Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và làm lành vết loét của keo fibrin tự thân trộn cefazolin trên thỏ thực nghiệm

44 Trang 11 MỞ ĐẦU Dựa trên quá trình đông máu tự nhiên của cơ thể các nghiên cứu đã tìm cách tách chiết, cố gắng thu thập được lượng fibrinogen và thrombin trong huyết tương nhiều chất

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ LÀM LÀNH VẾT LOÉT CỦA KEO FIBRIN TỰ THÂN TRỘN CEFAZOLIN

TRÊN THỎ THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ LÀM LÀNH VẾT LOÉT CỦA KEO FIBRIN TỰ THÂN TRỘN CEFAZOLIN

TRÊN THỎ THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Thu Soan Trường Đại học Y - Dược, ĐH Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Hoàng Thu Soan Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 8 năm 2021

Tác giả

Phạm Thị Thu Hương

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thu Soan, Bộ môn Sinh lý học, Khoa Y học cơ sở, Trường Đại học Y – Dược, Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa Công nghệ sinh học

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý học, Sinh lý bệnh – Miễn dịch, Vi sinh, Trường Đại học Y – Dược, Đại học Thái Nguyên

Tôi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè để tôi hoàn thành bản luận văn

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 8 năm 2021

Tác giả

Phạm Thị Thu Hương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Quá trình đông máu 3

1.2 Hai thành phần cơ bản của keo fibrin 4

1.2.1 Đặc điểm của fibrinogen 4

1.2.2 Đặc điểm của thrombin 5

1.3 Phương pháp tách chiết các thành phần keo fibrin 7

1.3.1 Phương pháp tách chiết fibrinogen tự thân 7

1.3.2 Phương pháp tạo thrombin tự thân 8

1.4 Tình hình nghiên cứu keo fibrin trên thế giới 9

1.4.1 Sự ra đời của keo fibrin 9

1.4.2 Ứng dụng của keo fibrin 10

1.5 Tình hình nghiên cứu keo fibrin ở Việt Nam 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.1.1 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 17

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.3 Xử lý số liệu 18

2.2 Địa điểm và thời gian 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 18

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 1 18

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 2 21

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 3 22

2.3.5 Sơ đồ nghiên cứu 24

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 26

3.1 Qui trình tạo keo fibrin tự thân bằng phương pháp gây đông lạnh 26

3.2 Khả năng kháng khuẩn của keo fibrin kết hợp với kháng sinh Cefazolin 29

3.3 Hiệu quả cầm máu và làm lành vết thương cắt da và vết loét của keo fibrin tự thân 35

3.3.1 Hiệu quả cầm máu và làm lành vết thương của keo fibrin tự thân 35

3.3.2 Hiệu quả làm lành vết loét của keo fibrin tự thân 40

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 46

4.1 Qui trình tạo keo fibrin tự thân bằng phương pháp gây đông lạnh 46

4.2 Khả năng kháng khuẩn của keo fibrin kết hợp với kháng sinh Cefazolin 49

4.3 Hiệu quả cầm máu, làm lành vết thương và vết loét của keo fibrin tự thân 53

KẾT LUẬN 56

1 Qui trình tạo keo fibrin tự thân bằng phương pháp gây đông lạnh huyết tương 56

2 Khả năng kháng khuẩn của keo fibrin kết hợp với kháng sinh Cefazolin 56

3 Hiệu quả cầm máu, làm lành vết thương và vết loét của keo fibrin tự thân 56

KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 62

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Fib Fibrinogen Cef Cefazolin

OXP Oxaliplatin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Nồng độ fibrinogen (fib) thu được sau 2 giờ ở nhiệt độ -180C, -350C và -800C 26

Bảng 3.2 Nồng độ fibrinogen (fib) thu được theo thời gian gây đông ở nhiệt độ -180C 27

Bảng 3.3 Nồng độ fibrinogen (fib) thu được theo thời gian gây đông ở nhiệt độ -350C 27

Bảng 3.4 Thời gian thu thập thrombin và hình thành keo fibrin 28

Bảng 3.5 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn Gram dương của các chế phẩm 29

Bảng 3.6 Đường kính vùng ức chế Gram âm của các chế phẩm 30

Bảng 3.7 Thời gian cầm máu của các chế phẩm keo fibrin 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh 4

Hình 1.2 Sơ đồ mô phỏng cấu trúc fibrinogen của con người 5

Hình 1.3 Vai trò của thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin 6

Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hóa prothrombin thành thrombin và sự trùng hợp fibrinogen tạo thành các sợi fibrin 6

Hình 3.1 Qui trình tạo keo fibrin tự thân bằng phương pháp gây đông lạnh được thể hiện bằng sơ đồ sau 28

Hình 3.2 Tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm ở thời điểm 3 giờ 31

Hình 3.3 Tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm ở thời điểm 6 giờ 32

Hình 3.4 Tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm ở thời điểm 12 giờ 32

Hình 3.5 Tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm ở thời điểm 24 giờ 33

Hình 3.6 Tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm ở thời điểm 48 giờ 34

Hình 3.7 Tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm ở thời điểm 72 giờ 34

Hình 3.8 Hình ảnh cầm máu của keo fibrin 35

Hình 3.9 Hình ảnh vết thương cắt da sau 1 giờ 36

Hình 3.10 Hình ảnh vết thương cắt da sau 24 giờ 36

Hình 3.11 Hình ảnh vết thương cắt da sau 3 ngày 37

Hình 3.12 Hình ảnh vết thương cắt da sau 5 ngày 37

Hình 3.13 Hình ảnh vết thương cắt da sau 7 ngày 38

Hình 3.14 Hình ảnh vết thương cắt da sau 10 ngày 38

Hình 3.15 Hình ảnh vết thương cắt da sau 14 ngày 39

Hình 3.16 Hình ảnh vết thương cắt da sau 20 ngày 39

Hình 3.17 Hình ảnh tạo vết loét 40

Hình 3.18 Hình ảnh vết loét ngay sau khi đổ các chế phẩm keo fibrin 40

Hình 3.19 Hình ảnh vết loét sau 1giờ 41

Hình 3.20 Hình ảnh vết loét sau 24 giờ 41

Hình 3.21 Hình ảnh vết loét sau 3 ngày 42

Hình 3.22 Hình ảnh vết loét sau 5 ngày 42

Hình 3.23 Hình ảnh vết loét sau 7 ngày 43

Hình 3.24 Hình ảnh vết loét sau 10 ngày 43

Hình 3.25 Hình ảnh vết thương sau 14 ngày 44

Hình 3.26 Hình ảnh vết thương sau 20 ngày 44

Hình 3.27 Hình ảnh vết thương sau 30 ngày 45

MỞ ĐẦU

Dựa trên quá trình đông máu tự nhiên của cơ thể các nghiên cứu đã tìm cách tách chiết, cố gắng thu thập được lượng fibrinogen và thrombin trong huyết tương nhiều chất cô đặc để tạo ra keo fibrin Với chức năng là một loại keo sinh học, giúp cầm máu và gắn kết mô, bịt kín vết thương, keo fibrin được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực phẫu thuật như cắt mộng ghép kết mạc, phẫu thuật cột sống… Có nhiều phương pháp thu thập fibrinogen và thrombin Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng Ví dụ, phương pháp tách fibrinogen có sử dụng protamin cho kết quả nhanh và hiệu quả, nhưng chưa kiểm chứng được sự ảnh hưởng của thuốc lên keo fibrin

Hiện nay, các công ty thương mại đã thu thập các thành phần của keo từ huyết tương của động vật (bò, ngựa…) hoặc máu của nhiều người gộp lại, điều này tiềm

ẩn nguy cơ lây các bệnh qua đường máu Vì vậy, xu hướng mới được các nghiên cứu tập trung gần đây là sản xuất keo fibrin tự thân Nghĩa là sản phẩm keo tạo ra được dùng cho chính đối tượng đó, nhằm giảm nguy cơ lây truyền, giảm phản ứng của cơ thể với keo khác loài Một số công bố thực tế cho thấy đã tách chiết được fibrinogen từ chính máu của người đó, nhưng lại sử dụng thrombin thương mại để tạo keo fibrin, vậy bản chất của keo vẫn không hoàn toàn mang nghĩa tự thân

Các nghiên cứu về tác dụng của keo fibrin gần đây cũng chỉ ra, keo fibrin còn đóng một vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình lành vết thương

do fibrin và fibrinogen rất quan trọng đối với sự ổn định cấu trúc của vết thương Tuy nhiên, nếu sử dụng keo fibrin đơn thuần đôi khi chỉ mang tính chất cầm máu và kích thích liền sẹo mà không có khả năng kháng khuẩn ở các vết thương chậm liền hoặc không liền Để tăng cường hiệu quả của keo fibrin thương mại, người ta đã rắc kháng sinh lên keo với mục đích cung cấp một lượng kháng sinh nhanh, nồng độ cao tại vết thương

Hiện nay, tại Việt Nam đã có Vũ Thị Kim Liên và cộng sự chế tạo thành công keo fibrin tự thân tách chiết có sử dụng protamin và chưa có công bố nào nghiên cứu về việc tạo mẫu keo fibrin có sự hòa trộn kháng sinh

Từ những vấn đề trên, với mong muốn tìm được phương pháp tách các thành phần tạo keo fibrin từ huyết tương tự thân đơn giản, rẻ tiền và mang tính kháng khuẩn chúng tôi đã lựa chọn phương pháp gây đông lạnh huyết tương nhằm giảm thiểu tối

đa lượng hóa chất trong quá trình tách chiết, đồng thời sử dụng kháng sinh cefazolin kết hợp với keo Sở dĩ chúng tôi sử dụng cefazolin vì, cefazolin là kháng sinh phổ rộng, thường được dùng trên lâm sàng, dễ mua, giá thành rẻ Do vậy chúng tôi thực

hiện đề tài: ―Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và làm lành vết loét của keo

fibrin tự thân trộn cefazolin trên thỏ thực nghiệm” Với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng quy trình tạo keo fibrin in vitro bằng phương pháp gây đông lạnh huyết tương

2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của keo fibrin kết hợp với kháng sinh Cefazolin

3 Đánh giá hiệu quả cầm máu, làm lành vết thương và vết loét của keo fibrin

tự thân trên thỏ thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Quá trình đông máu

Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc nhờ sự chuyển fibrinogen thành các sợi fibrin không hòa tan dưới tác dụng của thrombin Đông máu đóng vai trò quan trọng trong quá trình cầm máu, đây là quá trình phức tạp tạo ra các cục máu đông, là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu Ngay sau khi xảy ra chấn thương làm tổn hại đến nội mạc mạch máu, phản ứng đông máu được kích hoạt, các tiểu cầu ngưng tập tại vùng tổn thương Các tiểu cầu này giải phóng các yếu tố gây khởi động quá trình đông máu Quá trình này được diễn ra theo hai con đường chính là đông máu nội sinh và đông máu ngoại sinh Trên thực tế có sự xảy ra đồng thời của cả hai con đường và cả hai con đường cuối cùng đều dẫn tới con đường đông máu chung với sự hoạt hóa yếu tố đông máu

X, yếu tố này có nhiệm vụ chuyển prothrombin thành thrombin – là một chất có vai trò vô cùng quan trọng trong cơ chế đông cầm máu Thrombin sẽ kích thích hình thành fibrin (là yếu tố Ia) từ fibrinogen (yếu tố I), fibrin có vai trò giam giữ tiểu cầu

và các thành phần khác của máu tạo nên cục máu đông ổn định vững chắc có khả năng cầm máu tại vị trí tổn thương

Khi các tổn thương lành lại, cục đông fibrin không còn cần thiết nữa, nó sẽ được tan đi nhờ các chất gây tiêu fibrin trong cơ thể như plasmin nhằm trả lại sự thông thoáng cho lòng mạch Sau quá trình này lượng các yếu tố đông máu dư thừa

sẽ được các chất ức chế fibrin làm bất hoạt

Hình 1.1 Con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh 1.2 Hai thành phần cơ bản của keo fibrin

1.2.1 Đặc điểm của fibrinogen

Fibrinogen là một glycoprotein hòa tan trong huyết tương, do gan sản xuất, nó

là yếu tố đông máu thứ nhất trong 13 yếu tố đông máu của huyết tương

Fibrinogen chiếm khoảng 0,2% thể tích máu toàn phần (khoảng 3 mg ml huyết tương), chứa 3 cặp chuỗi polypeptide (α, β, γ) được nối với nhau bởi cầu nối disulphua tạo thành một cấu trúc đối xứng Vùng trung tâm của fibrinogen chứa fibrinopeptides α và β, fibrinopeptides α và β sẽ được tách khi có mặt của thrombin

để tạo thành fibrin đơn phân (fibrin monomer) Sau khi fibrin monomer kết hợp với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo thành dạng sợi xoắn (fibrin dimer), các dạng sợi xoắn tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành fibrin polymer Dưới tác dụng của thrombin, yếu tố XIII được hoạt hóa để tạo thành XIIIa, sự hoạt hóa này được tăng lên khi có mặt ion calci Với sự có mặt của yếu tố XIIIa, các liên kết đồng hóa trị

giữa các fibrin monomer đứng kề nhau được tạo thành và chuyển sang dạng fibrin polymer không hòa tan, tạo cục máu đông vững chắc

Hình 1.2 Sơ đồ mô phỏng cấu trúc fibrinogen của con người [8]

1.2.2 Đặc điểm của thrombin

Thrombin là dạng hoạt động của prothrombin, yếu tố đông máu thứ 2 trong 13 yếu tố đông máu của huyết tương Prothrombin có bản chất là một protein hòa tan trong huyết tương, do gan sản xuất Với sự có mặt của ion calci, prothrombinase sẽ chuyển prothrombin thành thrombin

Sự tạo thành prothrombinase diễn ra ở trong ống nghiệm như sau: yếu tố XII được hoạt hoá khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ tích điện âm Yếu tố XIIa xúc tác cho

sự hoạt hoá của yếu tố XI Với sự có mặt của ion calci, yếu tố XIa sẽ hoạt hoá yếu

tố IX Yếu tố IXa tương tác với yếu tố VIIIa trên bề mặt các hạt mixen phospholipid của tiểu cầu, với sự có mặt của ion calci tạo ra một phức hợp enzym để hoạt hoá yếu

tố X Yếu tố Xa, với sự có mặt của ion calci, tương tác với yếu tố V trên bề mặt các hạt mixen phospholipid tiểu cầu tạo ra phức hợp prothrombinase

Vai trò của thrombin là phân giải fibrinogen, giải phóng fibrinopeptide A Việc mất peptide nhỏ này không đủ để làm cho phân tử fibrin không hòa tan, nhưng

nó có xu hướng tạo liên kết giữa các phân tử fibrin liền kề nhau Thrombin sau đó phân cắt fibrinopeptide B thứ hai, từ fibrin và các monome fibrin được hình thành sau đó trùng hợp một cách tự nhiên để tạo thành một loại gel không hòa tan Fibrin trùng hợp được giữ với nhau bởi các lực không tĩnh điện và tĩnh điện và được ổn định bởi yếu tố enzyme chuyển hóa XIIIa, được tạo ra bởi tác động của thrombin trên yếu tố XIII Các cấu trúc fibrin không hòa tan (cục máu đông) và tiểu cầu có vai trò lấp vào vị trí mạch máu bị tổn thương để ngăn chảy máu [8]

Hình 1.3 Vai trò của thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin [8]

Bình thường quá trình đông cầm máu trải qua 4 giai đoạn (co mạch tại chỗ, tạo nút tiểu cầu, tạo cục máu đông, co và tan cục máu đông) Quá trình tạo keo fibrin dựa trên quá trình tạo cục máu đông máu, qui trình "bắt chước" để tách thành phần

là thrombin và fibrinogen trong huyết tương sau đó trộn hai thành phần để hình thành nên mạng lưới fibrin (cục đông không có các tế bào máu)

Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hóa prothrombin thành thrombin và sự trùng hợp

fibrinogen tạo thành các sợi fibrin

(Hoạt hóa prothrombin)

(Yếu tố ổn định fibrin

đã hoạt hóa)

1.3 Phương pháp tách chiết các thành phần keo fibrin

1.3.1 Phương pháp tách chiết fibrinogen tự thân

Khác với keo fibrin thương mại, keo fibrin tự thân là keo được tạo ra từ máu của 1 đối tượng và được dùng cho chính đối tượng đó Cả 2 thành phần fibrinogen

và thrombin đều được chiết xuất từ huyết tương Nồng độ fibrinogen và thrombin trong keo fibrin tự thân thường thấp hơn so với keo thương mại do vậy độ dính kém hơn và thời gian dính cũng lâu hơn

Dưới đây là các phương pháp tách chiết fibrinogen t huyết tương người

Kết tủa lạnh: Là một phương pháp khá phổ biến, được coi là tiêu chuẩn vàng cho việc tách chiết fibrinogen từ máu người Huyết tương được đông lạnh ở nhiệt

độ bằng hoặc dưới -180C trong ít nhất 12 giờ, sau đó máu được rã đông trong vài giờ ở nhiệt độ 40C, rồi đem ly tâm lấy tủa fibrinogen Nồng độ fibrinogen thu được

từ kỹ thuật này không cao, có ưu điểm là không cần các chất hóa học

Phương pháp siêu lọc huyết tương giàu tiểu cầu cũng được sử dụng để tách chiết fibrinogen, nồng độ fibrinogen có được từ phương pháp này thấp

+ Ly tâm: Dựa trên sự khác nhau về t trọng các thành phần trong máu để tách chiết fibrinogen, phương pháp này cũng cho nồng độ fibrinogen không cao

Phương pháp hóa học có sử dụng một số hóa chất như: Ethanol, polyethylen glycol (PEG) có ưu điểm hơn so với phương pháp kết tủa lạnh vì tổng thời gian tiến hành kỹ thuật ngắn hơn (khoảng 90 phút), cho nồng độ fỉbrinogen cao hơn, tuy nhiên do ảnh hưởng của các chất hóa học sẽ làm giảm đặc tính của keo dán, ví dụ như khi có mặt của ethanol sẽ làm giảm hoạt tính của yếu tố XIII

Tách chiết fibrinogen có sử dụng protamin: Protamin có vai trò trung hòa tác dụng chống đông của heparin do có tác dụng ức chế hoặc tiêu thrombin, khi đó fibrinogen không chuyển dạng fibrin được, tạo điều kiện cho việc tách chiết fibrinogen Hiệu quả tách chiết fibrinogen khi sử dụng protamin rất cao thậm chí có thể thu được đến 100 fibrinogen của huyết tương

Theo nghiên cứu của Cavichiolo [11] so sánh 3 phương pháp tách chiết fibrinogen là lấy trực tiếp fibrinogen huyết tương (nhóm 1), tủa lạnh (nhóm 2), và kết tủa bởi ammonium sulfate (nhóm 3) cho thấy, tất cả các phương pháp tạo ra một cục máu đông có độ bám dính cao và không có độc tính, nhưng thử nghiệm độ bền keo cho thấy chất keo được tạo ra từ cục máu đông kết tủa ammonium sulfate (nhóm 3) là mạnh nhất Tác giả sử dụng 350 mL máu để vào túi và làm đông lạnh ở -180C, làm tan đông trong tủ lạnh ở 40C và được ly tâm lạnh 5000 vòng/phút trong

5 phút Dung dịch calci clorid (1 mL) đã được thêm vào để gây kết tủa ở đáy túi được sử dụng làm thành phần I (fibrinogen) của keo Tuy nhiên, ở thực nghiệm của mình ông đã sử dụng thrombin thương mại Cavichiolo cũng đã sử dụng các keo đã tạo ra để ghép da thỏ Tất cả các phương pháp đều tạo ra được cục máu đông lớn, hình thành trong vòng 2 giây và tồn tại không thay đổi trong vài giờ Khi keo được

sử dụng để ghép da thỏ thì nhóm 1 tác giả đã không ghép, vì các mảnh ghép không dính, còn lại tất cả các mảnh ghép trong nhóm 2 và 3 đều thành công sau 30 ngày

1.3.2 Phương pháp tạo thrombin tự thân

Cho tới nay, đa số việc tạo keo fibrin kể cả keo fibrin tự thân thực tế vẫn chỉ

có thành phần fibrinogen là được chiết xuất đúng từ máu tự thân, còn thrombin được lấy từ sản phẩm thương mại có sẵn (sản xuất từ huyết tương của bò) Vấn đề này có thể gây phản ứng miễn dịch và khả năng lây nhiễm virus từ thrombin bò Những sản phẩm thương mại từ thrombin của nhiều người gộp lại hiện nay được sử dụng rộng rãi nhưng vẫn mang nhiều nguy cơ lây truyền qua đường máu Để tạo được keo dán fibrin tự thân thực sự thì cả fibrinogen và thrombin cũng phải được tạo ra theo phương pháp tự thân

Quy trình tách chiết thrombin tự thân dựa trên nguyên lý khi cho CaCl2 vào huyết tương nghèo tiểu cầu, sẽ gây kết tủa fibrinogen, khi đó sẽ thu được thombin ở phần dịch nổi phía trên Tác giả Huỳnh Duy Thảo [6] cũng đã tìm được cách tách thrombin tự thân, tuy nhiên kỹ thuật còn sử dụng nhiều hóa chất và phương pháp thu thập khá phức tạp

1.4 Tình hình nghiên cứu keo fibrin trên thế giới

1.4.1 Sự ra đời của keo fibrin

Thuật ngữ Fibrin lần đầu tiên được giới thiệu bởi Fourcroy vào năm 1801 Ông đã chứng minh rằng, huyết tương chứa các chất hòa tan và tiền chất của fibrin

có trong huyết tương nhưng ko phải là huyết thanh Vài thập k sau, vào năm 1859 Denis đề xuất tên fibrinogen là một chất khác với fibrin Đến năm 1879, lần đầu tiên fibrinogen được Hammarsten phân lập từ huyết tương ngựa bằng natri clorua [13] Các thí nghiệm ban đầu tìm hiểu vai trò cầm máu của fibrin có từ đầu thế k

20, như tác giả Bergel sử dụng bột fibrin vào năm 1909, vài năm sau đó Grey's và Harvey sử dụng miếng dán fibrin và các tấm fibrin mỏng để cầm máu [36]

Trong những năm 1940, Young và Medawar đã công bố có thể sử dụng fibrinogen để sửa chữa các dây thần kinh bị đứt lìa trên các mô hình động vật Đến năm 1944, Cronkite và cộng sự, lần đầu tiên biết kết hợp fibrinogen và thrombin để tạo thành keo fibrin để giữ các mảnh ghép da Các dạng keo fibrin ban đầu này thiếu độ bền kết dính do nồng độ fibrinogen thấp Điều này thôi thúc các nghiên cứu tìm ra cách tách chiết được các thành phần của keo fibrinogen có nồng độ cao Vào những năm 1970, khi phương pháp tách huyết tương ra đời đã tạo tiền đề cho việc sản xuất ra nhiều loại protein hòa tan trong đó có fibrinogen, và phát triển kỹ thuật sản xuất các sản phẩm fibrin thương mại, do đó có thể sản xuất được fibrinogen đậm đặc hơn [36]

Việc sản xuất các thành phần của keo fibrin được các nhà thương mại lấy từ huyết tương của bò hoặc từ máu của nhiều người gộp lại Nhưng sự lo ngại về tính

an toàn của thrombin bò đã được quan tâm do các báo cáo về phản ứng phụ như: hạ huyết áp, sốc phản vệ và rối loạn đông máu [39] Khoảng 10% bệnh nhân tiếp xúc với thrombin bò đã xuất hiện kháng thể chống lại cả thrombin và các yếu tố đông máu khác (yếu tố V) [17] Do sự lo ngại về các chế phẩm được sản xuất từ bò có thể gây phản ứng, người ta sản xuất thrombin từ huyết tương của nhiều người gộp lại và thấy nó có ưu điểm hơn các chế phẩm từ bò Tuy nhiên, chế phẩm từ máu người gộp lại đã vấp phải sự lo ngại về khả năng lây truyền bệnh do virus từ các mầm

bệnh qua đường máu như HIV, virus viêm gan B và virus viêm gan C Trên thực tế, việc phê duyệt sử dụng fibrinogen thương mại có nguồn gốc từ nhiều nguồn huyết tương đã bị rút lại ở Hoa Kỳ vào năm 1978 do lo ngại về sự lây truyền virus [36] Các thử nghiệm lâm sàng với quy mô lớn đã ghi nhận hiệu quả và độ an toàn của keo fibrin, cùng với sự ra đời của các kỹ thuật cải tiến nhằm bất hoạt virus (như lọc nano và thanh trùng bằng nhiệt) đã khiến FDA chấp thuận cho phép sử dụng trên lâm sàng keo fibrin thương mại vào tháng 5 năm 1998 Đến năm 2013 hàng loạt keo fibrin thương mại được chấp thuận để sử dụng ―trên nhãn‖ ở Hoa Kỳ chỉ sử dụng cho 3 quy trình: như một chất cầm máu trong các thủ thuật bắc cầu tim phổi, điều trị chấn thương lách, và bịt kín các lỗ nối để đóng các khối u tạm thời [44] Các chất keo thương mại được cấp phép này có chứa fibrinogen và thrombin có nguồn gốc từ huyết tương người đã được khử hoạt tính của virus Chúng cũng chứa một chất chống tiêu sợi huyết, aprotinin của bò

Keo fibrin thương mại đã được sử dụng trong hơn 4 triệu thủ thuật trên toàn thế giới, chỉ có một trường hợp được báo cáo là nghi ngờ lây truyền bệnh do virus (lây truyền parvovirus ở người tại Nhật Bản) [21]

Mặc dù việc sử dụng các đơn vị huyết tương đơn lẻ gộp lại đã được kiểm tra

để loại bỏ sự nhiễm virus nhằm giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm Nhưng để loại bỏ nguy cơ này các nghiên cứu bắt đầu tập trung vào việc sửdụng máu tự thân để điều chế thành phần fibrinogen của keo fibrin Các nghiên cứu tìm cách cô đặc fibrinogen từ máu tự thân được bắt đầu ở những năm 1990, kỹ thuật này đòi hỏi việc thực hiện cần có sự sắp xếp thời gian, chú ý đến khối lượng sản phẩm sao cho

đủ và đảm bảo vô trùng Thử nghiệm điều chế nhanh chóng fibrinogen từ một lượng nhỏ máu được thu thập trước khi phẫu thuật thành công trong phẫu thuật cho bệnh tăng nhãn áp Tuy nhiên, khuyến cáo của nghiên cứu là máu cần được xử lý cẩn thận để duy trì sự vô trùng và an toàn của keo fibrin [20]

1.4.2 Ứng dụng của keo fibrin

Keo fibrin có ba ứng dụng chính là cầm máu, chất kết dính hoặc được sử dụng

để phân phối thuốc và các tác nhân hoạt tính sinh học khác (chẳng hạn như các yếu

tố tăng trưởng) đến các vị trí đích trong cơ thể

Hiện nay, keo fibrin được sử dụng trong hầu hết các chuyên khoa phẫu thuật Lĩnh vực thường xuyên sử dụng là hỗ trợ cầm máu, kết dính các đường khâu phức tạp, nối mạch máu [31], [32] Các nghiên cứu đã ghi nhận hiệu quả của keo fibrin trong việc kiểm soát chảy máu sau phẫu thuật, ngăn chặn sự rò rỉ của huyết thanh màng ngoài tim và đạt được sự cầm máu dọc theo đường khâu động mạch [35] Bên cạnh đó keo fibrin còn được sử dụng kết hợp với một số các cấu trúc khác như miếng dán polytetrafluoroethylene [34], mảnh ghép Dacron [33]

Đến năm 1996, một đánh giá của Kjaergard H K và cộng sự [26] về các thử nghiệm sử dụng keo fibrin trong phẫu thuật tim và lồng ngực kết luận rằng, đến năm 1995, không có nghiên cứu lâm sàng có đối chứng nào công bố tác dụng có hại của keo fibrin, hoặc keo fibrin có tác dụng phụ nghiêm trọng, và cũng không chứng minh được hiệu quả của keo fibrin là kém hơn so với các hình thức phẫu thuật có sử dụng các chất kết nối khác [26]

Ngoài ra, một số các lĩnh vực khác như phẫu thuật thần kinh [38], một số bài báo đã đề cập đến vai trò của keo fibrin trong việc sửa chữa dây thần kinh bao gồm sửa chữa dây thần kinh ở chuột [43] và sửa chữa dây thần kinh mặt ở chó [10] Keo fibrin cũng được sử dụng trong lĩnh vực thẩm mỹ [23], [45] tim mạch [9], [18] và keo fibrin đặc biệt hiệu quả trong việc kiểm soát chảy máu sau, bịt kín các khoang rỗng và có tác dụng như một chất hỗ trợ để tái tạo hàm dưới Keo fibrin đã được ghi nhận là có tác dụng đẩy nhanh quá trình tái tạo tuần hoàn và di chuyển của các nguyên bào sợi, do đó kích thích quá trình chữa lành và tăng trưởng mô [15]

Trong phẫu thuật nói chung, keo fibrin được sử dụng để cầm máu trên bề mặt các tạng, đặc biệt là sau chấn thương [47] Trong phẫu thuật gan, keo fibrin đã được đánh giá là một chất cầm máu hiệu quả, đặc biệt trong các trường hợp cắt bỏ diện tích lớn [16], [52]

Các đánh giá khác đã ghi nhận qua hàng loạt các thử nghiệm phẫu thuật, cho thấy keo fibrin đã rất có giá trị trong thúc đẩy quá trình cầm máu ở những bệnh nhân bị rối loạn đông máu [30] hoặc đang điều trị bằng thuốc chống đông máu

Gần đây, keo fibrin còn được nghiên cứu với mục đích sử dụng như một phương tiện phân phối các yếu tố tăng trưởng, kháng sinh và các hóa chất xạ trị khác nhằm thúc đẩy quá trình chữa bệnh có hiệu quả

Một nghiên cứu thực nghiệm trên lợn đã kết hợp keo fibrin với hormon GH với mục đích chữa lành vết nối ruột Kết quả cho thấy, sự kết hợp đó đã làm giảm nguy cơ rò rỉ, cải thiện quá trình làm lành mối nối của ruột [50]

Tofuku [46] đã nghiên cứu tính kháng khuẩn của keo fibrin thương mại trên thạch, tất cả năm miếng keo fibrin thương mại được ngâm tẩm vancomycin đều có khả năng kháng khuẩn, còn đối với thử nghiệm lâm sàng thì keo fibrin thương mại được tẩm kháng sinh (AFS) có hiệu quả trong việc ngăn ngừa nhiễm trùng vết mổ René Verboket [49] đã tiến hành một nghiên cứu điều trị vết loét ở trên lưng chuột Sprague Dawley bằng kháng sinh vancomycin tại chỗ Kết quả khẳng định việc sử dụng đồng thời vancomycin với fibrin làm cho nồng độ kháng sinh ổn định

và tác dụng trong thời gian dài trong mô

Trong điều trị ung thư đại trực tràng đã được nghiên cứu sáng tạo bằng cách gắn với Oxaliplatin (OXP) là một thuốc hóa trị với keo fibrin để điều trị khối u [22] Keo fibrin được coi là hệ thống phân phối OXP và kết quả cho thấy hiệu quả chống khối u được nâng cao trong mô hình dưới da và mô hình di căn ổ bụng của ung thư đại trực tràng so với OXP được sử dụng đơn lẻ Điều này được giải thích là do sự kết hợp của OXP và keo fibrin có thể đã làm tăng CD8+, giảm tế bào T điều hòa (Treg) và tăng interferon-γ (IFN-γ) Hơn nữa, kết quả cho thấy, giảm sự tăng sinh

và ức chế sự hình thành mạch của khối u, và đặc biệt không có độc tính toàn thân được quan sát thấy trong nghiên cứu

Một nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của hỗn hợp chất gồm yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu 165 (VEGF165) và keo fibrin lên khả năng làm lành vết thương nối hồi tràng thỏ sau phẫu thuật cho thấy [28], VEGF165 trộn với keo fibrin có khả năng làm tăng tốc độ chữa lành vết thương và tăng cường nối thông bằng cách tăng hình thành mạch Thỏ ở nhóm VEGF keo fibrin có t lệ rò rỉ thấp nhất (p < 0,05) Đánh giá mô học cho thấy mô hạt được hình thành vào ngày thứ 5 sau khi

nối, có sự tăng sinh nguyên bào sợi và tăng sinh mao mạch đáng kể vào ngày thứ 7

và ngày 14 ở nhóm VEGF keo fibrin

Trên lâm sàng, nhiều nghiên cứu sử dụng keo fibrin với các ý nghĩa ứng dụng khác nhau đã được nghiên cứu

Năm 1988 [24], 20 người trưởng thành bị loét chân mãn tính do suy tĩnh mạch

và 5 bệnh nhân bị bỏng toàn thân đã được điều trị bằng ghép tế bào sừng tự thân, các tế bào được cố định vào bề mặt vết thương bằng lưới fibrin Năm bệnh nhân khác (bị loét chân) được điều trị bằng fibrin không có tế bào sừng 16 trong số 20 bệnh nhân được ghép tế bào sừng kết hợp trên mạng lưới fibrin được chữa lành hoàn toàn sau 14 đến 21 ngày Còn mạng lưới fibrin không có tế bào sừng thì quá trình tái biểu mô diễn ra chậm hơn

Dahlstom và cộng sự, vào năm 1992 [14], đã điều chế Fibrinogen đậm đặc để tạo keo fibrin tự thân Keo đã được sử dụng cho các bệnh nhân bị các vết loét mãn tính ở chân Vết loét được chia thành hai phần bằng nhau, keo fibrin được sử dụng

để dán một mảnh ghép da trên 1 2 vết loét, một nửa được ghép da nhưng không có chất kết dính mảnh ghép Sinh thiết mô được thực hiện vào ngày thứ 7 cho thấy không có sự kết dính ở khu vực ghép da không có mặt của keo fibrin, còn các mảnh được ghép có keo fibrin thì miếng ghép kín dính chặt nền ghép Đến ngày thứ 21 cho thấy không có sự khác biệt giữa các mảnh ghép được ghép bằng hai phương pháp nêu trên

Kopp và cộng sự [27] đã điều trị cho 11 bệnh nhân vào năm 2004 bị loét chi dưới mãn tính không có khả năng khỏi bằng tế bào sừng tự thân và keo fibrin thương mại, 90,9 bênh nhân được chữa lành hoàn toàn Còn Johnsen và cộng sự [25] cũng với phương pháp điều trị của Kopp cho thấy 55,8 bệnh nhân bị loét chi dưới mãn tính đã khỏi sau 6 tuần điều trị bằng sự kết hợp giữa tế bào sừng tự thân với keo fibrin thương mại của Đức

Năm 2010, Chen và cộng sự [12] đã điều trị cho 15 bệnh nhân với 17 vết loét

do các nguyên nhân khác nhau Các vết loét này được phun keo fibrin lên các mảnh ghép da đặt trên bề mặt vết thương Kết quả cho thấy, hầu hết các ca ghép da đều

diễn ra tốt đẹp Khoảng thời gian từ khi ghép da đến khi vết thương lành hoàn toàn dao động từ 3 tuần đến 2 tháng Không ghi nhận sự tái phát của vết loét trong thời gian theo dõi từ 3 đến 18 tháng

Dinato và cộng sự [29], vào năm 2012, đã nghiên cứu đánh giá hiệu quả của việc cấy ghép tế bào da tự thân (nguyên bào sợi và tế bào sừng) được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm để ghép cho các vết loét da lâu năm (9 - 34 năm) của 5 bệnh nhân đái tháo đường cùng với keo fibrin tự thân Có 6 vết loét ở chi dưới khởi phát từ 4 tháng đến 20 năm trước và có kích thước từ 4,0 cm2 đến 36,62 cm2 không đáp ứng với một số phương pháp điều trị thông thường Khi ghép da cùng với keo fibrin tự thân đã cho kết quả sự lành hoàn toàn ở 5 vết loét (83,3 ) sau 21 - 120 ngày Bệnh nhân có vết loét lớn nhất đã được cải thiện một phần trong 40 ngày Nghiên cứu kết luận rằng phương pháp này là một lựa chọn điều trị tuyệt vời cho các vết loét do tiểu đường, cho phép chữa lành nhanh hơn và ưu điểm hơn cả là kỹ thuật gây xâm lấn tối thiểu và có thể thực hiện được ngay tại phòng khám ngoại trú

Vào năm 2015, Velasco và cộng sự [48] đã thực hiện một nghiên cứu trên các bệnh nhân bị tổn thương tủy sống có thể có các vết loét do tì đè ở thời gian hậu phẫu Trước khi kết thúc phẫu thuật, keo fibrin thương mại đã được đưa trực tiếp vào các tổn thương Nhóm có keo fibrin đưa vào vết thương có t lệ tụ máu - huyết thanh thấp hơn (3,7 so với 33,8 ; p < 0,05), thể tích dẫn lưu trung bình thấp hơn (155 mL so với 360 mL; p < 0,05) và thời gian nằm viện ngắn hơn đáng kể so với nhóm không được sử dụng keo fibrin sau phẫu thuật (40 ngày so với 55 ngày; p < 0,05) Họ kết luận rằng việc sử dụng keo fibrin thương mại trong phẫu thuật ở những bệnh nhân bị tổn thương tủy sống bị loét áp lực đã chứng tỏ hiệu quả trong việc giảm không chỉ các biến chứng sau phẫu thuật mà còn giảm cả thời gian nằm viện do tiết kiệm được nguồn tài chính

Đánh giá trong hơn 25 năm, nhiều công trình khoa học đã chứng minh rằng keo fibrin được sử dụng trong nhiều tình huống lâm sàng với mục đích thúc đẩy quá trình chữa lành các loại loét khác nhau, không đáp ứng với điều trị thông thường Trong hầu hết các nghiên cứu, keo fibrin tự thân hoặc keo fibrin thương mại được sử dụng

để cố định các mảnh ghép hoặc làm giá đỡ để kết hợp các tế bào Đa số các bệnh nhân sử dụng liệu pháp này đều có sự cải thiện đối với các vết loét

1.5 Tình hình nghiên cứu keo fibrin ở Việt Nam

Nghiên cứu đầu tiên dùng keo fibrin thương mại để cố định mảnh ghép trong phẫu thuật cắt mộng ghép kết mạc được công bố bởi tác giả Nguyễn Hoàng Thụy Khanh và cộng sự (2012) Nghiên cứu chia thành hai nhóm, một nhóm dùng keo fibrin thương mại [1], một nhóm dùng chỉ vicryl để cố định mảnh ghép kết mạc T lệ tái phát sau 6 tháng ở nhóm dùng keo fibrin và chỉ tương ứng là 3,3% và 6,7% Các triệu chứng viêm sau phẫu thuật giảm hơn ở nhóm dùng keo so với nhóm dùng chỉ

Huỳnh Duy Thảo và cộng sự [6] lần đầu tiên đã sử dụng phương pháp gây đông lạnh ở nhiệt độ -200C để thu thập fibrinogen và thrombin tự thân Quy trình tách các thành phần keo dựa trên các nghiên cứu của nước ngoài có sáng tạo, qui trình sử dụng nhiều hóa chất, các bước thực hiện khá phức tạp Tác giả cũng đã bước đầu thử nghiệm đánh giá hiệu quả của keo fibrin tự thân so sánh đối chứng với keo fibrin thương mại trong điều trị phẫu thuật mộng thịt Kết quả cho thấy, keo dính tốt, có khả năng kết dính mô, không có hiện tượng dị ứng hay nhiễm trùng, trong khi các đối tượng được sử dụng keo fibrin thương mại (tách chiết từ huyết tương bò) thì có một số trường hợp xuất hiện tình trạng dị ứng Bên cạnh đó, vì keo fibrin thương mại có nồng độ các thành phần của keo cao, nên khả năng kết dính rất nhanh, cần phải thao tác kỹ thuật nhanh chóng, còn đối với keo fibrin tự thân với thời gian kết dính khoảng 3 phút sau khi trộn các thành phần để tạo keo chính là thời gian đủ để cho phẫu thuật viên thao tác hoàn tất qui trình kỹ thuật Chi phí cho keo fibrin thương mại cũng được cho là cao gấp nhiều lần so với keo fibrin tự thân Hoàng Thu Soan và cộng sự [4] năm 2018 đã tách chiết thành công fibrinogen bằng protamin, số lượng fibrinogen thu được trong khoảng 67,42% đến 99,64 Vũ Thị Kim Liên và cộng sự [2] cũng lần đầu tiên thực hiện phương pháp tách chiết đồng thời cả fibrinogen và thrombin từ huyết tương để tạo được keo fibrin tự thân, quy trình tách chiết fibrinogen cũng sử dụng protamin Tác giả nhận định keo fibrin tự thân trung bình được tạo thành sau 8 phút khi kết hợp fibrinogen và thrombin theo tỉ lệ 1:1

Năm 2018, Vũ Thị Kim Liên và cộng sự [2] đã xây dựng thành công qui trình tạo keo fibrin từ máu tự thân, cả hai thành phần của keo là firinogen và thrombin đều được lấy từ một mẫu máu, trong đó tác giả tách fibrinogen từ huyết tương bằng protamin Đến năm 2021 [3], tác giả đã tiến hành thử nghiệm lâm sàng phương pháp tạo keo fibrin tự thân này để cố định mảnh ghép kết mạc trong phẫu thuật mộng nguyên phát Nghiên cứu can thiệp không đối chứng ở 45 mắt mộng nguyên phát độ

II Qui trình tách chiết fibrinogen và thrombin là từ một mẫu máu, fibrinogen được tách bằng protamin Kết quả thấy, keo fibrin tự thân cố định được mảnh ghép kết mạc

ở 43/45 mắt (95,6%): cố định tốt 3 cạnh mảnh ghép ở 32/45 mắt (71,11%), bong mảnh ghép ở 2 mắt (4,4%) Sau phẫu thuật 1 ngày bệnh nhân đau ở mức độ trung bình (86%) Thời gian phẫu thuật trung bình 28,5 ± 2,7 phút Kết quả phẫu thuật đánh giá sau 3 tháng đạt tốt ở 86% Sau 10 tháng theo dõi chưa gặp tái phát

Vậy xu hướng sử dụng keo fibrin vẫn đang là hướng cần tiếp tục được quan tâm

Do việc sử dụng keo fibrin thương mại với giá thành cao với một số nguy cơ vẫn đang

là vấn đề đặt ra Vì vậy, để giải quyết thì cần tập trung nghiên cứu tìm cách tách chiết,

cô đặc các thành phần của keo fibrin để sử dụng keo fibrin theo hướng tự thân

Mặt khác, làm tăng tính hữu dụng của keo fibrin này trên nhiều lĩnh vực như điều trị loét khó khỏi, thì việc bổ sung kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng mô vào keo là cần thiết Ở đề tài của chúng tôi với mong muốn sử dụng keo fibrin tự thân kết hợp với kháng sinh Cef để phát huy tác dụng kép của keo Sở dĩ chúng tôi sử dụng kháng sinh Cef vì Cef là kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 1, tác động kìm hãm sự phát triển

và phân chia vi khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn

Cefazolin được chỉ định trong điều trị trong các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn da và mô mềm, nhiễm khuẩn xương và khớp, một số trường hợp nhiễm khuẩn huyết và viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn đường mật và tiết niệu sinh dục

Trong một nghiên cứu của [42] đã chỉ ra rằng dùng dự phòng kháng sinh Cef làm giảm t lệ nhiễm trùng trong phẫu thuật gãy xương kín và trong phẫu thuật chỉnh hình khớp nguyên phát

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

- Bộ dụng cụ lấy máu: Găng tay, bông, băng, cồn sát khuẩn, xilanh

- Bộ đồ mổ: Dao mổ, gạc, kéo, kẹp phẫu tích

- Dụng cụ tạo keo: Lam kính, pipet, đầu côn, ống nghiệm, giá cắm ống nghiệm

- Dụng cụ gây bỏng: Miếng nhôm có diện tích 1,0 cm x 1,5 cm

- Cân tiểu ly

- Máy li tâm nghiêng Smic 80 - 2 của Trung Quốc, máy định lượng fibrinogen staRmax của hãng Stago - France

- Tủ lạnh hãng panasonic của Thái Lan, tủ lạnh âm sâu panasonic MDF - U334 của Nhật Bản

- Thuốc chống đông (Natri citrate 0,129M), Calci clorid 10%

- Thuốc gây mê (Propofol 1%), dung dịch sát khuẩn (Betadine 10%), kháng sinh bôi tại chỗ (Tetracyclin 1%), nước muối sinh lý (NaCl 0,9%)

- Kháng sinh cefazolin dạng bột tinh khiết 1000mg, đạt chuẩn quốc tế do công

ty Tenamyd Việt Nam (Canada – Việt Nam) cung cấp

- Vi khuẩn Gram âm (trực khuẩn mủ xanh) và Gram dương (tụ cầu vàng) được cung cấp bởi khoa Vi sinh (Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên)

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

 Mục tiêu 3

7 con thỏ (2 cắt da, 5 gây bỏng)

Các con thỏ tham gia vào nghiên cứu đảm bảo tiêu chuẩn khỏe mạnh, trọng lượng từ 2000 – 2500 gam, không mang thai, không rối loạn đông máu

Sở dĩ tại nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thỏ bởi vì qua thăm dò định lượng fibrinogen của thỏ, chúng tôi nhận thấy nồng độ fibrinogen của thỏ tương tự người

2.1.3 Xử lý số liệu

- Số liệu thu thập được quản lý bằng phần mềm excel

- Số liệu nghiên cứu được xử lý và phân tích bằng phần mềm STATA 10

- Các biến số định lượng được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (X ± SD) (Mean ± Standard Deviation)

2.2 Địa điểm và thời gian

Nghiên cứu được tiến hành tại labo Bộ môn Sinh lý học, Sinh lý bệnh – Miễn dịch, Vi sinh, Trường Đại học Y - Dược, Đại học Thái Nguyên từ tháng 02 năm

2020 đến tháng 04 năm 2021

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 1

- Tách chiết fibrinogen (cô đặc fibrinogen)

+ Lần 1: Lấy 16 mL máu ở tĩnh mạch rìa tai thỏ, cho vào ống chống đông chứa

Natri citrate 0,129M với t lệ 1:9

 Ly tâm tách huyết tương: ly tâm ống máu với tốc độ 3000 vòng/20 phút Tách huyết tương vào 4 ống, mỗi ống 2 mL Trong đó:

 Ống 1 là ống đối chứng, gửi ngay đến Trung tâm Huyết học Truyền máu, bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên định lượng fibrinogen

 Ống 2 gây đông ở nhiệt độ -180

C

 Ống 3 gây đông ở nhiệt độ -350C

 Ống 4 gây đông ở nhiệt độ -800

 Thực nghiệm được tiến hành lặp lại trên 5 mẫu huyết tương của thỏ

+ Lần 2: Các bước thực hiện tương tự lần 1, nhưng nhiệt độ gây đông là -180C, -350C và thời gian gây đông để ở các thời điểm 12 giờ, 24 giờ và 48 giờ (do lần 1 ở nhiệt độ -800C fibrinogen cho kết quả không đo được vì fibrinogen bị biến tính hoàn toàn)

Thực nghiệm cũng được tiến hành lặp lại trên 5 mẫu huyết tương của thỏ

=> Kết luận nồng độ fibrinogen thu được sau 12 giờ, 24 giờ và 48 giờ ở nhiệt

=> Từ (i) và (ii) kết luận thời gian và nhiệt độ gây đông thu được lượng fibrinogen nhiều nhất (♦)

- Tạo keo fibrin tự thân

Dựa trên kết luận sau khi thăm dò tách chiết fibrinogen (♦), quá trình tạo keo fibrin được thực hiện trên 1 mẫu máu thỏ theo qui trình dưới đây:

+ Lấy máu thỏ: lấy 5mL máu ở tĩnh mạch rìa tai thỏ, cho vào ống chống đông chứa Natri citrate 0,129M% với t lệ 1:9

+ Ly tâm tách huyết tương: ly tâm ống máu với tốc độ 3000 vòng/20 phút Tách huyết tương vào 2 ống, mỗi ống 1 mL

 Ống 1: Lấy 1 mL huyết tương trên cùng để thu thập thrombin

 Ống 2: Lấy 1 mL huyết tương tiếp theo để thu thập fibrinogen

+ Gây đông đồng thời 2 ống ở nhiệt độ và thời gian đã được kết luận sau khi thăm

dò tách chiết fibrinogen (♦)

- Các bước tách các thành phần của keo Fibrin như sau:

Thu thập thrombin ở ống 1 (iii)[2]

Rã đông ống 1 ở nhiệt độ phòng (26 - 300C) trong thời gian 1 giờ cho huyết tương được giã đông hoàn toàn

+ Cho 0,04 mL CaCl2 10% vào 1 mL huyết tương, để ở nhiệt độ phòng (26 -

300C), thu phần dịch nổi chứa thrombin

Theo dõi thời gian hình thành thrombin bằng cách quan sát Cứ khoảng 30 giây nghiêng ống nghiệm 1 lần cho đến khi hình thành cục đông Tuy nhiên nếu chưa đến 30 giây đã có hiện tượng tạo cục đông thì nghiêng ống nghiệm để chắc chắn cục đông đã hình thành

Thu thập fibrinogen ở ống 2 (iiii)

+ Rã đông ống 2 ở nhiệt độ phòng (26 - 300C), quan sát dịch chảy ra và hút bỏ 0,5 mL huyết tương tan trước, giữ lại 0,5 mL huyết tương tan sau

+ Phần huyết tương tan sau chính là fibrinogen cô đặc thu thập được

Tạo keo fibrin

+ Lấy 0,2 mL thrombin + 0,2 mL fibrinogen

Xác định thời gian tạo keo bằng cách quan sát Sau khi trộn fibrinogen với thrombin cứ khoảng 30 giây nghiêng phiến nhựa 1 lần cho đến khi hình thành cục đông Tuy nhiên nếu chưa đến 30 giây đã có hiện tượng tạo keo thì nghiêng phiến kính để chắc chắn keo đã hình thành

Thí nghiệm lặp lại trên 5 mẫu máu thỏ

=>Kết luận thời gian tạo keo

 Từ các kết quả của mục tiêu 1, vẽ sơ đồ qui trình tạo keo fibrin tự thân bằng phương pháp gây đông lạnh

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 2

Xác định tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm keo fibrin - cefazolin bằng cách

ủ chế phẩm keo fibrin - cefazolin với các chủng vi khuẩn là trực khuẩn mủ xanh và

tụ cầu vàng Sau đó, theo dõi sự ức chế vi khuẩn bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn tại các thời điểm: 0 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ,

đổ các mẫu như sau:

+ Giếng 1 (nước cất - cefazolin): cho 0,2 mL nước cất đã pha với 0,005 gram cefazolin ủ với vi khuẩn

+ Giếng 2 (keo fibrin): cho 0,1 mL fibrinogen 0,1 mL thrombin Sau đó ủ với

Tất cả các bước tạo keo, rắc, trộn kháng sinh với nước cất hay keo fibrin đều được thực hiện trong tủ an toàn sinh học đảm bảo vô trùng

Các mẫu thạch sau khi thực hiện đổ chế phẩm xong được ủ ấm ở 37 độ C, O298%, nồng độ CO2 không quá 0,1%

Kích thước vùng vi khuẩn bị ức chế được đo tại các thời điểm như đã nêu trên Vùng ức chế sự phát triển của vi khuẩn là một vùng rõ ràng xung quanh chế phẩm thử nghiệm, có kích thước lớn nhất tính theo đường thẳng

Thực nghiệm được tiến hành lặp lại trên 5 mẫu Gram (+) và 5 mẫu Gram (-)

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu mục tiêu 3

* Chỉ số nghiên cứu

Khả năng làm lành vết thương hở bằng cách cắt da và tạo vết loét của keo fibrin qua đánh giá các chỉ số: kích thước, độ phồng, màu sắc, dịch, độ phẳng của vết thương ở các thời điểm ngày thứ 1, 3, 5, 7, 10, 14, 20 với vết thương cắt da và ngày 30 với vết loét

* Các bước thực hiện:

 Tách fibrinogen và thrombin: Lấy 5 mL máu thỏ ly tâm, tách huyết tương vào 2 ống Để 2 ống ở nhiệt độ -180 C trong 24 giờ Tạo keo bằng cách rã đông ống 1 và ống 2 Ống 1 tách thrombin bằng cách cho thêm calci clorid, ống 2 tách fibrinogen

Sau đó trộn fibrinogen và thrombin theo t lệ 1:1

 Thực nghiệm 1: Tạo 03 vết thương hở bằng cách tách bỏ da (vết thương cắt da)

Thỏ được gây mê, rạch tách bỏ 3 miếng da ở lưng thỏ với độ sâu khoảng 0,5 mm, diện tích 1,0 cm x 1,5 cm Ngay sau khi tách da các vết thương được đổ keo fibrin

- Vết thương 3: Đổ keo fibrin đã được trộn đều Cef theo trình tự như sau: Nhỏ 0,2 mL thrombin lên mặt vết thương, ngay sau đó nhỏ 0,2 mL fibrinogen đã trộn đều với 0,01 gam Cef từ trước đó

Thực nghiệm được tiến hành lặp lại trên 2 mẫu thỏ

 Thực nghiệm 2: Tạo 3 vết thương hở bằng cách gây bỏng (vết thương gây loét)

- Thỏ được gây mê, dùng miếng nhôm có diện tích 1 cm x 1,5 cm, nung đỏ đặt trên

da vùng lưng thỏ trong thời gian 3 phút để gây được 3 vết thương sâu khoảng 0,5

mm (đảm bảo tổn thương phá vỡ toàn bộ cấu trúc da: biểu bì, hạ bì

- Ngay sau khi gây tổn thương bỏng, tiến hành rắc 0,1 gam đường lên bề mặt vết thương, sau 2 ngày, vết thương có hiện tượng viêm và tạo mủ

- Vệ sinh sạch mủ, cắt lọc tổ chức hoại tử và thực hiện các bước đổ keo làm lành vết loét như ở vết thương hở đã tách bỏ da ở trên:

+ Vết loét A: Đổ keo fibrin

+ Vết loét B: Đổ keo fibrin và rắc Cef lên keo

+ Vết loét C: Đổ keo fibrin đã được trộn đều Cef

Thực nghiệm được tiến hành lặp lại trên 5 mẫu thỏ

Tất cả các vết thương cắt da hay gây loét đều để quan sát tự nhiên, theo dõi và đánh giá các chỉ số: kích thước, màu sắc da xung quanh, sưng tấy tại chỗ, độ căng của vết thương, dịch tiết, tổ chức hoại tử có hay không tại vết thương ở các thời điểm ngày thứ 1, 3, 7, 10, 14, 20 với vết cắt da và đến ngày thứ 30 với vết gây loét Riêng các vết thương trong quá trình theo dõi có hiện tượng nhiễm trùng, được làm

sạch bằng nước muối sinh lý và betadine

2.3.5 Sơ đồ nghiên cứu

- 18 0 C - 18 0 C - 18 0 C - 35 0 C - 35 0 C - 35 0 C

2 giờ 2 giờ 2 giờ giờ 12 giờ 24 giờ 48 giờ 12 giờ 24 giờ 48

MÁU THỎ  LY TÂM  TÁCH HUYẾT TƯƠNG

Rã đông gạn bỏ huyết tương  định lượng fibrinogen

Kết luận thời gian, nhiệt độ tối ưu

Theo dõi kích thước ổ loét, màu

quanh, sưng tấy tại chỗ, độ căng của vết thương, dịch tiết, tổ chức hoại tử có hay

Gây bỏng 1cm x 1,5cm

vi khuẩn

Mục tiêu 2

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của keo fibrin kết hợp

với kháng sinh Cef

VK GRAM (-)

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu

- Nghiên cứu tiến hành đảm bảo tuân thủ theo các nguyên tắc về đạo đức trong nghiên cứu y sinh học

- Thỏ được gây mê trong khi thực hiện kỹ thuật cắt da, tạo vết thương

- Thỏ được nuôi riêng mỗi con 1 chuồng, đảm bảo điều kiện môi trường sạch sẽ, ăn uống đầy đủ

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

Keo fibrin có rất nhiều ưu điểm và đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới Tuy nhiên việc sử dụng keo fibrin thương mại tiềm ẩn nhiều nguy cơ lây truyền các bệnh qua đường máu hay phản ứng của cơ thể Với mong muốn, tìm ra cách tạo keo fibrin tự thân kết hợp với kháng sinh để làm giảm nguy cơ lây nhiễm các bệnh qua đường máu, phản ứng của cơ thể đồng thời cung cấp được lượng kháng sinh cao tại chỗ nhằm làm giảm khả năng nhiễm khuẩn tại vết thương Trong quá trình nghiên cứu, quan sát, theo dõi, trong khi tiến hành các thử nghiệm chúng tôi chúng tôi thu được các kết quả sau:

3.1 Qui trình tạo keo fibrin tự thân bằng phương pháp gây đông lạnh

Bảng 3.1 Nồng độ fibrinogen (fib) thu được sau 2 giờ ở nhiệt độ -180C, -350C và -800C

Mẫu Fib chứng

(g/L)

- 18 0 C (g/L) (1)

Tỷ lệ Fib ở -18 0 C (%)

- 35 0 C (g/L) (2)

Tỷ lệ Fib ở

- 35 0 C (%)

- 80 0 C (g/L) (3)

Tỷ lệ Fib ở

- 80 0 C (%)

K: Không đo được

Sau 2 giờ gây đông nồng độ fibrinogen trung bình thu được ở nhiệt độ -180C

và -350C tương đương nhau Số lượng fibrinogen thu được từ 8,51% đến 48,64% Tại nhiệt độ gây đông -800C chúng tôi không thu được fibrinogen

Bảng 3.2 Nồng độ fibrinogen (fib) thu được theo thời gian gây đông ở nhiệt độ -180C

Mẫu Fib chứng

(g/L)

Giờ 12 (g/L) (1)

Tỷ lệ Fib ở giờ 12 (%)

Giờ 24 (g/L) (2)

Tỷ lệ Fib ở giờ 24 (%)

Giờ 48 (g/L) (3)

Tỷ lệ Fib ở giờ 48 (%)

Nồng độ fibrinogen trung bình thu được khi gây đông ở nhiệt độ -180C không

có sự khác biệt giữa các thời điểm 12 giờ, 24 giờ và 48 giờ.T lệ fibrinogen thu được khi gây đông trong khoảng 12 giờ đến 48 giờ từ 33.97% (ở 48 giờ) đến 55.13% (ở 12 giờ)

Bảng 3.3 Nồng độ fibrinogen (fib) thu được theo thời gian gây đông ở nhiệt độ -350C

Mẫu Fib chứng

(g/L)

Giờ 12 (g/L) (1)

Tỷ lệ Fib ở giờ 12 (%)

Giờ 24 (g/L) (2)

Tỷ lệ Fib ở giờ 24 (%)

Giờ 48 (g/L) (3)

Tỷ lệ Fib ở giờ 48 (%)

Nồng độ fibrinogen trung bình thu được khi gây đông ở nhiệt độ -350C không

có sự khác biệt giữa các thời điểm 12 giờ, 24 giờ và 48 giờ T lệ fibrinogen thu được khi gây đông trong khoảng 12 giờ đến 48 giờ từ 31,10% (ở 24 giờ) đến

57,46% (ở 12 giờ)

Bảng 3.4 Thời gian thu thập thrombin và hình thành keo fibrin

Hình 3.1 Qui trình tạo keo fibrin tự thân bằng phương pháp gây đông lạnh được

thể hiện bằng sơ đồ sau

độ

phòng

(26-300C)

Trộn huyết tương với

calciclorid thu dịch nổi

3.2 Khả năng kháng khuẩn của keo fibrin kết hợp với kháng sinh Cefazolin

Bảng 3.5 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn Gram dương của các chế phẩm (n=5)

13,22 ± 1,11 (12,1 - 14,5)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-3), (1-4), (3-4) > 0,05

6 giờ 17,68 ± 2,13

(15,2 - 20,9)

7,82 ± 0,25 (7,4 - 8,0)

16,94 ± 2,96 (12,7 - 20,5)

15,38 ± 1,68 (12,9 - 17,2)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-4) < 0,05; (1-3), (3-4) > 0,05

12 giờ 18,78 ± 0,77

(17,8 - 19,7,0)

6,52 ± 0,43 (6,1 - 7,1,0)

17,26 ± 3,00 (12,9 - 20,8,0)

17,14 ± 2,14 (14,9 - 20,5)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-3), (1-4), (3-4) > 0,05

24 giờ 26,56 ± 5,66

(18,8 - 30,8)

4,82 ± 0,98 (3,1 - 5,5)

22,54 ± 4,46 (18,9 - 30,2)

26,66 ± 4,24 (19,9 - 30,2)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-3), (1-4), (3-4) > 0,05

48 giờ 27,64 ± 6,01

(17,4 - 32,3)

3,06 ± 0,49 (2,2 - 3,4)

24,72 ± 5,39 (18,9 - 30,5)

28,20 ± 2,14 (25,5 - 30,4)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-3), (1-4), (3-4) > 0,05

72 giờ 27,62 ± 6,30

(16,9 - 32,7)

1,92 ± 0,66 (1,1 - 2,7)

24,72 ± 5,39 (18,9 - 30,5)

29,54 ± 1,48 (26,9 - 30,4)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (3-4) < 0,05; (1-3), (1-4) > 0,05

Tại những mẫu keo fibrin không có Cef, vi khuẩn Gram dương bắt đầu mọc ngay sau 3 giờ Đường kính vùng ức chế vi khuẩn Gram dương ở nhóm keo fibrin rắc kháng sinh tương tự nhóm keo fibrin trộn Cef đều có xu hướng đạt đường kính tối

đa sau 48 giờ đến 72 giờ, và bắt đầu có hiện tượng mọc vi khuẩn sau 24 giờ Đường

kính vùng ức chế vi khuẩn Gram dương ở nhóm keo fibrin rắc kháng sinh tương tự

nhóm keo fibrin trộn kháng sinh đa số tương tự nhau ở các thời điểm đã theo dõi 6

giờ, 24 giờ, 48 giờ Riêng ở 72 giờ, đường kính vùng ức chế vi khuẩn Gram dương

của nhóm keo fibrin trộn Cef lớn hơn so với nhóm keo fibrin rắc Cef có ý nghĩa

thống kê So sánh đường kính vùng ức chế vi khuẩn Gram dương của nhóm keo

fibrin rắc và fibrin trộn kháng sinh với nhóm Cef nước cất ở các thời điểm thấy đa

X ± SD (1)(mm)

Keo Fibrin

X ± SD (2) (mm)

Keo Fibrin rắc cef

X ± SD (3) (mm)

Keo Fibrin trộn cef

13,54 ± 1,81 (12,3 - 16,3)

15,50 ± 1,40 (13,6 - 16,9)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (3-4) < 0,05; (1-3), (1-4) > 0,05

6 giờ 16,56 ± 0,31

(16,1 - 16,9)

6,80 ± 0,65 (6,2 - 7,8)

15,10 ± 1,72 (12,4 - 16,7)

16,14 ± 0,81 (15,1 - 17,0)

12 giờ 18,08 ± 1,38

(16,1 - 19,4)

5,42 ± 1,01 (4,2 - 7,0)

15,48 ± 1,27 (13,5 - 16,7)

16,00 ± 0,57 (15,4 - 16,9)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-3), (1-4) < 0,01; (3-4) > 0,05

24 giờ 17,38 ± 1,53

(15,2 - 19,5)

4,54 ± 1,38 (3,1 - 6,7)

14,82 ± 1,03 (13 - 15,5)

14,70 ± 0,73 (14,2 - 15,9)

14,30 ± 1,42 (12,0 - 15,6)

13,96 ± 0,76 (13,1 - 15,0)

p (1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-3), (1-4) < 0,01; (3-4) > 0,05

72 giờ 16,76 ± 1,12

(14,8 - 17,6)

1,30 ± 1,33 (0,0 - 3,1)

13,84 ± 1,18 (11,9 - 15,0)

13,42 ± 0,71 (12,8 - 14,6)

p

(1-2), (2-3), (2-4) < 0,001; (1-3), (1-4) < 0,01; (3-4) > 0,05