Nghiên cứu chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen ossweet liên quan tính kháng bạc lá vào giống lúa bắc thơm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC CHỈNH SỬA GEN OsSWEET LIÊN QUAN TÍNH KHÁNG BẠC LÁ VÀO GIỐNG LÚA BẮC THƠM Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Đồng Huy Giới NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2020 Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huyền i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Đồng Huy Giới tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Viện di truyền Nông nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2020 Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huyền ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung lúa 2.1.1 Vài nét sơ lược lúa 2.1.2 Giới thiệu chung giống lúa Bắc Thơm 2.1.3 Bệnh hại lúa 2.2 Cải biến di truyền lúa thông qua công nghệ chỉnh sửa gen .12 2.2.1 Giới thiệu công nghệ chỉnh sửa gen 12 2.2.2 Thành tựu cải biến di truyền công nghệ chỉnh sửa gen lúa 14 2.3 Các phương pháp chuyển gen 15 2.3.1 Chuyển gen trực tiếp 15 2.3.2 Chuyển gen gián tiếp 17 2.4 Hệ vector sử dụng nghiên cứu chuyển gen thực vật .18 2.4.1 Vectơ liên hợp (co-integrate vector) 19 2.4.2 Vectơ nhị phân (binary vector) 20 2.4.3 Quá trình chuyển T- DNA vào tế bào thực vật 21 2.4.4 Vector chỉnh sửa gen tế bào thực vật 21 2.5 Chuyển gen vào lúa nhờ vi khuẩn Agrobacterium 27 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 29 3.1 Vật liệu nghiên cứu 29 3.2 Hóa chất thiết bị 29 iii 3.2.1 Hóa chất 29 3.2.2 Thiết bị 30 3.3 Phương pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Biến nạp vector biểu vào tế bào A tumefaciens 30 3.3.2 Phương pháp chuyển gen vào lúa 31 3.3.3 Phương pháp tách DNA tổng số lúa 34 3.3.4 Xác định kiểu gen chuyển gen PCR 34 3.3.5 Đánh giá sinh trưởng phát triển dòng lúa chuyển gen 37 Phần Kết thảo luận 38 4.1 Biến nạp vector vào tế bào A tumefaciens 38 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến nuôi cấy in vitro chuyển gen 39 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ Javen đến hiệu khử trùng hạt khả nảy mầm hạt 39 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến khả hình thành mô sẹo .41 4.2.3 Xác định nồng độ dịch khuẩn A tumefaciens thích hợp để chuyển gen 43 4.3 Tạo dòng lúa chỉnh sửa gen OsSWEET13 giống lúa Bắc Thơm .46 4.3.1 Tạo mô sẹo lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens vào mô sẹo lúa BT7 46 4.3.2 Hiệu chọn lọc mô sẹo 46 4.3.3 Hiệu tái sinh mô sẹo 48 4.3.4 Nuôi trồng điều kiện nhà lưới 50 4.4 Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen kiểu hình dòng lúa tái sinh T0 51 4.4.1 Xác định có mặt cấu trúc gen chuyển 51 4.4.2 Xác định số lượng cấu trúc gen chuyển 55 4.4.3 Giải trình tự đánh giá hiệu chỉnh sửa promoter OsSWEET13 chỉnh sửa dòng lúa chuyển gen 55 4.4.4 Đánh giá đặc điểm kiểu hình dòng lúa tái sinh T0 56 Phần Kết luận kiến nghị 55 5.1 Kết luận 57 5.2 Kiến nghị 57 Cơng trình cơng bố 58 Tài liệu tham khảo .59 Phụ lục 64 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens bp base pair (cặp bazơ) Cas CRISPR associated protein (protein liên kết CRISPR) CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (nhóm đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên) crRNA CRISPR RNA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DBS Double–stranded break (đứt gãy sợi đôi) ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EBE Effector–binding element EPS Extracellular polysaccharide (polysaccharide ngoại bào) EtBr Ethidium bromide HR Homologous recombination (tái tổ hợp tương đồng) kb Kilobase LB Luria–Bertani (môi trường nuôi cấy vi khuẩn) NHEJ Non–homologous end–joining (ghép nối điểm cuối không tương đồng) NST Nhiễm sắc thể Nu Nucleotide OD Optical density (mật độ quang học) PAM Protospacer adjacent motif (motif liền kề protospacer) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PSA Potato sugar agar (môi trường nuôi cấy vi khuẩn) QTL Quantitative trait locus RNAi RNA interference (can thiệp RNA) sgRNA single guide RNA (RNA dẫn đường) T2SS Type II secretion system (hệ thống tiết loại II) v T3SS Type III secretion system (hệ thống tiết loại III) TAL Transcription activator–like (tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) TALEN TAL effector nuclease (nuclease tác động tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) T–DNA Transfer–DNA (DNA chuyển) Ti–plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) tracrRNA trans–encoded CRISPR RNA Xoo Xanthomonas oryzae pv oryzae ZFN Zinc finger nuclease (nuclease ngón tay kẽm) vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại chi Oryza .4 Bảng 2.2 Ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas lúa gạo 15 Bảng 2.3 Một số hệ vector CRISPR/Cas9 dùng cho chuyển gen thực vật 22 Bảng 3.1 Mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra lúa Bắc Thơm .35 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 3.3 Mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc A tumefaciens .36 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ javen đến hiệu khử trùng hạt khả nảy mầm hạt .40 Bảng 4.2 Tỷ lệ tạo mô sẹo hạt lúa Bắc Thơm xử lý 2,4-D nồng độ khác (%) 41 Bảng 4.3 Tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens nồng độ dịch vi khuẩn khác (%) 45 Bảng 4.4 Kết tạo mô sẹo lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens 46 Bảng 4.5 Kết chọn lọc mô sẹo từ phôi trưởng thành 47 Bảng 4.6 Kết tiền tái sinh tái sinh phôi trưởng thành .49 Bảng 4.7 Kết tái sinh gieo trồng nhà lưới 50 Bảng 4.8 Kết kiểm tra với cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv pCas9–Fw/pCas9– Rv .54 Bảng 4.9 Hiệu trình sàng lọc cá thể mang gen chuyển 54 Bảng 4.10 Tổng hợp số liệu chuyển gen 55 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ phân bố bệnh bạc lúa giới Hình 2.2 Triệu chứng điển hình bệnh bạc lúa Hình 2.3 Khuẩn lạc hình dạng Xanthomonas oryzae pv oryzae Hình 2.4 Cơ chế sửa chữa đứt gãy DNA mạch kép .13 Hình 2.5 Cơ chế hoạt động hệ thống CRIPRS-Cas9 .14 Hình 2.6 Cơ chế cắt DNA phức hệ protein CRISPR/Cas9 25 Hình 3.1 Chu trình nhiệt PCR .35 Hình 4.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc .38 Hình 4.2 Hình ảnh mơ sẹo mơi trường MS khác 42 Hình 4.3 Khả tạo mô sẹo giống lúa Bắc thơm số .43 Hình 4.4 Hình ảnh lây nhiễm mô sẹo giống lúa Bắc thơm số .44 Hình 4.5 Mơ sẹo môi trường chọn lọc SI 47 Hình 4.6 Hình ảnh chọn lọc mơ sẹo mang gen đích lần II (A) lần III (B) 48 Hình 4.7 Mơ sẹo môi trường tiền tái sinh 48 Hình 4.8 Mơ sẹo mơi trường tiền tái sinh tái sinh 49 Hình 4.9 Cây non phát triển môi trường rễ 50 Hình 4.10 Cây non ngâm tuần nước 51 Hình 4.11 Ảnh điện di DNA tổng số từ mơ lúa chuyển gen .52 Hình 4.12 Nhân gen actin từ mẫu DNA tổng số lúa chuyển gen .52 Hình 4.13 PCR sử dụng cặp mồi cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv .53 Hình 4.14 PCR sử dụng cặp mồi pCas9–Fv/pCas9–Rv .53 Hình 4.15 Kết giải trình tự promoter OsSWEET13 .55 Hình 4.16 Cây trồng nhà lưới 56 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Thanh Huyền Tên luận văn: “Nghiên cứu chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen OsSWEET liên quan tính kháng bạc vào giống lúa Bắc Thơm” Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa promoter OsSWEET13 vào giống lúa Bắc Thơm Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen kiểu hình dịng lúa tái sinh T0 làm tiền đề cho nghiên cứu sâu vai trị vị trí EBE OsSWEET13 liên quan tới tính mẫn cảm với vi khuẩn Xoo giống lúa Bắc Thơm 7, từ hướng tới việc tạo giống lúa có suất chất lượng cao, đồng thời kháng bệnh bạc phổ rộng Phương pháp nghiên cứu Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào khả biến; Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α kỹ thuật sốc nhiệt (heat shock); Chuẩn bị tế bào khả biến; Biến nạp plasmid vào E.coli DH5α; Tách chiết DNA plasmid từ E.coli; Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kỹ thuật sốc nhiệt (heat shock); Phương pháp chuyển gen vào lúa; Ảnh hưởng nồng độ Javen đến hiệu khử trùng hạt khả nảy mầm hạt; Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến khả tạo mô sẹo; Ảnh hưởng nồng độ dịch khuẩn A tumefaciens đến tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens lên mô sẹo lúa Bắc Thơm 7; Chọn lọc mô sẹo kháng sinh; Tái sinh hoàn chỉnh; Phương pháp tách DNA tổng số lúa; Phương pháp PCR; PCR kiểm tra có mặt cấu trúc biểu gen chuyển; PCR kiểm tra tồn Ti-plamid vi khuẩn A tumefaciens ix Một phần gen kháng kháng sinh Hygromycin B nhân cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv cho sản phẩm PCR với kích thước tính tốn lý thuyết ~800 bp Và phần gen mã hóa enzyme Cas9 nhân cặp mồi pCas9– Fw/pCas9– Rv cho sản phẩm với kích thước tính tốn lý thuyết ~450 bp Hình 4.13 PCR sử dụng cặp mồi cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv Chú thích: Sản phẩm PCR mẫu lúa tái sinh điện di gel agarose 1%; đối chứng trắng: khuôn H2O ; đối chứng dương: khuôn DNA tổng số mẫu lúa TBR mang vector pCas9/Tal5; giếng 1-10: khuôn DNA tổng số mẫu lúa tái sinh Kết điện di Hình 4.13 cho thấy đối chứng trắng khơng có sản phẩm PCR chứng tỏ thành phần phản ứng không bị nhiễm Các mẫu lúa tái sinh (giếng 1-10) cho băng đặc hiệu rõ ràng với kích thước với dự đốn theo lý thuyết 800 bp giống với đối chứng dương Như kết luận, tất mẫu lúa có mặt trình tự mã hóa Hygromycin phosphotransferase Các mẫu cho lên băng rõ ràng tiếp tục sử dụng DNA tổng số để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi pCas9–Fw/pCas9–Rv Hình 4.14 PCR sử dụng cặp mồi pCas9–Fv/pCas9–Rv Chú thích: Sản phẩm PCR mẫu lúa tái sinh điện di gel agarose 1%; đối chứng trắng: khuôn H2O; đối chứng dương: khuôn DNA tổng số mẫu lúa TBR mang vector pCas9/Tal5-TalC; giếng 1-10: khuôn DNA tổng số mẫu lúa tái sinh 53 Kết điện di Hình 4.14 cho thấy đối chứng trắng khơng có sản phẩm PCR chứng tỏ thành phần phản ứng không bị nhiễm Các mẫu lúa tái sinh (giếng 1-10) cho băng đặc hiệu rõ ràng với kích thước với dự đốn theo lý thuyết 450 bp giống với đối chứng dương, mẫu đối chứng âm wild type không thấy xuất băng vạch DNA Như kết luận tất mẫu lúa có mặt cấu trúc mã hóa protein Cas9 Tiến hành phân tích tổng cộng 80 mẫu tái sinh lần thí nghiệm nhắc lại với cặp mồi nêu Kết tổng hợp Bảng 4.8 Bảng 4.8 Kết kiểm tra với cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv pCas9–Fw/pCas9–Rv Mẫu dương tính phản ứng PCR Số lần nhắc lại Lần Lần Lần Tổng cộng Tỷ lệ (%) Số lượng sống sót Sử dụng cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv Sử dụng cặp mồi pCas9–Fw/pCas9–Rv 30 23 28 22 28 22 27 80 25 75 22 72 93,86 ± 1,60 96 ± 6,93 Qua lần thí nghiệm nhắc lại, thu tổng 80 tái sinh Trong đó, 75/80 cho kết dương tính lần với cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv đạt tỷ lệ trung bình 93,86% Sau đó, 75 mẫu tiếp tục kiểm tra với cặp mồi pCas9–Fw/pCas9–Rv cho 72/75 mẫu dương tính đạt tỷ lệ trung bình 96% Bảng 4.9 Hiệu trình sàng lọc cá thể mang gen chuyển Cây tái Mô sẹo Mô sẹo Mô sẹo phát triển Cây tái ban đầu lây nhiễm qua chọn lọc sinh Số lượng 748 691 247 80 72 Tỷ lệ (%) 100 92,38 33,02 10,69 9,63 sinh mang gen chuyển Như vậy, từ 748 mô sẹo ban đầu xâm nhiễm chọn lọc 247 mô sẹo Đồng thời tái sinh thành công 72 mang gen chuyển (Bảng 4.9) Các cá thể tiếp tục kiểm tra để đánh giá hiệu hoạt động hệ thống CRIPRS/Cas9 hệ gen lúa Bắc Thơm khả kháng bạc bảo tồn đặc điểm nông sinh học so với không chuyển gen 54 4.4.2 Xác định số lượng cấu trúc gen chuyển Các dòng lúa kiểm tra có mang cấu trúc gen chuyển xác định số lượng copy phương pháp Realtime PCR với cặp mồi Hygromycin kết có 34/72 dòng mang copy 38/72 dòng mang copy (Bảng 4.10) Bảng 4.10 Tổng hợp số liệu chuyển gen Lần nhắc lại Lần Lần Lần Tổng cộng Số lượng Hơn 28 14 14 22 22 10 10 12 12 72 34 38 4.4.3 Giải trình tự đánh giá hiệu chỉnh sửa promoter OsSWEET13 chỉnh sửa dòng lúa chuyển gen Các dịng lúa mang copy giải trình tự promoter đích, kết cho thấy có 31/34 dịng có mang vị trí đột biến Điều chứng tỏ hiệu chỉnh sửa đạt 91,18% Hình 4.15 Kết giải trình tự promoter OsSWEET13 Chú thích: Kết giải trình tự promoter OsSWEET13 dịng lúa 34 (A) phân tích phần mềm CRISP-ID ver 1.1 (B) NST thứ cặp tương đồng bị đoạn TTAG, NST thứ hai cặp tương đồng chèn thêm Nu C 55 4.4.4 Đánh giá đặc điểm kiểu hình dịng lúa tái sinh T0 31 dịng lúa chỉnh sửa trồng nhà lưới 27 dịng sống sót qua giai đoạn phát triển nên đánh giá đặc điểm sinh trưởng phát triển Kết cho thấy dịng có sinh trưởng chậm so với đối chứng: 21 dòng (77,78%) sinh trưởng phát triển tương đương với đối chứng, có số bị biến dị dẫn đến lùn Hình 4.16 Cây trồng nhà lưới 56 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Chuyển thành công cấu trúc biểu phức hệ protein-RNA chỉnh sửa promoter OsSWEET13 vào giống lúa Bắc Thơm Kiểm tra số lượng chuyển gen có 34/72 mang 38/72 mang nhiều Trong số dịng chuyển gen sống sót có 21/27 dịng (tương đương 77,78%) có kiểu hình tương đương đối chứng 5.2 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu biểu OsSWEET13 dòng lúa chỉnh sửa gen Đánh giá khả kháng vi khuẩn bạc Xoo dịng lúa chỉnh sửa gen 57 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ ''Phân lập thiết kế gRNA chỉnh sửa promoter OsSWEET13 liên quan đến bệnh bạc lúa Bắc Thơm 7'' - Đã chấp nhận đăng tạp chí Nông nghiệp PTNT 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Adachi N & Oku T (2000) PCR–mediated detection of Xanthomonas oryzae pv oryzae by amplification of the 16S–23S rDNA spacer region sequence Journal of General Plant Pathology 66(4): 303-309 Adhikari T B & Basnyat R C (1999) Virulence of Xanthomonas oryzae pv oryzae on rice lines containing single resistance genes and gene combinations Plant Disease 83: 46-50 Akhtar M A., Rafi A & Hameed A (2008) Comparison of methods of inoculation of Xanthomonas oryzae pv oryzae in rice cultivars Pakistan Journal of Botany 40(5): 2171-2175 Arora L & Narula A (2017) Gene editing and crop improvement using CRISPR– Cas9 system Frontiers in Plant Science 8: 1932 pages Bharathkumar S., David P R S., Brindha P V., Kavitha S & Gnanamanickam S S (2008) Improvement of bacterial blight resistance in rice cultivars Jyothi and IR50 via markerassisted backcross breeding Journal of Crop Improvement 21: 101-116 Blanvillain–Baufumé S., Reschke M., Solé M., Auguy F., Doucoure H., Szurek B., Meynard D., Portefaix M., Cunnac S., Guiderdoni E., Boch J & Koebnik R (2017) Targeted promoter editing for rice resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae reveals differential activities for SWEET14–inducing TAL effectors Plant Biotechnology Journal 15(3): 306-317 Borkar S G & Yumlembam R A (2016) Bacterial diseases of crop plants CRC Press, Florida Bortesi L & Fischer R (2015) The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond Biotechnology Advances 33(1): 41-52 Broglie K., Chet I., Holliday M., Cresman R., Biddle P., Knowl-ton S., Mauvais C J & Brogile R (1991) Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctoiía solani Science 254: 1194-119 Bùi Trọng Thủy & Phan Hữu Tôn (2004) Khả kháng bệnh bạc dòng lúa thị (Tester) chứa đa gen kháng với số chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa phổ biến miền bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp (2): 1-6 59 CABI/EPPO (2016) Xanthomonas oryzae pv oryzae Centre for Agriculture and Bioscience International, Oxford Cao Lệ Quyên, Lê Kim Hoàn, Phạm Xuân Hội & Lê Huy Hàm (2008) Nghiên cứu khả tái sinh lúa từ phơi tập đồn giống lúa Việt Nam nhằm phục vụ công tác chuyển gen Tạp chí Sinh học 3: 141-147 Cao Lệ Quyên, Phạm Thị Vân & Phạm Xuân Hội (2011) Nghiên cứu khả tạo mô sẹo tái sinh từ giống lúa nương Việt nam nhập nội phục vụ cho cơng tác chuyển gen Tạp chí Sinh học 33(1): 80-85 Cao Lệ Quyên, Phạm Thị Vân, Trần Tuấn Tú & Phạm Xuân Hội (2019) Xây dựng quy trình chuyển gen vào giống lúa Bắc thơm số thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thôn 5: 25-30 Cao Lệ Quyên, Phạm Thu Hằng, Chu Thị Linh, Nguyễn Thi Lệ Thu, Lê Huy Hàm & Phạm Xuân Hội (2017) Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro số giống lúa chủ lực sản xuất Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn (1): 36-41 Đái Duy Ban & Lữ Thị Cẩm Vân (1994) Công nghệ Gen công nghệ sinh học ứng dụng nông nghiệp đai Nhà xuất Nông nghiệp 11-22 Dong Y F., Jin X., Tang Q L., Zhang X., Yang J T., Liu X J., Cai J F., Zhang X B., Wang X J & Wang Z X (2017) Development and event- specific detection of transgenic glyphosate-resistant rice expressing the G2-EPSPS gene Front Plant Sci 8: 885 Hiei Y & Komari T (2008) Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed Nat Protocols 3: 824-834 Hirofumi U., Seiichi F., Jirong H., Takaomi F., Masanori N., Kyung-Min K., Mawai Y., Takamitsu K., Kazuyuki K & Michito T (2002) Transgenic rice plants conferring increased tolerance to rice blast and multiphe environmental stresses Molecular Breeding 9: 25-31 Ji G H., Wei L F., Wu Y P & Bai X H (2008) Biological control of rice bacterial blight by Lysobacter antibioticus strain 13–1 Biological Control 45: 288-296 Jiang N., Yan J & Liang Y (2020) Resistance Genes and their Interactions with Bacterial Blight/Leaf Streak Pathogens (Xanthomonas Oryzae) in Rice (Oryza sativa L.) - an Updated Review Rice (N Y) 13 Korotkova A., Gerasimova S & Khlestkina E (2019) Current achievements in modifying crop genes using CRISPR/Cas system Vavilov Journal of Genetics and 60 Breeding 23: 29-37 Lê Thị Ánh Hồng (2000) Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen thực vật Nhà xuất Nông nghiệp 51-84 Li T., Liu B., R.R.I.D.B 7777, Ona I.P & Borines L.M (2002) Development of Xagene pyramid rice lines with durable resistance to bacterial blight Ma X., Zhu Q., Chen Y & Liu Y G (2016) CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: Developments and applications Molecular Plant 9(7): 961-974 Mew T W., Alvarez A M., Leach J E & Swings J (1993) Focus on bacterial blight of rice Plant Disease 77: 5-12 Mew T W., Vera Cruz C M & Medalla E S (1992) Changes in race frequency of Xanthomonas oryzae pv oryzae in response to rice cultivars planted in the Philippines Plant Disease 76: 1029-1032 Mikami M., Toki S & Endo M (2015) Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice Plant Mol Biol 88(6): 561-572 Murashige T & Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 473-497 Nguyễn Đức Doanh (1998) Tổng quan chuyển gen từ 1986 – 1997 Báo cáo hội nghị toàn quốc lần thứ công nghệ sinh học lúa Tháng 05/1998 Huế 35-40 Nguyễn Thị Lan Hoa, Dỗn Thị Hịa, Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Phí Cơng Ngun, Đặng Thị Minh Trang & Đỗ Minh Huy (2003) Những kết ban đầu chuyển gen Anti-ACO vào hoa cúc Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn-Viện Di truyền Nông Nghiệp (2+3): 20-26 Niño‐Liu D.O., Ronald P.C & Bogdanove A.J (2006) Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop Molecular Plant Pathology 7(5): 303-324 OEPP/EPPO (2007) Diagnostic: Xanthomonas Oryzae OEPP/EPPO Bulletin 37: 543-553 Phạm Xuân Hội & Trần Duy Quý (2002) Công nghệ gen việc tăng sản lượng lúa Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thônViện Di truyền Nông nghiệp (3+4): 1-10 Phan Hữu Tôn (2016) Khảo sát khả kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, rầy nâu giống lúa phục tráng: Nếp Đèo Đàng, Tẻ Pude, Blechâu Khẩu Dao Tạp chí khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 14(4): 551-559 Rao Y., Li Y & Qian Q (2014) Recent progress on molecular breeding of rice in China 61 Plant cell reports 33: 17 Romero F M & Gatica-Arias A (2019) CRISPR/Cas9: Development and Application in Rice Breeding Rice Science 26(5): 265–281 Rousseau C., Gonnet M., Le–Romancer M & Nicolas J (2009) CRISPI: a CRISPR interactive database Bioinformatics 25: 3317-3318 Sahoo1 K., Tripathi A., Pareek A., Sopory S & Singla-Pareek S (2011) An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars Methodology 7: 49 Sanadi Y., Samudra M., Priyatno T P., Susilowati D.N., Lestan P., Fatimah F & Kadir T S (2016) Determination of pathotypes from indonesian Xanthomonas oryzae pv oryzae population causing bacterial leaf blight and their reactions on differential rice Makara Journal of Science 20(3): 109-118 Shavindra B & Amitabh M (2005) Recent advances in rice biotechnology-towards genetically superior transgenic rice Plant Biotechnology Journal 3: 275-307 Shen C.X., Que Q.Z., Xia Y.M., Tang N., Li D., He R.H & Cao M.L (2017) Knock out of the annexin gene OsAnn3 via CRISPR/Cas9-mediated genome editing decreased cold tolerance in rice J Plant Bio 60(6): 539-547 Shiping Z., Wen-Yuan S., Lili C & Deling R (1998) Transgenic elite indica rice varieties, resistant to Xanthomonas oryzae pv oryzae Mulecular Breeding 4: 551-558 Srivastava D N (1972) Bacterial leaf blight of rice Phytopathol 26: 1-16 Streubel J., Pesce C & Hutin M (2013) Five phylogenetically close rice SWEET genes confer TAL effector-mediated susceptibility to Xanthomonas oryzae pv oryzae New Phytol 200(3): 808-819 Sun W., Zhang X., Wu C.Y., He Y.B., Ma Y.Z., Hou H., Guo X.P., Du W.M., Zhao Y.D & Xia L.Q (2016) Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase Mol Plant 9(4): 628-631 Swings J., Van Den Moore M., Vauterin L., Hoste B., Gillis M., Mew T.W & Kerster K (1990) Reclassification of the causal agents of bacterial blight (Xanthomonas campestris pv oryzae) and bacterial leaf streak (Xanthomonas campestris pv oryzicola) of rice as pathovars of Xanthomonas oryzae (ex Ishiyama 1922) sp nov., nom rev International Journal of Systematic Bacteriology 40: 309-311 62 Tổng cục Thống kê (2010) Niên giám thống kê năm 2010 NXB Thống kê Hà Nội Tsaftaris A S., Polidoros A N., Karavangeli M., Nianiou–Obeidat I., Madesis P & Goudoula C (2000) Biological resource management–connecting science and policy Transgenic crops: recent developments and prospects, Springer 187-203 Vaughan D A (1994) The wild relative of rice - A genetic resources handbook IRRI 3-5 Verdier V., Triplett L.R & Hummel A.W (2012) Transcription activator-like (TAL) effectors targeting OsSWEET genes enhance virulence on diverse rice (Oryza sativa) varieties when expressed 30 individually in a TAL effector-deficient strain of Xanthomonas oryzae New Phytologist 196(4): 1197-1207 Wang C., Qin T & Yu H (2013) The broad bacterial blight resistance of rice line CBB23 is triggered by a novel transcription activator‐like (TAL) effector of Xanthomonas oryzae pv oryzae Mol Plant Pathol 15(4): 333-341 63 PHỤ LỤC Phụ lục Kết kiểm tra số lượng copy dòng lúa chuyển gen STT Av2ΔCt±SD Số copy 1.01 0.53±0.002 1.02 0.95±0.057 1.03 STT Av2ΔCt±SD Số copy 1.15 0.44±0.048 1.16 1.17±0.126 0.52±0.028 1.17 0.90±0.053 1.04 0.93±0.026 1.18 0.54±0.027 1.05 0.51±0.017 1.19 0.91±0.008 1.06 0.99±0.040 1.20 0.48±0.031 1.07 0.47±0.020 1.21 1.01±0.212 1.08 1.25±0.017 1.22 1.10±0.159 1.09 0.52±0.029 1.23 0.49±0.035 1.10 0.51±0.008 1.24 0.50±0.049 1.11 1.37±0.015 2-3 1.25 1.17±0.020 1.12 0.53±0.044 1.26 0.51±0.033 1.13 0.91±0.027 1.27 0.97±0.015 1.14 0.57±0.014 1.28 0.91±0.022 STT (Lần 2) Av2ΔCt±SD Av2ΔCt±SD Số copy 2.01 1.29±0.035 2.12 0.52±0.029 2.02 0.49±0.013 2.13 0.41±0.057 2.03 0.94±0.027 2.14 0.93±0.026 2.04 0.49±0.043 2.15 1.17±0.126 2.05 1.01±0.212 2.16 0.91±0.212 2.06 0.53±0.002 2.17 1.20±0.159 2.07 0.95±0.057 2.18 0.51±0.008 2.08 0.52±0.028 2.19 0.48±0.031 2.09 0.93±0.026 2.20 0.99±0.040 2.10 1.01±0.212 2.21 0.52±0.028 2.11 0.53±0.002 2.22 0.93±0.026 (Lần 1) (Lần 1) Số copy STT (Lần 2) 64 STT STT Av2ΔCt±SD Số copy STT (Lần 3) Av 2ΔCt±SD Số copy STT (Lần 3) Av 2ΔCt±SD Số copy 3.01 0.63±0.012 3.12 1.64±0.023 3-4 3.02 0.105±0.057 3.13 1.27±0.026 3.03 0.55±0.029 3.14 0.60±0.033 3.04 1.13±0.016 3.15 1.39±0.123 2-3 3.05 0.41±0.018 3.16 0.51±0.008 3.06 0.99±0.030 3.17 0.58±0.021 3.07 0.48±0.021 3.18 1.21±0.012 3.08 1.15±0.019 3.19 0.52±0.059 3.09 0.42±0.025 3.20 1.49±0.035 2-3 3.10 0.91±0.009 3.21 0.50±0.049 3.11 1.27±0.014 3.22 1.07±0.025 (Lần 1) 65 (Lần 1) Av2ΔCt±SD Số copy Phụ lục Tổng hợp kết giải trình tự STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Cây 1.01 1.03 1.05 1.07 1.09 1.10 1.12 1.14 1.15 1.18 1.20 1.23 1.24 1.26 2.02 2.04 2.06 2.08 2.11 2.12 2.13 2.18 2.19 2.21 3.01 3.03 3.05 3.07 3.09 3.14 3.16 3.17 3.19 3.21 Đột biến Tal   Đột biến Tal C                 Dạng đột biến Không chỉnh sửa Mất Nu Chèn thêm Nu Mất đoạn Đổi đoạn                 66 Mất đoạn Đổi đoạn Phụ lục Kết sinh trưởng phát triển dòng lúa chuyển gen Số thứ tự Lơ Lơ Lơ Lơ Tên dịng 1.00 (ĐC) 1.01 1.03 1.05 1.07 1.09 1.10 1.12 1.15 1.18 1.20 1.23 1.26 1.00 (ĐC) 2.02 2.04 2.08 2.13 2.18 2.19 1.00 (ĐC) 3.01 3.03 3.05 3.07 3.09 3.16 3.17 3.19 3.21 Số cây/dòng (Cây) 15 3 4 3 15 3 3 15 3 3 4 Chiều cao (cm) 103,20±5,16a 100,00±1,80a 100,38±2,32a 96,83±6,43ab 99,13±3,57a 43,55±5,06d 98,17±2,52ab 100,38±1,97a 92,00±5,10b 101,83±3,88a 100,17±3,88a 51,33±3,55c 39,25±4,44d 103,20±5,16a 99,50±0,91ab 97,67±2,75ab 99,17±2,47ab 41,67±7,64c 98,00±0,50ab 95,25±5,52b 103,20±5,16a 101,17±2,08a 99,67±1,76a 97,75±5,95a 43,00±2,29c 43,57±6,20c 98,67±3,25a 99,63±1,70a 89,67±2,52b 97,00±1,35a Số nhánh (Nhánh) 10,93±1,83 4,67±0,58 4,75±0,50 4,00±1,00 4,75±1,00 2,75±0,96 5,33±0,58 5,33±0,58 3,75±0,50 5,00±1,00 4,33±0,58 2,67±0,58 3,00±0,82 10,93±1,83 4,50±0,58 5,33±0,58 5,33±0,58 2,00±1,00 4,33±0,58 5,25±1,71 10,93±1,83 5,00±0,00 4,33±0,58 4,75±1,26 2,33±0,58 4,33±1,53 5,00±0,00 5,25±0,96 3,67±0,58 5,50±0,58 Chú thích: - Chiều cao số nhánh trình bày: Mean ± SD - Các chữ nhỏ cột khác thể sai khác có ý nghĩa với α = 0,05 67