Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) là đánh giá tác dụng kháng khuẩn của cao chiết từ lá cây thuốc Thượng trên một số chủng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp; đánh giá tác động điều trị của cao chiết trên mô hình chuột nhắt trắng gây bệnh viêm phổi.
Trang 1(ONG DAI HQC SU’ PHAM NGUY! N THỊ ĐÔNG HÀNG
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẢN VÀ
KHÁNG VIÊM CUA CAO CHIET LA CÂY THUỐC THƯỢNG
(Phaeanthus vietnamensis Ban)
LUAN VAN THAC Si NH HQC THỰC NGHIỆM
ĐÀ NANG - 2020
Trang 2
DAI HQC DA NANG
TRUONG DAI HQC SU PHAM
NGUYEN THI DONG HANG
NGHIEN CUU KHA NANG KHANG KHUAN VA
KHANG VIEM CUA CAO CHIET LA CAY THUOC THUQNG
(Phaeanthus vietnamensis Ban)
Trang 3Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn * Nghiên cứu khả năng
kháng khuẩn và kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng (Phaeamrhws viefnamensis Ban), tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu:
Khoa Sinh - Môi trường; Thư viện; Hội đồng khoa học trường Đại học Sư phạm Da Nẵng; các thầy cô Giảng viên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài
Xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Thị Thơ, người đã tận tình
hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kiến thức chuyên môn, động viên tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn
Xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ từ phía gia đình và bạn bè và đồng nghiệp trong suốt quá trình thực hiện đề tài
Mặc dù đã cố gắng hết sức nhưng chắc chắn luận văn không tránh khỏi những sai sót, kính xin được góp ý và chỉ dẫn thêm
Xin trân trọng cảm ơn!
Đà Nẵng, tháng 9 năm 2020
Trang 4
ii
LOI CAM DOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bắt kỳ công trình nào khác
Tác giả luận văn
Trang 5
—
NGHIEN CUU KHA NANG KHANG KHUAN VA KHANG VIEM CUA CAO
CHIET LA CAY THUOC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban)
Negiinh: Sinh hge thực nghiệm
Họ tên học viên: Nguyễn Thị Đông Hằng
Người hướng dẫn khoa học: TS Bùi Thị Thơ Cơ sở đào tạo: Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng
Tóm tắt:
1 Những kết quả chính của luận văn
Luận văn đã đưa ra những đánh giá về khả năng kháng khuẩn và kháng viêm của cao chiết
thuốc Thượng
Cao Chiết ethanol lá cây thuốc Thượng có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn S/aplylococcus areus Đồng thời cao chiết thuốc Thượng cũng có khả năng ức chế yếu lên sự
sinh trưởng và phát triển của yuan Pseudomonas aeruginosa,
'Về khả năng kháng viêm, cao chiết ethanol lá cây thuốc Thượng đã có tác động tích cực lên
bệnh lý viêm phổi — dj img trong mô hình chuột gây bệnh bởi OVA Cao chiết đã làm giảm các tế bào
viêm như eosinophil, maerophage và tế bào goblet xâm nhập vào trong phổi Qua đó đã cải thiện sự thay đổi cấu trúc phổi như giảm phù nề thành phế quản, giảm gia tăng tiết dich nhầy, hạn chế sự xơ hóa khu vực ngoại vỉ ống phế quản và mạch máu Đồng thời, cao chiết thuốc Thượng đã điều hòa cân bằng các cytokines liên quan đến tế bào Th1/Th2 trong dịch phổi, cũng như các kháng thể đặc hiệu
OVA trong mau, qua đó đã ức chế các phản ứng miễn dịch xảy ra quá mức 2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
Luận văn đã góp phần cung cắp những bằng chứng khoa học mới về tính kháng khuẩn, kháng viêm của cao chiết từ lá cây thuốc Thượng; là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu tiếp
theo dé bổ sung nguồn nguyên liệu được liệu trong hỗ trợ và điều trị kháng khuẩn, kháng viêm Kết quả
nghiên cứu vẻ tác dụng kháng khuẩn và kháng viêm của cao chiết thuốc Thượng là cơ sở lý thuyết để có thể tham khảo nghiên cứu các sản phẩm Đông dược điều trị các bệnh liên quan viêm đường hô hắp
3 Hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài
~ Tiếp tục nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cao chiết thuốc Thượng trên các chủng vỉ
khuẩn khác
~ Tiếp tục khảo sát các hợp chất có trong lá cây thuốc Thượng và phân lập một số hoạt chất
chính có tính kháng khuẩn và kháng viêm trong cao chiết lá cây thuốc Thượng để thử hoạt tinh kháng khuẩn và kháng viêm nhằm mang lại hiệu quả điều trị cao hơn iii 4 Từ khóa
“Thuốc Thượng; khang viém; khdng khudn; Staphylococcus aureus; phổi
Xác nhận của GV hướng dẫn Người thực hiện đề tài
¬ Poul Ak
Trang 6
—
iv
RESEARCH ON ANTI-INFLAMMATORY AND ANTI-BACTERIAL ABILITIES OF EXTRACT OF PHAEANTHUS VIETNAMENSIS BAN LEAVES
Major: Experimental biology ‘Code: 60.42.01.14
Full name of Master student: Nguyen Thi Dong Hang Supervisor: Bui Thi Tho, Ph.D
Training Insitution: The University of Da Nang — University of Education
Abstract:
1, The major results of the thesis
The thesis consists of evaluations regarding the anti-inflammatory and anti-bacterial abilities of Phaganthus vietnamensis Ban
Ethanol extract from P vietamensis leaf has the ability t Staphylococcus aureus Additionally, P viemamensis is also it Pseudomonas aeruginosa
Regarding anti-inflammatory abilities, ethanol extract from P vienamensis leaf had a positive impact on the pulmonary inflammation mouse model induced by ovalbumin P vieinamensis extract reduced the number of inflamatory cells such as eosinophils, macrophages and goblet cells in lung In results, the lung histopathological was improved with reducing the bronchial wall thickening, the mucus secretion, the peribronchial and perivascular fibrosis Also, P viemamensis extract regulated the balance of cytokines related to Th1/Th2 cells in bronchoalveolar lavage fluid, and anti-OVA specific immunoglobulin in the serum, resulting in the inhibition of immune system overreaction
2 Science and practical significance
The thesis has provided new scientific evidence on the anti-inflammatory and antibacterial abilities of Phacanthus viemamensis, and is a document to be used for further reference for future researches Research results on the anti-inflammatory and antibacterial abilities of Phacanthus vietnamensis extract can be a theoretical knowledge base to be referred for further researches on other oriental medicines
3 Suggestions for further studies
Continuing to research on antibacterial abi bacterias Continuing to investigate another components in the Phaeanthus viemamensis Ban, identify of Phaeanthus vietnamensis Ban on other
Trang 7LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC THrererererrrererrrrrrrrrrrrrrerererererW,
DANH MỤC CÁC TỪ VIỆT: TAT
DANH MUC CAC BAN DANH MUC CAC SO DO
DANH MỤC CÁC HÌNH
MO DAU
1 Tính cấp thiết của đề
2 Mục tiêu nghiên cứu 3 Ý nghĩa của đề tài 4 Bố cục đề
CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Tong quan vé loai Phaenthus vietnamensis 1.1.1 Dae diém, phan loai 1.12 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái 1.1.4 Công dụng -
1.2 Tình hình nghiên cứu rong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chỉ Phđenthus
1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
1.3 Cấu trúc của phổi và cơ chế viêm đường hô hấp 1.3.1 Cấu trúc của phối
1.3.2 Cơ chế viêm — dị ứng đường hô ee
1.3.3 Vai trò của một số cytokine trong phản ứng viêm - dị ứng
1.4 Tổng quan về một số loại vi khuẩn, kháng sinh và tình hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh trên người 222s22<sc ul
Trang 8vi 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Phạm vi nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp điều chế cao chiết từ nguyên liệu thực vật 2.4.2 Phương pháp xác định một oe 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và xác định hoạt tinh khang khuan hợp chất từ cao chiết 27 2.4.4 Phuong pháp thử nghiệm cao chiết trên mô hình chuột viêm-dị ứng phổi 28 2.4.5 Xử lý số liệu
CHUONG 3 KET QUÁ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Xác định thành phần hóa học của cao chiết thuốc Thượng s 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thuốc Thượng
3.2.1 Tác dụng của cao chiết thuốc Thượng lên Pseudomonas aeruginosa
3.2.2 Tác dụng của cao chiết thuốc Thượng lên S/4plylococcus aureus 3.2.3 Tác dụng của cao chiết thuốc Thượng lên Zscherichia coli
3.3 Tác dụng kháng viêm của cao chiết thuốc Thượng 3.3.1 Tác động của PVE đến sự tích lũy các tế bào viêm trong phải
3.3.2 Tác động của PVE lên tinh trạng viêm và sự thay đổi cấu trúc mô phổi 3.3.3 Tác động của PVE lên việc điều hòa mức độ các kháng thể đặc hiệu „48 3.3.4 Tác động của PVE lên sự điều hòa cân bằng các phản ứng tế bào helper T trong dịch phôi c KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 22222222222222222222271 27221712 ee 52 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐÈ TÀI (Bản sao)
OVA trong serum
Trang 9
DANH MỤC CÁC TỪ VIET TAT
BALF : Bronchoalveolar lavage fluid
DK Đường kính
E coli : Escherichia coli
Trang 10viii
DANH MUC CAC BANG
Sẽ hiệu bang Tên bảng Trang
31, _| Các hợp chất được xác định trong cao chiết lá cây thuốc Thượng | —.„ bởi GC-MS 39, _ | Kh ning Khang Pseudomonas aeruginosa cia cao chiết thuốc | Thuong 33, | Khả năng kháng StaphyTococeus aureus của cao chiết thuée |) Thượng
3.4 [ Khả năng kháng Escherichia coli của cao chiết thuốc Thượng a 35, | Gil ti MIC va MBC eta eao chiét thuốc Thượng trên 3 loại vi| khuân khác nhau 2
Trang 11DANH MUC CAC SO DO
Số hiệu wr ‘ Tên sơ đồ 3 Trang
Z1 [Sơ đỗ chiết cao từ lá cây thuốc Thượng 26
22 |Môhình hen suyễn và điều trị 29
Trang 12x ANH MỤC CÁC HÌN vn 'Tên hình Trang TL | Cây thuốc Thugng (Pheanthus vieinamensis Ban) 5 T2” [Cấu trúc phối 7 13 [Cơchếviêm - dị ứng đường hô hấp 9 T4._| Vikhuin Pseudomonas aeruginosa 2 TS] Vikhudin Staphylococcus aureus 14 L6 |Vikhuẩn Zseheriehia col 15 31 [Kết quả GC-MS của cao chiét ethanol la cdy thuốc Thượng 3 32, | Khả năng không Pseudomonas aeruginosa cia cao chigtthude [5
Thượng
3a, | Khả ming Khing Staphylococcus aureus cia cao chiết thube | Thuong
34 | Kha ning kháng Escherichiz coli của cao chiết thuốc Thượng | 43 3s | PVE te chi sur tic Tay của các tế bảo viêm va ting bio tong [=
dich phéi
36 | PVE ngăn chặn sự thay đổi cầu trúc mô phối tong mô hình | „ chuột viêm - dị ứng phổi gây bởi OVA
Tác động của PVE lên mức d6 (A) ovalbumin (OVA)-specific
3.7 | IgE, (B) OVA-specific IgG1 và (C) OVA-specific IgG2 trong |_ 49 serum của chuột viêm phổi gây bởi OVA
38 [ Tác động của PVE đến sự cân bằng các chất tết t bào, 30
Trang 13hoc li Phaeanthus viemamensis Ban, thuộc họ Na - Annonaceae Đây là loài cây gỗ
nhỏ hoặc cây bụi, cao 2-10m, có vị đắng Lá dùng làm thuốc có tác dụng chống viêm
(chữa đau mắt, mụn nhọt, chữa tiêu chảy ở người và gia súc); vỏ rễ và vỏ thân cùng
với lá nấu cao dán chỗ mun nhot sung tay [18]
Theo kinh nghiệm dân gian sưu tầm, kế thừa ứng dụng và phát triển, chúng tôi nhận thấy đây là cây thuốc đặc biệt quý hiếm, có nhiều tác dụng điều trị bệnh, tuy có với nhiều loại bệnh nhưng những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này vẫn còn hạn chế Bên cạnh đó, cây thuốc
phổ ứng dụng cao đối
dân gian này vẫn chưa được khai thác đúng mức, phải đối mặt với nhiều nguy cơ như việc khai thác sử dụng không bền vững, bị mai một, thất truyền và quan trọng nhất là chưa có những bằng chứng khoa học để chứng minh tính hiệu quả trong điều trị bệnh của nó
Trong những năm gần đây, sự kháng lại các loại thuốc kháng sinh của nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh hiện đang gây nên mối quan ngại sâu sắc cho việc chăm sóc sức khỏe y tế cộng đồng trên toàn thế giới Tỷ lệ bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn (VK) đề kháng kháng sinh (KS) tăng lên rõ rệt ở cả môi trường bệnh viện và cộng đồng [22] Kháng kháng sinh là một trong những mối đe dọa toàn cầu nghiêm trọng nhất đối
với việc điều trị các bệnh truyền nhiễm Các vi sinh vật có tỷ lệ đề kháng ngày càng
cao với các loại thuốc kháng sinh thường được sử dụng bao gồm Staphylococcus aureus kháng methicillin, cầu khuẩn ruột kháng vancomycin, các loài Shigella và Salmonella đề kháng với nhiều loại kháng sinh, trực khuẩn gram âm đường ruột (loài Klebsiella và Enterobacter) kháng với ƒ-lactam phổ mở rộng va Streptococcus pheumoniae kháng penicilin [22] Tình trang kháng thuốc kháng sinh gây tác động lớn đến nền kinh tế, sự phát triển chung của xã hội Không chỉ riêng đối với Việt Nam nó còn tác động đến tất cả các nước trên thế giới, đặc biệt là trong thời đại toàn cầu hoá hiện nay Hiện tại, mỗi năm thế giới có khoảng 700.000 người tử vong do kháng thuốc Với tình hình này, WHO dự tính đến năm 2050, cứ 3 giây sẽ có 1 người tử vong do các siêu vi khuẩn kháng thuốc, tương đương với khoảng 10 triệu người mỗi năm [27] Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt Nam vào nhóm các nước có tỉ lệ kháng
kháng sinh cao nhất thế giới Tại Việt Nam đã xuất hiện vi khuẩn đa kháng (kháng 2
nhóm kháng sinh) và toàn kháng (kháng với
phát triển sử dụng kháng sinh thế hệ 1 vẫn điều trị hiệu quả thì tại Việt Nam đã phải
Trang 14
dùng kháng sinh thé hé 3 va 4 [43]
Con
do vi sinh vat thi
nguyên nhân gây ra viêm nhiễm Ngoài các nguyên nhân viêm nhiễm lêm do hóa chất, thực phẩm cũng rất phổ biến Vị
nhiệt đới âm nên bệnh liên quan đến viêm đường hô hấp, viêm phôi chiếm tỷ lệ khá cao Viêm phổi là một bệnh lâm sảng do tình trạng thương tồn tổ chức phổi (phế nang, tổ chức liên kết kẽ và tiểu phế quản tận cùng) như phổi bị viêm, mà chủ yếu ảnh
Nam là nước
hưởng đến các túi khí nhỏ được gọi là phế nang [30], [31] Viêm phỏi là bệnh phổ biến ảnh hưởng khoảng 450 triệu người trên khắp toàn cầu [38] Đây là căn bệnh gây tử vong ở mọi nhóm tuôi với số ca lên đến 4 triệu người, cÌ
năm Việc điều trị nguyên nhân chủ yếu sử dụng kháng sinh hoặc điều trị triệu chứng dùng thuốc hen như theophylin, ephedrin, corticosteroid Tuy nhiên các loại thuốc này
ìm 7% dân số thế giới mỗi
gây ra rất nhiều tác dụng phụ không mong muốn như: mắt ngủ, bồn chỗn, nhức đầu,
buổi
đập nhanh và mạnh, run cơ, đau toàn thân, sốt, tăng trị số của men gan, mẫn ngứa, và dùng lâu dài sẽ gây hiện tượng quen thuốc [24]
Hiện nay, dược liệu đóng một vai trò hết sức quan trọng trong ngành y tế Việt Nam, góp phần chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nhân dân và chữa bệnh bằng phương pháp y học cô truyền, đồng thời cung cấp một nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp
nôn, khó chịu ở bụng, rối loạn tiêu hoá, đắng miệng, đánh trống ngực làm tim
dược để sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng Thực vật được xem như là một trong
những nguồn dược liệu thay thế lý tưởng vì mức độ an tồn, khơng hoặc ít phản ứng
phụ, và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy co gay ra sự kháng thuốc [37] Các nguồn dược liệu từ thực vật đặc biệt là các nguồn thực vật được sử dụng trong dân gian ngày càng được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm nhằm tìm kiếm các minh chứng khoa học cho tác dụng dược lý của chúng Việc sử dụng nguồn nguyên liệu từ cây dược liệu để chiết xuất các hoạt chất mới có dược tính mạnh hơn, ít độc hơn, giúp đem lại khả năng bảo chế ra những bài thuốc
mới với chỉ phí nghiên cứu phát triển kinh tế hơn rất nhiều so với việc nghiên cứu bào
chế thành công một hóa dược mới
Xuất phát từ mong muốn bảo tổn, phát triển và ứng dụng tiềm năng của các cây
thuốc dân gian đồng thời cung cấp các dữ liệu khoa học về khả năng điều trị bệnh và
tìm kiếm liệu pháp chữa trị bệnh an toàn từ nhiên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thugng (Phaeanthus vietnamensis Ban)”
2 Mục tiêu nghiên cứu 3.1 Mục tiêu tổng quát
Trang 15~ Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của cao chiết từ lá cây thuốc Thượng trên một
số chủng vi khuân gây viêm đường hô hấp trên người
~ Đánh giá tác động điều trị của cao chiết trên mô hình chuột nhất trắng gây bệnh viêm phổi
3 Ý nghĩa của đề 3.1 Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những bằng chứng khoa học mới về tính kháng khuẩn, kháng viêm của cao chiết từ lá cây thuốc Thượng;
~ Là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu tiếp theo để bổ sung nguồn nguyên liệu dược liệu trong hỗ trợ và điều trị kháng khuân, kháng viêm 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu về tác dụng khang khuat
kháng viêm là cơ sở lý thuyết để có thể tham khảo nghiên cứu các sản phẩm Đông dược điều trị viêm đường hô hấp
4 Bố cục đề tài Gồm 3 phan:
~ Phần mở đầu
- Phần nội dung
+ Chương 1 Tổng quan tải liệu
+ Chương 2 Đồi tượng, nội dung, phạm vi và phương pháp nghiên cứu + Chương 3 Kết quả và bàn luận
~ Phần kết luận và kiến nghị
Trang 16CHUONG 1
TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Téng quan về loài Phaenthus vietnamensis 1.1.1 Đặc điễm, phân loại
Tén khoa hoc: Phaeanthus vieInamensis Ban
Tên tiếng Việt: Cây thuốc Thượng; thuốc mọi; thuốc dấu cà doong; da xà lắc Cây thuốc Thượng được phân loại như sau Nhánh: Basal Angiosperms Nhánh: Magnoliids — Ngọc Lan Bộ: Magnolialex — Ngọc Lan Họ: Annonaceae = Na Phân ho: Malmeoideae Tông: Miliusese
Chi: Phaeanthus Hook.f &Thomson Loài: Phaeanthus viernamensis Ban
Thuốc Thượng là cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao chừng 2-10m Cành non, gan
như không lông Lá thuôn hoặc gần hình mác, dài 9-16cm, rộng 3-7cm, chóp lá thường thành mãi đài và nhọn, gốc lá hình nêm và hơi lệch; gân bên 9 - 11 đôi, nỗi rõ ở mặt dưới, cong hình cung và hơi vấn hợp ở gần mép; cuống lá dài 5 - 6mm, không có lông Hoa mọc so le với lá, thường thành xim 2 - hoa; cuống chung dài 1 - 1,5cm; cuống hoa đài 1,5 - 3em, mang 4 - 6 lá bắc nhỏ Lá đài và cánh hoa ngoài gần giống nhau, hình mác, đài trên 1 mm; cánh hoa trong màu vàng (khi già trở nên trắng), hình trứng, dài 8 - 12mm, rộng 4 - 6mm, dính nhau bởi mép từ gốc tới đỉnh Nhị nhiều; mào trung đới
hình đĩa hơi nhọn đầu Lá noãn nhiều; bầu có lông; núm nhụy hình đầu, có lông,
không có vòi nhụy Noãn 1, bao phấn đính gốc Phân quả hình trái xoan, cỡ 12 - 15 x 6 ~ 7mm, khi chín màu vàng sau đó thành màu mận chín; cuống phân quả dài 13 -
Trang 17Hình 1.1 Cây thuéc Thuong (Pheanthus vietnamensis Ban)(620x429)
1.1.2 Phân bỗ
Trung Bộ Việt Nam: Thừa Thiên - Huế (Phú Lộc), Quảng Nam (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn, Đông Giang) [18]
1.1.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái
Cây ra hoa từ tháng 5 đến tháng 12, có quả tháng 6 đến thang | nim sau Moc
rải rác dưới tán rừng thưa, rừng thứ sinh nơi ẩm, ở độ cao dưới 300m [18] 1.1.4 Cong dung Bộ phận dùng là lá, vỏ thân, vỏ rễ Thuốc Thượng có vị đắng; có tác dụng hoạt ; chủ trị viêm loét dạ đày, nhiễm trùng đường ruột, co thất đại tràng, hen phế quản Dân gian
huyết, giảm đau, tiêu viêm, kháng khuẩn, sát trùng, có thể hạ đường hu
dùng lá non trị đau mắt Vỏ rễ, vỏ thân và lá đem nấu cao dán mun nhot sung tay
Hoặc cao đặc chế từ lá chữa bệnh tiêu chảy [18]
1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh hge cia chi Phaenthus
1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chỉ
Phaeanthus được bắt đầu từ năm 1968
Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của chỉ Phaeanthus cho
thấy loài này có chứa các chất thuộc nhóm alkaloid, các hợp chất như phaeanthine,
Trang 186
[28] Năm 1983, T A Van-Beek đã phân lập được hợp chất phacanthine và phaeantharine từ lá và vỏ cây loài Phaeamhus ebracreolarus Năm 1990, từ loài Phaeanthus crassipetalus Fasihuddin và cộng sự cũng phân lập được hai hợp chất phaeathine và limacine [25] Đến năm 2007, Khalijah Awang cùng các cộng sự đã chiết tách được 2 alkaloid seco-benzylisoquinoline mới là pecrassipine A và pecrassipine B cùng với 7 alkaloid đã biết: (-)-O-methyldauricine, (-)-limacine, +(-) vietnamine, doryphornine methyl ether, thalifoline, lanuginosine, (+)-limacusine từ vỏ cy cua loai Phaeanthus crassipetalus [29] Tiếp đến năm 2011, Pei Jean Tan và các cộng sự đã xác định được cấu trúc của một hợp chất mới li 7-formyl-151- hydroxypurpurin-7-lactone methyl ester và phân lập được năm hợp chất: pheophorbide-u, pheophorbide-œ methyl ester, 13°hydroxylpheophorbide-œ methyl
ester, pheophytin-a, va 15'-hydroxypurpurin-7-lactondimethyl ester từ loài Phaeanthus ophthalmicus [39]
Tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học các loài thuộc chỉ Phaeanthus
còn khá ít Các alkaloid phân lập từ chỉ Phaeanrhus có khả năng điều trị vết thương, và
chữa các bệnh huyết áp Một số báo cáo đã cho thấy một số hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ một số loài thuộc chi này như tính kháng khuẩn; gây độc tế bào ức chế tế bào ung thư; chống oxi hóa Năm 2011, Pei Jean Tan và các cộng sự đã báo cáo khả năng ức chế các tế bảo ung thư HL60 của các photosensitisers từ dịch chiết loài Phaeanthus ophthalmicus [25] Cùng năm 2011, Kazumasa Zaima và cộng sự đã báo cáo tác dụng giãn mạch rõ rệt của các bisbenzyl isoquinoline alkaloids, benzyl isoquinoline alkaloids, va_ isoquinoline alkaloids phân lập tir Phaeanthus crassipetalus [40] Năm 2013, Hairin Taha và các công sự nghiên cứu tác dụng chống lại sự co that gây ra bởi NE của loai Phaeanthus crassipetalus Gần đây, năm 2017, Nguyen Xuan Nhiem và cộng sự đã công bồ tác dụng ức chế hoạt động của sản phẩm gây viêm oxit nirit (NO) của 3 hoạt chất mới phân lập gồm (7S,88,8#)-9.-epoxy -3,5.3⁄5'- tetramethoxylignan-4,4’,7-triol, 8a-hydroxyoplop-11(12)-enl4-one, và (1#25,45)-4- acetyl-2ŒE)- (cinnamoyloxy)] -I-methyleyclohexan-l-oltừ cây Phaeanthus vietnamensis Ban [33]
1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Cây thuốc Thượng là một loài cây thuốc quý được sử dụng trong dân gian để giảm đau, tiêu viêm, kháng khuẩn, hạ đường huyết; đặc biệt chủ trị viêm loét dạ dày, nhiễm trùng đường muột
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học từ các chiết xuất
các loài thuộc chỉ Phaean:hus còn rất hạn chế Năm 1991, Nguyễn Thị Nghĩa và các
Trang 19
trong số này được xác định là isoquinolines N-methyl-6,7- dimethoxy isoquinolone, N- methylcorydaldine, phenanthrenes argentinine, atherospermine, seco-benzylisoquinoline petalinemethine Hai bisbenzylisoquinoline méi đã được mô tả là (-)-7,7'-O,O'- dimethylgrisabine va (-)-7-O-methylgrisabine va 1 secobisbenzylisoquinolone mới là vietnamine [34] Năm 2012, Võ Duy Lê Sơn Đại học Nông lâm thành phó Hồ Chí Minh đã nghiên cứu Định tính- định lượng - chiết tách và khảo sát hoạt chất kháng khuẩn của hop chat Alkaloid trong cay thuée Thugng (Phaeanthus vietnamensis Ban) [15]
Năm 2014, Đào Hùng Cường và cộng sự đã nghiên cứu về thành phần hóa học từ cây thuốc Thượng (Phaeanthus vieinamensis Ban) [4] Năm 2016, Nguyễn Trung Tường và cộng sự đã nghiên cứu về các hợp chất alkaloid phân lập từ lá cây thuốc Thượng (Phaeanthus vienamensis Ban) Tuy nhiên đây mới chỉ là bước đầu mang tính chất thăm dò, cần có nhiều hơn nữa các nghiên cứu về thành phần hoạt chất cũng như các hoạt tính sinh học chuyên sâu của loài cây thuốc đặc hữu Việt Nam Phaeanthus
vietnamensis Ban
1.3 Cấu trúc của phối và cơ chế viêm đường hô hấp 1.3.1 Cấu trúc của phối
Phổi là một cơ quan của hệ hô hấp, nằm bên trong lồng ngực có đặc tính đàn
hồi, mềm và xốp, là cơ quan quan trọng trong cơ thể với chức năng chủ yếu là trao đổi
Trang 20Phỏi đưa oxy từ không khí lưu thông vào tĩnh mạch phổi, và đưa CO; từ động mạch phổi ra bên ngồi mơi trường
Bên cạnh đó, phổi cũng giữ một số chức năng thứ yếu khác như: lọc độc tố
trong máu, lọc một số các chất sinh hóa Không những thế, phổi cũng là một khoang không gian để lưu trữ máu
Phdi bao gồm hai buồng phổi nằm bên trong lồng ngực, được bảo vệ bởi các
xương sườn xung quanh, bên dưới phôi gồm có cơ hồnh ngăn giữa phơi và các cơ
quan trong bụng như: gan, dạ dày, lá lách [16] Cấu tạo của phối
Giữa 2 buồng của phôi là khí quản giữ chức năng là một ống dẫn khí chính Cây khí quản lại được phân thành hai nhánh phế quản chính Quả tim nằm giữa 2 bên phổi, hơi chếch về bên mạn phổi trái Buồng phổi bên trái gồm có 2 thùy phổi, bên phổi phải thì có 3 thùy Mỗi buồng phổi lại có một phế quản chính, 2 tĩnh mạch và 1 động mạch chính
Những ống dẫn này lại được chia thành giống như các rễ cây chỉ chít ở giữa ngực đến các cực nhỏ phía ngoài cùng của 2 bên buồng phổi, kèm theo đó là các dây thần kinh lớn, nhỏ và các mạch bạch huyết bao xung quanh [ 16]
Bề mặt phế quản và phế nang được bao phủ bởi lớp nhung mao rất mịn và một
lớp màng nhầy mỏng Các chất nhây giữ bụi, hạt phấn và các chất ban Các nhung mao
chuyên động đây các bản lên, đưa vào thực quản nuốt xuống dạ dày theo nước miếng [I6]
Trang 21
9 1.3.2 Cơ chế viêm — dị ứng đường hô hấp MHC (as molecule Alegen T,Z cai Trúc ‘Abdullah A Alangari, 2012
Hình 1.3 Cơ chế viêm — dị ứng đường hô hấp
Trang 2210
trơn và lớp biểu mô thành phế quản gây co thắt phế quản dẫn đến khó thở IL-13 trực tiếp gây phù nề, co thắt thành phế quản và khu vực ngoại vi phế quản, cũng như mạch
máu, đồng thời tăng tiết dịch nhẳy trong ống phế quản Bên cạnh đó, tế bào Th1
IEN-y hoặc IL-12 có tác dụng ức chế Th2 sản xuất các cytokines viêm kể trên [20] 1.3.3 Vai trò của một số cytokine trong phản ứng viêm — dj ứng
Cytokine là những protein hay glycoprotein được tạo ra bởi nhiều loại tế bảo
khác nhau Chúng đóng vai trò đặc trưng trong sự tác động qua lại và truyền thông tin giữa các tế bao Cytokin có chức năng như là một phần của hệ thống lớn hơn liên quan đến nhau của protein và thác tín hiệu, đó là mạng lưới cytokin Đây là những tương tác phức tạp trong đó các tế bào khác nhau có thể phản ứng khác nhau đối với cùng một cytokin tùy thuộc vào các tín hiệu được tiếp nhận bởi tế bào Tin hiệu cytokin rất linh hoạt và có thê gây ra cả hai phản ứng bảo vệ và làm hư hại Một cytokin thường ảnh
hưởng đến sự tổng hợp các cytokin khác Chúng có thể tăng cường hay ức chế sản xuất cytokin khác Ngoài ra, chúng thường có thể ảnh hưởng đến hoạt động của các
eytokin khác Các hiệu ứng có thể là: đối kháng, phụ thêm, hoặc hiệp đồng Các
cytokin thường không được lưu trữ như protein da tao ra từ trước Thay vì sự tổng hợp của cytokin được bắt đầu bằng phiên mã gen và mRNA của chúng tồn tại ngắn ngủi Chúng được sản xuất khi cần thiết trong phản ứng miễn dịch Các gen mã hóa cho eytokin có thể sản xuất các biến thể thông qua việc cắt nói để tạo ra các protein hơi khác nhau nhưng có hoạt tính sinh học Nhiều cytokin được sản xuất bởi nhiều loại tế bào và tham gia vào cả hai đáp ứng miễn dịch tự nhiên và thu được Các cytokin riêng rẽ cũng tác động lên nhiều loại tế bào và trong nhiều trường hợp cytokin có cùng hoạt tính (ví dụ, chúng bị thừa) Sự dư thừa là do bản chất của các thụ thể của cytokin Cytokine gắn vào thụ thể đặc hiệu trên các tế bào đích với ái tính cao và các tế bào đáp ứng với một cytokin
Các cytokin có thể được xếp thành các loại khác nhau dựa vào chức năng của
chúng hay nguồn gốc của chúng, nhưng điều quan trọng cần nhớ là chúng có thể được
sản xuất bởi các té bao khác nhau và hoạt động trên các tế bào khác nhau, bất kỳ nỗ
lực nào để phân loại chúng cũng sẽ bị hạn chế Dưới đây là một số cytokines liên quan
đến phản ứng viêm — di img đường hô hap được đề cập trong nghiên cứu này [5]
Interleukin 4 (IL-4)
Interleukin 4 được sản xuất bởi các đại thực bào và tế bào Th2 Nó kích thích sự phát triển của các tế bào Th2 từ tế bào Th “trinh tiết” và nó thúc đây sự tăng trưởng biệt hóa của các tế bào Th2 gây đáp ứng sinh kháng thể Nó cũng kích thích lớp kháng thể chuyển đổi sang sản xuất các isotyp IgE [5]
Trang 23
ra IgE, do đó nó có vai trò quan trọng trong bệnh dị ứng IL-4 lại ức chế tế bào Th-2 là tế bào có vai trò phát triển miễn dịch tế bào, nghĩa là IL-4 cũng gián tiếp ức chế miễn
dịch tế bào IL~4 ức chế sản xuất các yếu tố viêm như IL-1, IL-6, TNE IL- 4 còn có
hoạt tính chống ung thư Interleukin 5 (IL-5)
Interleukin 5 được sản xuất bởi các
sào Th2 và nó có chức năng thúc đây sự tăng trưởng và biệt hóa của các tế bào B và bạch cầu ái toan Nó cũng hoạt hóa bạch
cầu ái toan trưởng thành [5]
Interleukin 13 (IL-13)
Interleukin 13 được sản xuất bởi các tế bào Th2, tế bào CD4, tế bào mass, tế
bào eosinophil, nó có cấu trúc tương tự như IL-4 Interleukin 13 là yếu tố điều hòa trung tâm trong tổng hợp IgE, tế bào goblet, tăng tiết chất nhảy, tăng phản ứng đường hô hấp, và xơ hóa Nó là một trung gian của viêm dị ứng và các bệnh khác nhau bao gồm hen suyễn [36] Interleukin 12 (IL-12) Interleukin 12 được sản xuất bởi các đại thực bào và tế bào đuôi gai hoạt hóa Nó tế bào Thl Ngoài ra, nó tăng cường các chức năng ly giải của tế bào Te và NK [5]
ích thích sản xuất IFN-y và gây ra sự biệt hóa của các tế bào Th để trở thành các Interferon — gamma (IFN-y)
Interferon gamma là một cytokin quan trọng được sản xuất chủ yếu bởi các tế
bào Th1, mặc dù nó cũng có thể được sản xuất bởi các tế bào NK và Te với một mức độ thấp hơn Nó có nhiều chức năng trong cả hai hệ thống miễn dịch tự nhiên và thu
được [S]
GATA3
GATA 3 là một yếu tố phiên mã được mã hóa bởi gen GATA 3 GATA 3 can thiết cho sự phát triển của các tế bào bạch huyết bẩm sinh, đặc biệt là các tế bào Th2
Va do đó, GATA 3, rat quan trong cho sự phát triển của các phản ứng miễn dịch dị
ứng va thé dich ở người Các nghiên cứu ở động vật cho thấy GATA 3 có vai trò trong sự phát triển của các tế bào lympho, do đó nó làm trung gian trong các phản ứng miễn dịch GATA 3 thúc đẩy tiét IL-4, IL-5 va IL-13 tir các tế bào Th2 ở người và tương tự trên các tế bào Iympho chuột [41], [42]
1.4 Tổng quan về một số loại vỉ khuẩn, kháng sinh và tình hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh trên người
1.4.1 Tổng quan về một số loại vỉ khuẩm
a Pseudomonas aeruginosa
Trang 2412
Proteobacteria; B6: Pseudomonadales; Ho: Pseudomonadaceae; Chi: Pseudomonas
Hinh 1.4 Vi khudn Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) hay con goi la true khuan mit xanh, là trực khuẩn Gram âm hiếu khí, có dạng hình que nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc có khi xếp thành chuỗi và có khả năng di động bằng một hoặc nhiều lông ở một đầu
Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy thích hợp, chúng tạo nên những sắc tố xanh không phát huỳnh quang, một số chủng có thể tạo màu xanh huỳnh quang Mủ của vết thương bị nhiễm P øeruginosa thường có màu vàng xanh, nên được gọi là trực khuẩn mủ xanh [6]
'P aeruginosa thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngoài óng ánh như hạt trai và có mùi giống như nho hoặc bánh tortilla khi được nuôi cdy invitro Các triệu chứng khẳng định sự cé mat cia P aeruginosa trong lâm sàng thường bao gồm khả năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát triển tại nhiệt độ 42°C
Mặc dù được phân loại là một sinh vật hiếu khi, P aeruginosa con duge xem
như là sinh vật ki khí tùy nghĩ, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng và thậm chí khi thiếu nitrat nó cũng có thẻ lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất
Trong môi trường tự nhiên, P aeruginosa có thể sống trong đất, trong đầm lầy và đặc biệt là môi trường ven biển, chúng tồn tại trong điều kiện mà ít sinh vật nào có thể chịu được [6]
‘Truc khuẩn mủ xanh phô biến trong môi trường tự nhiên, có mặt khắp nơi trong
Trang 25bề mặt các vật thê hữu cơ trong nước Trong nhà ở, có thể tìm được trực khuẩn mủ
xanh từ bồn rửa chén, bồn tắm, vòi sen, hồ bơi
Vi khuẩn này có thể gây nhiều bệnh khác nhau ở người, nhưng ít khi gây bệnh nặng ở những người khỏe mạnh mà không có các yếu tố thuận lợi kèm theo Nó phát triển mạnh ở các vết thương, vết bỏng; gây nhiễm trùng đường hô hắp kết hợp với các vi khuẩn khác; gây nhiễm trùng các vết thương ở mắt (thường gặp ở những người nông dân trong vụ mùa, bị hạt lúa bắn vào mắt làm xước giác mạc, sau đó bị bội nhiễm trực khuẩn mủ xanh gây viêm loét giác mạc cấp, có thể mù nếu không điều trị kịp thời) Từ những vị trí này, P aeruginosa có thể xâm nhập sâu vào cơ thể gây hoại tử vết thương, nhiễm trùng huyết, viêm màng não
'Những bệnh nhân bị bệnh xơ nang phổi hoặc suy giảm miễn dịch có thể bị bội nhiễm trực khuẩn mủ xanh gây nhiễm trùng phổi nặng Tắm, lội ở các vùng nước nhiễm bắn, trực khuẩn mủ xanh có thể gây viêm nang lông (nhiễm trùng da), viêm tai giữa
Đa số các chủng trực khuân mủ xanh đề kháng nhiều loại kháng sinh làm khó
khăn cho việc điều trị Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện, đó là tình trạng bội nhiễm các loại vi khuẩn đề kháng nhiều kháng sinh, hiện diện trong môi trường bệnh viện [ 13]
b Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus (S aureus) hay con goi la vi khuân tụ cầu vàng thuộc
giống Staphylococcus, do đó mang những tinh chat chung cia Staphylococcus Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loai Staphylococcus aureus [3] Tu cau vàng có đường kính từ 0,8-lum, đứng thành chùm như chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường không có vỏ Trong bệnh phẩm tụ cầu thường tụ tập thành đám nhỏ như những chùm nho Trong môi trường canh khuân xếp
thành những đám lớn Š/alylococcus aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều
Trang 2614
Hinh 1.5 Vi khudn Staphylococcus aureus
Tụ cầu vàng đễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 -45°C và nồng độ muối cao tới 10% Thích hợp được ở điều kiện hiếu và ky khí Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẫn Sau 24h ở 370C, khuân lạc thường có màu vàng chanh Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hồn tồn Trên mơi trường canh thang, tụ cầu làm đục môi trường, lắng cặn [3]
Tu cau vàng là loài vi khuẩn có độc lực cao, thường gây bệnh trên da Độc tố ruột sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng: là những protein tương đối chịu nhiệt, nên không bị hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử tir 28000 — 30000 dalton và bao gồm 6 typ được ký hiệu từ A-F Về miễn địch, 6 typ này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có kháng nguyên chéo [3]
Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc: kích thích giải phóng TNF alpha và các Interleukin 1, 2 với cơ chế gây shock tương tự như nội độc tố Exfoliatin toxin: là một ngoại độc tố gây hội chứng bong vảy da ở trẻ em Alpha toxin: gây tan bạch cầu đa
lâu có tỈ
nhân và tiểu cầu, gây các ô áp xe và hoại tử da, tan máu Leucocidin: độc tố bạch cầu gây độc cho bạch cầu gồm 2 mảnh F và S với trọng lượng phân tử 32000 và 38000 dalton Một số độc tố khác của tụ cầu gồm: Ngoại độc tố sinh mủ, dung huyết tố (hemolysin), coagulase, hyaluronidase, beta-lactamas [3]
Trang 27Staphylococcus aureus con 1a mot mim bénh phé bién lign quan dén mét loat các bệnh nhiễm trùng ảnh hưởng đến đường hô hấp, từ nhiễm trùng không có triệu
chứng đến viêm phơi hoại tử hồn toàn [23]
c Escherichia coli
Escherichia coli (E coli) thuge: Giéi: Bacteria; Nganh: Proteobacteria; Lp: Gammaproteobacteria; B6: Enterobacteriales, Ho: Enterobacteriaceae; Chi: Escherichia; Loài: E Coli
E coli là một loài vi khuẩn Gram âm, hay có mặt ở thực phẩm, nguồn nước, thường kí sinh trong ruột già của người và hầu hết các loài thú đẳng nhiệt
Hinh 1.6 Vi khudn E coli
Trong những điều kiện không thích hợp (vi dụ trong môi trường có kháng sinh) vi khuân có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng Z cofi có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Một số có thê phát triển trên môi trường tông hợp rất nghèo chất dinh dưỡng
Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 — 40°C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37°C
12)
Trang 2816
trường qua phân, có khả năng tiếp tục tạo nên các quản thể sống tự do, sinh trưởng mạnh trong phân tươi ở điều kiện yếm khí vài ba ngày rồi mới giảm tăng trưởng [12] Nhiễm trùng phổi do E coli hiếm gặp trên lâm sàng Tillotson và Lerner báo cáo rằng E coli chỉ chiếm 0,7% trong số 1.882 trường hợp viêm phổi tại Bệnh viện Nhiễm
khuẩn E coii thường gây ra viêm phế quản phổi với sự xâm nhập mô kẽ của các tế bào
đơn nhân Các yếu tố nguy cơ bao gồm bệnh mãn tính, đặc biệt là bệnh đái tháo
đường, bệnh thận và nghiện rượu [21]
1.4.2 Kháng sinh và kháng sinh thực vật a Khang sinh
“Kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuan (antibacterial substances)
được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nắm, Actinomycetes), có tác dụng ức
chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [25]
Hiện nay từ kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tông hợp như các sulfonamid và quinolon
Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động - 4 thành phần cấu
tạo cơ bản của tế bào và phát huy tác dụng: kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn, đặc biệt có hiệu quả ở các vi khuẩn đang sinh trưởng và phát triển mạnh bằng cách
Uc ché sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: các kháng sinh nhóm beta-lactam, fosfomyein và vancomycin ngăn cản sinh tổng hợp lớp peptidoglycan nên không tạo được khung murein - tức là vách không được hình thành Tế bào con sinh ra không có
vách, vừa không sinh sản được vừa dễ bị tiêu diệt hoặc bị li giải, đặc biệt ở vi khuẩn
Gram-dương Như vậy, những kháng sinh này có tác dụng diệt khuẩn nhưng chỉ với
những tế bào đang phát triển (degenerative bactericide)
Gây rối loạn chức năng màng bào tương: chức năng đặc
màng bảo tương là thâm thấu chọn lọc; khi bị rối loạn các thành phần (ion) bên trong
tế bảo bị thốt ra ngồi và nước từ bên ngoài ào ạt vào trong, dẫn tới chết, ví dụ
quan trọng của
polymyxin B, colisin Với cơ chế tác động này, polymyxin có tác dụng diệt khuẩn
tuyệt đối (absolute bactericide), tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả tế bào ở trạng,
thái nghỉ - không nhân lên [19], [25]|
Trang 29amin liên kết tạo polypeptid) nhu erythromycin, cloramphenicol, clindamyein Kết quả là các phân tử protein không được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có
hoạt tính sinh học làm ngừng trệ quá trình sinh trưởng và phát triển
Phong bề mạch polypeptid Nhóm phenicol, macrolid có khả năng gắn vào phần 50S của ribosom vi khuẩn, phong bế enzyme transferase (enzyme chuyển acid amin tir ARN vận chuyển) làm quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn bị ngừng
Tao protein bat thường, vô dụng Tetracyclin và aminoside có khả năng gắn vào phần 30S của ribosom vi khuẩn, gây nên đọc sai mã của ARN - thông tin khiến protein được tạo ra bắt thường, vô dụng đối với đời sống của vi khuẩn
Ức chế sinh tổng hợp acid nueleic: gồm ba cấp độ: Ngăn cản sự sao chép của ADN mẹ tạo ADN con, ví dụ do kháng sinh gắn vào enzym gyrase làm ADN không mở được vòng xoắn, như nhóm quinolon; ngăn cản sinh tổng hợp ARN, ví dụ do gắn vào enzym ARN-polymerase như rifampicin; ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển
hóa cần thiết cho tế bào: quá trình sinh tổng hợp acid folic — coenzym cần cho quá trình tổng hợp các purin và pyrimidin (và một số acid amin) bị ngăn cản bởi sulfamid và trimethoprim [25]
Cạnh tranh đối kháng
Đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit Acid folic giữ vai trò cần thiết trong quá trình tổng hợp acid nueleic Để tổng hợp ra acid folic, một số vi khuẩn phải sử dụng acid paraaminobenzoic (PAB) có trong môi trường Sunfonamit có cấu trúc hóa học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫn đến ngừng tông hợp acid nueleic của vi khuẩn
Nhu vậy, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thành phần
cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khác nhau của
tế bào vi khuân, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào Nếu vi khuân không bị li giải hoặc không bị nắm bắt (thực bào) và tiêu diệt, thì khi không còn tác động của kháng sinh (ngừng thuốc) vi khuẩn sẽ có thể hồi phục (sống) trở lại (reversible) Chỉ cần 1 tế bào sống sót, với tốc độ sinh sản nhanh chóng, sau vài giờ số lượng tế bào vi khuẩn đã không thể đếm được (ví dụ E coli nếu 20 phút “đẻ 1 lứa” thì sau 5 gid: từ 1 tế bào mẹ - ban đầu phát triển thành 215
hơn I tỷ); sẽ nguy hiểm hơn nữa nếu tế bào sống sót đó đề kháng khang sinh [19] b Phân loại kháng sinh
Tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng, người ta phân loại kháng sinh dựa
trên nhiều cơ sở khác nhau:
Trang 3018
~ Dựa vào cấu trúc hóa học:
'Nhóm f-lactam: penicil
ampicillin, amoxicillin, cephalosporin Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin Nhém polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin
Nhóm tetracyclin: tetracyclin, oxytetracyclin, chlotetracyclin, doxycyclin
Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol Nhóm macrolid: erythromycin, spiramycin, tylosin Nhóm cận macrolid: lincomycin, virginiamycin
Nhóm sulfamid: sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazol Nhóm diaminopyrimidin: trimethoprim, diaveridin
Nhóm quinolon: acid nadixic, flumequin, norfloxacin Nhóm nitrofuran: nitrofurazol, furazolidon, furaltadon
Các nhóm khác: glycopeptid, pleuromutilin, polyether ionophor
~ Dựa vào cơ chế tác động:
Tac d6ng lén thanh té bao vi khuan: cycloserin, vancomycin, penicillin Tác động lên màng sinh chất: polymycin, nystatin
“Tác động lên sinh tổng hợp DNA: quinosolon, rifampin, sulfonamid 'Tác động lên sinh tổng hợp protein: tetracyclin, aminoglycosid [19] ~ Dựa vào phổ điệt khuẩn
Kháng sinh đặc hiệu chỉ tác động lên một loại vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn nhất định Ví dụ: spectinomycin tác động lên vi khuẩn lậu
Các loại kháng sinh phổ rộng: có hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn khác nhau
Kháng sinh phô hẹp: chỉ tác động lên một số vi khuẩn
Cách này chỉ phù hợp với một số KS nhất định và mang tít
Được sử dụng theo kinh nghiệm trong định hướng ban đầu khi chưa có kết quả xét nghiệm KS đồ, bao gồm:
ước lệ
KS tac dụng lên các vi khuẩn Gram dương: penicillin, erythromycin KS tac dụng lên các vi khuẩn Gram (-): chloramphenicol, gentamycin KS phổ rộng: các cyclin, cephalosporin II, III quinolon, imipenem KS phé hep chuyên biệt
Voi cac cdu khuan Gram dương: oxacillin, cephalosporin I, vancomycin KS chéng lao: rifampicin, isoniazid, streptomycin
Trang 31~ Dựa vào khả năng tác động của kháng sinh:
Kháng sinh diệt khuẩn: gồm những kháng sinh có tác động lên thành tế bào của vi khuẩn, làm ly giải tế bào vi khuẩn bị tác động (ví du: penicillin, cephalosporin, aminoglycosid, polymycin ) Độ mạnh của kháng sinh diệt khuẩn được xác định bằng nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) Kháng sinh diệt khuẩn thường được dùng trong các trường hợp diệt khuẩn nặng hay nhiễm khuẩn trên cơ địa đã suy yếu
Kháng sinh kiềm khuẩn: gồm những kháng sinh có tác động lên quá trình tổng hop DNA và protein (Ví dụ: tetracyclin, macrolid, chloramphenicol, quinolon, rifampin, sulfonamid ) D6 mạnh của kháng sinh kiềm khuẩn được xác định bằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kháng sinh kiểm khuẩn thường được sử dụng trong các trường hợp nhiễm khuẩn nhẹ thông thường để hạn chế sự sinh sản của vi khuẩn,
tạo điều kiện cho hệ miễn dịch của cơ thê tiêu diệt khuẩn [25]
~ Dựa vào được lực, được động học:
Kháng sinh diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ: tác động diệt khuẩn tăng theo nồng độ thuốc trong máu Ví dụ: aminoglycosid, fluoroquinolon, metronidazol, rifampicin
Kháng sinh điệt khuẩn phụ thuộc vào thời gian: tác động diệt khuẩn không tăng theo nồng độ thuốc trong máu Ví dụ: kháng sinh nhóm j-lactam
~ Dựa vào nguôn góc kháng sinh:
Kháng sinh có nguồn gốc từ thiên nhiên; vi sinh vật, thực vật Trong đó kháng
sinh có nguồn góc từ vi sinh vật thường có hoạt tính mạnh hơn các kháng sinh khác Kháng sinh tổng hợp: những kháng sinh được tổng hợp hóa học dựa trên những cấu trúc hóa học đã biết của kháng sinh phân lập từ thiên nhiên, thông thường là từ vi sinh vật
Kháng sinh bán tông hợp: những kháng sinh được sản xuất bằng tổng hợp hóa học kết hợp với lên men tự nhiên từ vi sinh vật [9]
e Kháng sinh thực vật
Kháng sinh thực vật (hay còn goi la Phytonxit) được hiễu là những hoạt chất có chất hữu cơ Các hợp chất hữu cơ này có khả năng tiêu diệt hoặc „ nấm, đơn bào và virus Các loại hợp chất này có nguồn gốc từ thực
Kháng sinh thực vật được phân loại dựa vào yếu tổ :
Trang 3220
phat trién cua vi khuan, vius, nam
Nhóm không bay hơi: Gồm những hợp chất hữu cơ không có khả năng tự khuếch tán vào môi trường không khí Chúng cũng có khả năng tiêu diệt hoặc kìm
hãm vi khuẩn, nắm
Với nguồn gốc là từ thực vật và được hình thành từ các quá trình sinh học tự nhiên lên các kháng sinh thực vật phần lớn có tính an toàn cao trong sử dụng it có các
tác dụng phụ không mong muốn, Nguồn nguyên liệu để sản xuất rất phong phú, chỉ phí nguyên liệu rẻ, có thể sử dụng trong thời gian dài
Tuy nhiên, do hoạt lực yếu hơn các kháng sinh từ vi sinh vật và các kháng sinh tông hợp, bán tổng hợp khác, nên chỉ sử dụng được trong những trường hợp nhiễm khuẩn nhẹ và thông thường
Liều điều trị cao, thời gian điều trị kéo dài
Một vài nhóm hợp chắt từ thực vật có hoạt tính kháng sinh Alkaloid:
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, da số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử chung của alkaloid
Alealoid có phổ biến trong thực vật Trong cây, alcaloid thường tập trung ở một
số bộ phận nhất định như ở hạt Mã tiền, cafè ở quả: ớt, hồ tiêu [8]
~ Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một alcaloid duy nhất mà thường có hỗn hợp nhiều alcaloid, alcaloid có hàm lượng cao được gọi là alealoid chính, còn lại là phụ Cơ chế kháng khuẩn berberin là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chính vì điều này mà tác dụng kháng khuẩn của berberin khá mạnh đối với loại trùng gây bệnh này [8]
Một vài alkaloid có hoạt tính kháng khuẩn: berberin (Vàng đắng, Hoàng liên),
solamargin (họ Cà), capsaicin (Ớt), cây thuốc Thượng [15]
Coumarin
Coumarin (cumarin) là nhóm hợp chat tự nhiên, được xem là dẫn xuất lacton
của axit octo-hydroxi xinamic Đến nay đã xác định được khoảng 600 chất Coumarin
và các dẫn xuất của nó là các hợp chất khá hoạt động tồn tại trong tự nhiên ở dạng tự do hay liên kết với các hợp chất khác Nhiều nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra rằng Coumarin có nhiều trong các loài thuộc họ Đậu (Fabaceae), họ Hoa tán (Apiaceae), ho Cam (Rutaceae)
Trang 33ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mắt chức năng của protein Vì lí do đó khả năng kháng khuân của coumarin rất lớn Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh
vật là bề mặt tế bào, polypeptid ở thành tế bào và các enzym trên màng
Coumarin là một hợp chất thiên nhiên quan trọng, có tác dụng dược lý cao Coumarin được dùng để làm thuốc chống đông máu Ngoài ra một số Coumarin có tác
dụng làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi, có tác dụng chống co thất Một số
chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật Sự có mặt của Coumarin có tác dụng
chống sâu bệnh cho cây Coumarin glycozit (sản phẩm kết hợp của Coumarin với
monoxacarit) có tác dụng chống nấm, chống khối u, chống đông máu, chống virut HIV, chống cao huyết áp, chống loạn nhịp tim, chống loãng xương, giảm đau, ngăn ngừa bệnh suyễn và sát trùng chúng được sử dụng nhiều làm thuốc giãn mạch vành, chống co thắt, chồng lao Các xeton œ,)- không no là những hợp chất có hoạt tinh sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, kháng nắm, chống ung thư, diệt cỏ dại và trừ sâu Một vài coumarin có khả năng kháng khuẩn như: novobiocin [8|]
Flavonoid:
Flavonoid là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật, có nhiều chức
năng quan trọng đối với sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật, trong đó có tác dụng ngăn
ngừa ung thư Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid là khả năng tạo phức với các protein ngoại bài và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuôc các nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon,
isoffavon, biflavon, 4-aryl coumarin, 4-aryl chroman đều được chứng minh bằng thực
nghiệm do các chất flavonoid này ức chế con đường sinh tông hợp prostagladin [17] Một vài flavonoid có khả năng kháng khuẩn: catechin (Trà xanh), swertifranchesid, glyeynhiZin (Cam thảo), alpinumisoflavon, phloretin, galangin
Tannin:
'Tanin hay tannoit là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein vá các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác như các amino axit và alkaloit
Trang 3422
bai tia UV ở bước sóng khoảng 320 nm đến 400 nm
Một vài tannin có khả năng khang khudn: condensed, tannin Saponin
Thường được biết đến với khả năng diệt protozoa Khả năng diệt protozoa của saponin do sự kết hợp với cholesteron trên màng, làm cho màng bị phá hủy, gây ly giải
tế bào
Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên được khai thác từ thực vật, có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn mạnh Một vài saponin có khả năng diệt khuẩn như yuccin, quillajin
1.4.3 Tình hình kháng kháng sinh
Kháng kháng sinh là khả năng của một vi sinh vật (như vi khuẩn, vi rút và một số ký sinh trùng) ngăn chặn một loại thuốc chống vi trùng (như kháng sinh, thuốc chống vi rút và thuốc chống sốt rét) hoạt động chống lại nó Do đó, các phương pháp điều trị tiêu chuẩn trở nên không hiệu quả, nhiễm trùng vẫn tồn tại và có thẻ lây sang người khác Sử dụng kháng sinh có thể dẫn đến kháng thuốc Việc phát hiện ra kháng sinh là một phát minh vĩ đại của nền y học thế giới, nó đã cứu được hàng triệu người
trên thế giới Nhưng ngày nay càng ngày càng có nhiều loại vi khuẩn kháng lại các
loại kháng sinh từng tấn công, tiêu diệt được nó Điều này đã gây ra rất nhiều khó khăn trong việc tiêu diệt nó lần nữa vì mỗi loại vị khuẩn sẽ có sự đáp ứng tương tự với mỗi loại kháng sinh khác nhau Vậy tại sao lại xuất hiện hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc này?
Tình trạng kháng thuốc kháng sinh xảy ra khi một loại sinh vật tiến hóa để đề kháng mạnh hơn hoặc hoàn toàn chống lại kháng sinh mà trước đây từng trị được
Sự đề kháng này về cơ bản là do bộ gen của vi khuẩn, tức là vi khuẩn tự nhiên
xuất hiện các gen kháng thuốc trong tế bào Sự xuất hiện gen kháng thuốc này có thể có do 3 cách là đề kháng tự nhiên, đột biến gen hoặc có sức đề kháng được chuyền từ một loài khác
Mỗi lần bạn dùng thuốc kháng sinh, vi khuẩn nhạy cảm sẽ bị tiêu diệt Nhưng vi trùng kháng thuốc có thể còn lại để phát triển và nhân lên Họ có thể lây lan sang người khác Chúng cũng có thể gây nhiễm trùng mà một số loại kháng sinh không thể chữa khỏi
Cơ chế của đề kháng kháng sinh có thê được hiểu đơn giản như sau: khi người bệnh sử dụng kháng sinh, thuốc kháng sinh sẽ tác động trên một hay nhiều bộ phận
Trang 35năng kháng thuốc Vi khuẩn đề kháng kháng sinh bằng cách thay đổi các đặc tính ( cấu trúc hay chuyển hoá .) của các bộ phận của tế báo vi khuẩn làm cho kháng sinh không còn tác dụng giết chết vi khuẩn , sinh ra kháng thuốc Những vi khuẩn kháng thuốc này tiếp tục phát triển, nhân lên, phát tán và lây nhiễm những người khác khiến
thuốc kháng sinh dần mắt tác dụng, gây ra tình trạng đề kháng thuốc [ 12]
Nguyên nhân gây ra để kháng kháng sinh bao gồm kê toa kháng sinh khi không
cần thiết và bệnh nhân không tuân thủ điều trị, lạm dụng kháng sinh trong chăn nui hệ thống vệ sinh yếu kém, kiểm soát nhiễm khuẩn trong bệnh viện và phòng khám
chưa tốt, chưa có kháng sinh mới
Kháng kháng sinh đang tăng lên mức cao nguy hiểm ở tắt cả các nơi trên thế giới Các cơ chế kháng thuốc mới đang xuất hiện và lan rộng trên toàn cầu, đe dọa khả năng điều trị các bệnh truyền nhiễm thông thường
Kháng kháng sinh có mặt ở khắp mọi nơi và có khả năng ảnh hưởng đến bắt kỳ
ai, ở mọi lứa tuổi, ở mọi quốc gia Bệnh nhân bị nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc có nguy cơ tăng kết quả lâm sàng và tử vong tồi tệ hơn, và tiêu thụ nhiều tài nguyên chăm sóc sức khỏe hơn so với bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn không kháng cùng loại
Tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn Gram am nhu E.coli, Klebsiella spp, P.aeruginosa, A.baumannii dang 1a ganh nặng cho không những người bệnh mà cho toàn xã hội, vì sự gia tăng chi phí khi thay thế các kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới Những vi khi
thể hiện tính kháng với nhóm carbapenem và cephalosporin thế hệ 3, là những kháng sinh được dùng đề điều trị vi khuân đa kháng thuốc [12]
Tinh trang khang E.coli déi với một trong những loại thuốc được sử dụng rộng a tu trị nhiễm trùng đường tiết niệu (kháng sinh fluoroquinolone) là rất phô biến Có nhiều quốc gia ở nhiều nơi trên thế giới mà việc điều trị này hiện không hiệu quả ở hơn một nửa số bệnh nhân
Gram âm này ngày càng
Kháng thuốc hàng đầu để điều trị nhiém tring do Staphlylococcus aureus Sica gây ra nhiễm trùng nghiêm trọng tại các cơ sở y tế và cộng đồng cộng đồng là phổ bién Nhiing ngudi bi MRSA ( Staphylococcus aureus khang methicillin ) được ước tính có nguy cơ tử vong cao hơn 64% so với những người có dạng nhiễm trùng không kháng thuốc
Kháng kháng sinh có khả năng ảnh hưởng đến mọi người ở bắt kỳ giai đoạn nào
Trang 3624
nghiệp, khiến nó trở thành một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng cấp bách nhất
trên thé giới
Mỗi năm ở Mỹ, ít nhất 2,8 triệu người bị nhiễm vi khuân hoặc nim kháng
kháng sinh và hơn 35.000 người tử vong
Không ai có thể hoàn toàn tránh được nguy cơ nhiễm trùng kháng thuốc, nhưng một số người có nguy cơ cao hơn những người khác (ví dụ, những người mắc bệnh mãn tính) Nếu kháng sinh mắt hiệu quả, thì chúng ta sẽ mất khả năng điều trị nhiễm trùng và kiểm soát các mối đe dọa sức khỏe cộng đồng [19]
Kháng sinh là một thành tựu quan trọng của thế kỷ 20 Sự ra đời của kháng sinh là một bước ngoặt lớn của y học, giúp giảm thiểu đáng kể tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do nhiễm khuẩn Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh đã gây ra tình trạng kháng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng và trở thành vấn đề mang tính toàn cầu
Bên cạnh đó cho đến nay mặc dù các thế hệ thuốc kháng sinh mới đang được nghiên cứu, nhưng trên thực tế vẫn chưa được thử nghiệm lâm sàng Sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng trong bối cảnh nghiên cứu phát triển kháng sinh mới ngày càng hạn chế làm cho việc điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn ngày càng khó khăn và nguy cơ không còn kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn trong tương lai [7]
Một số nghiên cứu dịch tễ tại Việt Nam gần đây hơn cho thấy tỷ lệ vi khuân Gram âm kháng thuốc đang có xu hướng gia tăng nhanh chóng Theo báo cáo về cập nhật kháng kháng sinh ở Việt Nam của tác giả Đoàn Mai Phương trình bày tại Hội \g độc Việt Nam năm 2017, vi khuẩn Gram âm kháng thuốc đã xuất hiện trên cả nước Căn nguyên chính phân lập
nghị khoa học toàn quốc của Hội hồi sức cắp cứu và cÌ
duge la E.coli, K pneumoniae, A baumannii va P.aeruginosa Vi khuan A baumannii và P aeruginosa cô tỷ lệ đề kháng cao nhất, có những nơi đề kháng tới trên 90% Đồng thời, các nhóm vi khuân này đã mang hầu hết các loại gen mã hóa kháng thuốc [14]
Kháng kháng sinh là một vấn đề phức tạp ảnh hưởng đến tất cả xã hội và được thúc đây bởi nhiều yếu tố liên kết với nhau Việc quản lý sử dụng kháng sinh hợp lý đã
trở thành vấn đề có tính cấp thiết, đòi hỏi các nhà quản lý ở các nước phát triển cũng
Trang 37CHƯƠNG 2
DOI TUQNG, NOI DUNG, PHAM VI VÀ
PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.1 Đối tượng nghiên cứu ~ Nguyên liệu thực vật
'Đối tượng nghiên cứu là cây thuốc Thượng (Phaeanthus viefnamensis Ban) Lá cây thuốc Thượng dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi bệnh viện Y học Cổ
truyền thành phố Đà Nẵng, địa điểm thu hái tại huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam
- Ching vi khuan
3 chủng vi khuân dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thuốc Thượng, bao gồm 2 chủng vi khuẩn Gram âm: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli va 1 chủng vi khuẩn Gram dương S/aphylococcws aureus Các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Khoa Vi sinh lâm sàng - Bệnh viện C Đà Nẵng
~ Động vật thí nghiệm
Chuột nhất trắng đực (6 tuần tuổi) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế - IVAC được nuôi trong cùng điều kiện, cùng chế độ dinh dưỡng trong suốt
quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Giải phẫu sinh lý người và động vật, khoa Sinh Môi trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng
2.2 Nội dung nghiên cứu
~ Nội dung 1: Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của cao chiết lá thuốc Thượng trên 3 chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh người bao gdm Escherichia Coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa
- Nội dung 2: Nghiên cứu tác dụng kháng viêm của cao lá thuốc Thượng trên mô hình chuột nhất trắng gây viêm phổi- dị ứng
2.3 Phạm vi nghiên cứu
~ Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm Giải phẫu sinh lý người và động vật, khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng
- Vé khả năng kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng, thí nghiệm nghiên cứu trên mô hình chuột nhất trắng viêm phôi gay boi OVA
Trang 3826
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp điều chế cao chiết từ nguyên liệu thực vật
Mẫu lá thuốc Thượng được thu hái tại huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam Chọn
lá không quá non và quá giả Loại bỏ các cảnh nhỏ
Mẫu sau khi thu hái được sàng lọc loại bỏ những lá sâu bệnh và được sáy khô tự nhiên Sau đó lá được nghiền mịn thành bột và bảo quản lạnh trong lọ kín cho đến khi sử dụng
Mẫu nghiền mịn được chiết theo phương pháp đun hồi lưu
Trang 392.4.2 Phương pháp xác định một số hợp chất từ cao chiết
Cao được xử lý với máy sắc ký khí ghép khói phổ (GC-MS) tại trung tâm
Kỹ thuật Tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (Quatest 2) để xác định các hợp chất có
trong cao chiết Kết quả phân tích được đính kèm ở phần phụ lục 3
3.4.3 Phương pháp nuôi cấy vỉ khuẩn và xác định hoạt tính kháng khuẩn a Chuẩn bị môi trường nuôi cấp
Dụng cụ: Ông nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác 250 ml, cốc thủy tỉnh 250 ml, pipet các loại, ống đong, phéu thủy tỉnh, giấy lọc, giấy bao gói, bông không thấm nước, bông y tế, đèn cồn
Môi trường nuôi cấy LB
Cân chính xác các thành phần trong môi trường bằng cân kĩ thuật, pha với nước cất, xong cho vào lò vi sóng nấu tan agar Điều chỉnh pH bằng dung dịch kiềm Đỗ vào
chai 500ml bọc giấy bạc, cho vào nồi hap Dgi 1h30 dé mdi trudng ra dia petri
- Các vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus duge nuôi cấy trên môi trường LB Công thức pha chế môi trường được minh
họa trong bảng 2 phần phụ lục
~ Kháng sinh đồ được thực hiện trên môi trường thạch Mueller Hinton (MHA) Công thức pha chế môi trường được minh họa trong bảng 1 phần phụ lục
b Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Mẫu vi khuẩn sau khi lấy về từ đơn vị cung cấp, được cấy chuyển ngay trong vòng 24 giờ để đảm sức sống vi khuẩn và tính chính xác của thí nghiệm thử hoạt tính Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong môi trường LB Dùng que cấy vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn muốn nuôi cấy Ria các đường trên đĩa petri có chứa
môi trường thạch thích hợp, sau đó quay 180° và ria lại Sau mỗi đường rỉa liên tục,
đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo Lật ngược
đĩa và ủ trong tủ ấm trong 24h -72h
© Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng
Trang 4028
chế
Cách tiến hành: Cho vào mỗi đĩa 25 ml môi trường LB vô trùng Mỗi đĩa peptri
đục 6 giếng thạch với đường kính 3 mm gồm:
~4 giếng chứa 1001 dịch cao chiết từ lá thuốc Thượng với các nồng độ lần lượt 1a 100, 200, 400, 600, 800 mg/ml
~ 1 giếng chứng 100ul DMSO 5% vô trùng
- 1 giếng chứa kháng sinh đối chứng đặt ở trung tâm
Các đĩa mẫu chứa 3 chủng vi khuẩn gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus vai Pseudomonas aeruginosa
Để vào tủ lạnh 5 — 10 giờ cho kháng sinh, dịch chiết được khuếch tán rồi nuôi cấy ở nhiệt độ 28-30°C Đọc kết quả sau 24 giờ
d Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt
khuẩn tối thiểu (MBC)
Hút 0,2 ml dịch vi khuẩn nồng độ đã được chọn từ trước vào ống nghiệm chứa
môi trường LB lỏng, hút thêm 0,2 ml nước cắt vô trùng vào ống nghiệm có chứa môi
trường nuôi cấy và dịch vi khuân Lắc kỹ ống nghiệm Nuôi hỗn hợp trên trong vòng 24 giờ ở 37°C
Chọn nồng độ pha loãng thích hợp của các chủng vi khuẩn, hit 0,2 ml dich vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy lỏng, hút thêm 0,2 ml dịch cao chiết vào ống nghiệm có chứa môi trường nuôi cấy và dịch vi khuẩn phân phối từ nồng độ cao chiết từ thấp nhất đến nồng độ cao nhất Lắc kỹ từng ống nghiệm Hút 0,1 ml dịch trong mỗi ống nghiệm cấy trang lên đĩa thạch chứa môi trường LB rắn và tiếp tục đặt vào tủ ấm 37 °C trong 24 giờ
Nuôi hỗn hợp ở các ống nghiệm trên trong vòng 12 giờ quan sát độ đục từng ống nghiệm Chú ý quan sát ống nghiệm chứa chứng âm trước nếu thấy chủng vi khuân phát triển tốt mới tiếp tục cấy, nếu không phải làm lại thí nghiệm
Đọc kết quả: Đếm số khuẩn lạc có trên đĩa thạch chứa môi trường LB Đĩa có
số khuẩn lạc 1-3 khuân lạc/đĩa là đĩa có nông độ tối thiểu của cao chiết ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC) Những đĩa không không có sự phát triển của khuẩn lạc với nồng độ gần nồng độ ức chế tối thiểu nhất được xác định là đĩa chứa nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC),
2.4.4, Phương pháp thứ nghiệm cao chiết trên mô hình chuột viêm-dị ứng phéi
a Thiết lập mô hình hen suyễn và điều trị Mô hình thí nghiệm được mô tả như sơ đỗ 2.2