Khoá Học Chuyên Đề Khoá Học Chuyên Đề.pdf

Untitled TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM KHOÁ HỌC CHUYÊN ĐỀ TIỂU LUẬN Giảng viên T s Nguyễn Minh Xuân Hồng Bộ môn hoá sinh và dinh dưỡng con người Sin[.]

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM

KHOÁ HỌC CHUYÊN ĐỀ

TIỂU LUẬN

Giảng viên:T.s Nguyễn Minh Xuân Hồng

Bộ môn hoá sinh và dinh dưỡng con người

Sinh viên thực hiện: Nhóm 1

Nguyễn Khánh Dư 20125360

Nguyễn Trần Đăng Khoa 20125455

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên với tình cảm sâu sắc và chân thành nhất, cho phép em được bày tỏ lòng biết

ơn đến nhà trường đã tạo điều kiện giảng dạy cho em môn học tuyệt vời này

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi đến cô Nguyễn Minh Xuân Hồng đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập Nhờ có những hướng dẫn của Cô mà nền tảng của chúng em mới có thể hoàn thiện tốt hơn Đây chắc chắn sẽ là những kiến thức có giá trị sâu sắc giúp em rất nhiều cho công việc sau này

Em xin chân thành cảm ơn Cô!

MỤC LỤC

Contents

MỤC LỤC 3

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 4

CHƯƠNG II: NỘI DUNG CHÍNH 6

2.1: Tổng quan về quá trình Multiplex PCR: 6

2.2: Các loại Multiplex PCR 8

2.2.1: Phản ứng PCR mẫu đơn 8

2.2.2: Phản ứng PCR nhiều mẫu 8

2.3: Thiết kế mồi cho Multiplex PCR 9

2.3.1: Chiều dài mồi 9

2.3.2: Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm) 9

2.3.3: Độ đặc hiệu 9

2.3.4: Tránh hình thành dimer primer 9

2.3.5: Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex 9

2.4: Ưu điểm của multiplex PCR 10

2.4.1 Kiểm soát nội bộ 10

2.4.2 Hiệu quả 10

2.4.3 Chỉ định về Chất lượng Tiêu bản 10

2.4.4 Chỉ định Số lượng Tiêu bản 10

2.5: Nhược điểm của multiplex PCR 10

2.6: Tối ưu hoá các thành phần cho phản ứng multiplex PCR 11

2.6.1: Nồng độ mồi 11

2.6.2 Nồng độ dNTP và MgCl2 11

2.6.3: Sự cân bằng dNTP/ MgCl2 12

2.6.4: Nồng độ dung dịch đệm (buffer) 12

2.6.5: Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase 12

2.6.6: Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA 13

2.7: Ứng dụng của Multiplex PCR 13

2.7.1: Các mục đích phản ứng multiplex PCR 14

2.7.2: Multiplex PCR trong thực phẩm 14

CHƯƠNG III: KẾT LUẬN 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

Multiplex PCR( PCR đa mồi) là một biến thể của PCR cho phép khuếch đại đồng thời nhiều mục tiêu quan tâm trong một phản ứng bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi Multiplex PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến

Trong thử nghiệm ghép kênh, có thể khuếch đại nhiều hơn một trình tự đích bằng cách

sử dụng nhiều cặp mồi trong hỗn hợp phản ứng Là một phần mở rộng cho việc sử dụng PCR trong thực tế

Kỹ thuật này có thể tiết kiệm đáng kể thời gian và công sức bằng cách khuếch đại đồng thời nhiều trình tự trong một phản ứng đơn lẻ, một quá trình được gọi là phản ứng chuỗi polymerase đa nhân (PCR) Multiplex PCR yêu cầu các đoạn mồi dẫn đến

sự khuếch đại các vùng DNA duy nhất, cả trong các cặp riêng lẻ và sự kết hợp của nhiều đoạn mồi, trong một tập hợp các điều kiện phản ứng

Ngoài ra, phải có sẵn các phương pháp để phân tích từng sản phẩm khuếch đại riêng lẻ

từ hỗn hợp tất cả các sản phẩm Multiplex PCR đang trở thành một xét nghiệm sàng lọc nhanh chóng và thuận tiện trong cả phòng thí nghiệm lâm sàng và nghiên cứu Sự phát triển của một multiplex PCR hiệu quả thường yêu cầu lập kế hoạch chiến lược và nhiều nỗ lực để tối ưu hóa các điều kiện phản ứng

Đối với xét nghiệm PCR ghép thành công, nồng độ tương đối của mồi, nồng độ của dung dịch đệm PCR, sự cân bằng giữa nồng độ magie clorua và deoxynucleotide, nhiệt

độ chu trình, lượng DNA mẫu và Taq DNA polymerase là rất quan trọng Một sự kết hợp tối ưu giữa nhiệt độ ủ và nồng độ dung dịch đệm là điều cần thiết trong PCR ghép

để thu được các sản phẩm khuếch đại có tính đặc hiệu cao Nồng độ magie clorua chỉ cần tỷ lệ thuận với lượng dNTP, đồng thời việc điều chỉnh nồng độ mồi cho từng trình

tự đích cũng rất cần thiết Danh sách các yếu tố khác nhau có thể ảnh hưởng đến phản ứng không có nghĩa là đầy đủ Việc tối ưu hóa các tham số được thảo luận trong tổng quan hiện tại sẽ cung cấp một cách tiếp cận thực tế để giải quyết các vấn đề phổ biến gặp phải trong PCR ghép kênh (chẳng hạn như các sản phẩm khuếch đại giả, khuếch đại không đồng đều hoặc không khuếch đại một số trình tự đích, và khó khăn trong việc tái tạo một số kết quả) Việc đánh giá và xác nhận kỹ lưỡng các quy trình PCR ghép kênh mới là điều cần thiết Độ nhạy và độ đặc hiệu phải được đánh giá kỹ lưỡng bằng cách sử dụng axit nucleic tinh khiết đã chuẩn hóa Nếu có thể, nên sử dụng đầy

đủ các biện pháp kiểm soát chất lượng bên ngoài và bên trong, những biện pháp này phải được áp dụng nghiêm ngặt Khi số lượng tác nhân vi sinh vật có thể phát hiện bằng PCR tăng lên, nó sẽ trở nên rất mong muốn cho các mục đích thực tế để đạt được

sự phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây ra các hội chứng lâm sàng tương tự hoặc giống hệt nhau và/hoặc chia sẻ các đặc điểm dịch tễ học tương tự

CHƯƠNG II: NỘI DUNG CHÍNH

2.1: Tổng quan về quá trình Multiplex PCR:

Phản ứng chuỗi Multiplex polymerase (PCR Multiplex) là một sửa đổi của phản ứng chuỗi polymerase nhằm phát hiện nhanh chóng các đoạn xóa hoặc sao chép trong một gen lớn Quá trình này khuếch đại các mẫu DNA bộ gen bằng cách sử dụng nhiều đoạn mồi và DNA polymerase làm trung gian nhiệt độ trong một máy quay vòng nhiệt Multiplex-PCR lần đầu tiên được mô tả vào năm 1988 như là một phương pháp để phát hiện sự mất đoạn của gen dystrophin.Nó cũng đã được sử dụng với gen sulfatase steroid Năm 2008, multiplex-PCR được sử dụng để phân tích microsatellites và SNPs Multiplex-PCR bao gồm nhiều bộ mồi trong một hỗn hợp PCR đơn lẻ để tạo ra các bộ khuếch đại có kích thước khác nhau dành riêng cho các trình tự DNA khác nhau Bằng cách nhắm mục tiêu nhiều gen cùng một lúc, thông tin bổ sung có thể thu được từ một lần chạy thử nghiệm mà nếu không sẽ cần nhiều lần thuốc thử và nhiều thời gian hơn

để thực hiện Nhiệt độ ủ cho từng bộ mồi phải được tối ưu hóa để hoạt động chính xác trong một phản ứng duy nhất và kích thước bộ khuếch đại, tức là chiều dài cặp cơ sở của chúng, phải đủ khác nhau để tạo thành các dải riêng biệt khi hiển thị bằng điện di trên gel Bộ dụng cụ ghép kênh thương mại dành cho PCR hiện có sẵn và được nhiều phòng thí nghiệm pháp y sử dụng để khuếch đại các mẫu DNA đã phân hủy

Quy trình thực hiện:

Đầu tiên cần thu thập mẫu DNA từ nhiều nguồn sau đó đảo ngược đoạn mồi đặc hiệu cho Gen với các trình tự phổ biến và chuyển đoạn mồi đặc hiệu cho Gen với các trình

tự phổ biến Cho DNTP, Taq polymeraza, Taq buffer (containing MgCl2) vào trong ống nghiệm tiến hành ủ và đem đi phân tích điện di

2.2: Các loại Multiplex PCR.

Các phản ứng ghép kênh có thể được chia thành hai loại:

2.2.1: Phản ứng PCR mẫu đơn

Kỹ thuật này sử dụng một mẫu duy nhất có thể là DNA bộ gen cùng với một số cặp mồi xuôi và ngược để khuếch đại các vùng cụ thể trong một mẫu

2.2.2: Phản ứng PCR nhiều mẫu.

Nó sử dụng nhiều mẫu và một số bộ mồi trong cùng một ống phản ứng

Sự hiện diện của nhiều đoạn mồi có thể dẫn đến lai chéo với nhau và khả năng bắt nhầm với các mẫu khác

Tuy nhiên phản ứng PCR cũng có nhược điểm đó là: sự xuất hiện của nhiều đoạn mồi

có thể dẫn đến sự lai chéo với nhau Vì nhiều đoạn mồi nên sẽ có nhiều DNA nên chúng có thể có sự lai chéo và điều đó sẽ khiến cho việc ghép nối sai với các mẫu khác

2.3: Thiết kế mồi cho Multiplex PCR.

Thiết kế các bộ mồi cụ thể là điều cần thiết cho phản ứng ghép kênh thành công Các cân nhắc thiết kế mồi quan trọng được mô tả dưới đây là chìa khóa để khuếch đại cụ thể với năng suất cao

2.3.1: Chiều dài mồi.

Xét nghiệm PCR Multiplex Chiều dài mồi liên quan đến việc thiết kế một số lượng lớn mồi, do đó mồi được thiết kế phải có độ dài phù hợp Thông thường, mồi có độ dài ngắn, trong khoảng 18-22 base (nucleotide) được sử dụng

2.3.2: Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm).

Các mồi có Tm tương tự, tốt nhất là trong khoảng 55°C-60°C được sử dụng

Đối với các trình tự có hàm lượng GC cao, mồi có Tm cao hơn (tốt nhất là 75°C-80°C) được khuyến nghị Vì hàm lượng GC cao sẽ có nhiều liên kết hydro hơn làm cho nhiệt

độ nóng sẽ cao hơn

Độ dao động về Tm giữa các mồi nên nằm trong khoảng 3°- 5°C

2.3.3: Độ đặc hiệu.

Điều quan trọng là phải xem xét tính đặc hiệu của mồi được thiết kế đối với trình tự mục tiêu, trong khi chuẩn bị xét nghiệm ghép kênh, đặc biệt là khi có sự cạnh tranh khi nhiều trình tự mục tiêu ở trong một bình phản ứng

2.3.4: Tránh hình thành dimer primer

Các mồi được thiết kế nên được kiểm tra để phát hiện sự hình thành primer dimer, với tất cả các primer có trong hỗn hợp phản ứng (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) Giảm kích thước dẫn đến khuếch đại không đặc hiệu Tất cả các chỉ số cần lưu ý khi thiết kế mồi gần giống với thiết kế mồi cho 1 phản ứng PCR thông thường Thông thường, khi

tỷ lệ Mồi/Khuôn quá cao cũng có thể dẫn đến việc hình thành primer dimer, do đó phải chú ý chỉ số của các thành phần trong phản ứng

2.3.5: Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex.

PrimerPlex là 1 công cụ hữu ích cho quá trình thiết kế mồi đối với phản ứng multiplex PCR Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng có phản ứng chéo với nhau hay không, đồng thời tăng sự thích ứng giữa các mồi Quá trình này phân tích hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đó chương trình đưa ra danh sách các mồi

để người thiết kế lựa chọn

2.4: Ưu điểm của multiplex PCR.

2.4.1 Kiểm soát nội bộ

Các vấn đề tiềm ẩn trong PCR đơn giản bao gồm âm tính giả do phản ứng không thành công hoặc dương tính giả do nhiễm bẩn Âm tính giả thường được tiết lộ trong các thử nghiệm ghép kênh vì mỗi bộ khuếch đại cung cấp một biện pháp kiểm soát bên trong cho các đoạn được khuếch đại khác

2.4.2 Hiệu quả.

Chi phí thuốc thử và thời gian chuẩn bị trong PCR đa thành phần ít hơn so với trong các hệ thống sử dụng nhiều ống PCR đơn thành phần Một phản ứng ghép kênh là lý tưởng để bảo tồn polymerase đắt tiền và các khuôn mẫu đang thiếu hụt

2.4.3 Chỉ định về Chất lượng Tiêu bản.

Chất lượng của tiêu bản có thể được xác định trong multiplex hiệu quả hơn so với phản ứng PCR đơn giản

2.4.4 Chỉ định Số lượng Tiêu bản.

Khuếch đại hàm mũ và các tiêu chuẩn nội bộ của PCR ghép kênh có thể được sử dụng

để đánh giá số lượng của một tiêu bản cụ thể trong một mẫu Để định lượng chính xác các mẫu bằng PCR ghép kênh, số lượng mẫu tham chiếu, số chu kỳ phản ứng và sự ức chế tối thiểu của việc nhân đôi sản phẩm theo lý thuyết cho mỗi chu kỳ phải được tính đến

2.5: Nhược điểm của multiplex PCR.

Mặc dù multiplex PCR có nhiều ưu điểm nhưng nó cũng có một số nhược điểm không thể bỏ qua:

Thứ nhất, có thể xảy ra hiện tượng tự ức chế giữa các nhóm mồi khác nhau Primer dimer là một sản phẩm phụ tiềm năng của PCR, bao gồm hai phân tử primer lai với nhau vì chúng có chung một chuỗi bazơ bổ sung Sau đó, DNA polymerase sẽ khuếch đại dimer mồi, cạnh tranh các thuốc thử PCR và có khả năng ức chế quá trình khuếch đại của trình tự DNA đích Do đó, dimer mồi gây ra nhược điểm thứ hai, đó là hiệu suất khuếch đại thấp Nói chung, điều này làm cho PCR ghép kênh trở nên khó thiết kế

và có nghĩa là kỹ thuật này không thể dễ dàng nhân rộng đến các mục tiêu rất lớn Thứ hai, việc chia nhỏ các mẫu thường được yêu cầu để giảm bớt những thách thức đối với cỡ mẫu lớn Tuy nhiên, điều này lại làm giảm độ nhạy của thử nghiệm đối với các biến thể hiếm Sử dụng các giọt nhỏ hoặc mồi liên kết để tăng tính đặc hiệu là các giải pháp thay thế đã được sử dụng để vượt qua một số trở ngại này và giảm sự hình thành dimer của mồi

Một vấn đề phức tạp khác là chỉ có thể đặt một bộ điều kiện khuếch đại duy nhất cho mỗi sản phẩm PCR Do đó, thiết kế mồi cho một số mục tiêu đa kênh có thể khó khăn

Có nguy cơ ưu tiên một số sản phẩm hơn những sản phẩm khác Một tùy chọn là xem xét một số yếu tố trong quá trình thiết kế mồi, chẳng hạn như trình tự axit nucleic đích,

độ dài và hàm lượng GC Điều này làm cho nhiều khả năng tập hợp các điều kiện khuếch đại sẽ là tối ưu cho tất cả các sản phẩm được nhắm mục tiêu bởi PCR ghép

2.6: Tối ưu hoá các thành phần cho phản ứng multiplex PCR.

2.6.1: Nồng độ mồi.

Nồng độ mồi ban đầu cho phản ứng có nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM Có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ, người ta có thể tăng hàm lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm nồng độ mồi với các locus “mạnh” Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi trong phản ứng nên nằm trong khoảng từ 0.04 µM đến 0.5 µM

Với số lượng bản sao thấp hay ADN phức tạp, nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.3

µM đến 0.5 µM Ngược lại nếu số lượng bản sao lớn hay ADN khuôn ít phức tạp thì nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.04 µM đến 0.4 µM

2.6.2 Nồng độ dNTP và MgCl 2

Nồng độ MgCl2 nên giữ cố định ở mức 2 mM Nồng độ dNTP có thể dao động từ 0.5

mM đến 1.6 mM Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP là từ 0.2 mM đến 0.4

mM Quá ngưỡng này sẽ làm giảm tốc độ phản ứng

Nồng độ mỗi loại dNTP thấp hơn 0.1 mM sẽ vẫn giữ được tốc độ phản ứng nhưng lại làm giảm số lượng sản phẩm dNTP gốc (stock) nhạy cảm với quá trình rã đông, do đó làm hiệu quả phản ứng multiplex PCR có thể giảm

Để khắc phục nhược điểm này, dNTP nên được chia thành từng lượng nhỏ trước khi bảo quản ở -20ºC

Do MgCl2 ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả hoạt động của enzyme Taq ADN

polymerase nên nồng độ Mg2+ phải được kiểm tra chặt chẽ Enzyme Taq polymerase, khuôn, dNTP và các mồi đều liên kết với MgCl2 nên nồng độ MgCl2 phụ thuộc vào nồng độ các thành phần này Hơn nữa, nếu khuôn hoặc mồi có chứa EDTA hay EGTA thì nồng độ MgCl2 cũng sẽ được điều chỉnh Mg2+ giúp ổn định cấu trúc sợi đôi, bảo vệ ADN khỏi bị biến tính Nồng độ Mg2+ cao có thể dẫn đến việc làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu do nó tác động đến quá trình gắn mồi lên sợi khuôn Tuy nhiên nếu hàm lượng Mg2+ không đủ cũng sẽ làm giảm lượng sản phẩm cần thiết

2.6.3: Sự cân bằng dNTP/ MgCl 2

Để làm việc hiệu quả, Taq ADN polymerase cần Mg tự do (bên cạnh Mg liên kết với dNTP và ADN) Đây là lí do tại sao khi tăng nồng độ dNTP thì tốc độ phản ứng PCR lại giảm trong khi đó tăng nồng độ Mg lại cho kết quả ngược lại 0.2 mM dNTP kết hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2 là hợp lí

2.6.4: Nồng độ dung dịch đệm (buffer).

Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phản ứng multiplex PCR Nó hiệu quả hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol, BSA) Các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN có chiều dài lớn sẽ hoạt động tốt hơn ở nồng độ muối thấp trong khi các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN ngắn hơn yêu cầu nồng độ muối cao hơn

2.6.5: Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase.

Khi lượng khuôn ADN thấp, hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu của phản ứng có thể tăng lên nếu hạ thấp nhiệt độ gắn mồi Người ta tiến hành thử nghiệm ở các nồng độ Taq ADN polymerase khác nhau, sau đó đưa ra được nồng độ tối ưu đối với enzyme này 2.5U/ 50µl dịch phản ứng

Nếu quá nhiều enzyme, nồng độ glycerol dùng để bảo quản enzyme có thể làm mất cân bằng quá trính khuếch đại làm tăng sự nhiễu Tỷ lệ mồi đặc hiệu và hỗn hợp phụ thuộc vào hoạt tính của enzyme, các thành phần thiết yếu trong phản ứng như MgCl2, dNTPs và bản chất của ADN đích Vì vậy, một loạt các cải tiến được thực hiện nhằm cải thiện quá trình PCR chủ yếu định hướng trực tiếp vào các yếu tố tác động đến việc gắn mồi và kéo dài chuỗi

2.6.6: Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA.

Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗ trợ bởi các chất phụ gia như DMSO, glycerol, formamide và betaine Những phụ gia này giúp làm lỏng chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằng nhiệt nhanh hơn

Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO và glycerol lại gây ra sự cạnh