Trang 1 ẢNH HƯỞNG CỦA EPINEPHRINE LÊN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Vibrio harveyi TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Litopenaeus vannamei Nguyễn Đức Quỳnh Anh*, Nguyễn Thị Huế Linh, Nguyễn Nam Quang, Huỳnh
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 8(1)-2024: 4015-4026 ẢNH HƯỞNG CỦA EPINEPHRINE LÊN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Vibrio harveyi TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) Nguyễn Đức Quỳnh Anh*, Nguyễn Thị Huế Linh, Nguyễn Nam Quang, Huỳnh Văn Vì, Nguyễn Ngọc Phước Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế *Tác giả liên hệ: nguyenducquynhanh@huaf.edu.vn Nhận bài: 07/06/2023 Hoàn thành phản biện: 12/07/2023 Chấp nhận bài: 17/07/2023 TĨM TẮT Vibrio harveyi tác nhân gây bệnh phát sáng tôm tác nhân gây bệnh nhiều đối tượng động vật thủy sản, ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản giới Trong điều kiện vật chủ căng thẳng (stress), vi khuẩn cho có phản ứng lại với stress hormone, kết làm tăng tốc độ phát triển gia tăng độc lực Nghiên cứu thực nhằm xác định ảnh hưởng nồng độ stress hormone epinephrine khác (25 µM, 50 µM, 100 µM 200 µM) lên độc lực vi khuẩn V harveyi Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ epinephrine (nồng độ 50 µM, 100 µM 200 µM) làm tăng khả di động, tăng hoạt tính thủy phân enzyme lipase, phospholipase, haemolysin caseinase khơng ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase Thí nghiệm cảm nhiễm tôm thẻ chân trắng với vi khuẩn V harveyi ni mơi trường có bổ sung epinephrine 50 µM, làm giảm tỷ lệ sống tơm thẻ chân trắng thí nghiệm so với nghiệm thức đối chứng Từ khoá: Vibrio harveyi, Độc lực vi khuẩn, Epinephrine, Hoạt tính enzyme thủy phân IMPACT OF EPINEPHRINE ON VIRULENCE FACTORS OF Vibrio harveyi IN WHITE-LEG SHRIMP (Litopenaeus vannamei) Nguyen Duc Quynh Anh, Nguyen Thi Hue Linh, Nguyen Nam Quang, Huynh Van Vi, Nguyen Ngoc Phuoc University of Agriculture and Forestry, Hue University ABSTRACT Vibrio harveyi, the major causal agent of luminescent vibriosis, is one of the most important pathogens of marine aquatic animals, causing significant losses in aquaculture industry worldwide It has been found that bacteria are able to respond to chemicals releasing by the hosts during stress (stress hormones) resulted in increasing bacterial growth and virulence This research was aimed to determine the effect of different concentrations of stress hormone epinephrine (25 µM, 50 µM, 100 µM and 200 µM) on virulence factors of V harveyi The results showed that epinephrine (50 µM, 100 µM and 200 µM) enhanced swimming motility and increased the productions of lipase, phospholipase, haemolysin and caseinase (but not chitinase) in V harveyi compared to those in controls Results from challenge test indicated that pre-treated V harveyi with epinephrine 50 µM showed significant lower survival rate of white-leg shrimp in comparison with untreated ones Keywords: Vibrio harveyi, Bacterial virulence factors, Epinephrine, Lytic enzyme activity https://tapchidhnlhue.vn 4015 DOI: 10.46826/huaf-jasat.v8n1y2024.1098 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 8(1)-2024: 4015-4026 MỞ ĐẦU stress hormone chứng minh làm giảm chức miễn dịch tế bào vật Vibrio harveyi tác nhân gây chủ (Reiche cs., 2005), đồng thời làm bệnh phát sáng tôm, tăng mật độ phát triển độc lực vi tác nhân gây bệnh nguy hiểm khuẩn (Belay cs., 2003; Kinney cs., động vật khơng xương sống động vật có 1999; Sharaff Freestone, 2011) xương sống nước mặn, gây nhiều tổn thất Lesouhaitier cs (2009) mối nghiêm trọng cho nghề nuôi trồng thủy sản tương quan dương hàm lượng stress khắp giới (Austin Zhang, 2006; hormone catecholamine với yếu tố Defoirdt cs., 2012) Bệnh vi khuẩn V độc lực sản sinh enzyme ngoại bào, harveyi báo cáo gây chết hàng loạt độc tố, phần tử kết dính màng ấu trùng tôm he Philippines, Thái Lan, Ấn sinh học (biofilm) quorum sensing Độ, Indonesia, Úc, Venezuela Ecuador nhiều vi khuẩn Gram (-) (Lesouhaitier (Soto-Rodriguez cs., 2003) tỷ lệ chết cs., 2009) Khả phản ứng vi khuẩn đạt tới 100% giai đoạn giống với tồn stress hormone trại nuôi (Ruwandeepika cs., 2012) báo cáo nhiều vi khuẩn, bao gồm: Ngoài ra, V harveyi xác định tác Escherichia coli, Yersinia enterocolitica nhân hội nhiều đối tượng khác, (Lyte Ernst, 1992), Listeria chúng có khả sản sinh nhiều yếu tố độc monocytogenes (Coulanges cs., 1997), lực liên quan đến khả gây bệnh, bao Aeromonas hydrophila (Kinney cs., gồm: (i) có khả di động bám dính, 1999), Pseudomonas aeruginosa, (ii) sản sinh polysaccharides ngoại bào Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus hình thành màng sinh học biofilm; (iii) aureus (Belay cs., 2003), Vibrio sản sinh nhiều enzyme thủy phân; (iv) khả parahaemolyticus (Nakano cs., 2007; thu thập tích lũy sắt; (v) khả Pande cs., 2014), Vibrio harveyi (Pande cảm nhận nhận biết vật chủ; (vi) tạo cs., 2014; Yang cs., 2014), Yersinia thành thể thực khuẩn (Natrah cs., 2011, ruckeri (Torabi Delshad cs., 2019) Ruwandeepika cs., 2012) Sự biến động lớn yếu tố môi Các vi sinh vật có khả cảm nhận trường độ mặn, NH3, NO2 làm tăng phát chất hóa học tiết từ nồng độ axit amin sinh học (biogenic vật chủ hormone (Hughes amines) norepinephrine dopamine Sperandio, 2008; Sharaff Freestone, máu, làm giảm đáp ứng miễn dịch, 2011) Khả nhận biết giúp vi sinh tăng khả nhiễm bệnh động vật vật phát ký chủ tiềm thuỷ sản (Lacoste cs., 2001; Malham sau gia tăng biểu gen cá thể cs., 2003; Cheng cs., 2006) nhằm tăng độc lực xâm nhập vào vật chủ Norepinephrine dopamine xem (Sharaff Freestone, 2011) Nhiều nghiên loại hormone (crustacean hypergly cứu tập trung vào mối liên hệ vi khuẩn caemic hormone - CHH) làm tăng hàm loại hormone, đặc biệt lượng glucose máu tôm sú (Kuo hormone phản ánh tình trạng căng thẳng cs., 1996) Khi norepinephrine tạo vật chủ (stress hormone - tiết tôm thẻ chân trắng bị stress vật chủ bị stress), bao gồm epinephrine, tiêu miễn dịch tổng số tế bào máu, khả norepinephrine dopamine (Lyte thực bào, hoạt động sản sinh enzyme Freestone, 2010; Lyte cs., 2011; Sharaff phenoloxidase, lysozyme giảm (Cheng Freestone, 2011) Sự gia tăng hàm lượng 4016 Nguyễn Đức Quỳnh Anh cs TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 8(1)-2024: 4015-4026 cs., 2016) Mặc dù có nhiều nghiên định máy đo quang phổ bước sóng cứu độc lực vi khuẩn V harveyi, 600 nm nhiên việc nâng cao hiểu biết độc lực 2.2.2 Hormone epinephrine vi khuẩn mơi trường có mặt stress hormone cịn nhiều hạn chế Sự Epinephrine (Sigma-Aldrich) diện hormone norepinephrine pha dung dịch axit hydrocholoride dopamine có khả làm tăng tốc độ phát (HCl 0,1N) để tạo dung dịch gốc 10 mM triển số yếu tố độc lực vi khuẩn Dung dịch lọc qua giấy lọc (0,2 V harveyi (Pande cs., 2014; Yang cs., µm) bảo quản -20℃ 2014) Tuy vậy, đến chưa có nghiên 2.3 Phương pháp nghiên cứu cứu ảnh hưởng stress hormone epinephrine lên độc lực vi khuẩn V 2.3.1 Ảnh hưởng nồng độ harveyi tôm thẻ chân trắng Do epinephrine khác lên hoạt tính số nghiên cứu thực với mục tiêu nâng enzyme V harveyi sản sinh (lipase, cao hiểu biết độc lực vi khuẩn V phospholipase, caseinase, haemolysin harveyi ảnh hưởng epinephrine chitinase) NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Ảnh hưởng hormone NGHIÊN CỨU epinephrine lên hoạt tính enzyme V 2.1 Nội dung nghiên cứu harveyi thực theo hướng dẫn 2.1.1 Ảnh hưởng nồng độ Yang cs (2014) với số thay đổi nhỏ epinephrine khác lên hoạt tính số Môi trường Tryptic soy agar (TSA) (Sigma- enzyme V harveyi sản sinh (lipase, Aldrich) có bổ sung 2% muối phospholipase, caseinase, haemolysin (TSA+2%NaCl) hấp tiệt trùng chitinase) (121℃, 15 phút 15 psi) để nguội tới 55℃, sau trộn với chất 2.1.2 Ảnh hưởng hormone epinephrine epinephrine với nồng độ khác (0 lên khả di động vi khuẩn V µM - đối chứng, 25 µM, 50 µM, 100 µM harveyi 200 µM) Hoạt tính thủy phân enzyme 2.1.3 Tỷ lệ sống tôm thẻ chân trắng lipase thực cách nhỏ 5µL cảm nhiễm vi khuẩn V harveyi môi huyền phù vi khuẩn (OD600 =0,5) đĩa trường có khơng bổ sung epinephrine thạch có chứa epinephrine 1% Tween 80 (Sigma – Aldrich) Tất đĩa thạch ủ 2.2 Vật liệu nghiên cứu 28℃ 48h, sau tỷ lệ đường 2.2.1 Vi khuẩn điều kiện nuôi cấy kính vịng thủy phân xung quanh khuẩn lạc đường kính khuẩn lạc đo ghi lại Vi khuẩn V harveyi phân lập từ mẫu Hoạt tính enzyme phospholipase, tơm bị bệnh phát sáng tỉnh Thừa Thiên caseinase, haemolysin chitinase Huế sử dụng tất thí thực tương tự, cách bổ sung nghiệm nghiên cứu Vi khuẩn chất vào mơi trường 1% nhũ tương lịng giữ giống môi trường thạch lỏng đỏ trứng (Sigma-Aldrich) để xác định hoạt Tryptic soy broth (TSB) (Sigma- Aldrich) tính phospholipase, 4% bột sữa tách bổ sung 2% muối NaCl (TSB+2%NaCl) có béo (Woolworths, Úc) cho việc xác định bổ sung glycerol 20% bảo quản -80℃ hoạt tính phospholipase, 5% máu cừu Trong thí nghiệm, vi khuẩn ni cho hoạt tính haemolysin 0,1% bột cấy mơi trường TSB+2%NaCl với colloidal chitin (Himedia, Ấn Độ) để thử máy lắc vận tốc 100 rpm 24 hoạt tính chitinase Thí nghiệm bố trí nhiệt độ 28℃ Mật độ vi khuẩn xác 4017 https://tapchidhnlhue.vn DOI: 10.46826/huaf-jasat.v8n1y2024.1098 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 8(1)-2024: 4015-4026 với lần lặp lại cho hoạt tính nồng xác định dựa vào kết thử độc lực độ nghiên cứu vi khuẩn thí nghiệm nội dung (50 µM) Sau 24h ni cấy, dung dịch 2.3.2 Ảnh hưởng hormone epinephrine huyền phù vi khuẩn ly tâm rửa lên khả di động vi khuẩn V lần dung dịch NaCl 0,85% Mật độ vi harveyi khuẩn thí nghiệm cảm nhiễm xác định dựa vào liều lượng gây chết 60% - Khả di động vi khuẩn LD60 106 CFU/mL (đã xác định, số thực theo hướng dẫn Yang cs liệu khơng cơng bố) Tơm cảm nhiễm (2014) Thí nghiệm thực phương pháp ngâm môi trường môi trường thạch mềm TSB+2% NaCl nước có chứa vi khuẩn (vi khuẩn ni (chứa 0,3% agar) có bổ sung epinephrine mơi trường có bổ sung khơng bổ với nồng độ (0 µM - đối chứng, 25 µM, sung epinephrine) nghiệm thức đối 50 µM, 100 µM 200 µM) 5µL dung dịch chứng (khơng bổ sung vi khuẩn) 15 huyền phù vi khuẩn (OD600 =0,5) nhỏ phút Thí nghiệm lặp lại lần cho bề mặt thạch mềm ủ nhiệt độ nghiệm thức Tôm sau cảm nhiễm 28℃ Đường kính vịng di động xung quanh nuôi hệ thống nước chảy tốc độ 14 khuẩn lạc đo sau ủ 24h Tất L/phút, nhiệt độ 28-30C Tôm cho ăn nồng độ thực lặp lại lần lần/ngày (vào lúc 8h 16h) với khối lượng tương đương 2% trọng lượng thân 2.3.3 Tỷ lệ sống tôm thẻ chân trắng thức ăn CP (Việt Nam) chế độ sục cảm nhiễm vi khuẩn V harveyi mơi khí liên tục 24 giờ/ngày (DO ≥5 mg/L) Chế trường có bổ sung không bổ sung độ xi phông thay nước (25%) thực epinephrine hàng ngày Tỷ lệ chết (TLC) theo dõi xác định 14 ngày Tỷ lệ chết Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm xác định công thức sau: TLC = bố trí bể nhựa (80L) khử (số tơm chết) x100/tổng số tơm thí nghiệm trùng Sau cấp nước mặn 20 ‰ vào khoảng 2/3 thể tích sục khí liên tục 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu Tôm thí nghiệm: Tơm thẻ chân trắng Số liệu thu thập so sánh có trọng lượng 2-2,5 g/con, kích cỡ đồng phần mềm SPSS phiên (IBM SPSS đều, màu sắc tươi sáng, kiểm dịch 23.0) Phân bố chuẩn đồng không mang mầm bệnh Vibrio phương sai xem xét test Shapiro- parahaemolyticus (hoại tử gan tụy cấp), Wilk Levene’s test trước so sánh Whispovirus (bệnh đốm trắng), Okavirus ANOVA Tất số liệu so sánh giá trị (bệnh đầu vàng) Trạm xá Thú y, Chi cục trung bình ANOVA với phép thử Chăn nuôi Thú y Thừa Thiên Huế Mật Tukey post hoc test So sánh nhiều cặp độ ni 20 con/bể Trước tiến hành thí - Multiple comparisons of Dunnett T3 (giả nghiệm, 10 tôm chọn ngẫu nhiên định phương sai không đồng nhất) với mức để kiểm tra vi khuẩn cách lấy mẫu gan ý nghĩa p < 0,05 Phân tích tỷ lệ sống tụy cấy trực tiếp môi trường Kaplan-Meier (Survival analysis) tất TSA+2%NaCl môi trường TCBS đồ thị xử lý vẽ phần mềm GraphPad Prism 9.0 Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn nuôi tăng sinh 24 28C mơi trường thạch lỏng TSB+2%NaCl, có khơng bổ sung epinephrine Nồng độ epinephrine sử dụng thí nghiệm 4018 Nguyễn Đức Quỳnh Anh cs TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 8(1)-2024: 4015-4026 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN đóng vai trị tổng hợp lipid A ảnh hưởng đến độc lực vi khuẩn Tuy nhiên, 3.1 Ảnh hưởng nồng độ chế ảnh hưởng catecholamine epinephrine khác lên hoạt tính (norepinephrine dopamine) lên hoạt số enzyme V harveyi sản sinh động lipase tham gia trình gây bệnh vi khuẩn chưa Các enzyme ngoại bào vi khuẩn làm rõ (Defoirdt, 2013) V harveyi lipase, phospholipase, haemolysin, chitinase caseinase góp Có thể thấy hoạt tính enzyme phần tạo độc lực vi khuẩn, đóng vai trị phospholipase tăng bổ sung epinephrine quan trọng trình xâm nhập gây môi trường nồng độ 50µM, 100 µM bệnh vật chủ (Darshanee Ruwandeepika 200 µM (p0,05), khác với hoạt tính thủy trình phá huỷ lớp màng tế bào, đóng vai trị phân enzyme lipase, phospholipase, quan trọng suốt q trình cơng ký haemolysin caseinase cao chủ số vi khuẩn gây bệnh gây nghiệm thức có bổ sung epinephrine so tổn thương lên mô vật chủ (Istivan với đối chứng Coloe, 2006) Tuy nhiên chế hoạt động enzyme phospholipase Kết thử nghiệm ảnh hưởng đặc biệt ảnh hưởng epinephrine epinephrine lên hoạt tính lipase thể lên hoạt động enzyme chưa Hình Epinephrine nồng độ làm rõ Kết nghiên cứu ảnh hưởng 50 µM, 100 µM 200 µM làm tăng hoạt catecholamine khác tính lipase rõ rệt so với đối chứng norepinephrine dopamine vi khuẩn (p