Nghiên ứu đặ tính ứng dụng ủa vi khuẩn lati để sản xuất thứ ăn hăn nuôi

Hình ảnh khả năng sinh axit của một số chủng vi khuẩn 48 Hình 3.2.. Nhiều biện pháp đã được áp dụng để thay thế kháng sinh, trong số các biện pháp này là sử dụng các chế phẩm có chứa các

Nghiên cứu đặc tính ứng dụng của vi khuẩn lactic để sản xuất thức ăn

Mục lục

Trang

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

Mở đầu 1

Phần I Tổng quan 4

I.1 Tìm hiểu chung về vi khuẩn lactic 5

I.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu 5

I.1.2 Đặc điểm chung về vi khuẩn lactic 5

I.1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic 5

I.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic 6

I.1.2.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 12

I.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của qúa trình lên men lactic 15

I.1.3.1 Lên men lactic đồng hình 15

I.1.3.2 Lên men lactic dị hình 16

I.1.4 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 18

I.1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn của bacteriocin 19

I.1.4.2 Cơ chế tác dụng của bacteriocin của vi khuẩn lactic 22

I.1.5 ứng dụng của vi khuẩn lactic 23

I.1.5.3 ứng dụng trong việc baỏ vệ sức khoẻ 26

I.2 chế phẩm sinh học (probiotics) sử dụng trong chăn nuôI 28

I.2.1.Probiotic là gì? 28

I.2.2 Cơ chế tác động của probiotic 29

I.2.3 Giới thiệu một số chế phẩm sinh học ở Việt Nam và trên thế giới 31

I.2.3.1 Một số chế phẩm ở trong và ngoài nước 31

I.2.3.2 Chế phẩm vi khuẩn lactic cho chăn nuôi 31

Phần II NGUYÊN liệu và phương pháp nghiên cứu 33

II.1.Nguyên liệu 34

II.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34

II.1.2 Hoá chất 34

II.1.3 Thiết bị 34

II.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 35

II.2 Phương pháp nghiên cứu 37

II.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 37

II.2.2 Phương pháp bảo quản 37

II.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh axit 38

II.2.4 Phương pháp thử hoạt tính catalaza 38

II.2.5 Phương pháp xác định axit lactic 38

II.2.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp cấy chấm điểm 38

II.2.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán thạch 39

II.2.8 Phương pháp nhận biết bacteriocin 41

II.2.9 Các phương pháp quan sát hình thái tế bào 42

II.2.10 Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng 42

II.2.12 Phương pháp tạo chế phẩm 44

II.2.13 Xác định số lượng vi sinh vật trong chế phẩm 44

Phần III Kết quả và thảo luận 45

III.1 Phân lập vi khuẩn lactic 46

III.2 Tuyển chọn các chủng lactic có khả năng kháng khuẩn tốt 48

III.3 Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của 18 chủng vi khuẩn lactic 49

III.4 Kiểm tra khả năng sinh bacteriocin của 3 chủng đã chọn 51

III.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của NC13, TC5, TC9 56

III.5.1 Đối với chủng NC13 56

III.5.2 Đối với chủng TC5 57

III.5.3 Đối với chủng TC9 57

III.6 Định tên các chủng vi khuẩn lactic NC13, TC5, TC9 58

III.7 Khả năng sử dụng xitrat của 3 chủng 60

III.8 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng phát triển của 3 chủng trên 61

III.8.1 ảnh hưởng của nhiệt độ 61

III.8.2 ảnh hưởng của pH đến môi trường nuôi cấy 64

III.8.3 ảnh hưởng của hàm lượng muối đến môi trường nuôi cấy 65

III.8.4 ảnh hưởng của hàm lượng amoni đến môi trường nuôi cấy 66

III.8.5 ảnh hưởng của hàm lượng đường đến môi trường nuôi cấy 67

III.9 Phương pháp tạo chế phẩm 68

iv Kết luận 70

Danh môc c¸c thuËt ng÷ vµ ký hiÖu viÕt t¾t

®­îc sö dông trong luËn v¨n

C¸c lo¹i ®­êng chuyÓn sang ®u«i oza (VD: Glucoza)

C¸c lo¹i enzim chuyÓn sang ®u«i aza (VD: Proteinaza)

C¸c tõ ch­a cã phiªn ©m TiÕng ViÖt chÝnh thøc ®­îc gi÷ nguyªn gèc

(theo chuÈn TiÕng Anh) C¸c tõ cã phiªn ©m chuÈn TiÕng ViÖt ®­îc viÕt theo phiªn TiÕng ViÖt

(VD: axit)

Danh mục các bảng

Trang

Bảng 1.1 Phân loại các giống thuộc nhóm vi khuẩn lactic 6

Bảng 1.2 Nhu cầu axit amin của một số loại vi khuẩn lactic 8

Bảng 1.3 Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic 10

Bảng 1.4 Nhiệt độ phát triển của các nhóm vi khuẩn lactic 13

Bảng 1.5 Các khoảng pH của một số chủng lactic 13

Bảng 1.6 Các đặc tính bacteriocin của vi khuẩn lactic 21

Bảng 1.7 Một số thực phẩm được chế biến theo phương pháp lên men 24

Bảng 3.1 Nguồn gốc mẫu được sử dụng để phân lập 46

Bảng 3.2 Khả năng phân giải CaCO3 của các chủng vi khuẩn

46 phân lập được Bảng 3.3 Khả năng kháng L plantarum của 32 chủng đã chọn 48

Bảng 3.4 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của 18 chủng vi khuẩn 50

đã chọn được Bảng 3.5 Khả năng sinh bacteriocin của các chủng với các vi sinh vật 52

gây bệnh Bảng 3.6 Khả năng lên men các loại đường khác nhau của chủng NC13 59

Bảng 3.7 ảnh hưởng của pH ban đầu đến tốc độ sinh trưởng của 3 chủng 64

Bảng 3.8 ảnh hưởng của NaCl ban đầu đến tốc độ sinh trưởng của 3 65

chủng vi khuẩn Bảng 3.9 ảnh hưởng của (NH4)SO4 ban đầu đến tốc độ sinh trưởng

66

Bảng 3.11 Lượng tế bào vi khuẩn lactic sống sót trong chế phẩm trước 69

và sau khi sấy

Staphylococcus aureus

Hình 3.6 Khả năng kháng khuẩn của TC5 với chỉ thị S aureus 54 Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn của TC9 với chỉ thị S aureus 54 Hình 3.8 Khả năng kháng khuẩn của NC13 với chỉ thị 54

Salmonella typhimurium

Hình 3.9 Khả năng kháng khuẩn của TC5 với chỉ thị S typhimurium 55

Hình 3.13 Khả năng kháng khuẩn của TC9 với chỉ thị E coli 56

Hình 3.14 Hình ảnh khuẩn lạc chủng NC13 trên môi trường MRS 57

Hình 3.15 Hình ảnh khuẩn lạc chủng TC5 trên môi trường MRS 58

Hình 3.16 Hình ảnh khuẩn lạc chủng TC9 trên môi trường MRS 58

Hình 3.17 Khả năng sử dụng xitrat của 3 chủng vi khuẩn L plantarum TC9, L plantarum NC13, L lactic TC5 61

Hình 3.18 ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng của 62

L plantarum TC9 Hình 3.19 ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng của 63

L plantarum NC13 Hình 3.20 ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng của 63

L lactic TC5

Mở đầu

Lên men lactic đã có từ rất lâu đời và con người đã biết ứng dụng quá trình lên men này để chế biến và bảo quản thực phẩm ở khắp mọi nơi trên thế giới ở các nước Phương Tây, người ta đã biết sử dụng quá trình lên men lactic để sản xuất sữa chua, phomat, các loại thịt muối…Còn ở các nước châu Phi, ấn Độ đã

sử dụng hạt ngũ cốc lên men lactic trong bữa ăn chính hàng ngày Các nước châu

á cũng sử dụng nhiều thức ăn lên men lactic từ rau, quả, thịt cá Như Kim Chi của Triều Tiên, Nazezushi của Nhật Bản, dưa muối, nem chua của Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan

Vậy để có được những sản phẩm tuyệt vời đó là do sự tác động của các nhóm vi khuẩn hoạt động và phát triển Chủ yếu là nhóm vi khuẩn lactic Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và khẳng định rằng vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn an toàn, lành tính Hơn nữa thực tế cho thấy hàng bao nhiêu đời nay con người chúng ta ăn các sản phẩm có chứa vi khuẩn lactic đều rất tốt Vì ngoài việc sinh axit lactic làm tăng độ axit, giảm pH nó còn sinh tổng hợp ra các bacteriocin và hệ enzim phân giải protein trong cơ thể, tăng khả năng miễn dịch, tổng hợp vitamin, ức chế các vi sinh vật có hại cho cơ thể Trên cơ sở đó, ngày nay các nhà khoa học đã và đang tìm ra một hướng đi mới cho việc phát huy ưu

điểm của nhóm vi khuẩn lactic Đó là việc chế biến sản xuất thức ăn chức năng dùng cho con người và động vật Các sản phẩm này dùng cho người có tác dụng tăng cường sức khỏe, dùng cho động vật có tác dụng tăng năng xuất vật nuôi và ngăn ngừa một số bệnh do các vi sinh vật có hại trong đường ruột gây nên Mặt khác do yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng cao, kháng sinh và các

hoá chất dùng làm thức ăn bổ sung trong thức ăn cho động vật nuôi trên cạn và

động vật nuôi dưới nước được kiểm soát ngày càng chặt chẽ Khoảng 20 năm

trư-ớc đây kháng sinh dùng với một lượng rất lớn, hàng năm lượng kháng sinh sản xuất ra lên tới 27 ngàn tấn, 90% số lượng này bổ sung vào thức ăn chăn nuôi (theo International Poultry Production số 1998) Kháng sinh đã tạo ra những

dòng vi sinh vật kháng thuốc, nên loài người đã phải tốn hàng tỷ đô la để nghiên cứu và tìm ra những loại kháng sinh mới thay thế kháng sinh cũ đã mất tác dụng diệt khuẩn Ngày nay kháng sinh đã bị hạn chế sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản Bắt đầu từ năm

2006, Cộng đồng Châu Âu đã cấm sử dụng tất cả các loại kháng sinh làm thức ăn

bổ sung trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản Nhiều biện pháp đã được áp dụng để thay thế kháng sinh, trong số các biện pháp này là sử dụng các chế phẩm

có chứa các nhóm vi khuẩn có lợi, chủ yếu đó là nhóm vi khuẩn lactic Người ta gọi chung chế phẩm này với một thuật ngữ là Probiotic Vì có những đặc điểm trên Probiotic đã và đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học Có nhiều công trình nghiên cứu về Probiotic ở Mỹ, Anh, Nhật ,Hàn Quốc và đã có nhiều sản phẩm được ra đời dựa trên kết quả nghiên cứu này ở Việt Nam, thuật ngữ Probiotic cũng đã bắt đầu trở nên quen thuộc đối với các nhà khoa học tuy nhiên còn ít nghiên cứu tập trung vào vấn đề này

Với mong muốn góp phần vào việc tạo ra chế phẩm thức ăn chức năng trong đó có chứa nhóm vi khuẩn lactic để phục vụ cho chăn nuôi ở Việt Nam,

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu đặc tính ứng dụng của vi

khuẩn lactic để sản xuất thức ăn chăn nuôi"

Nội dung đề tài nghiên cứu bao gồm:

1/ Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn: tôm chua, nem chua, mắm chua, lạp xưởng, xúc xích Những chủng này có khả năng kháng khuẩn, nhất là kháng một số vi sinh vật gây bệnh trong đường ruột

2/ Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có sinh bacteriocin

3/ Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý sinh hoá của các chủng được tuyển chọn và tiến hành định tên loài

4/ Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho các chủng đã phân lập

5/ Lên men thu sinh khối vi sinh vật, tạo chế phẩm thức ăn chăn nuôi để ứng dụng

PhÇn I Tæng quan

I.1 Tìm hiểu chung về vi khuẩn lactic

I.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu

Năm 1780 Carl Wilhelm Scheele, nhà bác học Thuỵ Điển lần đầu tiên tách

được axit lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1847 Bloudean đã công nhận axit lactic (CH3CHOHCOOH) là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản ứng lên men Năm 1857, Louis Paster mới chứng minh được là việc làm chua sữa là do một nhóm vi sinh vật đặc biệt được gọi là vi khuẩn lactic Nhưng mãi đến năm 1878, Lister mới chính thức phân lập được loại vi khuẩn này và đặt tên là Bacterium lactic ( Hiện nay được gọi là Streptococcus lactic) Từ đó đến nay đã có rất nhiều

các công trình nghiên cứu thành công từ loài vi khuẩn này

Người ta tìm thấy vi khuẩn lactic trong các loại thực phẩm lên men, trên bề mặt thực vật ( ở rau quả và các loại hạt), trên da, trong tuyến nước bọt, ở niêm mạc và hệ tiêu hoá (nhất là ở đoạn ruột cuối) của người và một số gia súc, gia cầm [21]

I.1.2 Đặc điểm chung về vi khuẩn lactic

I.1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic:

Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Theo các nghiên cứu mới đây nhất, vi khuẩn lactic được xác định là một số loài trong các

Bifidobacterium, Carnobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus, Weissells [16]

Có nhiều cách để phân loại vi khuẩn lactic Có thể dựa vào hình thái tế bào

để chia ra hai nhóm : hình cầu và hình que

- Nhóm hình cầu là các giống: Aerococcus, Pediococcus…

- Nhóm hình que là giống: Lactobacillus

Ngoài ra chúng còn có thể có hình que dài hoặc ngắn, hình cầu tròn hoặc méo, có thể đứng riêng lẻ, cặp đôi hoặc xếp thành chuỗi Nên về độ dài kích thước cũng khác nhau, như: Lactobacillus plantarum có kích thước 0,7-1x3-8àm, trong khi đó Lactobacillus bulgaricus có kích thước 0,7- 0,9 x 5- 20àm, Streptococcus tế bào có thể là hình cầu và ovan đường kính từ 0,5 - 1àm, Leuonostoc có hình dài và ovan đường kính từ 0,5 - 0,8àm…

Bảng 1.1 Phân loại các giống thuộc nhóm vi khuẩn lactic [25]

I.1.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá của vi khuẩn lactic:

Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình dạng song về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất:

+Đều là vi khuẩn Gram (+)

+Không có khả năng tạo thành bào tử

+Hầu hết đều không có khả năng di động

+Có khả năng lên men lactic

+Catalaza, oxydaza và khử nitrat âm tính

+Không có khả năng tổng hợp nhân hem của các polyphyrine

+Không chứa các xitocrom

+Có thể là kỵ khí, cũng có thể là vi hiếu khí [6]

a) Nhu cầu dinh dưỡng cacbon:

Các loài vi khuẩn khác nhau thì có thể sử dụng các loại hydrat cacbon khác nhau Đây là nguồn thức ăn thiết yếu để có thể quyết định sự sinh trưởng của chúng Chúng có thể sử dụng hexoza (glucoza, fructoza, manoza, galactoza), các đường đôi (sacaroza, lactoza, maltoza) và cả các polysaccarit (tinh bột, dextrin) [6] Tuy nhiên nguồn cacbon quan trọng nhất vẫn là monosaccarit và disaccarit Nói chung vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn khó nuôi và dễ giảm họat lực, vì vậy khi nuôi cấy cần chọn các môi trường giàu chất dinh dưỡng Loại môi trường cần thiết để nuôi vi khuẩn lactic tuỳ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng nhóm vi khuẩn lactic

Thông thường người ta dùng từ 1-5% đường glucoza, ngoài ra chúng còn

đòi hỏi nguồn dinh dưỡng khác như 0,5-1% pepton hay cao nấm men Một số trường hợp khác đòi hỏi các yếu tố sinh trưởng đặc biệt, ví dụ như khuẩn gây bệnh Streptococcus đòi hỏi phải có thêm máu

Vì có một lượng lớn axit hữu cơ tạo thành (axit lactic, malic, pyruvic, fumaric, acetic…nên chúng cần phải có môi trường chứa chất đệm Mặc dù vi khuẩn lactic rất chịu axit nhưng chúng có thể chết ở môi trường không có chất

đệm, môi trường có chất đệm có thể thêm photpho hay canxi cacbonat

b) Nhu cầu dinh dưỡng nitơ:

Để sinh trưởng vi khuẩn lactic cần có các nguồn cơ chất với các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ như: pepton, cao thịt, cao men, lactabumin…[5] Vì phần lớn vi khuẩn lactic không thể tự sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, chỉ có một số ít loài có khả năng tự sinh tổng hợp các chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ

Theo E.J.Vandamme [22], dựa vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi

khuẩn lactic thành 3 nhóm dinh dưỡng chính:

- Các vi khuẩn lactic dị dưỡng amin cần hỗn hợp phức tạp các axit amin

trong môi trường ( giống Thermobacterium)

- Các vi khuẩn có thể phát triển tốt trên môi trường chỉ có xistein và

muối amoni ( giống Streptobacterium)

- Các vi khuẩn lactic tự dưỡng amin phát triển trên môi trường có nguồn

nitơ duy nhất là muối amoni ( giống Streptococcus)

Mặt khác nếu môi trường chứa quá nhiều các axit amin và protein thỉ lại ức

chế quá trình trao đổi chất của khuẩn lactic, vì các chất này tạo thành hệ keo bám

lên bề mặt tế bào làm giảm bề mặt trao đổi chất của tế bào với môi trường dinh

dưỡng [21]

Bảng 1.2: Nhu cầu axit amin của một số loại vi khuẩn lactic [6,9]

phát triển, àg/ml

Leuxin Lactobacillus arabinosus 0ữ10

c) Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic:

Cũng như cơ thể con người và động vật, vitamin đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể sống của vi sinh vật, vừa kích thích sự phát triển vừa điều hoà quá trình cân bằng năng lượng của cơ thể Vậy nên trong các môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic người ta phải bổ xung các nguồn cơ chất chứa nhiều vitamin như dịch chiết khoai tây, cà rốt, hoặc cao nấm men…Nhu cầu vitamin của các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì cũng khác nhau Ví dụ như: các loài của

Streptococcus lactic đều rất cần biotin, nhưng rất ít loài cần vitamin B6 Theo

Rogosa và cộng sự (1961) thì các axit nicotic và axit pantotenic không thể thiếu

được đối với sự phát triển của tất cả các loài thuộc giống Lactobacillus, trong khi

đó axit p-aminobenzoic và axit folic hầu như không có ảnh hưởng đến sự phát triển của giống này Dưới đây là bảng thành phần vitamin mà một số loài cần thiết [35]

B¶ng1.3: Nhu cÇu vitamin cña vi khuÈn lactic [6]

ph¸t triÓn, µg/ml

Axit

p-aminobenzoic

Lactobacillus plantarum Lactobacillus arabinosus

Axit pantotennic

(Vitamin B3)

Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

Riboflavin

(Vitamin C)

Lactobacillus casei Streptococcus lactic

Streptococcus faecalis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus delbrueckii

Tuy nhiên, nhu cầu vitamin cũng có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường

và điều kiện nuôi cấy Các yếu tố có tác động mạnh đến nhu cầu này là nhiệt độ,

pH, hàm lượng CO2 và thế oxi hoá khử của môi trường [35]

d) Nhu cầu các muối vô cơ:

Các ion kim loại như: đồng, sắt, kali, natri, mangan và magiê có vai trò quan trọng đối với sự phát triển của vi khuẩn lactic

• Mangan không những có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào

mà còn kích thích khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của vi khuẩn lactic Giải

độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy, Mn2+ có khả năng thay thế enzim dioxyl dismustaza để thải gốc O-2 ra khỏi tế bào

e) Các hợp chất hữu cơ cần thiết khác:

Các loại axit béo như axit oleic, linoleic cũng có tác dụng điều hoà sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic Chính vì điều này mà trong môi trường đặc hiệu MRS

có sự bổ xung Tween 80, là dẫn xuất của axit oleic ( polyoxyethylene sorbiton monooleate) Một vài loài vi khuẩn lactic như: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus còn cần tới các axit béo chưa no, thậm chí ngay cả khi

có mặt của Biotin trong môi trường

I.1.2.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic:

a ảnh hưởng của oxi

Vi khuẩn lactic là loài lên men yếm khí tuỳ tiện Tuy không có hệ enzim catalaza và xitocrom, nhưng nó vẫn có thể oxy hoá một vài chất nhờ vào hệ enzim oxy hoá FAD (Flavin Adenin Dinucleotit) Chẳng hạn như một số loài:

Streptococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Pediococcus spp có thể đồng

hoá glixerin trong điều kiện hiếu khí Một số vi khuẩn lại có thể khử H2O2 thành nước cùng với sự tham gia của một số chất bị oxy hoá như: Streptococcus faecalis, Streptococcus brevis, Leuconostoc mesenteroides

ảnh hưởng của oxi đôi khi còn phụ thuộc vào cả nhiệt độ Ví dụ như: một

số chủng của loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri phát triển tốt ở

300C trong điều kiện hiếu khí và yếm khí

b ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố vật lý quan trọng nhất đối với sự sinh trưởng Tốc độ của tất cả các phản ứng sinh lý, sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự ảnh hưởng rõ nét của yếu tố này, đăc biệt là phản ứng có enzim xúc tác Đây là một thông số công nghệ đáng lưu ý để khi sử dụng vi khuẩn lactic vào các mục đích ứng dụng khác nhau

Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng có thể từ 5 - 550C [27] Đa số thì phát triển ở khoảng 15 - 400C, người ta chia thành 4 nhóm vi khuẩn dựa vào nhiệt độ:

Bảng 1.4 Nhiệt độ phát triển của các nhóm vi khuẩn lactic [17]

động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là hệ enzim của chúng chịu tác động mạnh của

pH nên cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào Các giống khác nhau có một pH tối thích khác nhau

Bảng 1.5 Các khoảng pH của một số chủng lactic

3,2 – 3,5 3,5 – 4,4 5,0 4,0 – 4,6

Dựa vào pH tối thích người ta có thể chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm sinh hoá, một nhóm ưa axit (axidophilus) và một nhóm kỵ axit (axidophob)

b ảnh hưởng của hoạt độ nước

Hoạt độ nước có ảnh hưởng tới phản ứng enzim mà vi khuẩn lactic chỉ hoạt

động tốt trong một khoảng hoạt độ nước nhất định, thông thường từ 0,92 – 0,99 ở hoạt độ nước 0,92, các quá trình trao đổi chất bị đình chỉ, nhưng hệ enzim vẫn tiếp tục hoạt động cho tới khi hoạt độ nước < 0,7 Lúc này các chất dinh dưỡng không thể hoà tan trong môi trường

Tuy nhiên khả năng làm mất hoạt tính hệ enzim trong vi khuẩn lactic của hoạt độ nước phụ thuộc nhiều yếu tố như khả năng chịu đựng của chủng, tình trạng sinh lý, cơ chế thay đổi…

c ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu

Màng tế bào vi khuẩn có tính bán thấm Hoạt độ trao đổi chất qua màng tế bào phụ thuộc vào hệ enzim pecmeraza nằm trên màng tế bào và áp suất thẩm thấu của từng cơ chất có trong môi trường

Trong môi trường ưu trương, tế bào mất khả năng hút nước và các chất hoà tan xung quanh nó Khi đó tế bào ở trạng thái khô sinh lý, bị co nguyên sinh chất

và sẽ chết nếu kéo dài tình trạng này Ngược lại, trong môi trường nhược trương thì nước dễ dàng xâm nhập vào trong tế bào vi khuẩn, làm cho áp lực nội bào tăng lên, gây ức chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Tuy nhiên, do có vỏ tế bào cứng nên ở vi khuẩn không xảy ra hiện tượng vỡ màng nguyên sinh chất như

ở các tế bào thực vật [5]

áp suất thẩm thấu của môi trường tỷ lệ với nồng độ chất khô hoà tan trong môi trường Khi hàm lượng NaCl > 5% thì phần lớn các vi khuẩn lactic không phát triển, trừ Enterococcus có thể chịu hàm lượng muối lên tới 6,5% ở pH = 9,5 [18]

I.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của qúa trình lên men lactic

Qúa trình lên men bao gồm cả quá trình thu nhận năng lượng trong đó hydro được tách ra từ cơ chất chuyển đến chất nhận hữu cơ, oxy không tham gia vào quá trình lên men Tuỳ từng loại, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên men lactic xảy ra theo hai phương thức lên men đồng hình, lên men

dị hình hay kết hợp cả hai phương thức trên

I.1.3.1 Lên men lactic đồng hình (Homofermentation)

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân hủy được 95% glucoza và hexoza khác, hoặc cả một số disacarit thành axit lactic Hai phân tử axit lactic được tạo thành từ một phân tử glucoza [6,10]

C6H12O6 = 2CH3CHOHCOOH Con đường Fructoza 1-6 diphotphat ( con đường FDP hay con đường Embden – Meyerhof – Parnas viết tắt là EMP) được diễn ra tới Pyruvat Nhờ lactatdehydrogenaza mà pyruvat được khử thành axit lactic, khi đó NADH2 sinh

ra trong quá trình đường phân do sự tách hydro của glyxeraldehyt-3photphat

được chuyển trở lại thành NAD-lactatdehydrogenaza xúc tác cho việc khử pyruvat đặc hiệu lập thể Các vi khuẩn Lactobacillus có 1L(+) hoặc 1D(-)

lactatdehydrogenaza, nhưng cũng có khi có cả hai enzim chứa trong một cơ thể

Sự tạo thành hỗn hợp Raxemic của axit DL lactic thường do sự tồn tại của enzim lactat- raxemase

Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thường gặp là: Lactococcus lactic, Enterococcus fecalis, Streptococcus salivarius, S pyogenes, S cremoris,

S thermophilus, S diacetylactic, Pediococcus cerevisiae và một số vi khuẩn hình

que như: Lactobacillus lactic, L helveticus, L acidophilus, L bulgaricus, L delbruckii, L casei, L plantarum, Sporolactobacilus inulinus

I.1.3.2 Lên men lactic dị hình ( Heterofermentation)

Vi khuẩn lactic lên men dị hình cũng tạo thành axit lactic từ hexoza, ngoài

ra còn tạo thành một phần lớn các axit lactic ( 40%), ngoài ra còn có thêm các sản phẩm rượu etylic (20%), axit acetic (10%), các chất bay hơi như: etanol,

CO2 (20%) [6]

C6H12O6 = CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2 + …

Vi khuẩn lactic lên men dị hình do thiếu hai enzim chủ yếu của con đường EMP là: aldolase và triozophosphat-isomerase, nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucoza xảy ra theo con đường PP (pentose phosphats) Qúa trình chuyển hoá triozophosphat hình thành axit lactic xảy ra giống như trong lên men

Lên men đồng hình Lên men dị hình

C 6 H 12 O 6 = 2CH 3 CHOHCOOH C 6 H 12 O 6 = CH 3 CHOHCOOH + C 2 H 5 OH + CO 2 + … Glucoza Glucoza

Glucoza-6-P Glucoza-6-P

Fructoza-6-P 6-photphogluconat

Fructoza-1,6-diP Riboluza-5-P CO 2

Xyluloza-5-P

Dihydroaxeton-P Glyxeraldehyt-3-P Axetyl-P Axit acetic

1,3 di-P glyxerat Axetyl-CoA 3-P glyxerat Axetaldehyt

2 di-P glyxerat Etanol Photphoenolpyruvat

Pyruvat Lactat

Axit lactic

Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hoá glucoza thành axit lactic bằng con đường lên

men lactic đồng hình và dị hình [6]

I.1.4 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic:

Ta biết rằng, bản thân vi khuẩn lactic có thể tự kháng lại các khuẩn gây bệnh rất hữu hiệu Đây là một thế mạnh của vi khuẩn lactic và đó cũng là mối quan tâm sâu sắc của các nhà khoa học Các sản phẩm sau khi lên men như axit hữu cơ, diaxetyl, hydro peroxit, và đặc biệt là bacteriocin có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối, hỏng và mang mầm bệnh trong các sản phẩm thực phẩm

+ Axit axetic cũng là một chất ức chế mạnh đối với nhiều loại vi sinh vật sinh độc tố, các loại vi khuẩn sinh bào tử, cũng như các loại nấm mốc [17]

+ Diacetyl cũng là một sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic Nó là một trong những nhân tố tạo mùi thơm cho thực phẩm lên men như: phomat, sữa chua Diacetyl được sinh ra thông qua quá trình chuyển hoá citrat [25] Diacetyl

là chất ức chế mạnh đối với vi khuẩn và nấm mốc, nó có thể ức chế vi khuẩn

Mycrobacter turberculos, vi khuẩn Gram (-), vi khuẩn Gram (+)

+ Acetaldehit có khả năng ức chế sự sinh sản của E coli Tuy nhiên, khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của acetaldehit cũng như của etanol là rất thấp [25]

+ Trong quá trình lên men lactic dị hình khi có mặt O2 vi khuẩn có thể sản sinh H2O2 [26] Vi khuẩn lactic không có enzim catalaza để phân huỷ H2O2 được tạo thành trong quá trình trên Người ta cho rằng H2O2 có thể tích tụ và trở thành tác nhân gây ức chế đối với một số vi khuẩn khác

H2O2 cũng hoạt hoá hệ lactoperoxidaza của sữa tươi, tạo thành hypothiocyanat và các chất kháng vi sinh vật khác [36] Các vi khuẩn không mong muốn như: Pseudomonas sp, Staphylococcus aureus nhạy cảm với H2O2

gấp 2-10 lần so với các vi khuẩn lactic Chỉ cần 6 àg H2O2 /l đủ để kìm hãm sự phát triển của Staphylococcus aureus, 20àg H2O2 /l thì tiêu diệt hoàn toàn vi sinh

vật này H2O2 có khả năng ức chế một số vi khuẩn Gram (-) như: Flavobacter,

Pseudomonas, Archoromobacter [32]

+ Tác dụng kháng khuẩn của CO2 được tạo thành từ quá trình lên men lactic, có thể trực tiếp tạo môi trường yếm khí tác động lên màng tế bào và có khả năng làm giảm pH từ phía trong và ngoài tế bào Do đó, nó là độc tố đối với một

số vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm Ví dụ: Lactobacillus spp ít nhạy cảm với hàm lượng CO2 cao trong không khí, trong khi đó Pseudomonas spp lại khá nhạy cảm Sự nảy mầm của bào tử Bacillus bị ức chế còn của bào tử Clostridium lại

Trong các loại chất kháng khuẩn người ta phát hiện ra bacteriocin là chất

có tác dụng hữu hiệu nhất, đặc biệt nhất, thiết thực nhất đối với những ứng dụng trong công nghiệp cũng như cuộc sống đời thường

I.1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn của bacteriocin

Bacteriocin của vi khuẩn lactic bắt đầu được nghiên cứu từ những năm

1940 Từ đó đến nay đã có rất nhiều bacteriocin khác nhau được phát hiện 1944, Oxfort đã phát hiện ra diplococcin do Lactococcus cremoris sinh ra có khả năng

ức chế đặc hiệu các vi khuẩn Gram (+) và các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm Bacteriocin của vi khuẩn lactic là những protein mang điện tích dương, có khối lượng nhỏ từ 30-60 gốc axit amin, có tính trung tính, có điểm đẳng điện tương đối lớn, có khả năng ức chế các vi khuẩn có họ gần với các vi khuẩn sinh bacteriocin đó [28]

Hiện nay bacteriocin của vi khuẩn lactic được chia thành 4 nhóm sau:

• Nhóm I: Là nhóm Lantibiotic, là loại polypeptit có trọng lượng phân tử nhỏ (<5KDa), chứa amino axit lanthionine, β - methyllanthionine Ví dụ: Nizin, laticin 481, carnocin U149, lactocin S [31]

• Nhóm II: Gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, khối lượng phân tử nhỏ (<10KDa) Cấu trúc gấp nếp β, bền nhiệt, có thể chịu nhiệt

độ khoảng 100-1210C Các bacteriocin trong nhóm này lại được chia thành 3 nhóm nhỏ sau:

- Bacteriocin có chứa N-terminal là -Tyr-Gly-Ans-Val-Xaa-Cys- Các bacteriocin tiêu biểu của nhóm này là: Sakacin A, sakacin P, leucocin

Cho đến nay, nhóm I và II được nghiên cứu nhiều nhất và chúng cũng đa dạng nhất Dưới đây là các đặc tính của bacteriocin của vi khuẩn lactic

Bảng 1.6 Các đặc tính bacteriocin của vi khuẩn lactic

( theo De Vuyst và Vandamme, 1993) [22]

Bacteriocin Tên vi khuẩn sản xuất Phổ ức chế

Khoảng

pH hoạt

động

Trọng lượng phân tử (Da) Enzim bất hoạt

1 Lantibiotic

lactic subsp lactic ATCC

11454

Vi khuẩn Gram (+)

α-Chymotripsin, Nisinase

lactic subsp lactic NIZO

22186

Vi khuẩn Gram (+)

Lacticin 481 Lactococcus

lactic subsp lactic CNRZ

481

LAB, Clostridium tyrobutyricum

α-Chymotripsin, Ficin,

Proteinase K Lactocein S Lactobacillus

sake 145 Staphylococcus carnosus

carnobacteria, lactobacilli pediococcus, lactococci

Protease loại XIV

α-subsp cremoris

346

Chymotripsin, Trysin,

proteinase K Sakacin A Lactobacillus sake

Enterococci, Carnobacteri

a

α-Chymotripsin, Trysin,

Pepsin, Proteinase K Curvacin A Lactobacillus

curvatus LTH

1174

Lactobacilli, Carnobacteri

casei 109 Lactobacillus casei 109

3,0-9,0 4000 α-

Chymotripsin, Trysin,

Pepsin proteinase Mặc dù ở nhiệt độ , pH hay dung môi hữu cơ khác nhau nhưng một số bacteriocin vẫn giữ được hoạt tính [28], ví dụ: Plantacin bền khi bảo quản ở nhiệt

độ 4-200C, hoặc xử lý với dung môi hữu cơ như: metanol, cloroform, axetonitrit

và nhiệt độ 1000C ở 60 phút hoặc 1210C trong 10 phút hoặc bị làm lạnh tới -

200C Lactacin B, Lactacin F chịu được 1000C trong vòng 1 giờ được dùng nhiều trong sản xuất đồ hộp, nước quả [31]

I.1.4.2 Cơ chế tác dụng của bacteriocin của vi khuẩn lactic

Cơ chế tác dụng của bacteriocin là tấn công màng tế bào nhạy cảm, gây tổn thương màng tế bào và dẫn đến tế bào bị chết do nội chất bị thoát ra ngoài Sở

dĩ bacteriocin có thể tấn công tế bào vì nó ở dạng hoà tan, nên dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm mất lực đẩy proton (PMF), làm giảm thế năng của màng nguyên

sinh chất và thay đổi pH nội bào, từ đó tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục

được trên màng nguyên sinh chất Nội chất bị thoát ra ngoài theo các lỗ này Cho

dù quá trình sinh tổng hợp trong tế bào vẫn tiếp tục diễn ra nhưng nội chất lại luôn bị thất thoát Vậy nên tế bào không thể tổng hợp được màng tế bào và tế bào

bị chết [28]

Lactacin F của Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus delbruekii thì gây

thất thoát các ion kali, giảm lực đẩy proton của tế bào Enterococeus faecalis

và làm cho các ATP nội bào không thể tạo ra lực đẩy proton của tế bào nhạy cảm Còn với nizin thì gây thất thoát axit amin, ion kali, ATP và làm cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào nhạy cảm dừng lại Nizin còn có khả năng ức chế các loại vi khuẩn Gram (-) cũng như các loại sinh bào tử [28] Với hàm lượng

128 IU/ml đủ ức chế các vi khuẩn Bacillus, Clostridium và một số chủng Corynebacterium, Neisseria, Streptococcus aureur, Streptocoques Hàm lượng

nizin 100-500 IU/ml ức chế được vi khuẩn sinh độc tố như C botulinum [28]

I.1.5 ứng dụng của vi khuẩn lactic

I.1.5.1 ứng dụng trong công nghiệp

Lên men lactic được sử dụng phổ biến trong công nghiệp, đặc biệt là đối với công nghiệp sản xuất axit lactic Nó được sản xuất trong công nghiệp thuộc

da, công nghiệp dệt (làm thuốc nhuộm), trong in ấn và chế tạo chất dẻo, sơn Ngoài ra muối lactat với các nguyên tố vi lượng thường được dùng làm dược phẩm nhằm bổ xung cho cơ thể dưới dạng dễ hấp thụ [6]

I.1.5.2 ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

ứng dụng lớn thứ hai là trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là đối với công nghiệp sữa và các sản phẩm của sữa như: sữa chua, kvat, bơ, phomat và nhiều loại khác Rồi từ các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật như: thịt và các

sản phẩm thịt (jăm bông, xúc xích, nem chua, bơ chua…); các loại tôm cá lên men chua như: tôm chua, cá chua…; rồi đến các loại có nguồn gốc thực vật như: các loại rau quả muối chua hay các loại ngũ cốc lên men chua [4] [11]

Từ ngàn xưa các dân tộc đã sống bằng bột mỳ và đã biết làm bánh mỳ, nhưng đến thế kỷ thứ 18 mới biết sản xuất giống tinh khiết ( còn gọi là giống gốc cho bánh mỳ), giống gốc là giống chứa 200.000-10.000.000 tế bào vi sinh vật/gam Trong giống này chủ yếu là nấm men và vi khuẩn lactic Những giống

vi khuẩn lactic thường được sử dụng là: Lactobacillus plantarum, L brevis, L fermentum Các loài này rất có ý nghĩa trong sản xuất bánh mỳ đen [39] và giai

đoạn lên men malolactic khi sản xuất các loại rượu vang cổ truyền Chúng còn sinh ra axit axetic, etanol, CO2, mannit Chính nhờ quá trình tạo axit hữu cơ mà hạn chế được sự phát triển của các vi sinh vật phức tạp có trong bột mỳ hoặc nhiễm từ môi trường ngoài vào, đồng thời tạo ra môi trường thuận lợi cho nấm men phát triển [33]

Dưới đây là một số sản phẩm thực phẩm được chế biến theo phương pháp lên men lactic

Bảng 1.7 Một số thực phẩm được chế biến theo phương pháp lên men

lactic [11,12,13].

1.Từ sữa

Lactobacillus Kefir Lactobacillus bulgaricus

bét Streptococcus thermophilus

2 Tõ thÞt, c¸

Xóc xÝch b¸n

Lactobacillus plantarum vµ Pediococcus cerevisiae

cña

Lactobacillus plantarum vµ Pediococcus cerevisiae

hîp cña

Lactobacillus plantarum vµ Pediococcus cerevisiae

3 Tõ thùc vËt

¤ liu muèi

Lactobacillus plantarum Toµn thÕ giíi

Những thực phẩm này có ý nghĩa quan trọng, nó không những là nguồn cung cấp protein, năng lượng và vitamin mà còn là các thực phẩm truyền thống

mà mọi người đều ưa thích Để nâng cao hàm lượng protein trong khẩu phần ăn, ngoài việc khai thác hải sản phát triển chăn nuôi người ta còn tăng cường sử dụng các nguồn protein có nguồn gốc thực vật như sữa chua từ sữa đậu nành…

Người ta cũng sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết để ủ chua thức ăn gia súc [1] Lợi ích của việc làm này là tận dụng được phần lớn các phế thải, làm giảm tính thời vụ của thức ăn tự nhiên và mang lại sản phẩm chăn nuôi

có chất lượng cao

I.1.5.3 ứng dụng trong việc baỏ vệ sức khoẻ

Người ta đã phân lập và sản xuất được chế phẩm sinh học từ vi khuẩn lactic để bổ xung vào khẩu phần thức ăn của người già, em bé và người bệnh nhằm bổ xung vi khuẩn lactic trong đường ruột để kích thích và điều tiết qúa trình tiêu hoá, tiêu diệt các vi sinh vật gây nhiễm trùng , chữa chứng bệnh đầy hơi

và rối loạn tiêu hoá ở nước ta, việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm loại này

đang được đầu tư nghiên cứu nhiều Những vi khuẩn có khả năng sinh chất ức chế sinh học còn được sử dụng làm dược phẩm để chữa cho các chứng bệnh về

đường ruột như tiêu chảy, nhiễm trùng vì chúng có khả năng ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh như: Salmonella, Sarcina, Bacillus, E coli…

Khi nghiên cứu những vi khuẩn lactic phân lập từ đường ruột của người và

động vật, người ta thấy có sự khác nhau rõ rệt Những loài Lactobacillus acidophilus, L salivarius và L fermentum không thể phân lập từ thực phẩm lên

men như sữa chua, dưa muối, xúc xích…Các loài Lactobacillus cư trú trong ruột

Các vi khuẩn lactic khác nhau lọt vào cơ thể con người hay động vật thì chỉ

có những loài hay những kiểu thích hợp nhất cho vật chủ mới có thể cư trú được

ở đường ruột trong suốt quá trình tiến hoá lâu dài

a) Cơ chế tác động của vi khuẩn lactic trong ruột

Lactobacillus có tác động đến quá trình trao đổi chất của vật chủ

Gilliland và cộng sự đã lựa chọn được một số chủng thuộc loài Lactobacillus acidophilus có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có chứa mật và đồng

hoá được cholesterol in vitro và đem thí nghiệm với lợn Kết quả cho thấy sự kiềm chế tổng hợp cholesterol trong huyết thanh khi chế độ ăn có hàm lượng cholesterol cao Đối với cơ thể người, chúng tạo ra vitamin nhóm B, những vitamin này có vai trò chính trong sự tạo ra các hormon của tuyến thượng thận; giảm cholesterol và giúp cho sự cân bằng của các hormon

Bên cạnh tác động vào quá trình trao đổi cholesterol và axit mật, vi khuẩn lactic còn có vai trò làm giảm sự sản sinh ra các hợp chất nitơ có hại ở lợn cho

ăn sữa lên men bởi Lactobacillus acidophilus, lượng amin sinh ra trong ruột ít

hơn so với những con không ăn sữa ở người khi dùng Lactobacillus acidophilus trong khẩu phần ăn hàng ngày thì các enzim có khả năng gây ung thư như: β-glucoronidaza, nitroreductaza và azoreductaza cũng giảm đi

b) Tính ưu việt của cơ chế

Tác dụng có ích của sản phẩm sữa chua được Deeth và Tamine tóm tắt như sau [15]:

- Về mặt dinh dưỡng: làm phong phú thêm các peptid và các axit amino tự

do, axit lactic và enzim lactaza, nhóm vitamin B

- Về điều trị học: bảo vệ các kích thích gây rối loạn tiêu hoá, loại trừ việc nhiễm trùng đường ruột, ức chế sự phát triển các khối u tế bào

- Có tác dụng trực tiếp lên hoạt động của các tế bào và có thể làm ức chế hoạt tính của các chất gây đột biến [19]

Lactobacillus bulgaricum trong sữa chua có tác dụng ngăn cản sự hoạt

động của nhóm vi sinh vật gây thối trong ruột già của người Vi khuẩn gây thối này thường sử dụng thức ăn chưa tiêu hoá hết và tiết ra một số chất độc (indol, scatol…) Những chất này thấm qua thành ruột vào máu, tác động đến hệ thần kinh gây ra hiện tượng già trước tuổi Khi ăn sữa chua con người đã đưa một lượng lớn vi khuẩn lactic vào cơ thể, những vi khuẩn này đã phân giải lactoza thành axit lactic làm thay đổi pH của môi trường Ruột già đang ở pH kiềm thích hợp với vi khuẩn gây thối rữa, được chuyển sang pH axit kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây thối rữa

ở phần trên bộ máy tiêu hoá, vi khuẩn hiếu khí sinh trưởng và tiêu thụ hết oxy vì vậy nên càng đi xuống phần dưới môi trường càng kỵ khí và vi khuẩn kị khí càng trở nên chiếm ưu thế Bacteriocin cũng là một tương tác của vi khuẩn

Ví dụ: colixin tác động lên E coli nhưng vi khuẩn sinh ra nó không bị ảnh

hưởng, còn các vi khuẩn nhạy cảm thì colixin xâm nhập vào vị trí đặc hiệu của tế bào, phong toả sự photphoril hoá, oxi hoá và kìm hãm quá trình tổng hợp của AND, ARN và protein… để tiêu diệt tế bào vi khuẩn

I.2 chế phẩm sinh học (probiotics) sử dụng trong chăn nuôi

chủ và cải thiện chất lượng môi trường xung quanh" Probiotic còn có các tên

khác là: Probiont, Probiotic Bacteria, Beneficial Bacteria

Hầu hết probiotic được dùng như một tác nhân kiểm soát sinh học trong chăn nuôi cũng như nuôi trồng thuỷ sản thuộc về vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Carnobacterium ), Vibrio (Vibrio alginolyticus ), Bacillus và Pseudomonas

I.2.2 Cơ chế tác động của probiotic

Có nhiều nghiên cứu về cơ chế tác động của probiotic, tuy nhiên cũng có những

lý giải được chấp nhận hoàn toàn Sau đây là tóm tắt những kiểu tác của probiotic theo L Verschuere và cộng sự (2000) và Jenn-Kan Lu (2004) [23,20]

1/ Probiotic sản sinh các chất ức chế

Vi khuẩn probiotic có thể sản sinh một số hoá chất có tác dụng diệt khuẩn hay ức chế hoạt động của vi khuẩn gây bệnh dưới dạng đơn hay hỗn hợp như: kháng sinh, bacterocins, siderophores, lysozymes, proteases, hydrogen peroxid, axit hữu cơ hay diacetyl, nhờ đó ngăn chặn bệnh và hạn chế sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và năng lượng của những vi khuẩn có hại

Tác động này có thể thực hiện trên bề mặt (trên da) và trong ruột động vật chủ hay trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Các nhà vi sinh học đã đưa ra các bằng chứng sau:

+Lactobacillus sp có thể sản sinh bacteriocins là chất ức chế trưởng của vi khác, chủ yếu là vi khuẩn Gram (+)

+ Các vi khuẩn biển sản sinh enzym phân giải vi khuẩn chống lại Vibrio parahaemolyticus, V parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí Gram (-),thường

nhiễm trong hải sản và gây độc cấp tính cho người

+ Alteromonas sp phân lập từ nước biển gần bờ của Nhật Bản sản sinh

monastatin có tác dụng ức chế hoạt tính protease của Aermonas hydrophila và V

anguillarum (hai vi khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram (-) thường nhiễm trong

nước, trong đất và thực phẩm)

2/ Cạnh tranh thức ăn với những vi khuẩn khác

Tất cả các vi khuẩn đều cần có Fe để tăng trưởng Siderophores là chelat sắt ba khối lượng phân tử thấp (<1500) do vi khuẩn probiotic sinh ra và có thể hoà tan sắt kết tủa để cho vi khuẩn sử dụng, các vi khuẩn có hại không có khả này cho nên thiếu sắt cho tăng trưởng của chúng Bản thân vi khuẩn có hại bị loại

bỏ thì cũng có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh các chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn probiotic và cho con vật chủ

Cơ chế này xâỷ ra ở mô và được thực nghiệm với V anguillarum (dòng VL4335)

3/ Cạnh tranh vị trí với vi khuẩn có hại

Vi khuẩn probiotic có thể cản trở sự cư trú của vi khuẩn gây bệnh theo cơ chế tranh dành vị trí bám dính trên vách ruột hay trên bề mặt các mô khác. Vi

khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (dựa vào chất bám dính (adhesin) của vi khuẩn và các phân tử receptor của thượng bì ruột) và cơ chế không đặc trưng (dựa vào những yếu tố hoá vật lý học) Năng lực cạnh tranh bám dính và sinh trưởng trong ruột hay niêm dịch đã được chứng minh in vitro trên vi khuẩn probiotic Carnobacterium K1 đối với V anguillarum và A hydrophila

4/ Nâng cao đáp ứng miễn dịch của ruột

Kháng nguyên của probiotic kích thích tế bào niêm ruột sản sinh kháng thể chống lại bệnh Chất ức chế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả của kháng thể của con vật chủ Trong thực nghiệm người ta thấy động vật thí nghiệm được

bổ sung vi khuẩn lactic đã tăng khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm đường ruột khá rõ rệt, như đã trình bày ở trên

Ngày nay, với việc chăn nuôi ở quy mô công nghiệp, thức ăn nhân tạo cũng làm cho vật nuôi trở nên thiếu hụt một số yếu tố kháng bệnh, làm cho khả năng lây nhiễm bệnh bầy đàn rất cao Vì thế người ta cũng thấy rằng vi khuẩn lactic có trong probiotic còn góp thêm enzym cho con vật chủ cũng như cung cấp các nguyên tố đa, vi lượng cho con vật chủ, giúp con vật chủ sử dụng thức ăn hiệu quả hơn và tăng trưởng tốt hơn [37]

I.2.3 Giới thiệu một số chế phẩm sinh học ở Việt Nam và trên thế giới

I.2.3.1 Một số chế phẩm ở trong và ngoài nước

ở Việt Nam, thuật ngữ probiotic cũng đã bắt đầu trở nên quen thuộc đối với các nhà khoa học, tuy nhiên vẫn còn ít các nghiên cứu tập chung vào vấn đề này Tại Viện Công nghệ Sinh học thuộc Trung tâm Khoa học Công nghệ Đại học Quốc gia, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh đã có nghiên cứu probiotic dùng cho người từ bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis Tại Viện Sinh học Nhiệt đới - Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu chế phẩm sinh học phục vụ cho chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản, đã đưa ra được quy trình công nghệ sản xuất từ việc sử dụng bã khoai mỳ làm chất mang

Trên thế giới, đã có rất nhiều nước đã và đang sử dụng sản phẩm chế phẩm probiotic như: Mỹ, Anh, Nhật Bản, Hàn Quốc, Indonexia, Philippine…

I.2.3.2 Chế phẩm vi khuẩn lactic cho chăn nuôi

Hiện nay ngành chăn nuôi của nước ta đang ngày càng phát triển và càng

có quy mô hơn, nhiều vật nuôi như gà, lợn, bò… đã được nuôi ở quy mô công nghiệp phục vụ nhu cầu ngày càng tăng của con người Việc sử dụng chế phẩm probiotic có chứa vi khuẩn lactic vào thức ăn chăn nuôi chính là cách tự nhiên giúp cân bằng khu hệ vi sinh vật trong đường ruột của vật nuôi, tăng cường sức

Vi khuẩn lactic qua quá trình lên men được trộn với chất mang là tinh bột gạo, bột mỳ, bột ngô…sấy khô ở nhiệt độ 35-400C tới độ ẩm 12-13%, bảo quản ở 40C