Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen mã hoá enzyme columbamine omethyltransferase vào cây bình vôi (stephanin brachyandra diels)

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHANTHAHAK SANTHANA NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE VÀO CÂY BÌNH VƠI Stephania brach

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHANTHAHAK SANTHANA

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN

MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE

VÀO CÂY BÌNH VÔI (Stephania brachyandra Diels)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHANTHAHAK SANTHANA

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC MANG GEN

MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE

VÀO CÂY BÌNH VÔI (Stephania brachyandra Diels)

Ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số : 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHẠM THỊ THANH NHÀN

THÁI NGUYÊN – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đã thực hiện việc kiểm tra mức độ tương đồng nội dung luận văn qua phần mềm Turnitin một cách trung thực và đạt kết quả mức độ tương đồng % Bản luận văn kiểm tra theo phần mềm là bản cứng đã nộp để nghiệm thu trước hội đồng Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 07 năm 2022 TÁC GIẢ CỦA SẢN PHẨM HỌC THUẬT

(Kí và ghi rõ họ tên)

PHANTHAHAK Santhana

Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành cho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, cùng các thầy cô giáo trong khoa và bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu, đặc biệt là cô Trần Thị Hồng (ThS.KTV phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào) đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em làm các thí nghiệm của luận văn

Tôi xin cảm ơn toàn thể gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên, giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh sống tại Thái Nguyên, Việt Nam

Trong quá trình tiến hành nghiên cứu không tránh khỏi những sai sót, tôi rất mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía các thầy, cô giáo và bạn bè để tôi có thể hoàn thiện luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng 05 năm 2022

Học viên

PHANTHAHAK Santhana

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Bình vôi 3

1.2 Giá trị của cây Bình vôi 8

1.3 Enzyme Columbamine O-methyltransferase 10

1.4 Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 18

2.1.1 Vật liệu 18

2.1.2 Thiết bị 19

2.1.3 Hóa chất 19

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp pha môi trường nghiên cứu 21

2.3.2 Phương pháp khử trùng mẫu và nuôi cấy in vitro cây Bình vôi 22

2.3.3 Phương pháp chuyển gen thông qua A Tumefaciens 24

2.3.4 Phương pháp phân tích sự có mặt của gen CoOMT đã chuyển 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả nghiên cứu biến nạp gen CoOMT vào cây Bình vôi 29

3.1.1 Kết quả nuôi cấy in vitro tạo nguyên liệu biến nạp và ra cây 29

3.1.2 Kết quả biến nạp gen CoOMT vào cây Bình vôi 32

3.2 Kết quả phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây Bình vôi bằng phản ứng RT-PCR 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm đặc trưng về hình thái của một số loài Bình vôi 6

Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc chi Bình vôi Stephania 9

Bảng 2.1 Cặp mồi đặc trưng của phản ứng RT-PCR 18

Bảng 2.2 Thành phần các loại môi trường tái sinh ở cây Bình vôi 20

Bảng 2.3 Công thức giá thể ra cây Bình vôi 23

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 3.1 Kết quả biến nạp vector mang gen CoOMT vào cây Bình vôi 33

Bảng 3.2 Kết quả định lượng RNA tổng số tách chiết từ cây Bình vôi WT và cây chuyển gen 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Bình vôi 3 Hình 1.2 Con đường tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine 11

Hình 2.1 Cây Bình vôi in vitro 18 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện pBI121-35S-CoOMT-Cmyc-Kdel 19

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 21

Hình 3.1 Mẫu cây Bình vôi in vitro nghiên cứu 31 Hình 3.2 Hình ảnh chuyển gen CoOMT vào cây Bình vôi 34

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ cây Bình vôi WT và chuyển gen thế hệ T0 36 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR xác định sự có mặt của gen

chuyển CoOMT trong cây Bình vôi chuyển gen và WT thế hệ T0 36 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của đoạn gen 18S trong cây Bình

vôi chuyển gen và WT thế hệ T0 37

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

O-Methyltranferase

Gen mã hóa tổng hợp tetrahydropalmatin

acid

Axit hữu cơ dùng để khử hoạt tính các enzyme.

Reverse Transcription PCR

Phản ứng chuỗi tổng hợp cDNA

từ mRNA

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây Bình vôi có tên khoa học là Stephania spp, họ Tiết dê

(Menispermaceae), là một loài dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vào núi

đá, có củ rất to, nặng tới hơn 40 kg, vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá,

củ còn gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”,…Cây Bình vôi có giá trị dược liệu cao, đặc biệt củ Bình vôi chứa chủ yếu các alkaloid với hàm lượng rất khác nhau trong từng loài, trong đó hợp chất rotundin chiếm hàm lượng lớn Roduntin trong củ Bình vôi được dùng chủ yếu để chữa bệnh mất ngủ và an thần với những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sử dụng nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý, sau khi ngủ không bị mệt mỏi và gây nhức đầu Tuy nhiên theo nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra được rằng hàm lượng rotundin của các loài Bình vôi là rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái

Ở Việt Nam, chi Bình vôi (Stephania) có khoảng 20 loài, trong đó loài Bình vôi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), Bình vôi núi cao hay Bình vôi nhị ngắn (Stephania brachyandra Diels), Bình vôi tím (Stephania

rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania japonica Miers) đang được khai

thác quá mức và đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” và ”nguy cấp” (V)

Hiện nay, hướng nghiên cứu genome và chức năng của các gen trên đối tượng cây Bình vôi còn rất mới mẻ Số trình tự gen đăng trên Ngân hàng gen Quốc tế chưa nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trình tự gen mã hóa protein ribosome S2, S3, S4, S7, S8, S11, S12, S14, S15, S16, S18, S19, 23S, 4.5S, 5S, L14, L16, L20, L22, L23, L33, L36, CP43, NADH dehydrogenase subunit 1, NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 5, NADH dehydrogenase subunit 6, NADH dehydrogenase subunit 7, cytochrome b và c , RNA polymerase alpha, RNA polymerase beta, photosystem protein, envelope membrane protein, acetyl-CoA carboxylase beta, ribulose-1,5-bisphosphate

carboxylase/oxygenase, ATP synthase, Psa A và B, ATPase, maturase K,

ribosomal RNA, tRNA ở cây Stephania

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật cho phép đưa một hay một số gen nhất định nào đó vào hệ gen của cây chủ được quan tâm để tạo ra cây trồng biến đổi gen nhằm cải thiện một hay một số đặc tính hay tính trạng theo hướng lợi ích cho con người Kỹ thuật này đã và đang được quan tâm, được tiến hành thực nghiệm trên nhiều giống cây trồng và được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là kỹ thuật chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefacienes

Columbamine O-Methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện là một

enzyme làm chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây Coptis

japonica thuộc họ Mao lương (Rannunculaceae) trong cùng bộ Mao lương với

cây Bình vôi [29] Như vậy, liệu việc chuyển gen mã hóa enzyme CoOMT sẽ giúp tăng hàm lượng rotundin trong cây Bình vôi hay không đang là câu hỏi nghiên cứu

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen mã hoá enzyme Columbamine O-

methyltransferase vào cây Bình vôi (Stephanin brachyandra Diels)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Biến nạp được cấu trúc mang gen mã hoá enzyme Columbamine

O-methyltransferase vào cây Bình vôi (Stephanin brachyandra Diels)

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu biến nạp gen CoOMT vào cây Bình vôi

- Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây Bình vôi bằng

phản ứng RT-PCR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Bình vôi

Về nguồn gốc và phân loại

Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam

châu Á cũng như Australasia Tên gọi dân dã trong tiếng Việt là cây Bình vôi [37]

Về mặt phân loại, cây Bình vôi thuộc:

Chi Stephania có khoảng trên 45 loài Một số loài ở Việt Nam đã được

công bố như [37]:

 Stephania glabra (Roxb) Miers

 Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang

 Stephania pierrei Diels

 Stephania excentrica H S Lo

 Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong

 Stephania kwangsiensis H S Lo

 Stephania sinica Diels

 Stephania viridiflavens H S Lo et M.Yang

 Stephania rotunda Lour

Các loài Bình vôi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Thường gặp ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Nam Định, Hà Nội, Hà Nam, Hà Giang, Hoà Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hoá, Thái Nguyên, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu,… Một số loài thường chỉ gặp ở các vùng núi

đất và biển như S pierrei, S brachyandra, S haianensis Riêng loài S

pierrei Diels tập trung chủ yếu ở các tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh

Thuận [37], [42]

Về đặc điểm sinh học

Các loài trong chi Bình vôi (Stephania) đều thuộc dạng thân leo, nhẵn,

thường xanh, gốc hóa gỗ, sống lâu năm hoặc hằng năm Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh đậm Trên thân già thường

có những rãnh dọc, những mụn cóc sần sùi, màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành rễ củ Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc Củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định Có loài rễ củ thường chỉ nặng 0,5 – 2kg (hoặc 3 kg), nhưng cũng có loài cho củ có thể nặng tới 50-70 kg Tuỳ thuộc vào từng loài, tuổi cây

và điều kiện môi trường sống mà hình thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay

đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâu sáng, nâu đậm, xám tro, đen…) Thịt củ nạc hoặc

có lẫn những vằn xơ, màu trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi

[2], [3], [8]

Lá Bình vôi mọc cách Cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20

cm và hai đầu phồng lên [13] có khi gấp khúc ở gốc [7] Cuống lá đính vào lá thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc lá ở những khoảng cách nhất định, tùy thuộc vào từng loài (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá) Phiến lá mỏng hoặc dài, nhẵn mỏng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình tam giác rộng, hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc chia thùy; gân lá dạng chân vịt, gồm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát từ đỉnh cuống lá Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn; gốc lá gần tròn, phẳng hoặc gần hình tim Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh

nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía) [16]

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá Cụm hoa

có dạng tính tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [13]., có cuống

đơn độc hoặc xếp theo kiểu chum ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuống cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thình đầu hình đĩa [19] Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8 rời, xếp thành 2 vòng; 3-4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường

4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xòe thành đĩa tròn Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánh

hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [16]

Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt Ở quả trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Hạt hình móng ngựa, hình trứng đẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai (một số loài

có 5 hàng [16] Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từng taxon; nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giám định tên

khoa học đối với các loài chi Bình vôi [13] Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng

rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [21]

Bảng 1.1 Đặc điểm đặc trưng về hình thái của một số loài Bình vôi [37] STT Các loài Bình vôi Điểm đặc trưng về hình thái

giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm

- Lá hình khiên, mọc cách

hồng

- Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác

- Hoa đực không có cánh hoa

hơn so với các loài khác

- Gân lá mặt saucó màu tím hay tím hồng

- Giá noãn có lỗ lệch 1 bên

Lo et Yang

- Lá có phiến hình tam giác

- Cuống lá bằng hoặc dài hơn phiến lá

Về kỹ thuật nhân giống cây Bình vôi

Trong tự nhiên, đoạn thân, cành (ở thời kỳ sắp già hoặc bánh tẻ, mỗi đoạn

có 2 đến 3 mắt) và các mảnh củ (cắt từ phần gốc, mỗi mảnh có kích thước dài rộng 4 – 5 cm, dày 2 – 2,5 cm) được sử dụng để trồng vào mùa xuân Nhưng tốc

độ sinh trưởng, phát triển rất chậm, tốc độ lớn của củ cũng rất chậm, tỷ lệ sống sót thấp chỉ đạt khoảng 33%

Để gây trồng, theo dõi sự phát triển của các loài Bình vôi, Lã Đình Mỡi

và cs đã tiến hành nghiên cứu thu hái củ Bình vôi từ các vùng núi khác nhau (Lào Cai, Ninh Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình), đem trồng tại vườn thí nghiệm và nhận thấy tất cả các củ Bình vôi đều sống, nảy chồi, sinh trưởng Sau 2 năm theo dõi thì thấy tỷ lệ sống sót đạt 99% Tuy nhiên, quá trình sinh trưởng phát triển rất khác nhau Chỉ khoảng 30% số cá thể gây trồng ra hoa kết quả, số còn lại vẫn sinh trưởng xanh tốt nhưng không ra hoa Cây Bình vôi trong tự nhiên chủ yếu sinh sản bằng hạt Khi quả chín rụng xuống đất và hạt nảy mầm vào vụ xuân Cây Bình vôi mọc từ hạt sinh trưởng, phát triển nhanh Sau khi nảy mầm, nếu ở điều kiện bình thường cây sinh trưởng khoảng hơn 5 tháng đã hình thành

nụ và tháng sau ra hoa kết quả Khoảng 4 tháng tuổi ở gốc thân, củ cũng dần dần được hình thành Nhân giống cây Bình vôi bằng hạt là vấn đề gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi phải có thời gian nhất định; cần chú ý quan tâm nghiên cứu về kỹ thuật thu hái, bảo quản hạt giống Sự nảy mầm của hạt Bình vôi cũng rất khác nhau ở các điều kiện bảo quản khác nhau Tỷ lệ nảy mầm của hạt Bình vôi cao nhất đạt 85% và nảy mầm nhanh nhất là gieo hạt khi còn tươi [12]

Ngoài nhân giống cây Bình vôi trong tự nhiên, việc áp dụng các kỹ thuật

Công nghệ sinh học, đặc biệt là nhân giống in vitro các cây dược liệu là một

trong những biện pháp hiệu quả, trong thời gian ngắn có thể cung cấp số lượng cây giống lớn, đồng nhất về mặt hình thái và sạch bệnh phục vụ cho sản xuất Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về cây Bình vôi tím như: Ngô Vân Thu và Trần Hùng Tiến nghiên cứu, khảo sát bước đầu về cây Bình vôi tím

và Bình vôi biển [5], [6] Vào năm 2011, Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh

thành công trong nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất alkaloid rotundine từ

cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) [14] Theo kết quả nghiên cứu của

Nguyễn Thị Tình và đồng tác giả (2015), sử dụng đoạn thân non, bánh tẻ được cắt thành các khúc 2 - 3 cm, tiến hành ngâm trong dung dịch cồn 70 % rồi khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho tỉ lệ mẫu sống cao không nhiễm đạt 68,89% Mẫu sau khi khử trùng cho tỉ lệ tái sinh cao nhất trong môi trường MS cải tiến đạt tỉ lệ tái sinh 88,89% sau 4 tuần nuôi cấy [17]

1.2 Giá trị của cây Bình vôi

Alkaloid là hợp chất hữu cơ có chứa nitơ đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid [27], [34] Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay đổi tùy theo mùa thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu thổ nhưỡng [22]

Mất ngủ, giấc ngủ không sâu là bệnh của thế giới hiện đại khi con người luôn phải đối mặt với các stress Nhiều người phải tìm đến các loại thuốc gây ngủ hoặc các thuốc hướng tâm thần gây ngủ Giải pháp này tuy có hiệu quả tốt nhưng dễ gây lệ thuộc thuốc, thậm chí gây nghiện và ảo giác Một trong những thuốc được quan tâm có nguồn gốc dược liệu, an toàn và ít gây tác dụng phụ là rotundin Các nhà khoa học đã tách chiết được thuốc rotundin sulphat từ củ Bình vôi làm thuốc tiêm và được lưu hành trên toàn quốc Rotundin còn có tên gọi L-tetrahydropalmatin, lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin trong quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin [2] Trong củ Bình vôi có chứa nhiều alkaloid Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin Trong đó, quan trọng nhất là rotudin (0,2- 3,55%) Hàm lượng alkaloid toàn thân cũng như rotudin thay đổi tùy loài

và vùng thu hái [35]

Nhiều công trình nghiên cứu đã xác định tác dụng an thần gây ngủ với liều thấp mà độ dung nạp thuốc lại rất cao, trong quá trình sử dụng không có trường hợp nào bị tai biến và quen thuốc [36], [8] Ngoài tác dụng an thần giảm đau, rotundin còn có tác dụng điều hòa nhịp tim, hạ huyết áp, giãn cơ trơn, do

đó làm giảm các cơn đau do co thắt ở đường ruột và tử cung [36]

Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc chi

Kháng sinh Glabradine (dịch chiết từ củ loài S glabra (Roxb.)

Mies, dịch chiết từ rễ loài S japonica), cepharanone D,

N formyl - asimilobine, N - formylannonain Diệt giun sán Dịch chiết từ rễ loài S glabra (Roxb.) Miers

Chống virus Dịch chiết từ củ loài S cepharantha Hayata

Chống ung thư Dl - tetrandrine, fangchinoline, D - tetrandrine, D-

isochondrodendrine, dịch chiết từ củ loài S venosa

(Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine

Chống oxy hóa Fangchinoline cepharanthine

Cây Bình vôi là cây có tiềm năng lớn trong Y học, là nguồn nguyên liệu cho ngành Dược, có giá trị kinh tế đặc biệt đối với người dân tộc vùng cao và người dân ở một số vùng của Việt Nam Loài Bình vôi có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bị xâm hại do nạn chặt phá rừng Cây bị đào

rễ để làm thuốc dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng cao Loài đã được ghi trong Sách

Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục

Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [20] Trước tình hình trên cần áp dụng các biện pháp, kỹ thuật nuôi cấy tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc ngày một tăng Một số loại thuộc chi Thiên kim đằng cũng đã được các nhà khoa học trong nước nghiên cứu bảo tồn bằng giâm hom và nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3 Enzyme Columbamine O-methyltransferase

Methyltransferase là enzyme chìa khóa trực tiếp tham gia nhiều con đường sinh tổng hợp nhiều hợp chất quan trọng Mỗi methyltransferase trong quá trình sinh tổng hợp palmatine (gồm có S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase (6OMT); S-adenosyl-L-methionine: coclaurine N-methyltransferase (CNMT); S-adenosyl-L-methionine: 3’-hydroxy-N-methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase (4’OMT); S-adenosyl-L-methionine: scoulerine 9-O-methyltransferase (SMT) và CoOMT) đòi hỏi tính đặc thù về cơ chất chặt chẽ cho dù các cơ chất có sự tương đồng về cấu trúc [29]

Hiện nay, sự hiện diện và chức năng của các protein tham gia con đường sinh tổng hợp rotundin nói riêng, palmatine nói chung vẫn đang được các nhà khoa học quan tâm, khám phá Nghiên cứu của Takashi Morishige và cs (2002)

là công trình đầu tiên đã xác định được gen mã hóa columbamine methyltransferase tham gia trực tiếp chuyển hóa cơ chất tetrahydrocolumbamine

O-để sinh tổng hợp rotundin Các tác giả cũng xác định được trình tự cDNA mã hóa enzyme này dài 1053bp, mã hóa cho 351 amino acid (với mã số AB073908 trên Ngân hàng gen Quốc tế) Các kết quả nghiên cứu xác định tất cả các gen O-methyltransferase có liên quan đến sinh tổng hợp isoquinoline trong tế bào

Copapis japonica Tác giả giải trình tự 1014 cDNA được phân lập từ tế bào

nuôi cấy sản xuất alkaloid với hàm lượng cao của C Japonica Trong đó, tác giả phát hiện ra tất cả bốn O-methyltransferase giống như bản sao cDNA có mã

số CJEST64 cDNA này khá giống với cDNA của gen mã hóa methionine: coclaurine 6-O-methyltransferase và S-adenosyl-l-methionine: isoflavone 7-O-methyltransferase Nhờ S-adenosyl-l-methionine: columbamine O-methyl-transferase xúc tác chuyển đổi columbamine thành palmatine, là một

S-adenosyl-l-trong những thành phần chưa được phân giải S-adenosyl-l-trong quá trình tổng hợp

isoquinoline alkaloid ở C japonica, tác giả đã xác định được sự khác biệt của

protein trong E.coli và đánh giá sự hoạt động của columbamine methyltransferase Protein tái tổ hợp biểu hiện rõ ràng hoạt tính O-methyl hóa

Osử dụng columbamine, cũng như (S) tetrahydrocolumbamine, (S) , (R, S) scoulerine và (R, S) -2,3,9,10-tetrahydroxyprotoberine làm chất nền Kết quả này chứng tỏ rõ ràng rằng EST rất hữu ích để phân lập gen quan tâm theo con đường sinh tổng hợp tương đối tốt Mối quan hệ giữa cấu trúc và sự nhận biết chất nền của O-methyltransferase liên quan đến sinh tổng hợp isoquinoline alkaloid và palmatine[26]

-Hình 1.2 Con đường tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine [26]

1.4 Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen

thông qua Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen trực tiếp là kỹ thuật biến nạp trực tiếp cấu trúc mang gen chuyển vào mô, vào bộ phận của cơ thể động vật, thực vật [9] Các phương pháp chuyển gen trực tiếp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật có thể kể đến là chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện, vi tiêm, chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, súng bắn gen và chuyển gen nhờ silicon carbide Tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen, với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm gần đây phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi phí thiết bị đắt tiền

và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển vào tế bào cùng lúc gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững

Chuyển gen gián tiếp là kỹ thuật biến nạp cấu trúc mang gen chuyển thông qua trung gian, thường được sử dụng phổ biến là chuyển gen nhờ vi

khuẩn Agrobacterium với những ưu điểm nổi trội: (i) Gen chuyển ít bị đào thải;

(ii) Số lượng bản sao ít, do đó tránh được hiện tượng ức chế và câm lặng lẫn nhau; (iii) Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do phụ thuộc vào hệ thống protein Vir; (iv) Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền Mặc dù hệ thống

chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium được sử dụng thành công và có hiệu

quả đối với một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này Đặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ

Agrobacterium (do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu hướng hóa

gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai

lá mầm) [9]

A tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể và một plasmid lớn kích thước

khoảng 200kb gọi là Ti-plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây Khi cây

bị nhiễm A.tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các khối u được

hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm sự hình thành khối u sau đó có thể được tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng có được do

A tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid xâm nhập vào hệ gen

của cây bị bệnh

Ti-plasmid là một plasmid lớn 200kb, chúng được duy trì ổn định trong

Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30°C Trên Ti-plasmid có đoạn T-DNA có được

giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau Đoạn này được gọi là T-DNA vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể và gây ra bệnh khối u T-DNA của vi khuẩn được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với gen nhân (tế bào thực vật) T-DNA ổn định trong gen nhân Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên Ngoài T - DNA, trên Ti- plasmid còn có các vùng DNA ma hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các

protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1 Các protein này nhận biết

các vết thương ở các cây chú thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng

tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn Khi cây nhiễm A

tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và

sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trường của cây bị rối loạn, các tế bao phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “ thức ăn ” nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid Vì thế

sự thay đổi hình thai chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy

roots) khi bị nhiễm bệnh Trên thực tế Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá

mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp

gen của vi khuẩn Agrobacterium vào cây một lá mầm

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã thực hiện xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở nhiều loại cây thiết yếu trong lĩnh vực lương thực-dược phẩm và nông lâm nghiệp, nhằm nâng cao hàm lượng dược chất

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trở

thành một công cụ quan trọng đang được quan tâm trong chuyển gen thực vật với các mục đích nhữ tăng khả năng chống chịu, nâng cao năng suất và chất lượng, cải thiện khả năng tích lũy dĩnh dưỡng và tăng cường các họp chất có hoạt tính sinh học

Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Hoa đã nghiên cứu thành công hệ

thống tái sinh in vitro và chuyển gen GFP vào cây hoa loa kèn (Lilium

longgiflorum) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Thông qua nghiên cứu

đã xác định được môi trường tái sinh thích hợp cho mô nuôi cấy và làm rõ ảnh hưởng của một số khâu kỹ thuật đến quá trình chuyển gen Khẳng định được môi trường tốt nhất để tạo callus là MS +8% saccarose + 0,5mg/l BAP + 0,5mg/l 2,4D và để tái sinh chồi từ callus nên sử dụng môi trường MS + 2%

saccarose + 0,25mg/l BAP Quá trình chuyển gen GFP đạt hiệu quả cao khi

callus được nuôi cấy khởi động 5 ngày trước khi lây nhiễm vi khuẩn và để lây nhiễm vi khuẩn callus được cắt trên giấy thấm, ngâm trong dung dịch vi khuẩn

trong 5 phút, sau đó đồng nuôi cấy trong 3 ngày Gen GFP được biểu hiện với

tỷ lệ cao ở callus (52,38 – 62,35%) và rễ của cây tái sinh (31,25 – 52,94%) trong khi ở chồi tái sinh tỷ lệ này chỉ đạt 1,25% Kết quả này là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong tạo giống hoa loa kèn chuyển gen [1]

Theo Vũ Thị Lan và cs (2013), vật liệu nhận gen là mảnh cấy từ đỉnh

ngọn được nhiễm với A.tumefaciens CV58 ở nồng độ OD600nm = 0,8, bổ sung AS 150µM trong 20 - 30 phút, thu được tỉ lệ biểu hiện tạm thời gen gus cao nhất

(38%) Mô sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường CP3 bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycine 50 mg/l trong 3 - 4 tuần Chồi tái sinh từ các

mô sẹo sống sót được chọn lọc tiếp trên môi trường ra rễ MS bổ sung

kanamycine 100 mg/l Kết quả ban đầu về chuyển gen gus vào giống khoai lang KB1 là hầu hết các dòng mô sẹo sống sót đều biểu hiện hoạt động gen gus (có màu xanh chàm rất đậm) và thu được 8/21 dòng cây khoai lang chuyển gen gus

ra rễ trên môi trường chọn lọc bổ sung kanamycine 50 mg/l [10]

Nghiên cứu cải tiến quy trình chuyển gen ở lúa của Hoàng Thị Giang và

cs (2015), theo hướng thao tác đơn giản, giảm thiểu khối lượng công việc,

nhưng hiệu suất chuyển gen cao Theo quy trình này, dịch khuẩn A tumefaciens

có mật độ OD600nm = 0,1 là tối ưu với tần số biểu hiện gen gus ở mô sẹo cao

(81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp Đánh giá sự biểu hiện của gen gus và phân

tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền ổn định của gen chuyển sang thế hệ sau [4]

Vào năm 2018, Nguyễn Đức Thành đã thành công trong nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen giàu carorenoid Sau 2 năm triển khai đề tài, nhóm nghiên

cứu đã phân lập được gen Or từ giống khoai lang Hoàng Long ký hiệu là IbOr

và đã đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số: KX792094.1 và gen Or

từ cây súp lơ được đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số:

KX396544.1; thiết kế được 02 cấu trúc chuyển gen mang gen IbOr tăng cường

tích lũy carotenoid là: pCambia2300/Ubi/IbOr/Nos và

pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos vào một số dòng ngô và tạo được 18 dòng ngô

chuyển gen có hàm lượng carotenoid tổng tăng so với đối chứng tương ứng từ 1,756 đến 12,515 lần, và hàm lượng β-carotene tăng từ 2,022 đến 19,002 lần, trong đó có 06 dòng có hàm lượng β-carotene tăng trên 10 lần; xây dựng được

01 quy trình chuyển gen IbOr gia tăng tích lũy carotenoid ở ngô sử dụng mô phân sinh đỉnh và A.tumefaciens cho hiệu suất chuyển gen từ 1,50 đến 2,63%

Đây là công trình đầu tiên trên thế giới và Việt Nam về thể hiện thành công gen

IbOr từ giống khoai lang Hoàng Long trong một số dòng ngô trồng và tạo được

cây ngô chuyển gen có hàm lượng β-carotene tăng gấp trên 10 lần so với đối chứng không chuyển gen [15]

Isoflavone nổi tiếng với các hoạt động chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm và chống ung thư; tuy nhiên, cây đậu tương chứa lượng isoflavone rất thấp Do đó, tăng hàm lượng isoflavone là một trong những mối quan tâm lớn trong nghiên cứu đậu tương Năm 2020, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu

Quân và cộng sự đã chuyển thành công gen GmCHI1A vào cây đậu tương và

thế hệ T2 được chọn lọc để có hàm lượng isoflavone cao (daidzein, genistein)

trong mầm đậu tương chuyển gen Biểu hiện gen GmCHI1A được tăng cường

trong các dòng chuyển gen T1, dẫn đến tăng hàm lượng protein CHI1A (rCHI1A) tái tổ hợp Trong mầm đậu tương của các dòng chuyển gen T2, hàm lượng daidzein và genistein lần lượt tăng từ 166,46 lên 187,23% và từ 329,77 lên 463,93% Bốn dòng đậu tương chuyển gen T2 (T2-1, T2-4, T2-21 và T2-24)

có hàm lượng daidzein và genistein cao đã được chọn để đánh giá thế hệ con cháu trong tương lai [25]

Các nghiên cứu về cải tiến việc sản xuất alkaloid ở C roseus đã tập trung

vào việc nuôi cấy tế bào và rễ tơ để làm sáng tỏ quy định về sự biểu hiện quá mức của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp TIA ở cây chuyển gen

Magnotta và cộng sự (2007) đã phân tích sự biểu hiện protein DAT trong rễ C

roseus và kết luận rằng nó thay đổi cấu trúc MIA Kết quả này cho thấy sự biểu

hiện quá mức của các gen trong con đường vindoline có thể dẫn đến những thay

đổi đáng kể hàm lượng alkaloid trong cây C Roseus [26] Dựa trên nghiên cứu

về sự biểu hiện mạnh của gen ORCA3 và G10H trong cây C Roseus Pan Q và

cộng sự (2012) kết luận rằng sự biểu hiện quá mức này làm tăng đáng kể sự tích lũy của strictosidine, vindoline, catharanthine và ajmalicine [28] Trong năm

2010, Wang và cộng sự đã chuyển thành công gen G10H và ORCA3 vào cây dừa cạn thông qua A rhizogens MSU440 Do đó, hàm lượng catharanthine

trong cây chuyển gen tích lũy cao gấp 6,5 lần so với cây không chuyển gen

[33] Ngoài ra, hệ thống tái sinh và chuyển gen ở C roseus sử dụng

Agrobacterium tumefaciens được phát triển và hoàn thành thành công bởi Wang

và cộng sự (2012) [32]

Từ xưa cho đến nay, việc sử dụng thuốc trong phòng, chữa bệnh và tăng cường sức khỏe đã trở thành một nhu cầu tất yếu quan trọng đối với đời sống con người Với nhu cầu cần sử dụng dược liệu ngày càng tăng, dẫn đến nguy cơ cạn kiệt nguồn dược liệu và các cây thuốc trong tự nhiên cũng không đáp ứng

đủ hàm lượng dược chất cần thiết Theo hướng tiếp cận này, chúng tôi đã sử

dụng cấu trúc vector chuyển gen mang gen CoOMT biến nạp vào cây Bình vôi

nhằm nâng cao hàm lượng dược chất rotundin và alkaloid

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất

2.1.1 Vật liệu

Mẫu cây Bình vôi vàng (Stephania brachyandra Diels) đã được định

danh và trồng tại Vườn thực nghiệm của Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Hình 2.1 Cây Bình vôi in vitro

Chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 tái tổ hợp do Khoa Sinh học,

Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên cung cấp (Hình 2.2)

Bảng 2.1 Cặp mồi đặc trưng của phản ứng RT-PCR

TT Tên mồi Trình tự (5' - 3')

Nhiệt

độ bắt cặp

Kích thước gen