Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crisprcas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bắc thơm 7. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Vũ Hoài Sâm NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPRCas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BẠC LÁ Ở GI.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - Vũ Hồi Sâm NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ CRISPR/Cas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM Chuyên ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 94.20.201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2023 Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam (VAAS) Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Xuân Hội TS Nguyễn Duy Phương Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Quốc gia Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cơng nghệ chỉnh sửa gen cho phép cải biến DNA hệ gen cách xác hiệu quả, cách sử dụng nuclease để tạo đột biến đứt gãy sợi đơi vị trí xác định CRISPR-Cas9 cơng cụ chỉnh sửa gen tiên tiến, ứng dựng phổ biến nay, với cấu trúc đơn giản mà hiệu cao Việc ứng dụng công nghệ tạo cách mạng khoa học sống nói chung khoa học nơng nghiệp nói riêng, mang lại hội chọn giống trồng Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (gọi tắt Xoo) gây thiệt hại nặng nề cho sản xuất lúa gạo Việt Nam Sử dụng giống lúa kháng cách tốt để đối phó với bệnh bạc Giống lúa Bắc thơm (BT7) giống chủ lực miền Bắc với ưu điểm chất lượng gạo thơm, ngon, suất cao Tuy nhiên, giống mẫn cảm với bệnh bạc (vụ Mùa) Vì vậy, nghiên cứu tạo giống lúa BT7 kháng bạc yêu cầu tất yếu, giúp đảm bảo tính bền vững hiệu sản xuất lúa gạo khu vực phía Bắc Xoo xâm nhiễm vào tế bào lúa gây bệnh thông qua hệ thống tiết loại III (T3SS) Các protein TAL thuộc T3SS liên kết với vùng promoter hoạt hóa biểu gen “nhiễm” (S gene) gây bệnh bạc lúa OsSWEET14 gen “nhiễm” quan trọng, hoạt hóa protein TAL, tế bào tăng cường vận chuyển đường đến gian bào, cung cấp dinh dưỡng cho Xoo sinh trưởng phát triển Các đột biến vùng promoter gen “nhiễm” vị trí liên kết (Effector binding element – EBE) với protein TAL phá vỡ mối liên kết protein TAL Xoo gen “nhiễm” Ý tưởng gây đột biến xác gen “nhiễm” cơng nghệ CRSIPR/Cas9 để cải tiến tính kháng bạc cho giống lúa BT7 chiến lược chọn giống hoàn toàn Việt Nam, đáp ứng đồng thời nhu cầu cấp thiết sản xuất khoa học nơng nghiệp Việt Nam Vì vậy, luận án “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc giống lúa BT7” thực Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để tăng cường tính kháng bệnh bạc cho giống lúa BT7 thông qua chỉnh sửa promoter OsSWEET14 Mục tiêu cụ thể: - Tối ưu quy trình chuyển gen vào phôi non (immature embryo – IE) giống lúa BT7 thông qua Agrobacterium tumefaciens - Thiết kế T-DNA biểu phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 giống lúa BT7 (gọi tắt SW14-BT) - Tạo dòng lúa BT7 mang đột biến SW14-BT CRISPR/Cas9 - Sàng lọc dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT tăng cường tính kháng với vi khuẩn Xoo Việt Nam Những đóng góp luận án - Luận án tối ưu quy trình chuyển gen IE lúa BT7 thơng qua A tumefaciens, đạt hiệu suất chuyển gen 20,68% - Đã xác định OsSWEET14 gen “nhiễm” quan trọng bệnh bạc lúa giống BT7 thiết kế thành công hệ thống vector chuyển gen mang cấu trúc biểu CRISPR/Cas9 chỉnh sửa SW14BT - Đã ứng dụng thành công hệ thống CRISPR/Cas9 để tạo tám dòng lúa BT7 mang đột biến SW14-BT dạng đồng hợp, khơng chứa T-DNA có đặc điểm nơng sinh học tương tự giống đối chứng - Đã sàng lọc hai dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT thể tính kháng hồn tồn chủng VXO_11 Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa khoa học Việc xác định yếu tố môi trường yếu tố vật lý tác động đến chuyển gen IE vào giống lúa BT7 thông qua A tumefaciens bổ sung dẫn liệu khoa học cho nghiên cứu chuyển gen lúa indica Cơ chế gây bệnh bạc mức độ phân tử số chủng VXO giống lúa BT7 cho thấy quần thể Xoo Việt Nam có đa dạng hệ protein TAL liên quan tới độc tính vi khuẩn lúa Chủng VXO_11 gây bệnh giống BT7 thông qua protein TAL độc liên kết với EBE AvrXa7/PthXo3/TalF, độc tính VXO_60 VXO_96 phụ thuộc vào protein TAL khác Thành công việc ứng dung CRISPR/Cas9 để tạo đột biến xác giống lúa chủ lực sản xuất (BT7) miền Bắc Việt Nam nguồn dẫn liệu cho nghiên cứu cải tiến giống sau 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Luận án tạo dịng lúa BT7 chỉnh sửa gen có khả kháng chủng vi khuẩn VXO_11, có đặc tính nơng sinh học khơng khác biệt giống ban đầu Đây nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu chọn tạo phát triển dòng/giống BT7 kháng bạc sau Cấu trúc vector chỉnh sửa promoter OsSWEET14 sử dụng cho nghiên cứu tương tự lúa Việt Nam Thành công luận án mở triển vọng chỉnh sửa gen nâng cao suất, tính chống chịu chất lượng giống trồng khác Việt Nam Bố cục luận án: Luận án gồm (1) Mở đầu trang, (2) Tổng quan 37 trang, (3) Đối tượng phương pháp nghiên cứu 23 trang, (4) Kết nghiên cứu 61 trang, (5) Kết luận đề nghị trang, 162 TLTK, 23 bảng, 41 hình Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 công nghệ chỉnh sửa gen tiên tiến, cho phép cải biến DNA hệ gen tế bào cách xác hiệu Hệ thống tạo đứt gãy DNA sợi đơi vị trí xác định hệ gen thông qua chế tự sửa chữa DNA tế bào để tạo đột biến có chủ đích Cơng nghệ xem bước phát triển đột phá việc cải tiến tính trạng nơng sinh học q giống trồng, bao gồm lúa gạo Phức hợp CRISPR/Cas9 có cấu trúc đơn giản, dễ tùy biến để chỉnh sửa đặc hiệu DNA đặc biệt thiết kế thao tác khơng cần sử dụng DNA hay plasmid Điều giúp giảm thiểu lo ngại tương tự trường hợp sinh vật biến đổi gen Quá trình thực chỉnh sửa gen thực vật gồm bước chính: sàng lọc vị trí gen đích thiết kế sgRNA; tổng hợp sgRNA thiết kế cấu trúc vector biểu sgRNA-Cas9; biến nạp cấu trúc vector vào tế bào vật chủ; xác định đột biến; đánh giá kiểu hình chọn dịng chỉnh sửa gen mục tiêu Giới thiệu bệnh bạc vi khuẩn gây bệnh Bệnh bạc (bacterial leaf blight disease) lúa cịn gọi bệnh cháy bìa lúa, vi khuẩn Xoo gây ra, bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối thành đại dịch với nhiều vùng trồng lúa Việt Nam nhiều nơi giới Khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, Xoo tiết protein TAL tương thích (nhận biết EBE phù hợp) với gen nhiễm, tăng cường biểu gen nhằm ức chế hệ thống phòng vệ tế bào chủ giúp vi khuẩn sinh trưởng lan truyền chủ Họ gen SWEET (OsSWEET11(Os8N3/Xa13), OsSWEET12, OsSWEET13 (Xa25), OsSWEET14 OsSWEET) đích cơng Xoo; biểu gen tăng cường trình vận chuyển đường tích lũy ngồi màng sinh chất, cung cấp dinh dưỡng cho Xoo sinh trưởng phát triển OsSWEET14 xác định đích tác động protein TAL TalC, PthXo3, AvrXa7, TalF/Tal5 hoạt động gen “nhiễm” đóng vai trị quan trọng độc tính Xoo Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa kháng bệnh bạc Việc phát triển giống lúa kháng bệnh bạc sản xuất giống lúa chủ lực có ý nghĩa vơ to lớn để tăng sản lượng, góp phần nâng cao hiệu kinh tế sản xuất Tính biến động quần thể bạc nước thách thức lớn cho công tác chọn tạo giống lúa kháng Gần đây, với đời phát triển mạnh mẽ công nghệ chỉnh sửa hệ gen, nhà khoa học can thiệp biến đổi trình tự bám protein TAL vùng promoter gen “nhiễm” lúa Một số giống lúa mẫn cảm với chủng vi khuẩn Xoo châu Á châu Phi nghiên cứu chỉnh sửa gen hệ thống TALEN CRISPR/Cas9 nhằm tạo giống lúa kháng bạc công bố Ở Việt Nam, nghiên cứu nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc dựa tương tác protein TAL-gen “nhiễm” Giống lúa BT7 nghiên cứu cải tiến giống lúa BT7 Giống lúa BT7 giống lúa nhập nội từ Trung Quốc, chọn lọc làm Công ty cổ phần Tập đồn ThaiBinh Seed Đây giống lúa thuộc nhóm giống ngắn ngày loài phụ indica, giống lúa chủ lực sản xuất miền Bắc Việt Nam Tuy nhiên, giống lúa BT7 mẫn cảm với chủng vi khuẩn Xoo Với ưu điểm mặt suất chất lượng, giống lúa BT7 đối tượng đặc biệt quan tâm chương trình nghiên cứu chọn tạo giống Bằng thị phân tử kết hợp với lai trở lại (MABC), hướng nghiên cứu chọn giống có khả chịu ngập chịu mặn di truyền giống BT7 thực Một vài nghiên cứu gần cố gắng tích hợp gen kháng bệnh bạc vào BT7 (bằng phương pháp lai) nhằm nâng cao giá trị thương mại cho giống lúa Vì vậy, ứng dụng cơng nghệ tiên tiến CRISPR/Cas9 vào chỉnh sửa gen “nhiễm” (OsSWEET14) giống lúa BT7 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc hướng nghiên cứu có tính thực tiễn cao, bắt kịp xu hướng chọn giống xác với giới Chuyển gen lúa thông qua vi khuẩn A tumefaciens Trong nghiên cứu chỉnh sửa hệ gen thực vật CRISPR/Cas9, cấu trúc chỉnh sửa chuyển đến vị trí mục tiêu chủ yếu thơng qua tích hợp ổn định T-DNA vào hệ gen chủ thông qua A tumefaciens phương pháp hiệu phổ biến nhờ vào khả gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật cách xác ổn định Vật liệu khác hay gen đích khác cho hiệu chỉnh sửa gen khác loài Đặc biệt lúa, chuyển hệ thống CRISPR-Cas qua A tumefaciens, thu phần lớn mang sao, thuận lợi cho việc xác định đột biến hệ gen phân tích di truyền hệ cháu trở nên dễ dàng Sử dụng IE (phôi hạt non) làm vật liệu khởi đầu cho trình chuyển gen chứng minh hiệu nhiều so với loại vật liệu khác (phôi hạt già), khả tạo mô sẹo khả tái sinh từ vật liệu IE tốt Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu chuyển gen lúa sử dụng IE công bố, đặc biệt giống lúa chủ lực phía Bắc Bắc thơm Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Promoter OsSWEET14 giống lúa BT7 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu Hạt giống lúa BT7 IR24 cung cấp Công ty cổ phần Tập đoàn ThaiBinh Seed Vi khuẩn E coli chủng DH5α công ty Thermo Fisher Scientific; A tumefaciens chủng EHA105 khả biến Công ty Clontech Laboratories cung cấp; chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 mang vector pCAMBIA1301 20 chủng Xoo cung cấp Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền nông nghiệp Vector pCas9 pENTR4-gRNA nhóm nghiên cứu Tiến sĩ Sebastien Cunnac (Viện Nghiên cứu phát triển, Montpellier, Pháp) cung cấp Vector pGEM-T đóng gói kit pGEM®-T Easy Vector Systems hãng Promega cung cấp Các oligonucleotide sử dụng nghiên cứu cung cấp công ty Invitrogen (Hoa Kỳ) Sigma (Hoa Kỳ) Nội dung phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa BT7 sử dụng phôi non (IE) - Tối ưu hệ thống tái sinh in vitro lúa BT7 từ IE - Tối ưu điều kiện chuyển gen IE giống lúa BT7 nhờ A tumefaciens - Quy trình chuyển gen IE giống lúa BT7 nhờ A tumefaciens Nội dung – Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa promoter OsSWEET14 giống lúa BT7 (SW14-BT) - Nghiên cứu chế phân tử lây nhiễm Xoo giống lúa BT7 - Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT Hình 2.4&5 Sơ đồ thiết kế vector pCas9/gRNA-SW14 Ghi chú: Trình tự DNA nhận biết SW14-BT (gRNA-SW14) chèn vào vị trí BsaI vector pENTR4-gRNA Cấu trúc biểu sgRNA chèn vào khung vector pCas9 LR clonase Nội dung - Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa promoter SW14-BT - Tạo chủng A tumefaciens mang cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT - Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT vào giống lúa BT7 - Sàng lọc kiểu gen kiểu hình dịng lúa BT7 tái sinh - Sàng lọc kiểu gen kiểu hình dịng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1 Nội dung - Đánh giá tính kháng bệnh bạc dịng lúa BT7 chỉnh sửa promoter SW14-BT - Đánh giá đặc điểm nông sinh học dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT - Nghiên cứu biểu OsSWEET14 dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT - Đánh giá khả kháng bệnh bạc dòng BT7 đột biến SW14 hệ T2 11 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tuổi IE đến hiệu chuyển gen BT7 Công thức DAP1 IE1 -10 70,1b 16,3b 64,2a 6,7b 45,8b IE2 11 - 13 80,8a 24,6ab 56,8a 14,0a 59,0a IE3 14 - 16 85,0a 26,4a 22,6b 3,7b 24,4b Tỉ lệ IE tạo TL mô sẹo sau Tỉ lệ mô sẹo mô sẹo (%) chọn lọc (%) tái sinh (%) Số tái Tỉ lệ mang sinh gen chuyển2 (%) Tuổi phôi (số ngày sau thụ phấn); Tỉ lệ tái sinh có kết PCR dương tính với cặp mồi HPT-Fw/HPT/Rv (đặc hiệu cho gen chọn lọc HPT) Số liệu trình bày bảng giá trị trung bình lần lặp lại công thức Các chữ khác cột thể sai khác có ý nghĩa (α=0,05) Tuổi phơi non có tác động rõ rệt đến tạo thành mô sẹo sau giai đoạn đồng nuôi cấy số mô sẹo thu sau q trình chọn lọc mơi trường chứa kháng sinh Tuổi phơi thích hợp để chuyển gen vào IE giống lúa BT7 11-13 DAP, giai đoạn đầu q trình phơi trưởng thành, hiệu suất chuyển gen đạt 13,9% Bảng 3.5 Ảnh hưởng AS đến trình chuyển gen BT7 Nồng độ Tổng IE tạo mô Mô sẹo sống Số mô sẹo tái Số tái sinh AS (μM) số IE sẹo sau chọn lọc sinh mang gen chuyển1 60 46,3a 15,7a 9,7a 100 60 41,7 b b b 150 60 38,0b 10,0b 6,0b 12,3a 200 60 26,7c 2,7c - 11,0 6,3 8,3b Số tái sinh có kết PCR dương tính với cặp mồi HPT-Fw/HPT/Rv (đặc hiệu cho gen chọn lọc HPT) (-) Không đánh giá Số liệu trình bày bảng giá trị trung bình lần lặp lại cơng thức Các chữ khác cột thể sai khác có ý nghĩa (α=0,05) Ngồi ra, nồng độ Acetosyringone (AS) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy thấp gây hiệu chuyển gen kém, cao gây độc làm khả tái sinh mô sẹo Trong nghiên cứu này, với mật độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy tuổi phôi non tối ưu, nồng độ AS 150 μM cho hiệu suất chuyển gen cao nhất, đạt 20,6% 12 Quy trình chuyển gen IE giống lúa BT7 nhờ A tumefaciens thiết lập So với quy trình chuyển gen sử dụng phơi trưởng thành Cao Lệ Quyên et al (2019), hiệu suất chuyển gen quy trình sai khác khơng có ý nghĩa, 22,53% 20,68% Hình 3.7 Quy trình chuyển gen IE lúa BT7 nhờ A tumefaciens Thiết kế cấu trúc T- DNA chỉnh sửa SW14-BT 3.2.1 Nghiên cứu chế phân tử trình lây nhiễm Xoo BT7 Độc tính 20 chủng Xoo phân lập tỉnh miền Bắc Việt Nam (gọi tắt VXO) giai đoạn từ 2013 – 2017 đánh giá lúa BT7 phương pháp cắt lây nhiễm nhân tạo Chiều dài vết bệnh cho thấy giống lúa BT7 mẫn cảm với 19/20 vi khuẩn Xoo thu thập miền Bắc Bảy chủng Xoo (VXO_11, VXO_15, VXO_59, VXO_60, VXO_62, VXO_69 VXO_96) có độc tính cao BT7, đại diện cho vùng trồng lúa hoạt hóa OsSWEET14 q trình xâm nhiễm vào lúa BT7 Kết cho phép dự đoán 13 OsSWEET14 (trong những) gen “nhiễm” chính, có vai trị quan trọng độc tính chủng VXO (Hình 3.11) Hình 3.11 Biểu OsSWEET14 lúa BT7 nhiễm Xoo Ghi chú: RT-PCR nhân đoạn gen đích OsSWEET14 gen nội chuẩn (OsEF1α); (VXO_11, 15, 59, 60, 62, 69, 96): khuôn mẫu RNA tách chiết từ mẫu lúa nhiễm vi khuẩn Xoo; (ĐC): khuôn mẫu RNA: tách chiết từ mẫu lúa khơng lây nhiễm Xoo; Hình 3.15 Phân tích trình tự SW14-BT Ghi chú: Hộp TATA (TATA box) đóng khung Vị trí EBE (AvrXa7, Tal5, PthXo3 TalC) Exon I đánh dấu mũi tên Đoạn DNA dự đốn từ vị trí [-1343] đến [+52] so với ba mã mở đầu (ATG) OsSWEET14 nhân với cặp mồi cặp mồi SW14-F/SW14-R từ DNA tổng số giống lúa BT7 dịng hóa vào vector pGEM-T Đoạn DNA đích phân lập có chiều dài 1395 bp, bao gồm đoạn exon I OsSWEET14 dài 52 bp, vùng promoter OsSWEET14 (1343 bp) có chứa EBE TalC, Tal5, PthXo3 AvrXa7 (Hình 3.15) Vị trí hai EBE AvrXa7 PthXo3 xác 14 định mục tiêu cần chỉnh sửa SW14-BT để cải tiến khả kháng bệnh bạc cho giống lúa chủ lực BT7 công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 3.2.2 Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT Bằng công cụ CRISPR-P 2.0, Mfold 2.3, CCTop Benchling, trình tự crRNA-8 chọn lọc từ trình tự crRNA ứng viên crRNA-8 nhận biết đồng thời EBE AvrXa7, PthXo3 Tal5 (Hình 3.17), có khả trì hoạt tính tính đặc hiệu phức hệ CRISPR/Cas9 nhân tế bào sử dụng cho thí nghiệm thiết kế cấu trúc vector CRISPR/Cas9 gây đột biến SW14-BT Hình 3.17 Vị trí nhận biết sgRNA SW14-BT Ghi chú: Vị trí EBE Tal5, PthXo3, AvrXa7, hộp TA trình tự crRNA (gRNA-SW14) theo chiều 5’-3’ thể mũi tên Để thiết kế cấu trúc biểu sgRNA nhận biết SW14-BT, đoạn DNA gRNA-SW14 có mang trình tự crRNA-8 ghép nối vào vector pENTR4-gRNA vị trí BsaI nằm trình tự promoter OsU6 tracrRNA Sản phẩm ghép nối kiểm tra PCR với hai cặp mồi pEN-F/pEN-R U6-F/gRNA-SW14-R giải trình tự (Hình 3.20) Sau đó, cấu trúc biểu sgRNA mang gRNA-SW14 (đặt tên U6::gRNA-SW14) ghép nối vào vector nhị phân pCas9 có cấu trúc biểu protein Cas9 ([Ubiquitin:Cas9:Nos]) hệ thống Gateway Kết điện di gel agarose 1% cho thấy tất sản phẩm PCR cho băng DNA tính tốn lý thuyết (Hình 3.21, giếng 1, 15 3, 7), chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pCas9/gRNA-SW14 thu có mang đồng thời cấu trúc biểu gen Cas9 (điều khiển promoter Ubiquitin) cấu trúc biểu gRNA-SW14 (được điều khiển promoter U6) (Hình 3.21) Hình 3.20 Giải trình trình tự pENTR4/gRNA-SW14 Ghi chú: Một phần vector pENTR4/gRNA-SW14 giải trình tự nucleotide mồi Ter-R Hình 3.21 Kiểm tra vector pCas9/gRNA-SW14 Ghi chú: Giếng 1, 3, 5, 7: khuôn pCas9/gRNA-SW14; giếng 2, 4, 8: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 2: PCR với cặp mồi Ubi-F/NOS-R; giếng 4: PCR với cặp mồi Cas9-F/Cas9-R; giếng 6: PCR với cặp mồi U6-F/Ter-R; giếng 8: PCR với cặp mồi U6-F/gRNA-SW14-R Giếng M: thang chuẩn DNA 1,0 kb (iNtRoN) Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT 3.3.1 Tạo chủng A tumefaciens mang cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT Cấu trúc T-DNA pCas9/gRNA-SW14 biến nạp vào A tumefaciens EHA105 Thể biến nạp sàng lọc phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi U6-F/Ter-R 16 3.3.2 Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT vào lúa BT7 Cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT chuyển vào IE lúa BT7 theo quy trình tối ưu Kết thu cho thấy số mẫu tái sinh chồi sau lần chọn lọc đạt 51,11% (115 tái sinh/225 mơ sẹo sống sót sau chọn lọc) Tổng số sống sót điều kiện nhà lưới thu 88 cây, tỉ lệ sống đạt 76,52% Bảng 3.6 Kết biến nạp cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 vào BT7 Giai đoạn Số mẫu sống sót1 Tổng số Tỉ lệ mẫu Lô I Lô II Lô III (Đơn vị tính) mẫu sống2 (%) Số IE (phơi) Đồng ni cấy (phôi) Phục hồi (phôi) Chọn lọc I (mô sẹo) Chọn lọc II (mô sẹo) Chọn lọc III (mô sẹo) Tiền tái sinh (mô sẹo) Tái sinh (cây) Nhà lưới (cây) 300 269 250 200 150 80 70 38 30 300 230 220 150 120 78 70 30 23 300 275 246 190 150 110 85 47 35 900 774 716 540 420 268 225 115 88 86,00 92,51 75,42 77,78 63,81 83,96 51,11 76,52 Ghi chú: 1Thí nghiệm chuyển gen đươc thực lô (I, II III); 2Tỉ lệ mẫu sống (%) = Số mẫu sống sót giai đoạn quan sát/số mẫu sống sót giai đoạn trước liền kề) x 100% 3.3.3 Sàng lọc kiểu gen kiểu hình dịng lúa BT7 tái sinh Để xác định có mặt cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 hệ gen, 88 dịng lúa BT7 sống sót điều kiện nhà lưới kiểm tra PCR (Bảng 3.12) Hiệu suất chuyển gen trung bình tồn quy trình đạt 8,67% Các dịng lúa có mang cấu trúc T-DNA chứa đầy đủ gen HPT, Cas9 cấu trúc [U6:gRNASW14] (37 cây) chọn cho phân tích sàng lọc đột biến Kết phân tích trình tự Nu dịng lúa chuyển gen phần mềm BioEdit CRISPR ID xác định 30/37 dịng lúa chuyển gen có mang đột biến vùng trình tự đích SW14-BT (Bảng 3.13, Hình 3.27) Các đột biến phát đột biến nhỏ thêm 17 bớt từ – Nu, khơng có đột biến thay Nu xuất dòng lúa BT7 chuyển gen Các đột biến xuất xung quanh vị trí DBS (theo tính tốn lý thuyết) phức hệ Cas9/gRNA tạo SW14-BT Bảng 3.12 Kết sàng lọc kiểu gen dòng lúa BT7 tái sinh Số mẫu dương tính* I II III 30 23 35 Thí nghiệm Trồng tái sinh nhà lưới Tổng số mẫu 88 PCR với mồi đặc hiệu cho Actina 30 23 35 88 PCR với mồi đặc hiệu cho HPTa 28 20 30 78 PCR với mồi đặc hiệu cho Cas9a 28 20 28 76 PCR với mồi đặc hiệu cho sgRNAa qPCR xác định có TDNAb T7E1c 28 20 28 76 14 14 37 12 12 29 Ghi chú: aSố có kết PCR dương tính; bSố có 2ΔCt từ 0,4-0,57;*Thí nghiệm chuyển gen thực lơ (I, II, III) Bảng 3.13 Kiểu gen SW14-BT dòng lúa chuyển gen T0 Kiểu gen Dị hợp a a Tên dòng/Loại đột biến 1.01(-5), 1.03(-5), 1.09(+2), 1.10(-3), 1.12(+3), 1.18(-1), 1.24(-2), 1.26(+1), 2.06(+1), 2.13(-2) 2.18(-2), 3.02(+3), 3.04(-3), 3.06(-2), 3.10(-4), 3.11(-6), 3.13(-1), 3.19(+3), 3.21(-1), 3.25(-1) Đồng hợpb 1.15(-6), 1.23(+1), 2.08(+3), 2.17(+1) Bi-alenc 1.05(-3/-2), 1.07(-5/-1), 2.02(-3/-5), 2.04(-3/+1), 2.12(1/-4), 3.14(-4/-5), 3.27(-1/-5), 3.45(+1/-3) Không đột biến 1.14, 1.20, 2.11, 3.07, 3.15 Đột biến alen; bđột biến giống alen; cđột biến khác alen Kí tự ngoặc nằm sau tên dòng lúa thể số Nu đột biến thêm (+)/mất (-) 18 Hình 3.27 Giải trình tự SW14-BT7 dịng lúa BT7 T0 Ghi chú: Cột kí tự bên trái thể tên dịng lúa chuyển gen (1.03, 1.15, 2.06, 3.14) không chuyển gen (WT) Cột kí tự bên phải thể loại đột biến; kí tự số thể số Nu đột biến thêm (+) (-) SW14-BT, (WT) không đột biến Vị trí EBE Tal5, PthXo3 AvrXa7 đánh dấu mũi tên, đường nét đứt ( -) thể trình tự crRNA-8 Kết bước đầu đánh giá khả sinh trưởng phát triển 30 dịng lúa chỉnh sửa gen OsSWEET14 khác biệt khơng đáng kể so với dòng lúa đối chứng tái sinh từ mơ sẹo khơng chuyển gen, sức sống có phần hơn, hạt dòng chỉnh sửa gen BT7 hệ T0 để phục vụ thí nghiệm 3.3.4 Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình dịng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1 Kết giải trình tự SW14-BT lúa T1 (Bảng 3.17) cho thấy tất đột biến hệ T0 di truyền xác sang hệ T1; lúa T1 thuộc dòng T0 mang đột biến có hệ bố mẹ, không xuất đột biến Các quan sát bước đầu đột biến promoter OsSWEET14 tạo phức hệ CRISPR/Cas9 khơng gây ảnh hưởng tiêu cực đến suất lúa BT7 Các dòng lúa T1 chỉnh sửa SW14-BT gieo trồng điều kiện nhà lưới để thu số lượng hạt lớn nhằm phục vụ thí nghiệm phân tích đánh giá tính kháng bạc ... vậy, luận án ? ?Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc giống lúa BT7” thực Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Ứng dụng công nghệ. .. số giống lúa mẫn cảm với chủng vi khuẩn Xoo châu Á châu Phi nghiên cứu chỉnh sửa gen hệ thống TALEN CRISPR/Cas9 nhằm tạo giống lúa kháng bạc công bố Ở Việt Nam, nghiên cứu nghiên cứu chọn tạo giống. .. lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT - Nghiên cứu biểu OsSWEET14 dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT - Đánh giá khả kháng bệnh bạc dòng BT7 đột biến SW14 hệ T2 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu