Sự phát triển của sắc ký đồdiện tích pic và cường độ picnghiên cứu hợp chất trong quá trình quang xúc tác...11 Trang 5 LC: Liquid chromatography.MS: Mass spectrometry .UV-VIS: Ultra vio
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH KHOA HÓA HỌC ỨNG DỤNG ISO 9001-2015 BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) GVHD: Nguyễn Thiện Thảo SVTH: Thạch Thị Thảo Trương Huỳnh Thu Tâm Huỳnh Thị Hồng Thắm DANH MỤC HÌNH Hình Hệ thống HPLC Hình Sự phát triển quang phổ UV-vis trình phân hủy quang (a) phát triển tương ứng trình phân hủy tỷ lệ X (%) MB so với quang phân (b) Hình Sắc ký đồ HPLC (a) phổ MS tương ứng hỗn hợp phản ứng t=0, với phổ cực đại sắc ký đồ thứ (b) phổ cực đại sắc ký đồ thứ hai (c) 10 Hình Cơng thức MB (a) Azure B (b) 11 Hình Cơng thức Azure A (a) Azure C (b) 12 Hình Công thức giả định củacác phân tử tương ứng với 301 m/z: (a)Heitmann cộng [26], (b) Gnaser cộng [27]và 318 m/z: (c) Castro et al [28], (d)Heitmann cộng [26] 12 Hình Sự phát triển khu vực pic sắc ký đồ tương ứng với MS đạt cực đại 270 m/z (Azure B), 256m/z(Azure A) 242 m/z (Azure C) 13 Hình Cơ chế phân hủy MB Trong trình phân thủy quang 13 Hình Kết phân hủy quang MB HPLC-MS UV-nhìn thấy cách sử dụng dây nano ZnO làm chất xúc tác quang 14 DANH MỤC BẢNG BẢNG Sự phát triển sắc ký đồdiện tích pic cường độ pic nghiên cứu hợp chất trình quang xúc tác 11 DANH MỤC VIẾT TẮT HPLC: High-performance liquid chromatography LC: Liquid chromatography MS: Mass spectrometry UV-VIS: Ultra violet - Visible GC: Gas chromatography m/z: khối lượng phân tử điện tích LOD: giới hạn phát LOQ: giới hạn định lượng PDA: photodiode TLC: sắc ký lớp mỏng ESI:ion hóa phun điện MB:Methylene Blue Tổng quan : Trước HPLC, nhà khoa học dựa vào phương pháp sắc ký lỏng truyền thống Bởi tốc độ dịng chảy dung mơi xác định trọng lực, thiết bị sắc ký lỏng không hiệu Việc phân tách vài chí vài ngày để hồn thành Mặc dù sắc ký khí (GC) mạnh sắc ký lỏng (LC) vào thời điểm đó, việc tách phân tích pha khí polyme sinh học có trọng lượng phân tử cực cao cho thực Do tính khơng ổn định nhiệt chất hịa tan nên GC khơng có tác dụng nhiều nhà hóa sinh Kết là, nhiều phương pháp khác đề xuất, cuối dẫn đến việc phát minh HPLC Cal Giddings, Josef Huber người khác dự đoán vào năm 1960 LC vận hành chế độ hiệu cao cách giảm đáng kể đường kính hạt đóng gói xuống mức LC (và GC) điển hình 150 m sử dụng áp suất để tăng khả di động vận tốc pha, xây dựng dựa cơng trình tiếng Martin Synge vào năm 1941 Trong suốt năm 1960 1970, dự đoán thử nghiệm hoàn thiện rộng rãi Nghiên cứu ban đầu việc cải thiện hạt LC bắt đầu việc phát Zipax, hạt xốp bề ngồi, hứa hẹn cho công nghệ HPLC Nhiều tiến phần cứng thiết bị xảy suốt năm 1970 Các nhà nghiên cứu bắt đầu cách xây dựng hệ thống HPLC thô sử dụng máy bơm vòi phun Máy bơm khuếch đại khí xuất sắc chúng hoạt động áp suất khơng đổi khơng u cầu vịng đệm khơng rị rỉ van kiểm tra để có dịng chảy ổn định định lượng xác Tại Dupont IPD (Bộ phận Polyme Công nghiệp), mốc quan trọng phần cứng đạt được, chẳng hạn việc sử dụng thiết bị gradient thể tích có khoảng dừng thấp thay bơm vách ngăn van bơm vòng Mặc dù tiến thiết bị quan trọng, lịch sử HPLC chủ yếu cải tiến cơng nghệ hạt Đã có xu hướng liên tục hướng tới kích thước hạt nhỏ kể từ hạt lớp xốp đời để cải thiện hiệu Tuy nhiên, việc giảm kích thước hạt gây vấn đề Sự sụt giảm áp suất lớn cần thiết để đẩy chất lưu động qua cột, khó khăn việc tạo lớp vật liệu cực mỏng đồng nhất, nhược điểm thực tế [Khi kích thước hạt hạ xuống đủ mức, vòng phát triển thiết bị khác thường yêu cầu để thích ứng với áp suất tăng lên.[1] Giới thiệu phương pháp sắc khí lỏng hiệu cao HPLC HPLC (high-Performance Liquid Chromatography), trước gọi sắc ký lỏng cao áp, kỹ thuật hóa học phân tích để tách, xác định định lượng thành phần hỗn hợp Bơm sử dụng để di chuyển dung mơi lỏng có áp suất chứa hỗn hợp mẫu qua cột chứa đầy vật liệu hấp phụ rắn Mỗi thành phần mẫu tương tác với vật liệu hấp phụ theo cách khác, dẫn đến tốc độ dòng chảy khác tách thành phần chúng chảy khỏi cột HPLC sử dụng để sản xuất, hợp pháp (ví dụ: xác định loại thuốc tăng cường hiệu suất nước tiểu), nghiên cứu (ví dụ: tách thành phần mẫu sinh học phức tạp chất tổng hợp so sánh với nhau) dược phẩm (ví dụ: phát vitamin D nồng độ huyết thanh) ứng dụng.dịng pha động mang vào cột Các máy bơm cung cấp lưu lượng thành phần mong muốn pha động qua cột Máy dị tạo tín hiệu tỷ lệ thuận với lượng thành phần mẫu xuất từ cột, cho phép phân tích định lượng thành phần mẫu Một vi xử lý kỹ thuật số phần mềm người dùng điều khiển thiết bị HPLC cung cấp phân tích liệu Trong số thiết bị HPLC, máy bơm học trộn dung môi khác theo tỷ lệ thay đổi theo thời gian, dẫn đến độ dốc thành phần pha động UV/Vis, mảng photodiode (PDA) máy dò dựa khối phổ sử dụng phổ biến Nhiệt độ q trình phân tách thực điều chỉnh cách sử dụng hầu hết lò cột thiết bị HPLC Việc lựa chọn phương pháp phát quan trọng HPLC phân tích hợp chất chúng phát Sử dụng máy dị khơng phù hợp cho hợp chất quan tâm, thông tin sắc ký hợp chất bị Để chọn chế độ phát thích hợp nhất, cần xem xét bốn tham số quan trọng; chất hóa học chất phân tích, khả gây nhiễu, LOD LOQ cần thiết, phạm vi tuyến tính, tính khả dụng chi phí máy dò Dưới số kỹ thuật phát phổ biến cho sắc ký lỏng trình bày Nên sử dụng máy dị huỳnh quang, điện hóa khối lượng để phân tích vết Đối với HPLC chuẩn bị, số khúc xạ ưu tiên xử lý nồng độ cao mà khơng làm q tải máy dị Hấp thụ tia cực tím/nhìn thấy (UV/Vis) : Máy dò UV sử dụng phổ biến HPLC Máy dò kỹ thuật phát mạnh mẽ, rẻ tiền linh hoạt hầu hết hợp chất hấp thụ ánh sáng, đặc biệt bước sóng UV thấp Có thể sử dụng dị mảng đi-ốt (DAD) cho phép giám sát lại Phép đo khối phổ coi kỹ thuật phát thường quy thiết lập Máy dị MS kết hợp với kỹ thuật tách khác sắc ký lỏng (LC), sắc ký lớp mỏng (TLC) sắc ký khí (GC), nay, việc tạo gạch nối với LC thiết lập thường xuyên Trái ngược với máy dò đơn giản hơn, chẳng hạn UV, RI, FL, v.v., MS tạo liệu khối lượng phân tử thông số cấu trúc chi tiết cung cấp khả phân biệt đỉnh đồng rửa giải chế độ giám sát ion chọn Loại thứ hai làm giảm yêu cầu độ phân giải lưu giữ sắc ký trước phát hiện, tốt hết giữ lại phân giải hoàn toàn pic để ngăn chặn hiệu ứng ức chế ion tăng cường ion Máy phân tích khối lượng loại tứ cực, vùng từ tính, thời gian bay, bẫy ion loại cộng hưởng ion cyclotron Máy phân tích khối lượng bốn cực bao gồm bốn song song có dịng điện chiều (DC) cố định điện tần số vô tuyến (RF) xen kẽ áp dụng cho chúng Hệ thống HPLC xử lý chất phân tích hịa tan áp suất xung quanh (760 Torr) đưa mẫu đến MS, nơi việc phát mẫu khí, ion hóa thực điều kiện chân không cao (10-5-10-6 Torr ) Việc chuyển dung dịch phân tích từ LC sang MS thực thơng qua giao diện Giao diện chuyển đổi bước mẫu thành sol khí, ion hóa mẫu loại bỏ dung mơi Các ion sau tập trung truyền dọc theo tứ cực Chuyển động chúng phụ thuộc vào điện trường cho ion có tỷ lệ khối lượng điện tích cụ thể (m/z) có đường ổn định đến máy dò RF thay đổi để tập trung ion có m/z khác vào máy dị tạo khối phổ Tùy thuộc vào tính chất vật lý khối lượng phân tử phân tử, loại giao diện khác sử dụng, chúng khác tùy theo cách chúng ion hóa phân tử áp suất tác dụng trình Hiện tại, tất kỹ thuật ion hóa phổ biến hoạt động áp suất xung quanh; tức ion hóa phun điện (ESI), ion hóa hóa học áp suất khí (APCI), ion hóa/giải hấp thụ laser có hỗ trợ ma trận (MALDI) ion hóa quang áp suất khí (APPI) Cho đến nay, ESI APCI sử dụng rộng rãi gạch nối LC-MS Các kỹ thuật bí truyền hơn, ion hóa điện tử (EI) ion hóa hóa học (CI) hoạt động điều kiện chân không cao với ưu điểm phù hợp với trình gạch nối GC-MS Máy quang phổ khối bốn cực thường có hai cấu hình sử dụng với sắc ký lỏng, hệ thống bốn cực đơn giản đặt song song Nguyên tắc thứ hai, máy quang phổ khối ba tứ cực, cho phép thực nghiên cứu phân mảnh ion (phép đo khối phổ song song MS/MS) Thiết bị đo phổ( cấu tạo, nguyên tắc hoạt động,ứng dụng) 3.1 Sắc kí lỏng hiệu cao HPLC Cấu tạo: Hình Hệ thống HPLC Trong đó: Bình chứa dung mơi pha động Bộ phận khử khí Bơm cao áp Bộ phận tiệm mẫu ( tay hay Autosample) Cột sắc khí (pha tĩnh) (để ngồi môi trường hay điều nhiệt) Derector (nhận tín hiệu) Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu xử lý liệu điều khiển hệ thống HPLC In liệu 3.2 Nguyên tắc trình sắc ký cột: Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký loại sắc ký Nếu pha tĩnh chất hấp thụ ta có sắc ký hấp thụ pha thuận pha đảo.Nếu pha tĩnh chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion.Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có sắc ký phân bố sắc ký chiết.Nếu pha tĩnh Gel ta có sắc ký gel hay rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích khỏi cột,chúng ta cần có pha động.Như nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C Vào cột phân tích, kết chất A,B,C Sẽ tách ra,khỏi sau qua cột.Quyết định hiệu tách sắc ký tổng hợp tương tác Tổng 03 tương tác định chất đươcj rửa giải khỏi cột trước tiên lưu giữ cột nhỏ nhất(F1).và ngược lại Đối với chất,sự lưu giữ qui định lực F1,F2,F3 Trong F1 F2 giữ vai trị định.cịn F3 yếu tố ảnh hưởng khơng lớn Ở F1 lực giữ chất phân tích cột.F2 lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột Như chất khác F1 F2 khác nhau, kết chất khác di chuyển cột với tốc độ khác tách khỏi khỏi cột.(như hình đây) 3.3 Dectector Nhiệm vụ: phát đo nồng độ chất phân tích theo tính chất hóa lý cách chuyển tín hiệu khơng điện thành tín hiệu điện.u cầu:đáp ưng nhanh lặp lại,độ nhạy cao,phát chất phân tích nồng độ thấp,vận hành ổn định,dễ sử dụng,khoảng tuyến tính rộng,ít thay đồ theo nhiệt độ tốc độ dòng 3.3.1 Dectector UV-VIS Đây loại sử dụng phổ biến sắc ký lỏng dựa hấp thụ xạ UV-VIS( bước sóng 190-800) các chất cần phân tích cấu hình củadetector hấp thụ UV-VIS Detector đo bước sóng cố định,detector đo bước sóng thay đổi,detector mảng diod UV-DAD 3.3.2 Khối phổ Phân tích xác khối lượng phân tử chất dựa chuyển động ion nguyên tử hay ion phân tử điện trường định.là kỹ thuật cao,áp dụng cho phân tích hầu hết loại chất,chất bền nhiệt hay không bền nhiệt.độ nhạy cao,có thể phát chất có LOD