Bài giảng thực hành vi sinh

4 3 Phương pháp nhuộm vi khuẩn kháng cồn kháng acid Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen 4 4 Phản ứng huyết thanh học trong chẩn đốn Kháng nguyên, Kháng thể.. - Tụ quang: là một loại thấu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN KHOA Y  BÀI GIẢNG MÔN HỌC THỰC HÀNH VI SINH Giảng viên biên soạn: NGUYỄN THỊ THANH TUYỀN Đơn vị: TT TH Y DƯỢC Hậu Giang – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÀI GIẢNG MƠN HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN Tên môn học: Thực hành Vi sinh (Tên tiếng Anh: ……………………………….) Trình độ: Đại học Số đơn vị học trình: Giờ lý thuyết: Giờ thực hành: Thông tin Giảng viên:  Tên Giảng viên: Nguyễn Thị Thanh Tuyền  Đơn vị:  Điện thoại:  E-mail: ntttuyen@vttu.edu.vn Đề cương môn học Số tiết Tên học LT TH Phần thực hành Một số dụng cụ cở phịng thí nghiệm vi sinh Phương pháp khảo sát vi sinh vật Kỹ thuật soi tươi Phương pháp nhuộm Gram Phương pháp nhuộm vi khuẩn kháng cồn kháng acid ( Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen) 4 Phản ứng huyết học chẩn đoán Kháng nguyên, Kháng thể Một số nguyên tắc vô khuẩn thực hành vi sinh Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn Kỹ thuật kháng sinh đồ Tổng Nội dung giảng chi tiết Bài MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT VI SINH VẬT KỸ THUẬT SOI TƯƠI MỤC TIÊU HỌC TẬP Biết cách sử dụng số dụng cụ thường gặp phịng thí nghiệm vi sinh: kim cấy, vòng cấy, đèn cồn, ống nghiệm, hộp petri Biết cấu tạo, cách sử dụng kính hiển vi quang học cách bảo quản kính sau sử dụng Thực quan sát, mô tả kết mẫu soi tươi Làm quen với tiêu nhuộm soi I ĐÈN BUNSEN (HAY ĐÈN CỒN): Ngọn lửa đèn Bunsen (hay đèn cồn) có phần: - Phần giữa: nóng, nhiệt độ khoảng 4000C Nhiệt độ tăng dần phần - Phần ngoài: nhiệt độ khoảng 17000C II KIM CẤY VÀ VÒNG CẤY: Kim cấy vòng cấy làm sợi dây kim khí chóng nóng chóng nguội (Platin hay Chrome) Phải nhớ đốt kim cấy vòng cấy trước sau cấy vi trùng Phải để kim đứng thẳng lửa đèn cồn đầu kim vào phần nguội cảu đèn, kéo dần phần nóng lửa, phải đốt cho kim cấy vịng cấy nóng đỏ Như vi khuẩn không bị bắn xung quanh bị đố cháy hết III ỐNG NGHIỆM: Phải hơ nóng miệng ống nghiệm sau mở trước đậy nút Nút phải cặp ngón tay út vào lòng bàn tay, tránh đụng vào vật Khi mở nút ống nghiệm ln ln phải nghiêng ống nghiệm góc 450 để tránh nhiễm khuẩn bên ngồi vào mơi trường Việc lấy vi khuẩn từ môi trường phải luôn thực gần đèn cồn IV HỘP PETRI: Các môi trường cấy đựng hộp petri Khi cấy mở, không mở hết hộp để tránh lây nhiễm V KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC: Cấu tạo kính hiển vi quang học: Hệ thống giá đỡ: - Bệ kính: tiếp xúc với mặt bàn - Ống kính: trụ trịn rỗng lắp vào trụ kính hiển vi - Thân kính: bệ kính ống kính - Khai quay: lắp đầu ống kính, có lỗ đề lắp vật kính - Bàn kẹp tiêu Hệ thống phóng đại: - Thị kính: loại ống, loại ống, chất thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn Phần lớn kính hiển vi quang học dùng phòng thực tập vi sinh có thị kính có độ phóng đại 10X - Vật kính: phận quang học chủ yếu, gồm có nhiều thấu kính ghép lại, lắp khai quay Vật kính có bội số phóng đại khác có ghi rõ bội số (4X, 10X, 40X, 100X) Khi dùng vật kính phóng đại bội số thấp để xem vật khơng cần phải cho dầu vào tiêu bản, nên người ta gọi vật kính vật kính khơ Khi dùng vật kính có bội số cao cho giọt dầu lên tiêu vật kính gọi vật kính dầu Hệ thống chiếu sáng: - Nguồn sáng: bóng đèn gương phản chiếu, nằm bệ kính Gương phản chiếu gồm mặt lồi mặt lõm lộn lộn lại, dùng để lấy ánh sáng - Tụ quang: loại thấu kính lồi lắp giá để tiêu bản, đưa lên đưa xuống, dùng để tập trung ánh sáng vào tiêu Hệ thống điều chỉnh: - Ốc đại cấp (ốc lớn) ốc vi cấp (ốc nhỏ): để điều chỉnh tiêu cự - Ốc điều chỉnh bàn đặt tiêu - Ốc di chuyển tụ quang - Ốc đóng mở khe chắn sáng Cách sử dụng kính hiển vi quang học: - Nhỏ giọt dầu lên lam (nếu cần) - Đặt lam lên giá để tiêu - Di chuyển lam vào vị trí - Chỉnh vật kính vào nấc - Lấy ánh sáng: bật đèn xoay gương phản chiếu để lấy ánh sáng - Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp Để quan sát vi khuẩn mẫu vật nhuộm, ta cần có ánh sáng tối đa Muốn vậy, ta cần: + Nâng tụ quang cực đại + Mở hết khe chắn sáng - Xoay ốc đại cấp đến tìm thấy vi trường, di chuyển lam để tìm vùng phết bệnh phẩm - Chuyển sang vật kính dầu, nhẹ nhàng xoay ốc đại cấp cho vật kính gần sát tiêu nhỏ dầu Mắt khơng nhìn vào thị kính mà nhìn ngang từ bên ngồi vào khoảng cách vật kính tiêu để tránh vật kính làm vỡ lam - Nhìn vào thị kính, xoay ốc đại cấp thấy vi trường dừng lại - Chuyển sang xoay ốc vi cấp hình ảnh hồn tồn rõ nét Giữ gìn bảo quản kính: Cuối buổi thực tập phải lau vật kính dầu - Hạ giá để tiêu xuống để tách vật kính khỏi tiêu - Lấy tiêu khỏi giá - Xoay vật kính tới vị trí dễ lau - Dùng giấy thấm lau kính hiển vi lau thị kính trước - Dùng giấy thấm tẩm aceton để lau vật kính sau Lau nhẹ nhàng theo hình xoắn ốc - Xoay vật kính 10X vào nấc, hạ giá để tiêu xuống tối đa ( vị trí nghỉ) - Lau bụi phần giá để tiêu bệ kính - Cầm kính hiển vi tay: tay cầm thân kính, tay đỡ đến kính, cất kính vào vị trí phịng thí nghiệm VI PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT VI SINH VẬT KỸ THUẬT SOI TƯƠI: Có nhiều phương pháp quan sát vi sinh vật Trong đó, soi tươi phương pháp đơn giản Soi tươi giúp quan sát hình dạng, màu sắc, tính chất di động vi sinh vật có mẫu Thường áp dụng cho nhóm vi sinh vật có kích thước tương đối lớn Kỹ thuật soi tươi:  Sử dụng vật kính: 4x, 10x  Hạ tụ quang cực đại  Đóng khe chắn sáng Quan sát tiêu nhuộm soi: quan sát hình thể, tính chất bắt màu, cách xếp vi khuẩn:  Sử dụng vật kính dầu 100x  Nâng tụ quang cực đại  Mở hết chắn sáng Bài PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM MỤC TIÊU HỌC TẬP Nêu đặc điểm tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm Gram Biết cách làm phết vi khuẩn để nhuộm Gram bước phương pháp nhuộm Gram Mơ tả lame nhuộm Gram kính hiển vi với vật kính dầu I CHUẨN BỊ MỘT PHẾT VI KHUẨN ĐỂ NHUỘM Chuẩn bị lame: - Tấm lame dùng để làm phết vi khuẩn phải rửa lau khô - Hơ qua lửa đèn cồn để nguội - Tránh chạm ngón tay vào lame Cách gắn vi khuẩn vào lame: - Dùng bút chì sáp vẽ vịng trịn đường kính cm lame - Lấy vòng cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng trải mỏng diện tích vịng trịn vẽ Nếu vi khuẩn từ mơi trường đặc (hộp thạch petri), ta phải đặt vòng cấy nước lên lame trước đặt vi khuẩn vào - Để cho lame khơ tự nhiên, sau gắn chặt vi khuẩn lên lame cách hơ lame lửa đèn cồn II PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM: Đây phương pháp nhuộm vi khuẩn học Phương pháp nhuộm Gram gọi phương pháp nhuộm kép phương pháp nhuộm ta sử dụng hai loại phẩm nhuộm tương phản màu sắc Đó tím Gentian hồng Safranin Nguyên tắc: Phương pháp nhuộm vào nguyên tắc: “chất rượu (alcool) tẩy màu hợp chất “tím Gentian – iod” vi khuẩn Gram âm Đặc điểm cấu trúc tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm Gram: Vi khuẩn chia làm nhóm: Gram âm Gram dương tùy theo đáp ứng vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram (tên nhà phát minh phương pháp nhuộm vi khuẩn) Sự khác biệt vi trùng Gram âm Gram dương tùy thuộc vào khác biệt thành phần hóa học tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Trong tế bào vi khuẩn Gram dương có 40 lớp peptidoglycan, chiếm đến 50% vật liệu cấu tạo vách, cịn vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan, chiếm từ – 10% vật liệu cấu tạo vách Dụng cụ: - Lamen - Vòng cấy - Bộ thuốc nhuộm gồm: + Tím Gentian ( Crystal violet) + Gram’s iodine (dung dịch Lugol) + Cồn 950 (tẩy màu) + Hồng Safranin - Bút chì sáp - Đèn cồn - Giấy thấm Thực hiện: - Làm phết vi khuẩn - Nhỏ dung dịch tím gentian lên phết vi khuẩn (30 giây) - Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa - Nhỏ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn (1 phút) - Rửa nước - Nhỏ dung dịch cồn 950 lên phết vi khuẩn (10-15 giây) - Rửa nước để loại bỏ cồn - Nhỏ dung dịch hồng Safranin lên phết vi khuẩn ( phút) - Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa - Để lam khô tự nhiên - Nhỏ giọt dầu Cedre lên tiêu quan sát kính hiển vi vật kính dầu (100X) Đọc kết quả: Mơ tả hình dạng, màu sắc, cách xếp vi khuẩn Màu sắc: Màu hồng: Gram âm Màu tím: Gram dương Bài PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG CỒN KHÁNG ACID (Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen) MỤC TIÊU HỌC TẬP Nêu đặc điểm cấu tạo tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm kháng acid Kể dụng cụ cần cho phương pháp nhuộm kháng acid Thực đượcc bước phương pháp nhuộm Nhận diện trực khuẩn kháng acid kính hiển vi quang học I ĐẶC ĐIỂM CẤU TẠO TẾ BÀO CỦA TRỰC KHUẨN KHÁNG ACID CÓ LIÊN QUAN ĐẾN PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG ACID Mycobacteria trực khuẩn dài, mảnh, phân nhánh có dạng sợi Chúng có đặc tính kháng lại xâm nhập loại phẩm nhuộm vào tế bào có lượng lớn chất lipid lớp vỏ tế bào vi khuẩn Do đó, ta khơng thể sử dụng phương pháp nhuộm thông thường loại vi khuẩn khác Nhưng với Carbonfuchsin, nhuộm với thời gian lâu (5-10 phút) đun nóng vi trùng ăn màu tẩy màu hỗn hợp acid-alcool Dựa tính chất này, Ziehl – Neelsen đưa phương pháp nhuộm kháng acid Các Mycobacteria gây bệnh thường gặp: Mycobacterium tuberculosis: gây bệnh lao người Mycobacterium bovis: gây bệnh lao bò Mycobacterium leprae: gây bệnh phong II DỤNG CỤ: - Bệnh phẩm đờm bệnh nhân - Lame - Đèn cồn - Vòng cấy - Hóa chất: Carbon fuchsin (Hồng fuchsin) Dung dịch cồn acid (dung dịch tẩy màu) Xanh methylen - Giấy thấm - Kính hiển vi quang học - Dầu Cedre III THỰC HIỆN: Gắn vi khuẩn lên lame Nhuộm nóng Carbonfuchsin: - Nhỏ hồng fuchsin lên lame - Hơ lame lửa đèn cồn thấy bốc hơi( khoảng 10 giây phải kéo đèn cồn thấy bốc lên được) Làm lần cách vài phút Lưu ý: Khi hơ lame không để chất màu cạn đi, cần nhỏ thêm phẩm nhuộm lên lame - Rửa nước Sau rửa nước, lớp sáp (lipid) tế bào vi khuẩn đông lại giữ cho vi khuẩn không bị tẩy màu dung dịch cồn-acid Tẩy màu dung dịch cồn-acid thấy hết màu Rửa nước Nhuộm nền: Nhỏ dung dịch Xanh methylen lên lame (khoảng 30 giây đến phút) Ta dùng màu tương phản với màu đỏ Carbonfuchsin thay xanh methylen Rửa nước, để lam khô tự nhiên xem vật kính dầu (100X) IV QUAN SÁT TRỰC KHUẨN LAO BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VỚI VẬT KÍNH DẦU: Trực khuẩn lao có hình dài, mảnh, màu hồng đỏ Còn vi khuẩn thường khác tế bào bào biểu mô bạch cầu bắt màu xanh lơ Đọc kết quả: Chỉ trả lời có hay khơng có trực khuẩn kháng acid đếm số vi khuẩn quan sát 1-99 AFB/100 vi trường: 1+ 1-10 AFB/1 vi trường: 2+ > 10 AFB/1 vi trường: 3+ ( Thay đổi tùy theo quan theo chương trình quốc gia) ( AFB: Acid Fast Bacilli) Bài PHẢN ỨNG HUYẾT THANH HỌC MỤC TIÊU HỌC TẬP Nắm nguyên lý, cách tiến hành biện luận kết phương pháp sắc ký miễn dịch chẩn đoán kháng nguyên HBsAg Nắm nguyên lý, cách tiến hành biện luận kết phương pháp ngưng kết hạt latex chẩn đốn ASO Trình bày thực phương pháp bán định lượng nồng độ liên cầu khuẩn máu I PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH: Nguyên lý: Bệnh viêm gan vi rút bệnh chủ yếu liên quan đến gan Hầu hết trường hợp cấp tính bệnh viêm gan virút virút Viêm gan A, Viêm gan B (HBV) Viêm gan C gây Phức hợp kháng nguyên (complex antigen) tìm thấy bề mặt HBV gọi HBsAg Sự có mặt HBsAg huyết huyết tương cho thấy dấu hiệu lây nhiễm virút Viêm gan B cấp mãn tính Test nhanh chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) dụng cụ xét nghiệm nhanh định tính phát có mặt HBsAg huyết huyết tương NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG: Test nhanh chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính phương pháp dòng chảy chiều (hiện tượng mao dẫn) để phát có mặt kháng nguyên vi rút Viêm gan B huyết huyết tương Màng que thử phủ lớp kháng thể kháng HBsAg vùng kết Trong trình làm xét nghiệm, mẫu huyết huyết tương phản ứng với phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ mao dẫn, gặp phản ứng kết tủa màu với kháng thể kháng HBsAg lớp màng tạo vạch màu Sự có mặt vạch màu vùng kết que thử cho biết kết dương tính, ngược lại trường hợp khơng có vạch màu kết âm tính Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, vạch màu ln xuất vùng chứng (gọi vạch chứng) để khẳng định lượng mẫu đủ lớp màng thấm tốt Dụng cụ: - Quick test HBV - Máy ly tâm - Bơm tiêm 5ml - Gịn vơ khuẩn có tẩm cồn - Dây garro - Găng tay - Ống đựng máu Tiến hành: Quick test chẩn đoán nhanh HbsAg sử dụng mẫu huyết huyết tương Bước 1: lấy 3ml máu tĩnh mạch, để đông tự nhiên khoảng 15 – 30 phút Bước 2: quay ly tâm, tốc độ 4000 vòng phút Bước 3: tách lấy huyết Bước 4: Nhúng que thử vào huyết vị trí nhúng Đọc kết sau 10 phút Đọc kết quả: - Nếu xuất màu vạch C T: dương tính - Nếu xuất màu cạch C: âm tính - Nếu có cạch T khơng có vạch nào: khơng xác định II PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT HẠT LATEX: Nguyên lý: Liên cầu khuẩn ß tan huyết nhóm A, có tên gọi Streptococcus pyogenes nhóm liên cầu gây bệnh quan trọng người, đặc biệt bệnh hậu nhiễm liên cầu (viêm khớp, viêm cầu thận cấp, viêm màng tim) Streptolysin O loại kháng nguyên đặc hiệu liên cầu nhóm A Khi xác định máu với số lượng vượt số cho phép thể bình thường thuộc loại bệnh lý Xét nghiệm máu tìm kháng thể kháng liên cầu nhóm A gọi phản ứng ASLO (Anti Streptolysin O) Test ASLO dùng để xác định nhanh, giúp biết máu bệnh nhân có kháng thể kháng liên cầu nhóm A hay khơng (Phương pháp định tính) Ngun lý phản ứng dựa vào ngưng kết kháng nguyên Streptolysin O với kháng thể Anti Streptolysin O Các kháng thể có huyết tạo kết tủa với kháng nguyên gắn hạt latex thuốc thử Dụng cụ: - Bộ thuốc thử ASO - Máy ly tâm - Bơm tiêm 5ml - Dây garro - Ống đựng máu - Gịn vơ khuẩn có tẩm cồn - Găng tay - Que khuấy - Phiến nhựa đen - Micropipet - NaCl 0,9% Tiến hành: Bước 1: Lấy 3ml máu tĩnh mạch, để đông tự nhiên khoảng 15 – 30 phút Bước 2: Quay ly tâm với tốc độ 4000 vòng phút Bước 3: Tách lấy huyết Bước 4: Cho 50µL latex ASO vào giếng theo thứ tự đánh số sau: - Giếng 1: Mẫu - Giếng 2: Chứng (+) - Giếng 3: Chứng (-) Bước 5: Lần lượt cho 50µL mẫu huyết vào giếng 1, 50µL chứng (+) vào giếng 50µL chứng (-) vào giếng Bước 6: Dùng que khuấy giếng Bước 7: Dùng máy lắc lắc tay – phút đọc kết Đọc kết quả: Giếng 2: chứng dương: có ngưng kết Giếng 3: chứng âm: khơng có ngưng kết Quan sát so sánh ngưng kết cuối giếng mẫu với chứng dương chứng âm Nếu có ngưng kết, nghĩa kết dương tính, chứng tỏ có nhiễm liên cầu khuẩn Tuy nhiên, để ước lượng nồng độ vi khuẩn máu, ta phải tiến hành phương pháp bán định lượng PHƯƠNG PHÁP BÁN ĐỊNH LƯỢNG: Phản ứng 1: 50 microlit huyết + 50 microlit thuốc thử:  Âm tính: kết luận âm tính  Dương tính: pha lỗng 50 microlit huyết + 50 microlit NaCl 0,9%: dung dịch (1) Phản ứng 2: 50 microlit dung dịch (1) + 50 microlit thuốc thử:  Âm tính: kết luận dương tính 200 UI  Dương tính: pha lỗng tiếp 50 microlit dung dịch (1) + 50 microlit NaCl 0,9%: dung dịch (2) Phản ứng 3: 50 microlit dung dịch (2) + 50 microlit thuốc thử:  Âm tính: kết luận dương tính 400 UI  Dương tính: pha loãng tiếp Bài MỘT SỐ NGUYÊN TẮC VÔ KHUẨN TRONG THỰC HÀNH VI SINH CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MỤC TIÊU HỌC TẬP Nắm số nguyên tắc vô khuẩn thực hành vi sinh Thực quy trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy đảm bảo vô khuẩn I MỘT SỐ NGUYÊN TẮC VÔ KHUẨN TRONG THỰC HÀNH VI SINH: Khử trùng tiệt trùng dụng cụ: - Khử trùng hấp ướt: 1210C_1 atm: 30 phút - Tiệt trùng nhiệt khô: 1700C: Khử trùng tiệt trùng môi trường nuôi cấy: Hấp tiệt khuẩn môi trường 1210C_1 atm: 15 phút Chiếu UV: 15 phút sau đỗ mơi trường II QUY TRÌNH CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG NI CẤY: Các loại mơi trường sử dụng: - Môi trường thạch NA - Môi trường thạch EMB - Môi trường thạch MHA Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: - Cân pha môi trường theo hướng dẫn - Hấp môi trường 1210C_1 atm: 15 phút - Chờ nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 55-650C, đỗ môi trường vào đĩa Petri tiệt khuẩn tủ nuôi cấy vô khuẩn - Sau 30 phút, chiếu tia UV 15 phút Bài PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN MỤC TIÊU HỌC TÂP Nắm nguyên tắc phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn Thực phương pháp cấy đường Biết cách đọc kết cấy đường I NGUYÊN TẮC: Phân lập vi khuẩn hay tách rời vi khuẩn từ hỗn hợp dựa nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy Để làm cạn dần mầm cấy ta áp dụng phương pháp cấy đường II DỤNG CỤ: - Mơi trường thích hợp: NA, EMB… - Vi khuẩn cần phân lập - Tủ nuôi cấy vô khuẩn - Tủ ấm vi sinh - Que cấy vòng - Đĩa petri, đèn cồn, cồn 700 III THỰC HIỆN: Dùng bút chì sáp chia đáy thạch làm phần cách kẻ chữ thập đánh số từ – Khử trùng vòng cấy cách đốt đỏ vòng cấy Đợi vòng cấy nguội Lấy vòng cấy cách nhúng vòng cấy vào ống nghiệm chứa hỗn hợp vi khuẩn Lấy vòng cấy hỗn hợp vi khuẩn Cấy lần thứ I: Đặt vịng cấy có vi khuẩn vào mặt thạch vùng số Cấy vi khuẩn từ vùng sang vùng cách chạm nhẹ đầu vòng cấy mặt thạch, kéo zic – zac từ vùng sang vùng Cấy khoảng 1/3 đường kính hộp dừng lại Đốt đỏ vòng cấy, để nguội Cấy lần thứ II: Xoay hộp thạch 900, để vùng – lên trên, đặt vịng cấy nguội, khơng lấy thêm mầm cấy, cấy lần thứ cách: Đặt vòng cấy vào vùng 2, nơi cấy vi khuẩn, vạch zic – zac từ vùng sang vùng Giống lần cấy thứ I, sau cấy 1/3 đường kính hộp thạch, ta dừng lại Đốt đỏ vòng cấy, để nguội Cấy lần thứ III: Xoay hộp thạch 900, để vug 3-4 lên trên, đặt vòng cấy nguội vào vùng 3, nơi cấy vi khuẩn, vạch zic-zac từ vùng sang vùng Lần ta cấy lên khắp diện tích mặt thạch cịn lại Cấy xong, đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp dưới, cho vào tủ ấm 370C Hôm sau đọc kết VI ĐỌC KẾT QUẢ: Quan sát vi khuẩn mắt trần Quan sát vùng chiều cấy thứ 3, chỗ có vi khuẩn nằm riêng lẻ Chú ý quan sát khác khúm vi khuẩn Mỗi loại vi khuẩn tăng trưởng tạo nên loại khuẩn lạc khác về: - Hình dạng khuẩn lạc: + Đường kính + Đường viền + Bề mặt ( lịi hay lõm, khơ hay ướt, trơn hay nhăn) - Màu sắc khuẩn lạc - Độ đục khuẩn lạc Mỗi khác chi tiết hình dạng, màu sắc, độ đục khuẩn lạc tượng trưng cho loại vi khuẩn khác Sau quan sát hộp thạch để tìm khác biệt lồi khuẩn lạc Có thể kết luận: có khuẩn lạc khác có nhiêu loại vi khuẩn diện hộp thạch Bài KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ MỤC TIÊU HỌC TẬP Trình bày định nghĩa kháng sinh đồ Nắm nguyên tắc, cách làm cách đọc kết kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy khuếch tán thạch Thực hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy khuếch tán thạch đọc kết I ĐỊNH NGHĨA: Kháng sinh đồ phương pháp tìm độ đề kháng vi khuẩn kháng sinh Trong thực tế lâm sàng, kháng sinh đồ có ý nghĩa giúp cho người thầy thuốc chọn kháng sinh thích hợp liều lượng thích hợp nhằm nâng cao hiệu điều trị hạn chế tượng kháng thuốc vi khuẩn Ngoài ra, kỹ thuật dùng giám sát dịch tễ học nhằm phát tính kháng thuốc vi khuẩn Có nhiều phương pháp kháng sinh đồ, như: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán thạch Kirby-Bauer, Phương pháp pha loãng kháng sinh ống nghiệm… Trong buổi thực tập này, tìm hiểu phương pháp đĩa giấy khuếch tán thạch (Kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer) II NGUYÊN TẮC: Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp khuếch tán mặt thạch xung quanh, ngăn chặn phát triển vi khuẩn Đường kính vịng vơ khuẩn thể nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh Trường hợp khơng có vịng vơ khuẩn, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh III DỤNG CỤ: - Đĩa kháng sinh: đĩa giấy có đường kính 6mm tẩm dung dịch thuốc kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn Đĩa kháng sinh phải cất giữ ống có chứa chất chống ẩm phải bảo quản lạnh Khi thực kháng sinh đồ, ống chứa đĩa kháng sinh phải lấy khỏi tủ lạnh 1-2 trước mở nắp - Môi trường: MHA - Chủng vi khuẩn cần làm kháng sinh đồ - Ống nghiệm vô khuẩn - NaCl 0,9% vô khuẩn - Que cấy vịng, que tăm bơng tiệt trùng, bơng khơng thấm nước - Đèn cồn - Kéo, kẹp… - Tủ ấm vi sinh IV TIẾN HÀNH: Pha dung dịch vi khuẩn: Từ đĩa nuôi cấy chủng, dung que cấy vô khuẩn chấm vào 10 khuẩn lạc để ăng đầy, hòa tan vào ml dung dịch đệm PBS 1ml nước muối sinh lý So sánh với Mc Faland 0.5, cần thiết phải cho thêm PBS nước muối sinh lý để có nồng độ 108 vi khuẩn/ ml ( dung dịch 1) Pha loảng dung dịch để có 106 vi khuẩn/ml cách lấy 0.5ml dung dịch cho vào 4.5ml PBS dung dịch Tiếp theo lấy 0.5ml dung dịch hòa vào 4.5ml PBS dung dịch Dung dịch có 106 vi khuẩn/ml Phết vi khuẩn lên đĩa thạch: - Dùng que tăm vô khuẩn nhúng vào dung dịch vi khuẩn, ép cách ép nhẹ tăm lên thành ống nghiệm - Trải vi khuẩn lên mặt thạch cách dùng que tăm kẻ hai đường vuông góc Sau đó, phết vi khuẩn từ dần Xoay đĩa petri 900 phết tiếp từ 10 đến vi khuẩn trải đĩa thạch Để yên nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút Đặt đĩa kháng sinh lên đĩa thạch trải vi khuẩn: - Hơ kẹp đèn cồn - Để kẹp nguội lấy đĩa kháng sinh cho loại, đặt nhẹ đĩa kháng sinh lên mặt thạch Các đĩa kháng sinh cách mép hộp thạch khoảng 1,5 cm cách khoảng cm Phải đảm bảo mặt đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch Có thể đặt 5-6 đĩa kháng sinh - Hơ kẹp thu dọn dụng cụ  Chú ý: Tất thao tác phải thực gần đèn cồn Sau thực xong, úp ngược đĩa thạch Sau đó, để tủ ấm 370C từ 18-20 Nhận xét đọc kết V ĐỌC KẾT QUẢ: Quan sát hộp thạch với chủng vi khuẩn thử nghiệm: Chúng ta nhận thấy vi khuẩn mọc khắp mặt thạch làm đục mặt thạch Có trường hợp xảy ra: Xung quanh đĩa kháng sinh khơng có vịng vơ khuẩn (Thạch đục đến tận mép đĩa kháng sinh) Kết luận: vi khuẩn đề kháng với loại kháng sinh Xung quanh đĩa kháng sinh có vịng suốt, vịng vơ khuẩn, nơi tác dụng kháng sinh vi khuẩn không mọc Trong trường hợp này, ta không thể kết luận mà phải đo đường kính vịng vơ khuẩn (tính mm) Đánh giá kết quả: vào bảng Giới hạn đường kính vùng ức chế hãng sản xuất đĩa kháng sinh mẫu quy định để xác định mức độ Có mức độ nhạy cảm với kháng sinh: Độ S: nhạy cảm (susceptible): vi khuẩn đáp ứng với liều kháng sinh thông thường dùng theo đường thích hợp, gồm đường uống Độ I: trung gian (intermediate): vi khuẩn bị ức chế với nồng độ kháng sinh đạt sau dùng liều lớn theo đường tiêm chích Độ R: đề kháng (resistant): vi khuẩn không bị ức chế với nồng độ kháng sinh đạt được, thuốc không nên lựa chọn cho điều trị Nên lựa chọn loại kháng sinh cho kết kháng sinh đồ mức độ S để điều trị lâm sàng Nhưng loại kháng sinh cho mức độ S nên lựa chọn loại kháng sinh có phổ tác dụng hẹp, có tác dụng đặc hiệu loại vi khuẩn thử, tác dụng phụ rẻ tiền để điều trị 11