Nghiên ứu sử dụng enzyme từ nấm mốc aspergillus ozyzae để thu peptide từ bã đậu nành

Trang 1 MẠC THẾ VINHBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- Họ và tên tác giả luận văn Trang 3 1 M C LỤỤCDANH M C HÌNH NH .... Enzyme pr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Họ và tên tác giả luận văn

“Nghiên cứu sử dụng enzyme từ nấm mốc Aspergillus oryzae để thu peptide từ

1

M C L Ụ Ụ C

DANH M C HÌNH NH 5

DANH M C B NG 7

L I C 9

PH N I T NG QUAN 12

1.1. Gi i thi u v u nành 12

1.1.1 u nành 12

1.1.2.Thành ph ng 12

1.2. Tình hình s n xu t s u nành 16

1.2.1 Quy trình s n xu t s u nành [7] 17

1.2.2 u nành 18

1.3 Enzyme protease 20

1.3.1.Khái ni m: 20

1.3.2 Phân lo i: 21

1.3.3 M t s y u t n kh y phân c a protease

1.4. u nành s d ng n m m c Aspergillus oryzae 2

1.4.1 N m m c Aspergillus oryzae 23

1.4.2 y n m m c s n xu t enzyme [9]

1.4.3 M t s y u t n quá trình sinh t ng h p enzyme protease c n m m c Aspergillus oryzae trong nuôi c y b m t [9] 24

PH N 2: V T LI U 2

2.1 V t li u nghiên c u 28

2

2.1.1 u nành và b t m 28

2.1.2 N m m c Aspergillus oryzae 28

2.1.3. Hóa ch t 28

2.1.4. Thi t b 28

2.2. u

2.2.1 m nguyên li u [5] 29

2.2.2 nh protein hòa tan b

2.2.3 nh ho protease b [5] [6] 32

2.2.4 nh acid amin trong d ch sau th y phân b ng nin [5] 35

2.2.5 ng tinh b t b c 2.2.6 ng s b 2.2.7 ng peptide b 2.2.8 nh ho t tính ch ng oxy hóa b ng DPPH (Bijoy M 2008)[13] 43

2.2.9 y truy n vi sinh v t 4

2.2.10 ng vi sinh v t b m khu n l c [3] 2.3. nghiên c u th u nành b ng protease t Aspergillus oryz 48

2.3.1 n 1: Kh o sát các y u t n quá trình nuôi c m c t o h enzyme protease có ho : 48

3

u nành b ng protease t Aspergillus oryzae 49

2.3.3 n 3: Ti n hành kh u ki n th u 50

PH N 3: K T QU VÀ TH O LU N 51

3.1. Thành ph n nguyên li u: 51

3.1.1 u nành: 51

3.1.2 sung 5% b t mì:

3.2. Nghiên c u ng c u ki n nuôi c y A.oryzae n ho prot 52

3.2.1 ng c a thành ph ng nuôi c y

3.2.2 ng c ng

3.2.3 ng c a nhi nuôi c y 54

3.2.4 ng c a th i gian nuôi c y 55

3.2.5.Nghiên c u t l n m m c gi c s d ng 56

3.3 Nghiên c u ng c a các y u t n kh protease t A.oryzae 57

3.3.1 ng c ng th y phân

3.3.2 ng c a nhi th y phân 58

3.3.3 ng c a th i gian th y phân 59

3.3.4 ng peptide và kh ng oxi hóa c a m ki n th n 6 3.4. Nghiên c u ki n th

4

3.4.1. Kh o sát ho enzyme protease khi nuôi c y A.oryzae

u 61

3.4.2.Kh o sát u ki n th y phân t ng acid am hòa tan và ho t tính ch ng oxi hóa c a s n ph ng 500g 3.4.3 ng peptide c a m u sau khi th ki n th n 6

PH N 4: K T LU N VÀ KI N NGH 66

4.1 K t lu n: 66

TÀI LI U THAM KH O 68

PH L C MÔ T K T QU PHÂN TÍCH 71

PH L NH THÀNH PH N NGUYÊN LI U 71

PH L NH HO NUÔI C Y M U 73

PH L NH KH PHÂN B NG ENZYME PROTEASE 78

PH L C 4: NUÔI C Y N M M C A.ORYZAE U 500G 82

5

DANH M C HÌNH Ụ Ả NH

Hình 1 quy trình s n xu t s u nành nhà máy Vinasoy B c Ninh

th ng chu n albumin

th ng chu n Tyrosin

ng chu n Glutamic 37

ng chu n L-glutathione 42

n ng v i DPPH

nghiên c u thu u nành b ng n m m c A.oryz Hình 3.1: ng c a t l thành ph n nguyên li n ho protease

Hình 3.2: ng c n ho enzyme protea Hình 3.3: ng c a nhi nuôi n m m n ho enzyme protease Hình 3.4: ng th i gian nuôi n m m n ho protease

Hình 3.5: ng c a s t bào n m m n ho protease

Hình 3.6: ng c ng protei amin sau thu phân 58

Hình 3.7: ng c a nhi ng protein hoà sau thu phân 59

Hình 3.8: ng c a th i gian th ng protein hoà t amin sau thu phân 60

Hình 3.9: Ho enzyme protease khi nuôi c y A.oryzae ng 500g

Hình 3.10: ng c m trích ly t ng acid amin, protein hòa ho t tính ch ng oxi hóa c ng 500g sau th y phân 62

7

DANH M Ụ C ẢNG B

B ng 1.1: Thành ph n dinh ng c u nành và các s n ph m ngu n g c t

nành (Hassan, 2013) [12] 13

B ng 1.2: Thành ph n acid amin c u nành và các s n ph m ngu n g c t u nành (Hassan, 2013) [12] 14

B ng 1.3: B ng thành ph n carbohydrat trong h u nành [A Hou, 2009] [11] 15

B ng 1.4: K t qu m t s thành ph n hóa h c c u nành nhà máy Vinasoy Qu ng Ngãi - Nguy n Th Thanh T nh [8] 19

B ng 2.1: N pha loãng albumin 30

B ng 2.2: K t qu ng albumin 31

B ng 2.3: K t qu Tyrosin 34

B ng 2.4: K t qu glutamic 36

B ng 2.5: K t qu acid amin 36

B ng 2.6: K t qu glutathione 41

B ng 3.1: B ng thành ph u c u nành t nhà máy Vinasoy B c Ni B ng 4.1: B m nguyên li u

B ng 4.2: B n ng protein hoà tan

B ng 4.3: B ng tinh b u

B ng protein t ng s B u

9

L I C Ờ ẢM ƠN

Khoa Hà N i

Sau m t kho ng th i gian làm vi c, lu c hoàn thành v i s

gian th c hi tài này

y/Cô giáo trong V

h c và Công ngh Th c ph m i h c Bách Khoa Hà N i t tình ch

trong thtôi i gian qua

10

M Ở ĐẦU

T i Vi t Nam, ngành công nghi p s n xu t s u nành

, Vinasoy hi n là dtrong ngành hàng s u nành, chi m 84,2% th ph

m t cách t nhiên khi không c b o qu n u ki n thích h p Bên c nh hàm

ng protein l n, trong ph ph m này còn r t nhi u vitamin và các thành ph n dinh

ng có giá tr khác có th khai thác Do v y, t n d c ngu n ph ph m này

sinh v t lành tính có th i m t s n ph m có giá tr ng prote

11

tài:

“Nghiên cứu s d ng enzyme t n m mử ụ ừ ấ ốc Aspergillus oryzae để thu peptide t ừ

bã đậu nành"

12

PH N I T NG QUAN Ầ Ổ 1.1 Giớ i thi u v u nành ệ ề đậ

D a vào s ng v hình thái, Fukuda (1993) và nhi u nhà khoa h c khác v

xu t phát t m t lo u nành d i, thân m nh, d ng dây leo, tên khoa h c G.soja (t

Hymovits, 1970) Trong m t s công trình nghiên c u, các nhà khoa h c dùng tên

c

u nành m c du nh p vào M

u nành r t giàu protein, glucid, lipid, mu i khoáng và acid amin

d u th c v t và s u nành

nhi u khoáng ch t và m t s vitamin khác [ 2011] [4]

lý nhi t

u

h t nhi t

Lipid: Ch t béo trong h ng t 13,5 - 24%, trung bình

ch a kho ng 6,4 - 15,1% là acid béo no (acid stearic và acid archidonic) và

80 - 93,6 % acid béo không no (acid linoleic, acid oleic) Trong d u nành có ch a

Carbohydrates: Glucid u nành chi m kho ng 22 -

3% tinh b t Carbohydrates có hai lo i Lo: c chi m kho ng 10%

c chi m 90%

Bảng 1.3 B ng thành ph n carbohydrat trong h: ả ầ ạt đậu nành [A Hou, 2009] [1 1]

Sugar

ng trung bình (mg/g) Chi t xu t l n 1 Chi t xu t l n 2

Vitamin: u nành ch a nhi u lo i vitamin khác nhau, tr vitamin C và vitamin

D M t s lo i vitamin g m vitamin A, vitamin K, vitamin E, vitamin B: 1, vitamin B2,

khi n cho các doanh nghi p qua

chi c v ngu n nguyên li u vào, công ty liên k t v i 2 trung tâm nghiên c

v u nành t i M S liên k t này s cho ra nh ng nghiên c

Hi n nay, không ch riêng Vinasoy mà còn r t nhi u nhà máy s n xu t s u

kh c li t Theo s li u nghiên c u c a Nielsen Vi t Nam tháng 1/2015, th ph n s a

p hi n n m trong tay Công ty s u nành Vi t Nam Vinng; g n 18% còn l i là Vinamilk, Tân Hi

17

Hình 1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất sữa đậu nành nhà máy Vinasoy Bắc Ninh

u nành c thu mua t nhi u ngu n khác nhau và c ki m tra các tiêu chí : Ngu n g c xu t x ; thành ph ng; các tiêu chu n v v sinh an

18

nhi t và bài khí d u nành giúp lo i b hoàn toàn c enzyme không có l i cho s n ác

ph enzyme Lipoxygenaza và Anti Trypsine, ng th i t o ra mùi v

u nành (okara) là m t s n ph m ph t ngành công nghi p ch bi n snành và u ph Bã u thô là ch t không hòa tan màu tr ng ho c màu vàng (tùy lo i

u thô, là m t ch t không hòa tan, m c dù protein trong bã u nàn25,4 - 28,4% (ch t khô) (O'Toole, 1999) [21 v i ch],

do tính tan th p nên i ta ch y u nghiên c u nh m c i thi n các tính ch t ch c

u nành b ng cách lên men và s d ng các enzyme(Kasai et al., 2004)

Tùy thu c vào gi ng cây tr u ki n th i ti t, ch

công ngh s n xu t s

nhau

phân tích và cho k t qu :

19

Bảng : ế1.4 K t qu mả ột số thành ph n hóa hầ ọc của bã đậu nành nhà máy

Vinasoy-Quảng Ngãi - Nguy n Thễ ị Thanh Tịnh [8]

Thành ph n Protein Xenluloza ng

t ng s

ng

kh Photpho Kh

u nành kho ng 7này có th c t nâng cao l i nhu n cho ngành s n xu t s

u nành nh m nâng cao kh ng oxy hóa và m t s

ng c a nguyên li u

Ana Aguado (2010) Nghiên c u s d u nành b sung thành ph n làm

bánh có vai trò thay th gluten b t mì

nành (t 10-40%) v i b làm v bánh há c o

20

ng và thành ph n ho t ch t ch

b ng n m men (Rhasad, 2011); b ng Aspergillus oryzae (Wu Shi-bin, 2010),b ng

Bacillus subtilis ( Zhu, 2008);

Trong m t nghiên c u, Zhu và c ng s (2008)

m t s n ph m ph ng protein th p t quá trình s n xu u ph ,

ph m ch ng cách lên men v i Bacillus subtilis Rashad et al (2011) cho th y

ng b ng cách lên men r n Wu Shi bin và c ng s

c lên men b ng Aspergillus oryzae, có ch a ch t ch

n (<10 kDa) cho kh ng oxy hóa cao nh t (Moure, 2006)

B ng h enzyme protease c a Aspergillus oryzae A.oryzae) ( và Bacillus subtilis

5% - 63% (B.subtilis) và 5% - 35% (A.oryzae), ng protein c

c ng s , 2012)

1.3 Enzyme protease

Protease là lo i enzyme th y phân các liên k t peptide trong phân t

gi i phóng các acid amin ho c peptide ng n Ngoài ra, nhi

thu phân liên k t este và v n chuy n acid amin

 Aminopeptidase: xúc tác th y phân liên k t peptide u N t do c a chu i

gi i phóng ra m t amino acid, m t dipeptide ho c tripeptide

 Carboxypeptidase: xúc tác th y phân liên k t peptide u C c a chu i polypeptide và gi i phóng ra m t amino acid ho c m t dipeptide

 Aspartic protease: H u h t các aspartic protease thu c nhóm pepsin Các

aspartic protease có ch a nhóm carboxyl trong trung tâm ho ng và

ng ho ng m nh pH trung tính

 Metallo protease:

khu n, n m s

ho ng vùng pH trung tính

 Ảnh hưởng củ a nhiệt độthủ y phân

n enzyme Ngoài ra nó còn có th i tu thu

vi sinh v ) ho c khá cao (substilizin có pH t

24

th b sung thêm ngu , ngu n cacbon, ph t pho và các ch t kích thích sinh

bào vi sinh v t Ch ph m d dàng s y khô mà kh

ho t tính enzyme, ch ph m khô d b o qu n, v n chuy n, nghi n nh ho c

d ng tr c ti p n u không c n khâu tách và làm s ch enzyme, t ng, th

khí cung c p cho quá trình nuôi c y n c a quá trình nuôi c y chìm gchu n b ng nuôi c y, nuôi c y m c gi ng, nuôi c y n m m c s n x

s n xu t Có th nuôi c y d dàng các ch ng vi sinh v t bi n có kh

h p enzyme cao và l a chon t

ng và n enzyme th p nên khi tách thu h i enzyme s có g

gây thi t h i l n [9 ]

 Ảnh hưởng c a nhiủ ệt độ

25

Nhi có vai trò ch y u trong s ng, s n sinh bào t và s n

c a s i n m c a chúng hi thích h p cho s phát tri n và hìnhmen c a A.oryzae là kho ng 28 32oC N u nhi xu ng o i 24

36oC thì n m m c s phát tri n ch m quá trinh sinh t ng h p en

th n 19 (chi m ½ toàn b ng nhi t t a ra), khi n ng có th lên 40oC ho ] Vì v y c n gi cho nhi[3 ng

kho ng t 24oC n không quá 36oC

s i n m và s sinh s n bào t c bi t s n y m m c a bào t

c a n m m c là kho ng 55% - 60% m thích h p cho s hình thành bào t là kho ng 45% C n gi m không b m trong quá trình phát tri n N

trên 60% d nhi m khu n, khó thông khí, m 45 - 50% khi nuôi c n

m ho t tính khi sinh t ng h p enzyme

không khí thích h p cho phát tri n là t n bão hòa Trong phòng nuôi c n gi

ng kh

 Ảnh hưởng của độ thoáng khí

oxy Chandran Sandhya và c ng s (2005) 5] [1

cám lúa mì, tr u, cám g c, bánh d u d a, bánh nhân c , bánh mè, b t h t m

và bánh d u ô liu, cám lúa mì là ch t n n t t nh A.oryzae cho protease ho t tính

27

ng thích h p cho A.oryzae ng acid y u, pH trong kho

ch nh

 Ảnh hưởng củ a th i gian nuôi n m m c ờ ấ ố

t ng h p enzyme Tuy nhiên y u t này còn ph thu c vào nhi

c y

Natália Lima de Oliveira Pascoal và c ng s (2014) [1 ] 9 u v kh

a n m m c A.oryzae khi nuôi c y b m

r n v i ch t n n là khô d u h t c i (100g khô d u v c)

nhi oC, t l n m m c 10 20 7 TB/g trong 96 gi và nh n th y các ch ng A.oryzae

c nghiên c u u sinh enzyme protease sau 48 gi nuôi c y v i ho cao nh

c 72 gi sau nuôi c y

Chuenjit Chancharoonpong và c ng s (2012) [14] u quá trình s

ng c i t 72 gi sau nuôi c y, còn protease có ho t l c c i t 48 gi nuôi c y

Qu n Lê Hà và c ng s (2011) [2] u ki n sinh tprotease t n m m c Aspergillus oryzae

gi nuôi m c và gi m d n n u ti p t c nuôi m c; t i th m 54 gi thì ho

2 l n, và t i th m 60 gi thì gi m 2,4 l n

Ch ng gi ng n m m c Aspergillus oryzae c l y trong b p c a ViCông ngh sinh h c và Công ngh th c ph i h c Bách khoa Hà N i

 Huy t thanh bò  Pyridine

 Dung d ch TCA  Tyrosin

 NaOH + Na2CO3  Folin

 Dung d m photphat  CuSO4.5H2O

 NaOH 0,1N  Acid Glutamic

n p và cân t chính xác 0,001g t h p vào t s y có nhioC s y trong 60

kho ng 10 phút r i làm ngu i v nhi phòng trong kho ng 2h (không dùng bình hút

y n p) Ti t h p vào t s y có nhioC, b u t stính th i gian khi t t nhi này Sau 2h l y h p s y ra làm ngu i trong bình hút

30

Nguyên tắc: P

Chuẩn bị hóa ch t ấ :

 Dung dịch A: Cân 2,8598 g NaOH +14,3084 g Na2CO3 hòa tan trong 500ml

 Dung dịch B: Cân 1,4232 g CuSO4.5H2O trong 100 m l

 Dung dịch C: Cân 2,853 Natritatrate.2(H2

 Dung dịch Lowry (tỷ lệ thể tích các dung dịch A: : B C = 100 1 : : : 1)

 Thuốc thử Folin: T

 Dung dịch chuẩn BSA 100mg/l: C

Bảng 2.1: ồ g độN n pha loãng albumin

ph n ng th y phân b ng thu c th Folin D th chu n c a tyros

ng s n ph ng cho enzyme xúc tác t o nên

acid amin c a các enzyme c bi u th b ng s protease trong 1g ch ph

ch ph m b ng que th y tinh trong c c nh v i m t ít dung d m v

34

2CO3

:

Bảng : ế2.3 K t qu ả đo nồng độ Tyrosin Tyrosin (µmol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,10 0,15 0,30

OD 0,021 0,038 0,096 0,112 0,192 0,335 Phương trình đường chu n Tyrosẩ in:

Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn Tyrosin

ng chu n tyrosin y = 1,1408x + 0,0011 : :

[µmol /ml]

36

Dung dịch chuẩn acid amin:

Bảng 2.4: ếK t qu ả đo nồng độ glutamic acid glutamic 1mg/ml (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Kết quả dựng đường chuẩn:

Bảng 2.5: ếK t qu ả đo nồng độ acid amin 0,02 0,04 0,06 0,08 0,09 0,012 0,14 0,16

OD 0,148 0,234 0,286 0,343 0,379 0,478 0,532 0,585

37

Đường chu n Glutamic ẩ :

Hình 2.3: Đường chuẩn Glutamic

ng chu n l c y = 3,0892x + 0,099 : : Y G: iá tr OD c a m u

X N: acid amin tính theo [mg/ml]

ng acid amin thu nh c trong d ch trong sau th y phân :

TNaa=X * f *V(mg) :

TNaa: L ng acid amin thu nh c khi th y phân (mg)

f H s pha loãng :

V: Th tích d c sau ly tâm (ml)

Nguyên t cắ : Th y phân tinh b ng trong dung d ch HCl 2%

i sôi và cho sôi trong kho ng 2 gi M c

c trong bình th y phân, ph i chu n b vào Sau 2 gi th y phân, toàn b ng tinh b n thành glucose, làm ng

n nhi phòng r i thêm 4 5 gi t metyl da cam, dùng NaOH 10% trung hòa acid

c c b thì glucose s b phân h y làm k t qu kém chính xác Trung hòa xong ta chuy n toàn b dung d nh m c 250, tráng bình r

chu n b dung d ch glucose tinh khi t Cân 0,5 g glucose tinh khi n