic trong khi caffeine không có hoạt tính này [20]
1.2.3 Giới thiệu về Theophylline
hợp chất Alkanloid
Công thức cấu tạo:
Trang 20Theophylline thường được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị hơi thở nặng nề, tức ngực trong bệnh hen suyễn, viêm phế quản mạn tính, khí thủng phổi và một số bệnh
về phổi khác Thuốc có tác dụng mở rộng đường dẫn khí ở phổi, giúp bạn dễ thở hơn Với liều lượng thấp theophylline có tác dụng chống hen suyễn bằng việc tăng hoạt hóa của HDAC sau đó được tập hợp bởi corticosteroid để ngăn chặn các gene gây viêm [23] Nó còn có hoạt tính chống viêm thích hợp để điều trị hen phế quản, khi được thêm vào thuốc làm giãn phế quản và làm giảm hàng đờm
Theophyline làm tăng lượng glucocorticoid trong huyết thanh, được sử dụng như chất giãn cơ hoặc giãn mạch máu và cũng hiệu quả như là một chất kích thích lợi tiểu và tim mạch Nhưng nó có nguy cơ gây loét cao, tăng sự phát triển của sâu răng và
hiệu ứng này có thể liên quan đến cơ chế làm thay đổi thành phần của nước bọt
1.3 Giới thiệu về chè ở Tân Cương, Thái Nguyên
Thái Nguyên là tỉnh thuộc vùng Trung du và miền núi phía Bắc nơi hội tụ của nhiều giá trị tự nhiên và văn hóa Bên cạnh đó, Thái Nguyên còn là vùng đất nổi tiếng
về nghề truyền thống trồng, chế biến chè và được biết đến như một “Thủ đô chè” của Việt Nam Ở Thái Nguyên có tới 50 làng nghề chè nổi tiếng tập trung ở cả 9 huyện, thành phố, thị xã Từ lâu, chè Tân Cương đã được biết đến như một vùng chè nổi tiếng của Việt Nam nói chung và tỉnh Thái Nguyên nói riêng Chè Tân Cương thơm ngon nổi tiếng, được nhiều du khách trong và ngoài nước biết đến Cho đến nay, sản phẩm chè Tân Cương đã được xuất khẩu đi nhiều nước như: Pháp, Iran, Iraq, Algérie, Nhật Bản, Hoa Kỳ và các nước khác [43]
Xã Tân Cương nằm ở phía tây nam thành phố Thái Nguyên, cách trung tâm thành phố 12 km Gần khu du lịch Hồ Núi Cốc nổi tiếng; có vị trí địa lý: phía đông giáp
xã Thịnh Đức, phía tây giáp thị xã Phổ Yên, phía nam giáp thành phố Sông Công, phía
Trang 21bắc giáp xã Phúc Trìu Xã Tân Cương có tổng diện tích tự nhiên là 14,03 km2, gồm 12 xóm [44]
Các làng nghề chè truyền thống xã Tân Cương bao gồm Xóm Hồng Thái I (là một trong những làng nghề chè đầu tiên của thành phố, đứng đầu ở làng chè Tân Cương được đón nhận: búp chè vàng, bàn tay vàng), làng nghề chè xóm Hồng Thái II (làng nghề hình thành cách nay hơn 60 năm), xóm Soi Mít- xã Phúc Trìu, hợp tác xã Chè Minh Thu – xã Tân Cương, xóm Rộc Lầy – xã Tân Cương, xóm Khuôn II – xã Phúc Trìu, xóm Cây De – xã Phúc Trìu Đặc biệt, làng nghề chè Phúc Thuận – xã Phúc Trìu
có các chương trình giao lưu văn nghệ cho du khách thưởng thức các làn điệu hát Sli, hát then với đánh đàn tính để du khách được hòa nhập vào không gian văn hóa, đây thực sự là hoạt động để lưu giữ chân du khách
Xã Tân Cương có địa thế đồi núi phù hợp với phát triển cây chè Địa hình tại xã Tân Cương chủ yếu có dạng gò đồi và bát úp, độ cao trung bình 30m -100m so với mực nước biển, rải rác có một số đồi đỉnh tròn, cao khoảng 150m Loại đất chủ yếu ở Tân Cương là đất Feralit vàng đỏ; khí hậu đặc trưng của vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa với hai mùa rõ rệt Bên cạnh đó, còn có Sông Công thơ mộng cung cấp nguồn nước mát lành thuận lời về nguồn cung cấp nước tưới tiêu Vì vậy, chè búp Tân Cương có màu xanh đen, xoăn chặt, cánh chè gọn nhỏ, trên bề mặt cánh chè có nhiều phấn trắng Nước trà rất trong, xanh, vàng nhạt, sánh Nước chè có vị chát ngọt, dễ dịu, hài hòa, có hậu, gần như không cảm nhận có vị đắng Mùi chè thơm ngọt, dễ chịu Chất lượng bao gồm các chỉ tiêu về ngoại hình, màu nước, và đặc biệt về mùi thơm của trà Tân Cương là kết quả của quá trình chế biến rất tỉ mỉ, công phu do xử lý nhiệt tạo ra [3], [43]
1.4 Các công trình nghiên cứu về hợp chất phenolic trong chè xanh ở trong nước
và trên thế giới
1.4.1 Các công trình nghiên cứu về hợp chất phenolic trong chè xanh ở trong nước
Trong vài năm trở lại đây, tại Việt Nam, các nghiên cứu cũng tập trung vào xác định, phân tích, tách chiết hàm lượng phenolic trong các loại chè bằng nhiều phương pháp phân tích hiện đại khác nhau
Khi nghiên cứu về “Sự biến động của các hợp chất phenolic trong lá trà trong quy trình chế biến trà ô long” nhóm tác giả Nguyễn Ngọc Trâm [13] đã nhận thấy hàm
Trang 22lượng TPP dao động trong khoảng 7,0 - 12,0% hàm lượng chất khô; hàm lượng tannin tăng nhẹ ở giai đoạn làm héo, sau đó giảm nhẹ và gần như không đổi từ giai đoạn ủ 1 – quay thơm 2 do sau 2 lần quay thơm lá trà chịu sự cọ xát cơ học tạo điều kiện cho PPO tiếp xúc với cơ chất dẫn đến sự giảm đột ngột hàm lượng tannin ở mẫu trà Và có
sự biến động về tỉ lệ TF/TR biểu thị mối quan hệ tương quan với màu sắc (màu tổng) của dịch trà ô long
Tác giả Nguyễn Minh Thông [12] tiến hành “Nghiên cứu cấu trúc, khả năng
pháp hóa tính toán” và đã thiết kế được các hợp chất chống oxy hóa mới từ fullerene
và hợp chất phenolic có nguồn gốc thiên nhiên bằng phản ứng Bingel-Hirsch Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất này được khảo sát thông qua các thông số đặc trưng
là BDE, IE và EA Kết quả nghiên cứu trên cho thấy các dẫn xuất fullerene mới có khả năng chống oxy hóa rất cao vì đã kết hợp được cả tính chất của fullerene và hợp chất phenolic
Nhóm tác giả Trần Thị Huế [4] và các cộng sự đã tiến hành “Phân tích và đánh giá hàm lượng Caffeine, Theobromine và Theophyline trong các loại chè xanh Việt Nam có nguồn gốc địa lý khác nhau” bằng phương pháp HPLC và đã thấy rằng phương pháp xác định đồng thời TB, TP và CF trong mẫu chè ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam
và Lâm Đồng bằng phương pháp HPLC có độ nhạy cao, phương pháp xử lý mẫu đơn giản Hàm lượng các chất là khác nhau theo vùng địa lý
Tác giả Phạm Thị Ngọc Mai [8] và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Xác định hàm lượng polyphenol và EGCG trong chè, sản phẩm chè bằng phương pháp UV-Vis và HPLC” Kết quả phân tích một số mẫu chè cho thấy có mối liên hệ nhất định giữa hàm lượng polyphenol tổng và EGCG Từ đó, có thể đề xuất sử dụng các chỉ tiêu này để đánh giá chất lượng chè Phương pháp UV-Vis phù hợp để xác định tổng hàm lượng polyphenol và phương pháp HPLC phù hợp để xác định hàm lượng EGCG và
có thể mở rộng ra đối với các chất riêng biệt trong các hợp chất polyphenol
Khi tiến hành “Nghiên cứu khả năng thủy phân lá chè xanh bằng enzyme và ứng dụng để chiết tách polyphenol” của nhóm tác giả Lành Thị Ngọc [10] bước đầu cho thấy việc tiền xử lý nguyên liệu chè xanh bằng enzyme laccase làm tăng đáng kể hiệu
Trang 23suất thu hồi polyphenol (hiệu suất > 95,0% so với 83,63% khi không sử dụng enzyme) Đồng thời, quá trình sử dụng enzyme không làm biến đổi chất lượng EGCG - thành phần nhạy cảm và có hoạt tính tốt nhất trong các polyphenol từ chè xanh
Nhóm tác giả Trịnh Thị Chung [2] và cộng sự đã tiến hành “Nghiên cứu phương pháp trích ly thu hồi dịch chè cho chế biến sản phẩm bột chè hòa tan từ lá ché già Trung
du Thái Nguyên”, kết quả trích ly dịch chè hòa tan từ lá chè già bằng phương pháp trích ly xay – nấu cho hiệu suất trích ly và nồng độ chất tan cao nhất Thông số được chọn với thời gian 15 phút trích ly với tỷ lệ nước: dung dịch xay là 1: 3 được phối trộn thêm nước ở tỷ lệ 1: 7
1.4.2 Các công trình nghiên cứu về hợp chất phenolic trong chè xanh trên thế giới
Khi tiến hành “Xác định theobromine, theophylline và caffeine trong các sản phẩm phụ của cupuacu và hạt cacao bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, nhóm tác giả F Lo Coco [17] đã rút ra kết luận các điều kiện tối ưu của phương pháp HPLC như thể tích pha động của methanol: nước: axit axetic là 80: 19: 1 (v/v), tốc độ dòng 1,0 mL/phút, bước sóng 275,0 nm; thời gian rửa giải đối với các chất phân tích là dưới 10 phút và giới hạn phát hiện của các chất là 0,1 mg/g Lượng theobromine và caffeine được tìm thấy trong tất cả các mẫu cupuacu thấp hơn so với cacao Theophylline được tìm thấy trong tất cả các mẫu cacao (trừ bột đã rang) và nó chỉ được tìm thấy ở bột đã rang trong các mẫu cupuacu
Nhóm tác giả B Srdjenovic [39] và cộng sự khi nghiên cứu “Xác định đồng thời caffeine, theobromine và theophylline bằng phương pháp HPLC trong thực phẩm, đồ uống và các sản phẩm thảo dược” đã thực hiện trên cột Zorbax Eclipse XDB-C8 (4,6
(0,1% THF trong nước, pH = 8,0) - acetonitril là 90: 10 (v/v); tốc độ dòng chảy là 0,8 mL/phút và đo độ hấp thụ UV ở bước sóng 273,0 nm; giới hạn phát hiện là 0,07 - 0,2 mg/L và độ thu hồi là 100,20 - 100,42% Hệ số tương quan, đối với đường chuẩn trong khoảng tuyến tính 0,2-100,0 mg/L; > 0,9999 đối với tất cả các hợp chất Độ chính xác trong và giữa ngày được xác định cho cả thời gian lưu và diện
tích đỉnh
Trang 24Khi tiến hành “Phân tích định lượng các thành phần chính trong trà xanh qua các thời gian thu hoạch khác nhau và hoạt tính chống oxy hóa của chúng”, nhóm tác giả Lan – Sook Lee [24] và các cộng sự đã rút ra kết luận chè xanh được chế biến từ lá hái từ cuối tháng 4 năm 2013 đến cuối tháng 5 năm 2013 trong khoảng thời gian một tuần hoặc lâu hơn, hàm lượng Theanine, Theobromine, Caffeine, Catenchin và Gallocatechin giảm đi đáng kể; trong khi đó hàm lượng Epigallocatechin gallate và epigallocatechin lại tăng lên trong cùng thời gian thu hoạch lá chè Các hoạt tính chống oxy hóa của trà xanh phụ thuộc vào thành phần hóa học của chúng, đặc biệt là dạng catechin
Tác giả Pereira VP [32] đã “Xác định các hợp chất phenolic và hoạt tính chống oxy hóa của các loại trà xanh, đen và trắng thuộc họ Camellia sinensis (L.) Kuntze, Theaceae” bằng phương pháp HPLC - DAD và rút ra kết luận hàm lượng phenolic và flavonoid khác nhau giữa các thương hiệu trà; các loại trà xanh và trắng có hàm lượng phenolic và flavonoid cao hơn các loại trà đen
Nhóm tác giả Cai – Ning Zhao [16] và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Cấu hình phenolic và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết 30 loại trà từ xanh, đen, Ô long, trắng, vàng và màu sẫm” Kết quả cho thấy các hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết 30 loại trà được đánh giá bằng cách sử dụng khả năng chống oxy hóa khử sắt (FRAP) và xét nghiệm khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC) Tổng hàm lượng phenolic trong trà được phát hiện bằng xét nghiệm Folin – Ciocalteu và nằm trong khoảng 24,77 ± 2,02 đến 252,65 ± 4,74 mg Các hợp chất phenolic trong dịch chiết trà đã được xác định và định lượng, trong đó catechin là chính
Chile được coi là nước tiêu thụ chè lớn nhất ở Mỹ; do đó, rất nhiều loại chè và thương hiệu có sẵn trên thị trường Chile Khi nghiên cứu “Các hợp chất phenolic, khả
năng chống oxy hóa và khả năng ức chế α-amylase của dịch chiết chè (Camellia sinensis) được thương phẩm ở Chile”, Ana Maria Quesille [14] kết luận rằng nhóm trà
xanh và trắng có tổng hàm lượng phenolic cao hơn so với trà đỏ và đen Các hợp chất phenol được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng trong trà xanh và trắng là EGCG
và ECCG; axit gallic chủ yếu trong trà đen, đỏ và ô long Caffeine có trong tất cả các mẫu trà Hàm lượng phenolic có sự khác nhau giữa các loại chè và ở các thương hiệu khác nhau là khác nhau
Trang 25Tác giả Jose Manuel Lorenzo [27] đã tiến hành nghiên cứu “Hợp chất phenolic
từ trà xanh: Lợi ích sức khỏe và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” Kết quả cho thấy hàm lượng phenolic trong chè cao có tác dụng tích cực đến sức khỏe và có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh bằng cơ chế chống oxy hóa Việc chiết xuất polyphenol trong trà xanh có hoạt tính chống oxy hóa Riêng đối với thịt và các sản phẩm từ thịt, chất chống oxy hóa tự nhiên có tác động tích cực làm tăng thời hạn sử dụng và ổn định lipid
Khi tiến hành nghiên cứu “Xác định các điều kiện chiết xuất hợp chất phenolic
từ lá Pistacia palaestina ở hai giai đoạn trưởng thành khác nhau” ở Syria, tác giả Wissam Zam [40] đã rút ra kết luận hàm lượng phenolic và AA% cao nhất được tìm thấy ở lá tươi (tương ứng là 14,32g/100g và 92,69%) Dung môi chiết xuất tối ưu để thu hồi phenol và khả năng chống oxy hóa là axeton 40% Những thay đổi cả về nhiệt
độ (25, 40, 60 và 80°C) và thời gian (15, 30, 45 và 60 phút) không có ảnh hưởng đáng
kể đến TPC và AA% của chiết xuất Pistacia Các hợp chất phenolic có thể được chiết xuất trong thời gian ngắn ở nhiệt độ thấp và có thể được sử dụng làm chất chống oxy hóa tự nhiên
Tác giả Luz Stella [28] đã “Nghiên cứu so sánh khả năng chống oxy hóa trong trà xanh bằng cách chiết xuất ở các nhiệt độ khác nhau của bốn thương hiệu được bán tại Colombia” Bốn hiệu thương trà xanh là Oriental, Lipton, Hindú, Jaibel được sử dụng
Folin-Ciocalteu; tổng hàm lượng flavonoid (TFC) được xác định bằng phương pháp đo quang phổ và khả năng chống oxy hóa được xác định bằng hai phương pháp: xét nghiệm bắt gốc DPPH và xét nghiệm khả năng hấp thụ gốc oxy (ORAC) Cuối cùng, định lượng catechin của dịch chiết chè bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Qua tham khảo các tài liệu [4], [17], [29], [31], chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography- HPLC; còn được gọi là Sắc ký lỏng cao áp) để phân tích hàm lượng của một số hợp chất phenolic trong chè xanh Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích
Trang 26hiện đại trong hóa học phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp [1]
Phương pháp HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu Thành phần hoạt động của cột, chất hấp phụ, tiêu biểu là một vật liệu cấu trúc hạt làm từ những hạt rắn như silica hay polymers, có kích thước trong khoảng 2-50 µm Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động" Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên những tương tác xảy
ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột
Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn Sau khi chuyển tới cuối cột tách được chuyển tới detector để phát hiện Tùy thược vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau Dựa vào sắc ký đồ của chất phân tích để định lượng các chất phân tích đó [7]
HPLC là một trong những phương pháp sắc ký hiệu quả và ấn tượng nhất đã được sử dụng rộng rãi để tách, xác định và định lượng các hợp chất phenolic, đặc biệt
là phương pháp sắc kí khí (GC) Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của HPLC như pha động, loại cột, máy dò, độ tinh khiết mẫu, detector Thông thường, các hợp chất phenolic khác nhau có thể được phân tách bằng cách sử dụng cột C18 khi có mặt các dung môi khác nhau có độ phân cực khác nhau Ngoài ra, pH của pha động phải được ổn định để tránh sự ion hóa của các hợp chất phenol [38]
Trong HPLC, sắc ký lỏng hiệu năng cao-khối phổ (HPLC-MS), có tính chọn lọc cao và có giới hạn phát hiện thấp và thời gian phân tích ngắn hơn Ngày nay, người ta còn kết hợp phương pháp HPLC-DAD và HPLC-MS/MS để định lượng các phenolic Phương pháp này nhanh chóng, chính xác và nhạy bén Ngoài ra, cũng có thể sử dụng phương pháp HPLC-UV đối với các hợp chất phenolic có phổ UV, lúc này việc lựa
Trang 27chọn bước sóng là điểm quan trọng nhất Hay HPLC với phát hiện huỳnh quang (HPLC-FLD), là một phương pháp hiệu quả để xác định và định lượng các hợp chất phenolic có phổ huỳnh quang Độ nhạy của detector huỳnh quang cao hơn 10 – 1000 lần so với detector UV HPLC với phát hiện điện hóa dựa trên phản ứng oxy hóa khử của các hợp chất phenolic Phương pháp này nhanh chóng, chi phí thấp, giới hạn phát hiện chính xác và thấp của các hợp chất phenol [38]
Trang 28Chương 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
- Máy rung siêu âm Elmasonic S 100 H (hãng Elma, Đức)
Hình 2.2 Máy rung siêu âm Elmasonic S 100 H
Có thể điều khiển quá trình ghi đo trên máy bằng các chương trình đo cụ thể do người đo thực hiện dưới dạng các câu lệnh
Trang 29Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các dụng cụ thủy tinh như: bình định mức, pipet, cốc thủy tinh, bình tam giác, chai lọ đựng hóa chất đều được rửa sạch, sau đó tráng lại bằng nước cất một lần, cuối cùng là tráng bằng nước cất hai lần và làm
khô trước khi dùng
2.1.2 Hóa chất
Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo, các loại hóa chất được sử dụng đều là hóa
Theophylline, Theobromine loại PA của Sigma; nước cất sử dụng là nước cất hai lần
Các dung dịch pha chế:
+ Dung dịch cafein (CF) (M = 194,19 g/mol) chuẩn 500ppm: Cân chính xác 0,005g
CF chuẩn, rồi định mức bằng nước cất hai lần trong bình định mức 10mL
+ Dung dịch theophylline (TP) (M = 180,164 g/mol) chuẩn 500ppm: Cân chính xác 0,005g TP chuẩn, rồi định mức bằng nước cất hai lần trong bình định mức 10 mL
+ Dung dịch theobromine (TB) (M = 180,164 g/mol) chuẩn 500ppm: Cân chính xác 0,005g TB chuẩn, rồi định mức bằng methanol 50% trong bình định mức 10 mL
Các dung dịch chuẩn được rung siêu âm để đảm bảo chất chuẩn tan hết Chuẩn
Từ các dung dịch chất chuẩn gốc 500 ppm, chuẩn bị các dung dịch chất chuẩn
có nồng độ lần lượt là 100 ppm; 90 ppm; 80 ppm; 70ppm; 60 ppm; 50 ppm ; 40 ppm;
30 ppm; 20 ppm; 10 ppm; 5 ppm; 2 ppm; 1 ppm; 0,5 ppm và 0,1 ppm bằng cách pha loãng trong dung môi tương ứng
mức 100 mL, rồi định mức với nước cất hai lần đến vạch định mức
mL, rồi định mức với nước cất hai lần đến vạch định mức
định mức bằng nước cất hai lần trong bình định mức 100 mL
Trang 30+ Dung dịch Na2HPO4 0,02M: Hòa tan 3,56g Na2HPO4 rắn bằng nước cất hai
lần, rồi định mức bằng nước cất hai lần đến thể tích 1000 mL trong bình định mức 1000
mL
kiểm tra lại giá trị pH trên máy đo pH
2.2 Thực nghiệm
2.2.1 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình xác định đồng thời
TB, TP và CF bằng phương pháp HPLC
2.2.1.1 Khảo sát lựa chọn detector
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp, do nó phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng
Qua tham khảo các tài liệu [8], [10], [16], [24] kết hợp với các detector hiện có đi kèm hệ thống HPLC của Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên, chúng tôi lựa chọn detector Photodiode Array (PDA) Detector PDA cho phép theo dõi đồng thời nhiều thành phần hấp thụ ở các bước sóng khác nhau, với ít thời gian và giảm chi phí cho các dung môi đắt tiền
2.2.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng
Trong phép phân tích đồng thời, việc chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết định trực tiếp đến độ nhạy của phép phân tích Chính vì vậy, sau khi chọn được detector PDA, chúng tôi tiến hành quét phổ và tìm bước sóng tối ưu cho mỗi chất cần phân tích
2.2.1.3 Khảo sát lựa chọn pha tĩnh
Pha tĩnh trong HPLC là một yếu tố quan trọng quyết định sự tách hỗn hợp chất Bản chất pha tĩnh quyết định đến cơ chế tách và khả năng lưu giữ chất Tuỳ thuộc vào đối tượng phân tích mà ta chọn cột tách có pha tĩnh và kích thước hạt thích hợp Pha tĩnh thông dụng nhất là silicagel có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân cực (hay được gọi
sử dụng loại cột chứa pha tĩnh này
Trang 31Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu [15], [19], [30] xác định đồng thời theobromine, theophylline và caffeine sử dụng pha tĩnh là C18 và kết quả các công trình này cũng cho thấy sử dụng pha tĩnh cột C18 có khả năng tách các chất tốt và chọn lọc; cho hình ảnh peak tách tốt, ít doãng, nhọn và cân đối, thích hợp cho phân tích được
nhiều chất
Vì vậy, chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18 với đường kính hạt pha tĩnh là 5 μm, chiều dài cột tách 250 mm và đường kính cột 4,6 mm để tìm các điều kiện khác tối ưu
hóa việc tách để xác định đồng thời TB, TP và CF
2.2.1.4 Khảo sát lựa chọn tỷ lệ pha động
Ba chất theobromin, theophylline và cafein là các hợp chất không phân cực nên muốn tách chúng ra khỏi các chất cản trở trong nền mẫu, định lượng chúng dễ dàng và chính xác, phải lựa chọn pha động phù hợp Qua tham khảo các tài liệu [4], [9], [31], [39], cũng như dựa trên tính chất của các chất phân tích, chúng tôi lựa chọn pha động
(5 : 95; 15 : 85; 25 : 75; 35 : 65; 45 : 55; 55 : 45; 65 : 35; 75 : 25; 85 :15 và 95 : 5) với các điều kiện đã lựa chọn ở trên bằng phương pháp HPLC
2.2.1.5 Khảo sát và lựa chọn tốc độ pha động
Tốc độ pha động cũng là yếu tố quyết định đến quá trình rửa giải các chất trong cột sắc ký Tốc độ pha động được định nghĩa là số mL dung dịch pha động chảy qua cột tách trong một đơn vị thời gian, tức là số mL/phút của pha động
Để lựa chọn tốc độ dòng pha động phù hợp cho phép xác định đồng thời TB, TP
và CF, chúng tôi đã khảo sát hỗn hợp TB, TP và CF có nồng độ bằng nhau và bằng 20 ppm ở các tốc độ dòng pha động khác nhau lần lượt là 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 và 1,0 mL/phút
2.2.1.6 Khảo sát và lựa chọn pH của pha động
Độ pH của pha động có thể ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu và hình dạng đỉnh của peak sắc ký vì nó ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của chất phân tích, dẫn đến sự tương tác xảy ra trong cột Khi pH thay đổi, thời gian lưu của chất phân tích trên cột cũng thay đổi Chính vì vậy, cần khảo sát lựa chọn giá trị pH thích hợp của dung môi trong pha động để quá trình phân tích đạt hiệu suất cao nhất
Trang 32Để khảo sát và lựa chọn pH thích hợp cho pha động, chúng tôi tiến hành chuẩn
5,0; 6,0; 7,0 như sau:
4,0; 5,0; 6,0; 7,0 (đã được điều chỉnh ở trên) với ACN có tỷ lệ tương ứng là 85 : 15 (v/v)
+ Tiến hành ghi đo sắc ký đồ của hỗn hợp TB , TP và CF có nồng độ bằng nhau
= 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0) với ACN có tỷ lệ tương ứng là 85 : 15 (v/v), tốc dộ dòng là 1,0 mL/phút và thể tích bơm mẫu 10,0 µL
2.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình xác định đồng thời TB,
TP và CF trong mẫu chè bằng phương pháp HPLC
Ở đây, chúng tôi khảo sát để lựa chọn thời gian rung siêu âm thích hợp cho quá trình xác định đồng thời TB, TP và CF trong các mẫu chè thực bằng phương pháp HPLC
Cân chính xác 1,00 gam những mẫu chè khác nhau trên cân phân tích, chuyển mẫu phân tích vào các bình eclen có nút nhám Thêm vào mỗi bình 100mL nước cất 2 lần đã được đun sôi Tiến hành chiết suất theobromine, theophylline và caffein bằng máy rung siêu âm ở các thời gian khác nhau lần lượt là 0, 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút Sau đó để lắng, lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến hành ghi đo sắc ký đồ của dung dịch mẫu chè thu được với các điều kiện khảo sát ở trên
2.2.3 Đánh giá phương pháp phân tích
2.2.3.1 Đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký
Để đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký, chúng tôi đã tiến hành như sau:
- Ghi đo trên máy HPLC lặp lại 10 lần của hỗn hợp dung dịch chuẩn TB, TP và
CF đều có nồng độ bằng nhau và bằng 20ppm
- Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các chất qua các thông số: thời gian lưu, diện tích peak:
Trang 33+ Giá trị trung bình : x = 1
n⋅ ∑ni=1xi (2.1)
kết quả của mỗi lần thí nghiệm
X− ⋅ 100 (2.3)
- So sánh RSD (%) vừa tính với RSD (%) ở bảng 2.1 và RSD (%) vừa tính không
được lớn hơn trị giá RSD (%) cho phép ở hàm lượng chất tương ứng, độ chụm thay đổi
theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn
Bảng 2.1 Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC
Trang 34Chuẩn bị một dãy dung dịch chất chuẩn của hỗn hợp ba chất TB, TP và CF có nồng độ từ 0,5 ppm đến 100 ppm được pha từ dung dịch chuẩn 500 ppm đã được chuẩn
bị trước đó Rồi tiến hành chạy sắc ký đồ của hỗn hợp 3 chất cần phân tích trong các điều kiện tối ưu đã lựa chọn bằng phương pháp HPLC
Sau đó, khảo sát khoảng nồng độ của hỗn hợp ba chất phân tích, trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích peak chất phân tích/diện tích peak nội chuẩn với nồng độ của chất đó bằng phần mền Microsoft Excel Chúng tôi thu được phương trình đường chuẩn có dạng:
Phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b (2.4)
Trong đó : y là tỷ lệ diện tích peak chất phân tích/diện tích peak nội chuẩn
x là nồng độ chất khảo sát Sau khi xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan (R): hệ số tương quan hồi quy, R phải đạt theo yêu cầu:
2.2.3.3 Giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD)
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích có ý nghĩa với tín hiệu phân tích mẫu trắng hay tín hiệu nền Đây là một đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân tích Nếu chất nào có độ nhạy hơn thì có giới hạn phát hiện nhỏ
Dựa vào kết quả tính độ lệch chuẩn qua 10 lần đo lặp lại và áp dụng
Trong đó, nồng độ mẫu chuẩn là C
Từ đó, chúng tôi tính được giới hạn phát hiện của các chất
2.2.3.4 Giới hạn định lượng (Limit of Quantification - LOQ)
Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu
Dựa vào giới hạn định lượng, tính giới hạn phát hiện (LOQ) theo công thức:
Trang 352.2.3.5 Độ chụm (độ lặp lại)
Độ chụm (độ lặp lại) phản ánh sự phù hợp giữa các kết quả thu được trong các lần thí nghiệm lặp lại ở trong cùng một điều kiện thực nghiệm quy định của phép đo Kết quả
đo có thể có độ chụm cao nhưng không đúng hoặc ngược lại
Để đánh giá độ chụm của phép đo, chúng tôi tiến hành ghi đo sắc ký đồ lặp lại
10 lần của hỗn hợp dung dịch chuẩn theobromine, theophylline và caffein có nồng độ bằng nhau và bằng nồng độ 20ppm; sau đó tính độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của hàm lượng chất phân tích
So sánh RSD (%) vừa tính với RSD (%) ở bảng 2.1 Trong đó, RSD (%) vừa
tính không được lớn hơn trị giá RSD (%) cho phép ở hàm lượng chất tương ứng, độ
chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn
2.2.3.6 Độ đúng (độ thu hồi)
Một phương pháp phân tích tốt ngoài đánh giá về độ lặp còn đánh giá về độ đúng của phương pháp Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực hoặc được chấp nhận thực
Để đánh giá độ thu hồi của phép đo, chúng tôi đã tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn các nồng độ chuẩn 5ppm TB; 5ppm TP và 20ppm CF vào trong mẫu chè thực; rồi ghi đo sắc ký đồ trên máy HPLC Dựa trên các kết quả thu được tính độ thu hồi (R%) theo công thức sau:
Sau khi tính độ thu hồi, so sánh kết quả với các giá trị cho trong bảng 2.2 dưới đây
Trang 36Bảng 2.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC
TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi %
độ chất tương ứng
2.3 Phân tích mẫu thực
2.3.1 Địa điểm và thời gian lấy mẫu
Việc xác định vị trí lấy mẫu và vùng lấy mẫu tùy thuộc vào mục đích của phép phân tích Mục đích của đề tài là xác định được hàm lượng một số hợp chất phenolic (Theobromine, Theophylline, Caffeine) trong chè xanh tại một số địa điểm khác nhau thuộc địa bàn xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên Từ đó, có thể có những nhận xét
sơ bộ về sự phân bố hàm lượng TB, TP và CF trong chè xanh ở cùng một xóm hay các xóm khác nhau với kỹ thuật canh tác, chăm bón khác nhau
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở các địa điểm khác nhau thuộc xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên Địa điểm cụ thể được trình bày hình 2.3 và bảng 2.3