Tóm tắt: Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.

Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.

Xanthomonas oryzae pv oryzae BẰNG DỊCH

TRÍCH CỎ CỨT HEO Ageratum conyzoides L

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT

MÃ SỐ 62 62 01 12

2023

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn: PGS.TS Trần Thị Thu Thủy

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ

sở

Họp tại: Phòng bảo vệ luận án tiến sĩ, lầu 2, nhà điều hành, trường Đại học Cần Thơ Vào lúc 8 giờ ngày 25 tháng 6 năm 2023

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Hồng Sơn

Phản biện 2: PGS TS Lê Văn Vàng

Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng

PGS.TS Trần Vũ Phến

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC NHỮNG BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

1.Mai Như Phương, Trần Thị Thu Thủy, (2023) Phân lập và tuyển

chọn các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh

cháy bìa lá lúa tại tỉnh Bạc Liêu Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật Số

3.Mai Như Phương, Trần Thị Thu Thủy, (2023) Đánh giá khả năng

kháng khuẩn của Ageratum conyzoides L ức chế vi khuẩn Xanthomonas

oryzae pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa, Tạp chí Khoa học và công

nghệ Đại học Thái Nguyên 228(09): 95-101

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của luận án

Việt Nam là một trong những quốc gia có sản lượng xuất khẩu gạo hằng năm đứng thứ 2 – 4 trong số các nước xuất khẩu lúa gạo trên thế giới, sau Thái Lan (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Theo thống kê của Chi Cục Trồng Trọt và Bảo vệ Thực Vật Bạc Liêu năm 2021, bệnh cháy bìa

lá nhiễm nặng vào vụ Hè Thu với diện tích trên 25.000 ha Theo Ou

(1985) và Liu et al (2014), bệnh cháy bìa lá gây hại nặng vào thời điểm

mưa nhiều có thể giảm sản lượng lúa đến 30% - 75% năng suất Để quản lý bệnh cháy bìa lá lúa, hầu hết nông dân ở ĐBSCL nói chung và ở Bạc Liêu nói riêng vẫn phụ thuộc nhiều loại thuốc hóa học Việc lạm dụng thuốc trong sản xuất nông nghiệp đã đến mức đáng báo động gây ảnh hưởng đến chất lượng lúa gạo Một trong những biện pháp thân thiện môi trường là nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng Tại Việt Nam có nhiều nghiên cứu về bệnh cháy bìa lá lúa bằng kích kháng như Nguyễn Tuyết Minh (2009) đã dùng ba loại dịch trích

chống lại bệnh cháy bìa lá (Xanthomonas oryzae pv oryzae) Sau đó,

Nguyễn Văn Tứ (2011) đã quản lý bệnh cháy bìa lá lúa lá

(Xanthomonas oryzae pv oryzae) bằng sử dụng dịch trích cỏ cứt heo ở

ngoài đồng Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào khảo sát cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa bằng dịch trích cỏ cứt heo Vì vậy,

đề tài “Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá do vi

khuẩn (Xanthomanas oryzae pv oryzae) trên lúa bằng dịch trích cỏ cứt heo Ageratum conyzoides L.” được thực hiện với mục tiêu nhằm xác

định nồng độ và cách thức áp dụng dịch trích cây cỏ cứt heo để kiểm soát bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng trên giống lúa RVT tại tỉnh Bạc Liêu Đồng thời cũng xác định sự gia tăng hoạt tính của một số emzyme liên quan đến sự kích kháng

1.3 Mục đích nghiên cứu

Xác định nồng độ và biện pháp xử lý dịch trích cỏ cứt heo có khả

năng giúp hạn chế bệnh cháy bìa lá lúa (Xanthomonas oryzae pv

oryzae) và sự gia tăng hoạt tính của một số emzyme liên quan đến sự

kích kháng chống lại bệnh cháy bìa lá lúa tại Tỉnh Bạc Liêu

1.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập và đánh giá khả năng gây hại của các chủng

vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa

Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế của dịch trích cỏ cứt heo đối

với vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa và ảnh hưởng của dịch trích cỏ cứt heo đến sự mọc mầm của hạt lúa Trong điều kiện nhà lưới, nghiên cứu cũng tìm ra nồng độ và phương pháp xử lý mang lại hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá lúa

Nội dung 3: Khảo sát sự gia tăng hoạt tính của một số emzyme

liên quan đến sự kích thích tính cây trồng kháng bệnh cháy bìa lá lúa

Nội dung 4: Đánh giá khả năng hạn chế bệnh cháy bìa lá lúa của dịch

trích cỏ cứt heo trong điều kiện ngoài đồng

1.5 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

1.5.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae, dịch trích cỏ cứt heo Agertum conyzoides L

1.5.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi nghiên cứu của luận án được thực hiện thu thập mẫu bệnh vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá ngoài đồng ở Bạc Liêu, sau đó thực hiện phân lập và tuyển chọn vi khuẩn triển vọng trong điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện nhà lưới

Đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn X oryzae pv oryzae gây

bệnh cháy bìa lá trên giống lúa RVT trồng phổ biến tại Bạc Liêu Đánh giá khả năng ức chế của dịch trích cỏ cứt heo đối với vi khuẩn cháy bìa lá lúa

Đánh giá khả năng gây hại của chủng vi khuẩn gây hại nặng trên một số giống lúa

Xác định nồng độ và biện pháp xử lý của dịch trích cỏ cứt heo

(Ageratum coinyzoides) trong điều kiện nhà lưới

Đánh giá hiệu quả của dịch trích cỏ cứt heo đối với bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng

Khảo sát cơ chế liên quan kích kháng của dịch trích cỏ cứt heo như hoạt động enzyme PAL, PPO, CAT trong điều kiện phòng thí nghiệm

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.6.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án là công trình nghiên cứu có giá trị khoa học có tính hệ thống tốt từ phòng thí nghiệm đến ngoài đồng về sử dụng dịch trích cỏ cứt heo để quản lý bệnh cháy bìa lá lúa Các số liệu của luận án được thu thấp đầy đủ và thống kê rõ ràng chính xác Kết quả công trình nghiên cứu là cơ sở cho bài giảng của các trường Đại học

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf blight disease)

2.1.1 Tình hình và mức độ gây hại của bệnh cháy bìa lá lúa

Ở Việt Nam, bệnh cháy bìa lá lúa xuất hiện và gây hại đáng kể từ năm 1965 – 1966 Ở ĐBSCL, bệnh cháy bìa lá xuất hiện rất nặng vào năm 1978 đến năm 1979, bệnh gây hại từ trung bình đến nặng chiếm khoảng 90% diện tích vụ Hè Thu tại các huyện Châu Thành, Ô Môn, Thốt Nốt (Cần Thơ), Kế Sách, Thạnh Trị (Sóc Trăng) (Lê Thị Thủy, 1980) Theo Viện Bảo Vệ Thực Vật cho biết trên giống lúa IR8, cây lúa nhiễm bệnh với mức độ là 20 – 40% thì tỷ lệ hạt lép là 15%, trọng lượng

1000 hạt là 29,3 gram và năng suất đạt được là 5,62 tấn/ha Trên diện tích lúa mùa cấy giống NN8 bị bệnh ở mức độ 60% – 100%, giảm năng suất từ 30 – 60% (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) Bệnh thường phát triển ở giai đoạn lúa nảy chồi tối đa hay có đòng, nên làm tăng số hạt lép, hạt lửng và giảm phẩm chất, trọng lượng hạt, đồng thời làm tăng

tỷ lệ tấm khi xay xát Bệnh cũng làm giảm lượng đạm và protein thô trong hạt (Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993)

2.1.2 Triệu chứng bệnh

Triệu chứng thường gặp nhất của bệnh là triệu chứng cháy bìa lá

mà trong đó điển hình là vết cháy dọc theo 2 bên bìa của lá lúa, rồi lan dần vào gân chính của lá Vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào lá lúa qua các thủy khẩu dọc theo rìa lá nên vết bệnh có thể bắt đầu từ rìa lá lan dần vào bên trong (Phạm Văn Kim, 2016) Tuy nhiên, một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá, vết bệnh tạo những mép viền hình sóng mô bệnh xanh tái rồi trở nên vàng trong vài ngày cuối cùng cháy khô có màu nâu xám Các vết bệnh có thể phát sinh trên một hoặc cả hai rìa lá Bệnh tiến triển các vết bệnh lan rộng phủ kín cả hai mặt lá, khi đẫm nước vết bệnh sẽ lan dài ra và có những vệt màu vàng và phát triển dần ra tạo thành màu vàng xám hoặc xám khô chạy theo 2 rìa lá (Agrios, 2005) Ở các nước nhiệt đới, trong lúc cấy người ta

cắt chóp lá mạ Các lá bị cắt chóp thường bị bệnh đầu tiên Triệu chứng bệnh xuất hiện sớm nhất là vết bệnh dạng thấm nước màu xanh ở ngay dưới bề mặt vết cắt sau đó nhanh chóng chuyển màu xanh xám nhạt Toàn bộ lá bị cuộn lại và héo, tiếp đến bẹ lá cũng bị héo Vi khuẩn truyền theo mạch xylem đến đỉnh sinh trưởng của cây non và nhiễm bệnh cho các lá khác, dẫn đến cây non bị chết toàn bộ Trong các giai đoạn sớm, khi chỉ có một vài lá già bị héo

và trông như bị nổi trên mặt nước Ở Java của Indonesia người ta gọi đó là bệnh “Kresek”(Ou, 1985) Triệu chứng Kresek là triệu chứng nghiêm

trọng nhất và gây khô chồi (Jambhulkar et al., 2014) Kresek cho thấy

sự phá hủy nhiều hơn với các triệu chứng biểu hiện là màu vàng nhạt, héo trong giai đoạn từ cây con đến nảy chồi (Mew, 1993)

2.2 Khái niệm về kích kháng

Kích thích tính kháng thường được gọi tắt là “kích kháng”, là sự kích thích để tạo ra tính kháng bệnh của thực vật Hiện tượng này giúp giống cây trồng bị nhiễm trở nên có khả năng kháng được bệnh ở mức

độ nào đó sau khi xử lý chất kích kháng Phương pháp kích kháng không có tác dụng loại trừ trực tiếp mầm bệnh như những thuốc trừ dịch hại mà dựa trên sự kích thích của những cơ chế tự nhiên của cây trồng Chất kích kháng có thể là một loài vi sinh vật không gây bệnh, không mang tính độc đối với cây trồng hoặc có thể là một loại hóa chất nào đó không độc và không có tác động trực tiếp diệt mầm bệnh như những hóa chất được dùng trong nông dược (Phạm Văn Kim, 2002) Dịch trích

thực vật là một nhóm các chất được trích ra từ các bộ phận khác nhau

của cây trồng có chứa rất nhiều hợp chất có thể có tính kháng với vi sinh vật gây bệnh Các hợp chất này có thể thu được từ rễ, vỏ, hạt, chồi, lá và trái cây (Davidson, 1997) Dịch trích thực vật của một số loài cây đã được chứng minh là có hiệu quả như là những chất mồi cho các phản

ứng kháng bệnh ở cây (Llorens et al., 2017)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Thời gian: từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 12 năm 2022

Địa điểm: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại Học Cần Thơ Huyện Phước Long và Hồng Dân tỉnh Bạc Liêu

3.1 Dụng cụ thiết bị: Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm là chậu lớn

(nhỏ) nhựa, ống nghiệm, đĩa Petri (đường kính 9 cm), đũa vạch vi khuẩn, lame, lamel, bình tam giác, chai thuỷ tinh, đèn cồn, kim mũi giáo, kéo, kẹp, ống hút (pipette) Một số thiết bị dùng trong thí nghiệm

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây hại của các

chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá

lúa trên giống lúa RVT

Mục tiêu: Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa

nặng nhất trên giống lúa RVT Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên mỗi nghiệm thức là chủng vi khuẩn Mỗi lặp lại là một chậu lúa với 3 cây (chồi) được lây bệnh, mỗi chồi 3 lá trên cùng được lây bệnh

Chuẩn bị lúa: Ngâm hạt trong nước ấm (khoảng 540

C – 2 sôi 3 lạnh) trong 15 phút Khử trung bằng NaOCl 2,63% trong 30 phút và sau

đó rửa 3 - 5 lần bằng nước vô trùng (Ella et al., 2011) Hạt giống được

ủ trong đĩa Petri có lót giấy thấm vô trùng và duy trì ẩm độ bằng nước cất vô trùng cho hạt nứt nanh Lúa được trồng trong chậu với 1,5 kg đất khô (tương ứng 2,04 kg đất ở ẩm độ 36%) Mỗi chậu gieo 5 hạt Lúa sau trồng được chăm sóc và bón phân theo công thức của Nguyễn Ngọc Đệ (2008): 120N – 40P2O5 – 30K2O Lây bệnh nhân tạo: Lúa 45 ngày

tuổi được sử dụng lây bệnh nhân tạo theo phương pháp cắt chóp lá (Leaf-clipping method) của Kauffman (1973) bằng cách nhún mũi kéo vào huyền phù vi khuẩn đã chuẩn bị sẵn (OD600nm=0,3) và cắt chóp lá

một đoạn khoảng 2-3 cm trên lá trưởng thành của chồi, mỗi chồi cắt 3 lá

trên cùng và mỗi chậu cắt 3 chồi Chậu lúa sau khi đã lây bệnh được bao

phủ bằng bọc kiếng trong (kích thước 40*60 cm) và ủ tối ở 25°C trong

24 giờ ở điều kiện phòng ủ bệnh (nhiệt độ: 250C, ẩm độ 90%) Ghi

nhận chỉ tiêu: Chiều dài vết bệnh tính phần trăm tỷ lệ chiều dài vết

bệnh theo công thức (Gnanamanickam et al (1999)

Ghi nhận các chỉ tiêu bệnh : +Tỷ lệ (%) chiều dài vết bệnh (TLCDVB)

TLCDVB = (Chiều dài vết bệnh/chiều dài lá)*100

Chỉ số bệnh: Thang đánh giá cấp bệnh theo Ezuka và Horino (1972) Bảng 3.1: Thang đánh giá cấp bệnh theo Kauffman (1973)

Từ đó tính ra chỉ số bệnh theo công thức: Y(%)=(a1*X1+a2*X2+…+anXn)/PN*100 Trong đó: Y(%): Chỉ số bệnh; A1.….an: Số lá bệnh ở cấp 1,…,n; X1…Xn: Cấp bệnh 1,…n; P: Tổng số lá quan sát; N: Cấp bệnh cao nhất trong thang đánh giá

3.2.2 Đánh giá khả năng gây hại của chủng vi khuẩn BL36 trên một

số giống lúa phổ biến tại tỉnh Bạc liêu

Mục tiêu: Xác định mức độ gây bệnh của chủng vi khuẩn BL36

trên 5 giống lúa được trồng phổ biến tại Bạc Liêu Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 5 nghiệm thức là 5 giống lúa Jasmine 85, RVT, OM18, OM5451, Đài thơm 8 với 3 lặp lại Chuẩn bị lúa lây bệnh: tương tự thí nghiệm 3.2.1 Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn: tương tự thí nghiệm 3.2.1 Lây bệnh nhân tạo: tương tự thí

3 Chiều dài vết bệnh <1/4 chiều dài lá

5 Chiều dài vết bệnh từ 1/4- 1/2 chiều dài lá

7 Chiều dài vết bệnh >1/2 chiều dài lá

9 Chiều dài vết bệnh bằng chiều dài lá hoặc gây lá chết

nghiệm 3.2.2.1 Chỉ tiêu ghi nhận: Tỷ lệ (%) chiều dài vết bệnh tương tự thí nghiệm 3.2.1 vào thời điểm 7 NSLB và 14 NSLB

3.2.3 Xác định nồng và biện pháp xử lý dịch trích cỏ cứt heo

(Ageratum conyzoides L.) có hiệu quả kích kháng cây lúa chống lại

bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới

3.2.3.1 Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae của dịch trích cỏ cứt heo

Mục tiêu: Xác định khả năng ức chế trực tiếp của các nồng độ

dịch trích khác nhau lên vi khuẩn BL36 Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiệm thức và 5 lần lặp lại Tương ứng với, 5 nồng độ dịch trích cỏ cứt heo 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, một

nghiệm thức đối chứng (0%), 1 nghiệm tức thuốc Starner 20WP Chuẩn

bị dịch trích cỏ cứt heo: Ly trích phương pháp ly trích dịch trích theo

Trần Thị Thu Thủy và ctv (2015) (nồng độ dịch trích = trọng lượng lá/ lượng nước cần ly trích, 100 g cỏ cứt heo tươi thì sau khi sấy khô ẩm độ 60% thì còn 20g) Các bộ phận của cây cỏ cứt heo gồm thân và lá được thu thập vào sáng sớm Cân mẫu và rửa sạch phần thân lá của cỏ cứt heo dưới vòi nước Sau đó dùng máy xay sinh tố nghiền nhỏ các bộ phận để thu dịch trích với dung môi nước cất ở nhiệt độ phòng, sau đó lược qua vải the được xếp thành nhiều lớp ở các nồng độ Dịch trích thực vật sau khi pha được thanh trùng bằng cách lọc qua màng lọc vi khuẩn có kích thước ø = 0,2 µm (lọc nhỏ nhất dành cho vi khuẩn) trong điều kiện vô

trùng Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn: Tương tự 3.2.1 Thực hiện thí

nghiệm: Theo phương pháp khuếch tán đĩa của De Zoysa et al (2019)

cụ thể như sau: Hòa tan 1 ml vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

có mật số 109 cfu/ml vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường Wakimoto 1,6% agar đã nấu tan và giữ ở nhiệt độ khoảng 500

C, lắc nhẹ

để vi khuẩn được trộn đều vào môi trường, đổ nhanh vào đĩa Petri vô trùng, tráng đều để tạo bề mặt phẳng của môi trường khi đặc lại Các khoanh giấy có đường kính 6 mm, được thấm dịch trích thực vật dùng làm thí nghiệm được đặt vào đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh theo

các điểm đã được đánh dấu (ba khanh giấy thấm trên đĩa) Sau đó, các đĩa Petri được ủ ở điều kiện nhiệt độ 280

C- 300C Quan sát sau 48, 72 và

96 giờ cho đến khi thấy môi trường đục và có vòng vô khuẩn xuất hiện

rõ thì có thể đánh giá kết quả Các chỉ tiêu ghi nhận: Đo đường kính

vòng vô khuẩn tại các thời điểm 48, 72 và 96 giờ sau khi xử lý

3.2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của dịch trích cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides L.) lên sự phát triển của rễ mầm và diệp tiêu

Mục tiêu: Xác định sự ảnh hưởng của các nồng độ dịch trích cỏ

cứt heo lên sự phát triển của rễ mầm và diệp tiêu.Thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức với 5 lần lặp lại mỗi nghiệm thức tương ứng với 1 mức nồng độ khác nhau 2%, 4%, 8 %, 1 đối chứng nước cất

vô trùng, 1 nghiệm thức thuốc Staner 20WP Thực hiện thí nghiệm:

Cân 25 g hạt lúa cho mỗi nghiệm thức và khử trùng theo phương pháp

3.2.1 và ngâm hạt trong 100 ml dịch trích thực vật trong 24 giờ (đối với các nghiệm thức ngâm dịch trích) hoặc áo với 2 ml dịch trích trong 1 giờ, sau đó ủ hạt trên đĩa Petri có lót giấy thấm tẩm nước cất thanh trùng Đối với nghiệm thức đối chứng được ngâm ủ với nước cất Hạt lúa vô trùng sau khi xử lý với dịch trích được trải ra đĩa Petri có sẵn giấy thấm vô trùng và duy trì ẩm độ bằng nước cất vô trùng với 4ml/ đĩa Sau

đó đĩa Petri được ủ trong điều kiện chiếu sáng tối xen kẽ (12 giờ sáng và

12 giờ tối) ở 250

C Chỉ tiêu ghi nhận: Tiến hành đo chiều dài rễ mầm

và diệp tiêu vào các thời điểm 48, 72 và 96 giờ sau khi xử lý

3.2.3.3 Xác định nồng độ và biện pháp xử lý dịch trích cỏ cứt heo cho hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà lưới

Mục tiêu: Xác định nồng độ và biện pháp xử lý cỏ cứt heo cho

hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá lúa cao nhất Thí nghiệm được bố trí

theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố (nhân tố A nồng độ dịch trích và nhân tố B biện pháp xử lý) với 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 chậu với 5 cây (Chậu C7: 15*14 cm) có chứa sẵn một 1,5 kg đất khô (tương ứng 2,04 kg đất ở ẩm độ 36%) Nhân tố A (Nồng độ dịch trích):

Ba nồng độ dịch trích được sử dụng 2%, 4%, 8% và đối chứng nước cất

vô trùng Nhân tố B (Biện pháp xử lý): Năm biện pháp xử lý tương ứng là: 1 Ngâm hạt bằng dịch trích cỏ cứt heo; 2 Áo hạt bằng dịch trích cỏ cứt heo; 3 Phun dịch trích cỏ cứt heo ở thời điểm lúa 25 ngày; 4 Phun dịch trích cỏ cứt heo ở thời điểm lúa 35 ngày; 5 Phun kết hợp phun dịch

trích cỏ cứt heo ở thời điểm lúa 25 +35 ngày Chuẩn bị hạt lúa vô

trùng tương tự 3.2.1, chuẩn bị dịch trích cỏ cứt heo, chuẩn bị huyền phù vi khuẩn: Tương tự như thí nghiệm 3.2.3.1 Ghi nhận chỉ tiêu: Tỷ

lệ bệnh được tính theo công thức, Tỷ lệ bệnh (%) = số lá nhiễm bệnh/tổng số lá*100, cấp bệnh được đánh giá theo Kauffman (1973) và chỉ số bệnh được tính theo công thức tương tự như ở thí nghiệm 3.2.1 Hiệu quả giảm bệnh dựa vào tỷ lệ bệnh được tính theo công thức Abbott (1925): HQGB (%) = ĐC-NT/ĐC*100 HQGB: Hiệu quả giảm bệnh; ĐC: Đối chứng; NT: Nghiệm thức

3.2.3.4 Đánh giá hiệu quả của dịch trích cỏ cứt heo đối với bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà lưới

Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của biện pháp kết hợp của nồng độ

và biện pháp xử lý của dịch trích cỏ cứt heo trong điều kiện nhà lưới

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố (nhân tố A nồng độ xử lý và nhân tố B biện pháp xử lý) với nhân tố A nồng độ 2%, 4%, đối chứng nước cất vô trùng và nhân tố B biện pháp xử lý là: 1 Ngâm kết hợp phun 25 ngày sau khi gieo; 2 Ngâm kết hợp phun 25+35 ngày sau khi gieo; 3 Áo hạt kết hợp phun 25 ngày sau khi gieo; 4 Áo hạt kết hợp phun 25+35 ngày sau khi gieo Mỗi

nghiệm thức 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 chậu Cách lấy chỉ tiêu: Chỉ

tiêu ghi nhận vào thời điểm 7 và 14 ngày sau khi chủng bệnh Trước khi chủng ta tiến hành đánh dấu lá (lá thứ 5 trên cùng nở hoàn toàn) Ghi nhận tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh và hiệu quả giảm bệnh tương tự như thí nghiệm 3.2.1

3.2.4 Khảo sát hoạt tính enzyme có liên quan đến tính kháng chống bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích cỏ cứt heo

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn

toàn ngẫu nhiêm gồm 4 nghiệm thức 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 chậu lúa gồm 10 cây lúa Nghiệm thức 1: Đối chứng-không chủng bệnh Nghiệm thức 2: Kích kháng- không chủng bệnh Nghiệm thức 3: Đối

chứng- có chủng bệnh Nghiệm thức 4: Kích kháng-có chủng bệnh Thu

mẫu phân tích: Sau khi lây bệnh nhân tạo tiến hành thu mẫu lá tại các

thời điểm khảo sát Mẫu lá lúa được thu vào các thời điểm 0, 12, 24, 48,

72 giờ sau khi lây bệnh (GSLB) và 5, 7 ngày sau khi lây bệnh (NSLB) bằng cách dùng kéo cắt toàn cây lúa, sau đó đông lạnh ngay với nitơ lỏng và trữ trong điều kiện lạnh ≤ -800C trước khi phân tích enzyme Mẫu được dùng chung cho các thí nghiệm từ 3.2.4.1-3.2.4.3

3.2.4.1 Khảo sát sự gia tăng hoạt tính enzyme Phenylalanine ammonia lyase

Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính enzyme phenylalanine ammonia

lyase (PAL) trong mô tế bào cây lúa Ly trích mẫu: Mẫu nghiền với

nitơ lỏng và ly trích bằng dung dịch đệm buffer (25 mM Tris HCl, pH

8,8 + 32 mM β-mercaptoethanol), ly tâm Ƣớc lƣợng protein trong

mẫu: được ước lượng bằng đường chuẩn protein BSA (Bovine serum

albumin) gồm hàm lượng BSA (0 - 7 µg/µl) và thể tích Bradford tương ứng để đạt 260 µl/giếng ở bước sóng 595 nm Tiến hành đo hàm lượng protein bằng cách kết hợp các giếng chứa mẫu (5 µl dịch trích mẫu +

255 µl Bradford) với đường chuẩn BSA, được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 595 nm

Phân tích enzyme PAL: Đường chuẩn cinamic acid (CA) được

xây dựng gồm hỗn hợp: Tris HCl 25 mM với pH 8,8 (100 µl/giếng); Tris HCl 100 mM với pH 8,8 (125 µl/giếng); chuẩn bị dung dịch stock

CA 20 mM, thực hiện rút với thể tích tăng dần 0-6 µl qua các giếng (tương ứng nồng độ đường chuẩn 0-0,12 mM CA/µl) và thể tích Tris HCl 25 mM + β-mercaptoethanol 32 mM tương ứng để đạt 250

µl/giếng, thực hiện lặp lại 2 lần Sau 1 giờ ủ ở 400C, ngừng phản ứng bằng 15 µl HCl 5N và đọc ở bước sóng 290 nm để xác định đường chuẩn CA Hoạt tính enzyme PAL trong mỗi giếng được xác định với hỗn hợp phản ứng gồm 25 µl dịch trích enzyme, 125 µl substrate (L- phenylalanin 50 mM trong Tris HCl 100 mM, pH 8,8), 100 µl Tris HCl

25 mM (pH 8,8, không chứa mercaptoethanol) Tương ứng với mỗi giếng trên là giếng mẫu blank gồm 25 µl dịch trích enzyme và 225 µl Tris HCl 25 mM, thự hiện đo lặp lại 2 lần/mẫu Tiếp tục, ủ ở 400

C trong

1 giờ, ngừng phản ứng bằng 15 µl HCl 5N, tiến hành đọc phản ứng trên máy ELISA ở bước sóng 290 nm Qua công thức: (mM của CA x 1000)/(µg của protein x 1 giờ)

Hàm lượng enzyme PAL =

3.2.4.2 Khảo sát sự gia tăng hoạt tính của enzyme Peroxidase: Hoạt

tính enzyme peroxidase được xác định theo mô tả của Kapchina và Yakimova (1997) Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,25 % guaiacol và 10

mM H2O2 được hòa tan trong kali photphat 0,1 M (pH 7,0) Chiết xuất protein 5µl được thêm vào từng giếng của tấm ELISA và phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 225 µl hỗn hợp phản ứng Sự tăng độ hấp thụ ở bước sóng 470 nm là do tạo thành sản phẩm có màu tetraguaicol trong

10 phút 20 giây đo 1 lần Hoạt tính peroxidase được tính theo µmol sản phẩm dehydroguaicol mg-1

protein second-1

3.2.4.3 Hoạt tính enzyme Catalase: Hỗn hợp phản ứng bao gồm 30ml

potassium phosphate buffer 50 mM và 30µl H2O2 Chiết xuất protein 5µl được thêm vào từng giếng của tấm ELISA và phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 225µl hỗn hợp phản ứng Hoạt tính của enzyme được đo bằng đầu đọc ELISA ở bước sóng 240 nm trong 10 phút 20 giây đo một lần Hoạt tính enzyme catalase được tính với theo µmol sản phẩm mg-1

protein second-1