parahaemolyticus EMS Early Mortality Syndrome Bệnh hoại tử gan tụy cấp FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc GSMC Global Seafood Market Conference Hội n
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -
Trần Quang Vinh
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM VI SINH
VẬT ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC AO NUÔI TÔM
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Thành phố Hồ Chí Minh 07- 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -
Trần Quang Vinh
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM VI SINH
VẬT ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC AO NUÔI TÔM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Phúc
Thành phố Hồ Chí Minh 07- 2019
Trang 3I
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được sự hướng dẫn tận tình của thầy TS Nguyễn Hữu Phúc Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn chưa từng được công bố trong công trình nào khác Các số liệu và trích dẫn trong Luận văn đảm bảo tính chính xác, tin cậy và trung thực
Tôi xin chân thành cảm ơn!
TP Hồ Chí Minh, ngày … tháng 7 năm 2019
Tác giả
Trần Quang Vinh
Trang 4II
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian theo học tại Học Viện Khoa Học và Công Nghệ, tôi đã được tạo điều kiện tốt nhất trong học tập, nghiên cứu từ Học Viện Khoa Học
và Công Nghệ và Viện Sinh Học Nhiệt Đới
Tôi đã nhận được sự tận tình chỉ dẫn của Quý Thầy Cô trong Học Viện,
sự chu đáo của cán bộ, nhân viên ở các đơn vị của Học Viện
Đây cũng là thời kỳ gắn bó và giúp đỡ đầy thiện chí của tập thể bạn bè tôi
ở lớp Cao học Sinh học thực nghiệm 2017A, Học Viện Khoa Học và Công Nghệ, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
Để có được bản luận văn thạc sĩ này, tôi vô cùng biết ơn Thầy Tiến sĩ Nguyễn Hữu Phúc luôn tận tâm, hết lòng nâng bước cho nhiều thế hệ học trò, người đã gắn bó không mệt mỏi với sự nghiệp trồng người, đã cho tôi nhiều ý kiến quí báu trong quá trình thực hiện đề tài
Tôi không quên lòng nhiệt tình, sâu sát, lo lắng, chia sẻ của Ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới, và các đồng nghiệp đã quan tâm tạo điều kiện, giúp
đỡ, cũng như sự tiếp sức chân tình và hiệu quả từ gia đình nhỏ của tôi
Em xin chân thành cảm ơn !
Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng 07 năm 2019 Tác giả
Trần Quang Vinh
Trang 5III
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
VPAHPND Vibrio parahaemolyticus Acute
hepatopancreatic necrosis disease
Bệnh hoại tử gan cấp tính
do V parahaemolyticus
EMS Early Mortality Syndrome Bệnh hoại tử gan tụy cấp FAO Food and Agriculture
Organization
Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc
GSMC Global Seafood Market
Conference
Hội nghị Thị trường Thủy sản Toàn cầu
VASEP Vietnam Association of Seafood
Exporters and Producers
Hiệp Hội chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam BOD Biochemical oxygen demand Nhu cầu oxy sinh học COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa học
cấy khuẩn lạc TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts
Sucrose
Môi trường phân lập chọn
lọc Vibrio sp
FCR Feed Conversion Ratio Hệ số chuyển đổi thức ăn EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic
Acid
Acid hữu cơ mạnh
Trang 6IV
Danh mục các bảng
Bảng 1.1: Hiệu quả sử dụng Probiotic trong nuôi thủy sản: 9 Bảng 2.1: Phương pháp phân tích chất lượng nước: 46 Bảng 3.1: Một số chủng vi sinh phân lập đã được chọn lọc : 51 Bảng 3.2: Đặc điểm phát triển và tạo acid lactic của các chủng
vi khuẩn lactic: 63 Bảng 3.3 : Số lượng vi sinh trong EM: 73 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến tỷ lệ sống và năng suất tôm: 75 Bảng 3.5: Báo cáo giai đoạn các kết quả thử nghiệm chế phẩm trong ao nuôi tôm sú: 76 Bảng 3.6: Biến động các yếu tố chất lượng nước trong ao nuôi tôm: 77
Trang 7V
Danh mục các hình
Hình 1.1: Sơ đồ ảnh hưởng của các chế phẩm vi sinh sử dụng trong thủy sản: 10
Hình 2.1: máy đo DO, pH,… 49
Hình 2.2: Máy phá mẫu COD 50
Hình 2.3: Máy đo BOD5 50
Hình 2.4: Máy đo chỉ tiêu Amonium, nitrate, nitrite, 51
Hình 3.1: Khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp 53
Hình 3.2: Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng Bacillus sp 54
Hình 3.3: Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp amylase 55
Hình 3.4 Hoạt lực enzym protease của các chủng Bacillus sp 56
Hình 3.5: Hoạt lực enzym amylase của chủng Bacillus sp 57
Hình 3.6: Hoạt lực emzyme protease của chủng Bacillus sp 58
Hình 3.7: Sự biến động số lượng Vibrio sp 59
Hình 3.8: Sự biến động Bacillus sp trong nước nuôi tôm 60
Hình 3.9: Sự biến động của Vibrio sp trong tôm theo thời gian 61
Hình 3.10: Sự biến động số lượng Bacillus sp trong tôm 62
Hình 3.11: Lactobacillus sp Lac 1 ; Lactobacillus acidophilus Lac 2 65
Hình 3.12: Lactobacillus sp Lac 3 ; Lactobacllus acidophilus Lac 4 65
Hình 3.13: Lactobacillus sp Lac 5 ; Lactobacillus sp Lac 6 66
Hình 3.14: Lactobacillus sp Lac 7 ; Lactobacillus sp Lac 8 66
Hình 3.15: Streptococcus sp Lac 9 ; Streptococcus sp Lac 10 67
Hình 3.16: Lactobacillus sp Lac 11 ; Lactobacillus sp Lac 12 67
Hình 3.17: Streptoccocus sp Lac 13; Streptococcus sp Lac 14 67
Hình 3.18: Lactobacillus sp Lac 16 ; Lactobacillus sp Lac 17 68
Hình 3.19: Lactobacillus sp Lac 18 ; Tế bào vi khuẩn Lactobacillus sp 68
Trang 8VI Hình 3.20: Sự biến động pH của khi nuôi EM 72
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ khối chế tạo EM gốc và các loại EM khác 71
Trang 9VII
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC: 5
1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC: 7
1.3 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG AO NUÔI TÔM: 8
1.3.1 Các chế phẩm vi sinh sản xuất từ các loài vi khuẩn Bacillus sp và các vi khuẩn khác: 10
1.3.2 Chế phẩm EM: 10
1.3.3 Vi sinh quang tự dưỡng: 12
1.3.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang tự dưỡng: 12
1.3.3.2 Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh: 14
1.3.3.3 Ứng dụng của VKQH tía trong nuôi trồng thuỷ sản: 15
1.4 DỊCH BỆNH TÔM: 19
1.4.1.Tình hình bệnh tôm trên thế giới: 19
1.4.2 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam: 20
1.4.3 Vi khuẩn Vibrio sp: 23
1.5 CHẤT HỮU CƠ TRONG CÁC AO NUÔI TÔM: 24
1.5.1 Nguồn gốc chất hữu cơ trong các ao thủy sinh: 24
1.5.2 Chất hữu cơ từ nguồn nước cấp: 24
1.5.3 Chất hữu cơ từ thức ăn : 24
1.5.4 Chất hữu cơ từ phân bón: 25
1.5.5 Chất hữu cơ hình thành trong quá trình nuôi tôm: 25
1.6 VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG CÁC QUÁ TRÌNH BIẾN ĐỔI VẬT CHẤT TRONG AO NUÔI THỦY SẢN: 28
1.6.1 Phân huỷ các hợp chất carbon: 28
Trang 10VIII
1.6.2 Vai trò vi sinh vật trong việc chuyển hóa các hợp chất chứa
nitrogen: 30
1.6.2.1 Phân giải protein amon hóa : 30
1.6.2.2 Vi sinh vật tham gia vào quá trình nitrat hóa (Nitrification) : 30
1.6.3 Biến đổi sulfur: 34
1.7 CÁC YẾU TỐ HÓA LÝ TỚI MÔI TRƯỜNG NUÔI TÔM: 35
1.7.1 Yếu tố vật lý: 35
1.7.2 Yếu tố hóa học: 36
1.7.3 Yếu tố sinh học: 37
CHƯƠNG 02: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU: 38
2.1.1 Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu hiện có tại Viện Sinh học nhiệt đới 38
2.1.2 Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm: 39
2.1.2.1 Đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp amylase, protease của một số chủng Bacillus sp 39
2.1.2.2 Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym amylase của các chủng Bacillus sp: 39
2.1.2.3 Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym protease của các chủng Bacillus: 40
2.1.2.4 Xác định hoạt tính emzyme amylase theo phương pháp Smith và Roe (1946) 40
2.1.2.5 Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson 41
2.1.3 Thử nghiệm chế phẩm sinh học vi sinh trong phòng thí nghiệm: 44
2.1.4 Thử nghiệm tại ao nuôi: 45
2.1.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm: 45
2.1.4.2 Phương pháp quản lý chất lượng nước: 46
Trang 11IX
2.1.4.2.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý nước: 46
2.1.4.2.2 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong nước: 47
2.1.4.2.3 Phương pháp phân tích tăng trưởng và năng suất tôm nuôi: 47
2.1.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: 47
2 2 MỘT SỐ HÓA CHẤT, THIẾT BỊ DÙNG TRONG PHÂN TÍCH MẪU VI SINH, HÓA LÝ: 48
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51
3.1 CHỌN LỌC CÁC CHỦNG BACILLUS SP SỬ DỤNG TRONG NUÔI TÔM 51
3.1.1 Chọn lọc các chủng đối kháng với Vibrio 51
3.1.2 Xác định khả năng sinh tổng hợp emzyme của các chủng vi sinh: 53
3.1.2.1 Xác định khả sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp: 53
3.1.2.2 Khả năng sinh tổng hợp emzym protease của các chủng Bacillus sp sử dụng trong nuôi tôm : 54
3.1.2.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym amylase của các chủng Bacillus sp sử dụng trong nuôi tôm sú: 55
3.1.2.4 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym protease của các chủng Bacillus sp: 56
3.1.2.5 Xác định hoạt tính amylase của chủng Bacillus sp: 57
3.1.2.6 Hoạt tính enzym protease của một số chủng Bacillus sp: 58
3.1.3 Thử nghiệm tính đối kháng các chủng với vi khuẩn Vibrio sp trong phòng thí nghiệm: 59
3.1.3.1 Sự biến động số lượng vi khuẩn Vibrio sp: 59
3.1.3.2 Sự biến động số lượng vi khuẩn Bacillus sp: 60
3.1.3.3 Sự biến động Vibrio sp trong tôm thử nghiệm: 61
3.1.3.4 Sự biến động Bacillus sp trong ruột tôm: 62
Trang 12X
3.2 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM EM : 63
3.2.1 Chọn chủng vi khuẩn lactic: 63
3.2.2 Chọn chủng nấm men: 69
3.2.3 Chế tạo chế phẩm EM: 69
3.2.3.1.Nguyên liệu: 69
3.2.3.2 Sơ đồ khối tạo chế phẩm EM: 71
3.2.3.3 Sự biến đổi pH khi nuôi EM: 72
3.2.3.4 Kết quả kiểm tra vi sinh trong EM: 73
3.3 KẾT QUẢ SO SÁNH ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM EM VÀ BACILLUS ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC VÀ HIỆU QUẢ NUÔI TÔM: 74
3.3.1 Ảnh hưởng chế phẩm Bacillus sp đến chất lượng nước ao nuôi tôm tại Cần Giờ và Nhà Bè: 74
3.3.1.1 Khảo nghiệm chế phẩm tại Cần Giờ: 74
3.3.1.2 Khảo nghiệm chế phẩm ở huyện Nhà Bè: 76
3.3.1.3 Một số chỉ tiêu hóa lý phân tích ao thử nghiệm: 77
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78
4.1 KẾT LUẬN 78
4.2 KIẾN NGHỊ 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO 79
PHỤ LỤC 83
Trang 131
MỞ ĐẦU
Ngành nuôi tôm nước lợ chiếm vị trí đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế ngành thủy sản Việt Nam hơn 10 năm qua
Cụ thể: theo báo cáo Tổng cục thủy sản năm 2018, giá trị sản xuất thủy sản năm 2018 đạt khoảng 228.139,8 tỷ đồng, tăng 7,7% so với năm 2017, tổng sản lượng đạt khoảng 7,74 triệu tấn, tăng 7,2%, trong đó sản lượng sản lượng khai thác đạt 3,59 triệu tấn, tăng 6,0%, nuôi trồng đạt 4,15 triệu tấn, tăng 8,3% Đối với tôm nước lợ: Từ cuối quý II/2018, giá tôm nguyên liệu đã tăng lên, người nuôi tiếp tục thả giống nuôi tôm, góp phần đưa sản lượng tôm các loại đạt khoảng 800 nghìn tấn trong năm 2018, tăng 10,5% so với năm 2017, theo dự báo của Tổng cục thủy sản năm
2019, ngành thủy sản Việt Nam sẽ tiếp tục tăng trưởng xuất khẩu đạt mức
10 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm phấn đấu đạt 4,2 tỷ USD tiến tới nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu đạt 508 nghìn tấn vào năm 2020 và
678 nghìn tấn vào năm 2030 [1]
Hiện nay, vẫn còn rất nhiều kẽ hở trong việc quản lý sản xuất tôm Quản lý môi trường, dịch bệnh trong nuôi tôm còn nhiều hạn chế, đã dẫn tới lây lan dịch bệnh Thực tế người dân chưa áp dụng mà chỉ biết nuôi theo quy trình của các công ty bán giống, thức ăn, chế phẩm sinh học tổ chức tập huấn tận vùng nuôi Các quy trình này đều hướng người nuôi đến sử dụng sản phẩm của họ càng nhiều càng tốt nên tình trạng lạm dụng thuốc, hóa chất, chất kháng sinh rất phổ biến, làm ô nhiễm môi trường, lờn thuốc, không an toàn và ảnh hưởng tới chất lượng và khả năng cạnh tranh của sản phẩm Trong khi đó hiện nay, thị trường thức ăn nuôi tôm, thuốc và hóa chất các loại phụ thuộc trên 80% vào các doanh nghiệp có vốn đầu tư trực tiếp nước ngoài Nghề nuôi trồng thủy sản chúng ta đang đương đầu với nhiều loại bệnh khác nhau: bệnh phát sáng,
bệnh đầu vàng, trong đó bệnh EMS nguyên nhân là do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm, vi khuẩn Vibrio sp chịu được nồng độ muối cao cho nên chúng có thể sống được ở môi trường nước lợ hoặc nước mặn, Vibrio sp
là vi khuẩn phát sáng sống bám trên động vật giáp xác và ruột của động vật nước Theo báo cáo FAO khẳng định (Food and Agriculture
Trang 142
Organization of the United Nations FAO, 2013) chỉ ra rằng độc tính của
Vibrio sp được phát hiện trên động vật thủy sinh, đặc biệt là họ penaeids
ở Châu Á, vi khuẩn Vibrio sp là nguyên nhân chủ yếu đối với bệnh EMS
và báo cáo mới đây nhất của (Anuphap Prachumwat et al., 2018) công bố tại tạp chí thủy sản thế giới cũng chỉ ra rằng nguyên nhân cũng vậy Theo (Han et al., 2017) tác nhân gây bệnh đã được báo cáo vào năm 2013
Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) mà sau này đều mang một
plasmid (PVA) mã hóa các Pir - như gen độc tố nhị phân Pir VPA và Pir VPB VPAHPND phân lập khuẩn lạc trong dạ dày tôm và giải phóng độc
tố nhị phân gây ra sự bong tróc lớn của các tế bào biểu mô ống hình ống
và tử vong, plasmid và các biến thể xảy ra ở nhiều loại huyết thanh V
parahaemolyticus và cả ở các loài Vibrio khác như V harveyi, V campbellii, và V owensii., dịch bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên
toàn thế giới, ở Việt Nam trong những năm gần đây diện tích bị bệnh không ngừng gia tăng trên diện rộng, Ngày nay FAO đã xác định sử dụng probiotic là biện pháp chủ yếu để cải thiện chất lượng môi trường thủy sản Để phòng trị bệnh hoại tử gan tụy, biện pháp hàng đầu là phòng
và trị bệnh cho tôm nuôi hiệu quả, cần thay thế thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, bổ sung các chất khoáng và sử dụng probiotic trong thức ăn (Gomez-Gil et al., 2000), xử lý nước của thủy sản nuôi là lựa chọn tốt nhất trong xu thế hiện nay Mặc dù ngày nay người nuôi tôm Việt nam đang sử dụng khá nhiều các chế phẩm vi sinh, nhưng phần lớn đều là các sản phẩm nhập nội
Các chế phẩm vi sinh là nguyên liệu hết sức quan trọng hiện nay thay thế phương pháp dùng kháng sinh, số lượng các chế phẩm vi sinh phổ biến trên thị trường hiện nay một phần lớn là nhập khẩu và một phần còn lại là sản xuất trong nước Vì vậy trong chương trình thực hiện luận văn
thạc sĩ chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến chất lượng nước ao nuôi tôm”
Trang 153
MỤC TIÊU:
- Nghiên cứu và sản xuất hai chế phẩm xử lý môi trường nước ao nuôi tôm và phòng chống vi khuẩn gây bệnh cho tôm
- Đánh giá hiệu quả của hai loại chế phẩm vi sinh đang sử dụng nhiều
trong nuôi tôm là chế phẩm Bacillus nhiệt đới và chế phẩm EM gốc nhiệt đới đến chất lượng nước ao nuôi tôm và phòng chống Vibrio sp gây
bệnh cho tôm nuôi ở trong phòng thí nghiệm
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
- Chọn lọc một số chủng vi khuẩn Bacillus sp để tạo chế phẩm
Bacillus nhiệt đới kháng Vibrio sp dùng trong nuôi tôm
- Phân lập và chọn một số chủng vi khuẩn Lactic để tạo chế phẩm EM
gốc nhiệt đới
- Nghiên cứu ảnh hưởng của 02 chế phẩm vi sinh Bacillus nhiệt đới
và EM gốc nhiệt đới đến chất lượng nước và hiệu quả tôm nuôi trong phòng thí nghiệm và ngoài ao nuôi tôm thương phẩm