Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHANTHAHAK SANTHANA NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE VÀO CÂY BÌNH VƠI Stephania brach
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHANTHAHAK SANTHANA NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE VÀO CÂY BÌNH VÔI (Stephania brachyandra Diels) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHANTHAHAK SANTHANA NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE VÀO CÂY BÌNH VÔI (Stephania brachyandra Diels) Ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHẠM THỊ THANH NHÀN THÁI NGUYÊN – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đã thực hiện việc kiểm tra mức độ tương đồng nội dung luận văn qua phần mềm Turnitin một cách trung thực và đạt kết quả mức độ tương đồng % Bản luận văn kiểm tra theo phần mềm là bản cứng đã nộp để nghiệm thu trước hội đồng Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm Thái Nguyên, ngày 20 tháng 07 năm 2022 TÁC GIẢ CỦA SẢN PHẨM HỌC THUẬT (Kí và ghi rõ họ tên) PHANTHAHAK Santhana i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09 Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành cho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, cùng các thầy cô giáo trong khoa và bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu, đặc biệt là cô Trần Thị Hồng (ThS.KTV phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào) đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em làm các thí nghiệm của luận văn Tôi xin cảm ơn toàn thể gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên, giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh sống tại Thái Nguyên, Việt Nam Trong quá trình tiến hành nghiên cứu không tránh khỏi những sai sót, tôi rất mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía các thầy, cô giáo và bạn bè để tôi có thể hoàn thiện luận văn của mình Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng 05 năm 2022 Học viên PHANTHAHAK Santhana ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2 3 Nội dung nghiên cứu .2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu chung về cây Bình vôi 3 1.2 Giá trị của cây Bình vôi 8 1.3 Enzyme Columbamine O-methyltransferase .10 1.4 Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 12 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 18 2.1.1 Vật liệu 18 2.1.2 Thiết bị 19 2.1.3 Hóa chất 19 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu .21 2.3.1 Phương pháp pha môi trường nghiên cứu .21 2.3.2 Phương pháp khử trùng mẫu và nuôi cấy in vitro cây Bình vôi .22 2.3.3 Phương pháp chuyển gen thông qua A Tumefaciens .24 2.3.4 Phương pháp phân tích sự có mặt của gen CoOMT đã chuyển 26 iii CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết quả nghiên cứu biến nạp gen CoOMT vào cây Bình vôi 29 3.1.1 Kết quả nuôi cấy in vitro tạo nguyên liệu biến nạp và ra cây 29 3.1.2 Kết quả biến nạp gen CoOMT vào cây Bình vôi 32 3.2 Kết quả phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây Bình vôi bằng phản ứng RT-PCR 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .39 CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm đặc trưng về hình thái của một số loài Bình vôi 6 Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc chi Bình vôi Stephania .9 Bảng 2.1 Cặp mồi đặc trưng của phản ứng RT-PCR .18 Bảng 2.2 Thành phần các loại môi trường tái sinh ở cây Bình vôi 20 Bảng 2.3 Công thức giá thể ra cây Bình vôi 23 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR .27 Bảng 3.1 Kết quả biến nạp vector mang gen CoOMT vào cây Bình vôi 33 Bảng 3.2 Kết quả định lượng RNA tổng số tách chiết từ cây Bình vôi WT và cây chuyển gen 35 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Bình vôi 3 Hình 1.2 Con đường tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine 11 Hình 2.1 Cây Bình vôi in vitro 18 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện pBI121-35S-CoOMT-Cmyc-Kdel 19 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 21 Hình 3.1 Mẫu cây Bình vôi in vitro nghiên cứu 31 Hình 3.2 Hình ảnh chuyển gen CoOMT vào cây Bình vôi 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ cây Bình vôi WT và chuyển gen thế hệ T0 .36 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây Bình vôi chuyển gen và WT thế hệ T0 36 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của đoạn gen 18S trong cây Bình vôi chuyển gen và WT thế hệ T0 37 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AS Acetosyringone BAP 6-Benzyl Amino Purin Cặp base bp Base pair Môi trường đồng nuôi cấy CCM Cocultivation medium Gen mã hóa tổng hợp L- CoOMT Columbamine O- tetrahydropalmatin Methyltranferase Cộng sự cs DNA Deoxyribonucleic Acid Đối chứng ĐC Nucletide tổng hợp dùng trong dNTP Deoxynucleoside Triphosphate phản ứng PCR Axit hữu cơ dùng để khử hoạt EDTA Ethylene diamine tetraacetic tính các enzyme acid IBA Indole-3-butyric acid Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB Luria Bertani Môi trường nuôi cấy cơ bản MS Murashige – Skoog Mật độ vi khuẩn OD Optical density Phản ứng chuỗi Polymerase PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi tổng hợp cDNA RT-PCR Polymerase Chain Reaction từ mRNA Reverse Transcription PCR Môi trường tạo rễ RM Rooting medium Môi trường tạo đa chồi SIM Shoot induction medium Dung dịch đệm điện di DNA TAE Tris - Acetate - EDTA Cây không biến nạp WT Wild type vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Cây Bình vôi có tên khoa học là Stephania spp, họ Tiết dê (Menispermaceae), là một loài dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vào núi đá, có củ rất to, nặng tới hơn 40 kg, vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá, củ còn gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”,…Cây Bình vôi có giá trị dược liệu cao, đặc biệt củ Bình vôi chứa chủ yếu các alkaloid với hàm lượng rất khác nhau trong từng loài, trong đó hợp chất rotundin chiếm hàm lượng lớn Roduntin trong củ Bình vôi được dùng chủ yếu để chữa bệnh mất ngủ và an thần với những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sử dụng nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý, sau khi ngủ không bị mệt mỏi và gây nhức đầu Tuy nhiên theo nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra được rằng hàm lượng rotundin của các loài Bình vôi là rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái Ở Việt Nam, chi Bình vôi (Stephania) có khoảng 20 loài, trong đó loài Bình vôi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), Bình vôi núi cao hay Bình vôi nhị ngắn (Stephania brachyandra Diels), Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania japonica Miers) đang được khai thác quá mức và đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” và ”nguy cấp” (V) Hiện nay, hướng nghiên cứu genome và chức năng của các gen trên đối tượng cây Bình vôi còn rất mới mẻ Số trình tự gen đăng trên Ngân hàng gen Quốc tế chưa nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trình tự gen mã hóa protein ribosome S2, S3, S4, S7, S8, S11, S12, S14, S15, S16, S18, S19, 23S, 4.5S, 5S, L14, L16, L20, L22, L23, L33, L36, CP43, NADH dehydrogenase subunit 1, NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 5, NADH dehydrogenase subunit 6, NADH dehydrogenase subunit 7, cytochrome b và c , RNA polymerase alpha, RNA polymerase beta, photosystem protein, envelope membrane protein, acetyl-CoA carboxylase beta, ribulose-1,5-bisphosphate 1