Nghiên ứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ bã đậu nành của công nghiệp sản xuất sữa bằng chế phẩm enzyme thương mại

Protein Bã đậu nành Yuporn Puechkamut và Woralak Panyathitipong công b protein trong Bã ốđậu nành gi m kh ả ả năng hòa tan vào nước do tr i qua các quá trình nghiả ền cơ học và nhi t là

B GIÁO DỘ ỤC VÀ ĐÀO TẠO

-

CAO TH KIM CHI Ị

NGHIÊN C U THU NH Ứ Ậ N SẢ N PH M TH Y PHÂN PROTEIN Ẩ Ủ

B GIÁO DỘ ỤC VÀ ĐÀO TẠO

-

CAO TH KIM CHI Ị

NGHIÊN C U THU NH Ứ Ậ N SẢ N PH M TH Y PHÂN PROTEIN Ẩ Ủ

LỜI CAM ĐOAN

Học viên: Cao Thị Kim Chi

Nơi đào tạo: Trường Đạ ọi h c Bách Khoa Hà N i ộ

Chuyên ngành: Công ngh ệSinh học

Người hướng dẫn : PGS.TS Quản Lê Hà

Tên luận văn: “Nghiên c u thu nh n s n ph m th y phân protein t ứ ậ ả ẩ ủ ừ Bã đậu nành c a công nghi p s n xu sủ ệ ả ất ữa bằng các ch phế ẩm enzyme thương mại”

Nội dung cam đoan: Em xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên c u luứ ận văn thạc sĩ, dướ ự hưới s ng d n ch b o t n tình cẫ ỉ ả ậ ủa giáo viên hướng dẫn, em đã tiến hành nghiên c u luứ ận văn một cách trung th c, toàn b n i dung trong báo cáo luự ộ ộ ận văn được em tr c ti p th c hi n T t c ự ế ự ệ ấ ả các t qu nghiên c u không sao chép t kế ả ứ ừcác báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của b t cứấ tác gi nào ả

Học viên

Cao Thị Kim Chi

LỜ I CẢM ƠN

Đối v i m i h c viên cao h c, luớ ỗ ọ ọ ận văn tốt nghi p là m t công trình khoa ệ ộ

h c nh ọ ỏ nhưng mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành đầu tiên c a m i cá ủ ỗnhân trên con đường ng d ng nh ng ki n th c đã đư c h c vào th c ti n ứ ụ ữ ế ứ ợ ọ ự ễ

Trước h t, em xin bày t lòng biế ỏ ết ơn sâu sắ ớc t i PGS.TS Qu n Lê Hà, Vi n ả ệtrưởng Vi n Công ngh Sinh h c và Công ngh Th c ph m – ệ ệ ọ ệ ự ẩ – Trường Đại h c ọBách Khoa Hà N PGS.TS Ph m Thu Thội, ạ ủy – ả gi ng viên b môn Công ngh sinh ộ ệ

h c ọ đã tận tình hướng d n và truyẫ ền đạt nh ng ki n thữ ế ức quý báu để giúp em hoàn thành luận văn này

Trong th i gian th c t p và làm vi c t i phòng Thí nghiờ ự ậ ệ ạ ệm ộ môn b Công ngh Sinh h c- ệ ọ Viện Công ngh Sinh h c và Công ngh ệ ọ ệ Thực phẩm, em đã nhận được s ự quan tâm giúp đỡ ự, s ch b o t n tình v ỉ ả ậ ề chuyên môn, kĩ thuật cùng s ự

động viên chân thành c a th y cô và t p th h c viên, sinh viên th c t p t i phòng ủ ầ ậ ể ọ ự ậ ạ

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Em xin được g i l i cử ờ ảm ơn đến Ban lãnh đạo Vi n Công ngh Sinh h c và ệ ệ ọCông nghệ Th c phẩm –ự Trường Đạ ọi h c Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều ki n thu n ệ ậ

lợi giúp em hoàn thành luận văn

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khuy n khích em ếtrong suốt quá trình h c tọ ập để đạt được kết qu ả như ngày hôm nay

Hà Nội, tháng năm 2018

Học viên

Cao Th Kim Chi ị

M C L C Ụ Ụ

LỜI CAM ĐOAN 1

M Ở ĐẦU 8

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 10

ậu nành 10

1.1.1.S n xu t sả ấ ữa đậu nành 10

1.1.2.Bã đậu nành 11

1.1.3.Thành phần Bã đậu nành: 13

1.1.4.Protein Bã đậu nành 14

1.1.5.Phương pháp x lí protein ử 15

1.2.H enzyme protease ệ 18

1.2.1.Định nghĩa 18

1.2.2.Phân lo i protease ạ 19

1.2.3.Các y u tế ố ảnh hưởng đến ho t tính c a protease ạ ủ 20

1.3.Protein th y phân và ho t tính ch ng oxy hóa c a protein th y phân ủ ạ ố ủ ủ 22

CHƯƠNG II Ậ V T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 26 Ứ 2.1 V t li u nghiên cậ ệ ứu: 26

2.1.1.Bã đậu nành 26

2.1.2.Các ch ếphẩn enzyme thương mại 26

2.2.Hóa ch t ấ 26

2.3.Thi t b ế ị 26

2.4.Phương pháp xác định hoạt độ protease c a các ch ủ ếphẩm 27

2.5.Phương pháp xác định độ ẩ m c a nguyên li u ủ ệ 29

2.6.Phương pháp xác định protein hòa tan bằng phương pháp Lowry 30

2.7.Phương pháp xác định axit amin b ng Ninhydrin ằ 32

2.8.Phương pháp xác định ho t tính ch ng oxy hóa b ng DPPH: ạ ố ằ 34

2.9.Sơ đồ nghiên c u thứ ủy phân Bã đậu nành b ng các ch ằ ếphẩm protease 36

CHƯƠNG III KẾT QU VÀ BÀN LU N Ả Ậ 40

3.1.Phân tích thành phần ban đầ ủa Bã đậu nành 40 u c 3.2.Xác định hoạt độ ủ c a các ch phế ẩm enzyme thương mại 40

3.3.Nghiên c u thu h i protein trong bứ ồ ã đậu ướ ằt b ng các ch ếphẩm protease thương mại 40

3.3.1.Nghiên c u thứ ủy phân protein trong bã đậu ướ ằt b ng ch phẩm protease ế 40

3.3.2.Nghiên c u l a chứ ự ọn t l ỷ ệphố ộn bã đậ ướ và nước đếi tr u t n kh năng ả thu phân protein ỷ 42

3.3.3.Nghiên c u l a ch n ch khuứ ự ọ ế độ ấy đến ho t tính ch ng oxy hóa cạ ố ủa d ch th y phân ị ủ 45

3.3.4.Nghiên c u l a ch n nứ ự ọ ồng độ enzyme đến kh ả năng thủy phân protein 47 3.3.5.Nghiên c u s k t h p 2 lo i enzyme Neutrase và Flavourzyme trong ứ ự ế ợ ạ thủy phân protein Bã đậu nành thu nh n s n ph m có ho t tính ch ng oxy hóa ậ ả ẩ ạ ố cao 49

3.4 Nghiên c u kh o sát t l ứ ả ỉ ệphố ộn bã đậu khô và nướ ới tr c t i kh ả năng thu h i protein ồ 51

K T LU N VÀ KI N NGH Ế Ậ Ế Ị 53

TÀI LI U THAM KH O Ệ Ả 54

PHỤ Ụ L C 58

DANH M C B NGỤ Ả

B ng 1.1 Thành phả ần dinh dưỡng trên 100g bã đậu nành ướt 13

B ng 1.2ả Bảng so sánh thành ph n axit ầ amin trong protein Bã đậu nành ướt

Bảng 1.2’: Bảng xác định protein hòa tan trong Bã đậu nành 59 Bảng 2.1’ : Xác định lượng protein c a d ch trong 60 ủ ịBảng 2.2’: Xác định lư ng axit amin c a d ch trong ợ ủ ị 61 Bảng 3.1’ Bảng xác định lượng protein c a d ch trong ủ ị 64 Bảng 3.2’ Bảng xác định lượng axit amin c a d ch trong ủ ị 65

Bảng 3.3’ : Kết qu phân tích d ch trong khi kh o sát t l ả ị ả ỷ ệphố ộn bã đậi tr u và nước 67

Bảng 3.4’ : Kết qu phân tích ho t tính chả ạ ống oxy hóa c a dủ ịch trong khi khảo sát t l ỷ ệphố ộn bã đậu và nước 68 i trBảng 4.1’ Bảng xác định lượng protein c a d ch trong ủ ị 69 Bảng 4.2’ Bảng xác định lượng axit amin c a d ch trong ủ ị 70

Bảng 4.3’ : Kết qu phân tích ho t tính chả ạ ống oxy hóa c a dủ ịch trong khi khảo sát ch khu y ế độ ẩ 71 Bảng 5.1’ Bảng xác định lượng protein c a d ch trong ủ ị 72 Bảng 5.2’ Bảng xác định lượng axit amin c a d ch trong ủ ị 74

Bảng 5.3’: Kết qu phân tích ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch trong khi khả ạ ố ủ ị ảo sát nồng độ enzyme 75

Bảng 5.4’: Kết qu phân tích ho t tính ch ng oxy hóa c a d ch trong khi khả ạ ố ủ ị ảo sát t l ỉ ệphố ộn bã đậu khô và nưới tr c 76

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease th y phân phân t Protein ủ ử 19

Hình 1.2 H n h p protein th y phân ỗ ợ ủ 23

Hình 2.1 Đường chuẩn Tyrosine 28

Hình 2.2 Đường chuẩn albumin 31

Hình 2.3 Đồ ị th đư ng chu n glutamic ờ ẩ 33

36

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thu h i protein s d ng enzyme ồ ử ụ 36

Hình 3.1 (a) Lượng axit amin trong d ch thị ủy phân bã đậu ướ ằt b ng 2 ch ế phẩm Flavourzyme và Neutrase 41

Hình 3.1 (b) Kh ả năng thủy phân protein trong BĐ ướ ủt c a ch ếphẩm enzyme 41

Hình 3.2 (a) Ảnh hưởng c a t l ủ ỷ ệphố ộn BĐ và nưới tr c tới lượng axit amin 42

Hình 3.2 (b) Ảnh hưởng c a t l ủ ỷ ệphố ộn BĐ và nướ ới tr c t i hi u su t thệ ấ ủy phân c a enzyme ủ 43

Hình 3.2 (c) Ảnh hưởng c a t l ủ ỷ ệphố ộn BĐ và nưới tr c t i hi u su t thu hớ ệ ấ ồi protein 43

Hình 3.2 (d) Ảnh hưởng c a t l phố ộn BĐ và nướ ớủ ỷ ệ i tr c t i ho t tính ch ng ạ ố oxy hóa c a d ch th y phân protein ủ ị ủ 44

Hình 3.3 (a) Ảnh hưởng c a ch khu y tủ ế độ ấ ới lượng axit amin trong d ch sau ị thủy phân 45

Hình 3.3 (b) Ảnh hưởng c a ch khu y t i hi u su t th y phân protein ủ ế độ ấ ớ ệ ấ ủ 46

Hình 3.3 (c) Ảnh hưởng c a ch khu y t i hi u su t thu h i protein ủ ế độ ấ ớ ệ ấ ồ 46

Hình 3.3 (d) Ảnh hưởng c a ch khu y t i ho t tính chủ ế độ ấ ớ ạ ống oxy hóa c a ủ d ch th y phân protein ị ủ 46

Hình 3.4 (a) Ảnh hưởng c a nủ ồng độ enzyme tới hàm lượng axit amin trong d ch th y phân ị ủ 47

Hình 3.4 (b) Ảnh hưởng c a nủ ồng độ enzyme t i hi u su t thớ ệ ấ ủy phân protein 48

Hình 3.4 (c) Ảnh hưởng c a nủ ồng độ enzyme t i hi u su t thu h i protein ớ ệ ấ ồ 49 Hình 3.4 (d) Ảnh hưởng c a nủ ồng độ enzyme t i ho t tính chớ ạ ống oxy hóa của d ch th y phân protein ị ủ 49

M Ở ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành sản xu t sấ ữa đậu nành phát tri n m t cách ể ộvượt b c Theo s li u th ng kê c a hãng th ng kê th trưậ ố ệ ố ủ ố ị ờng Neilsen, năm 2014 Việt Nam tiêu th kho ng 613 tri u lít sụ ả ệ ữa đậu nành, có nghĩa khoảng 1,5 tri u lít / ệngày Việt Nam là nước tiêu th sụ ữa đậu nành nhi u th 3 trên th gi [34] V i th ề ứ ế ới ớ ịtrường tiềm năng này, các doanh nghiệp cũng mạnh tay đầu tư cơ sở, công ngh ệ để

s n xu t m t hàng này, n i bả ấ ặ ổ ật như nhà máy Vinasoy (Bắc Ninh và Qu ng Ngãi), ảnhà máy Vinamilk …Nhưng đi đôi với việc đẩy m nh ch biạ ế ến đậu nành thì vi c ệ

một lượng lớn bã đậu được th i ra Theo m t s ả ộ ố thống kê cho bi t, riêng nhà máy ếVinasoy v i công su t thiớ ấ ết kế 180 triệu lít/năm, mỗi năm nhà máy thải ra 20000 t n ấ

bã đậu [34] Ph n lầ ớn lượng bã này đượ ấc s y khô bán cho nhà máy ch bi n thế ế ức ăn gia súc Với phương pháp tận thu này tiêu tốn năng lượng và không đem lạ ợi l i nhu n cao Còn m t phậ ộ ần bã đậu được bán tươi, tuy nhiên bã đậu ch a nhi u ch t ứ ề ấdinh dưỡng cũng như độ ẩ m cao nên r t d ấ ễ hư hỏng c n s dầ ử ụng Để kh c ph c ắ ụ

những nhược điểm trên, cũng đã có nhiều nghiên c u ng dứ ứ ụng bã đậu như lên men thu h i axit xitric hay dùng enzyme cellulase và pectinase thồ ủy phân bã đậu thu hồi

s n phả ẩm kích thước nh b sung m t ph n vào bỏ ổ ộ ầ ột làm bánh mì….bởi phần bã đậu sau quá trình s n xu t sả ấ ữa đậu nành v n ch a nhi u thành phẫ ứ ề ần dinh dưỡng như protein (20-30%), gluxit, ch t béo và chấ ất xơ Nh n th y nguậ ấ ồn protein trong bã đậu

có kh ả năng thu hồi và vi c thu hệ ồi protein trong bã đậu s giúp t kiẽ tiế ệm năng lượng cũng như tăng giá trị thương mạ ủa bã đậ Xu hưới c u ng m ra hi n nay là ở ệ

ph i h p các ch phố ợ ế ẩm enzyme thương mại để ủy phân bã đậ ạ th u t o ra các peptide, các axit amin có ho t tính chạ ống oxy hóa được s dử ụng để ổ b sung vào th c ph m ự ẩchức năng hay ứng dụng trong dược ph m ẩ

Xuất phát t nh ng mừ ữ ục đích thăm dò khả năng thu hồi protein trên bã đậu khô b ng ch ằ ếphẩm Neutrase và Flavourzyme nhằm đưa ra một hướng m i giúp tớ ận

d ng tụ ốt đa nguồn bã đậu thải ra hàng năm và mang lại giá tr kinh t ị ếcao, tôi tiến hành nghiên cứu đềtài: “Nghiên cứu thu nh n s n ph m th y phân protein ậ ả ẩ ủ

t ừ Bã đậu nành c a công nghi p s n xu t s a b ng các ch ủ ệ ả ấ ữ ằ ế phẩm enzyme

thương mại”.

bã đậu ướt và bã đậu khô ch ph m Flavourzyme và Neutrase (t l ph i tr n, ế ẩ ỉ ệ ố ộchế độ khu y và nấ ồng độ enzyme hi u su t thu h i protein cao nh t và t o ra ệ ấ ồ ấ ạcác peptide có hoạt tính ch ng oxy hóa ố

v cho s n ph m Tuy nhiên, nh ng thành ph n này có th b l ng xu ng nên cị ả ẩ ữ ầ ể ị ắ ố ần

đồng hóa dịch Dưới áp su t cao thì các ph n t trong dấ ầ ử ịch được phân tán đề ạu t o dung dịch đồng nh t Mấ ột công đoạn không th ểthiếu trong dây chuy n s n xu t là ề ả ấtiệt trùng v i nhiớ ệt độ cao và áp su t cao thì nh ng vi sinh v t b tiêu di t mà không ấ ữ ậ ị ệlàm thay đổi tính ch t s n phấ ả ẩm ban đầu Cu i cùng dố ịch được tr lữ ạnh, đóng gói và

b o qu n [34]ả ả Bã đậu nành thu đượ ừ quá trình này được ức t ng dụng vào đề tài của tôi

Sơ đồ quy trình s n xu t s ả ấ ữa đậ u nành t i công ty Vinasoy Vi t Nam ạ ệ

1.1.2. Bã đậu nành

Bã đậu nành hay còn g i tọ ắt là bã đậu: là ph n r n còn l i sau khi l c trong ầ ắ ạ ọ

quá trình s n xuả ất đậu ph , sụ ữa đậu nành và các s n phả ẩm từ đậ u nành khác

Trên th gi i, t ng thông dế ớ ừ ữ ụng đểchỉ ã đậ b u nành là “okara”, thuật ng này ữ

xuất phát từ Nhật Bản (phát âm theo ti ng Nhế ật là “oh-KAR-uh”)

Okara là bã màu tr ng ho c tr ng ngà bao g m các ph n không hòa tan ắ ặ ắ ồ ầ

c a hủ ạt đậu nành còn l i, khi hạ ạt đậu nành xay nhuyễn đượ ọc l c trong s n xu t sả ấ ữa đậu nành và đậu ph Khi s y khô, ụ ấ bã đậu nành có màu vàng

Okara là m t s n ph m ph t ngành công nghi p ch bi n sộ ả ẩ ụ ừ ệ ế ế ữa đậu nành và

đậu ph Nó ch a protein, chụ ứ ất xơ có giá trị và có th ể được s d ng trong các s n ử ụ ả

ph m th c phẩ ự ẩm để đáp ứng nhu c u c a th ầ ủ ị trường Tuy nhiên, chúng ta ph i x lý ả ử

một cách nhanh chóng để duy trì được các tính ch t c a nó Bã u nành ấ ủ đậ chứa hầu

h t cacbohydrate, m t ph n protein và mế ộ ầ ột lượng nh ph n d u c a hỏ ầ ầ ủ ạt đậu nành

Bã ướt giống như mùn cưa ẩm, nó được cho là gi ng vố ới cơm dừa v k t c u và ề ế ấhình thức, thường được s dử ụng như một thành ph n th c ph m trong món súp ầ ự ẩNhật Bản, salad và các món ăn được ch bi n t ực vật ế ế ừth

Tình hình nghiên c u okara ứ ở nước ngoài:

- Ma và c ng s ộ ự (1997) đã tách các protein từ okara và nghiên c u tính ch t hóa lý, ứ ấchức năng của chúng để so sánh với protein thương mại tách chi t t u nành ế ừ đậChan và Ma (1999) cũng đã thủy phân protein bã đậu b ng trypsin K t qu cho ằ ế ảthấy protein tách chi t t ế ừ okara có lượng axit amin phong phú so v i tiêu chu n cớ ẩ ủa FAO/WHO và so với protein đậu nành thương mại; d tiêu hóa, có th b sung vào ễ ể ổthực phẩm [10,11,21]

- Quitain và c ng s ộ ự (2005) đã tách chiế ầ ừt d u t okara s d ng cacbon dioxit siêu ử ụ

t i hớ ạn Lượng dầu thu được là 3,09g trên 100g bã đậu khô Ngoài ra isoflavone, genistein và daidzen cũng được tách chi t cùng dế ầu làm tăng giá trị dinh dưỡng c a ủ

d u v i s c khầ ớ ứ ỏe con người (ho t tính ch ng oxy hóa, ch ng viêm, ạ ố ố chống ung thư…)[28]

- Sourel (2005) đã nghiên cứu quá trình s y okara và ch ra r ng quá trình s y làm ấ ỉ ằ ấ

biến đổi c u trúc s i và làm gi m kh ấ ợ ả ả năng giữ nước Tuy nhiên, hàm lượ ng isoflavones trong okara không thay đổi nhiều trước và sau khi x lý nhi t [31] ử ệ

Tình sử ụ d ng và nghiên c u bứ ột okara trong nước:

- Đỗ Bích Th y, Lê Th Kim Anh ủ ị (2017) đã thủy phân, lên men bã đậu nành b i các ởchế ph m Bacillus amiloliquefaciensẩ N1 và Lactobacillus fermentum DC4t2 Giá tr ịdinh dưỡng c a s n ph m sau x ủ ả ẩ ử lý được đánh giá thông qua hoạt độ enzyme ngo i ạbào protease, amlylase, hàm lượng axit amin t do [2] ự

- Lê Chiến Phương và các cộng tác viên (2004) x lý okara b ng n m m c Mucor ử ằ ấ ố

và vi khu n lactic [3] ẩ

Tính đến thời điểm hi n t i, cệ ạ hưa có sản ph m nào trong s các s n ph m ẩ ố ả ẩnêu trên được tri n khai s n xu t th quy mô công nghiể ả ấ ử ở ệp Điều này cho th y ấ ởViệt Nam lo i ph ph liạ ụ ế ệu đậu nành này vẫn chưa đượ ậc t n d ng có hi u qu vào ụ ệ ảcác mục đích khác ngoài thức ăn chăn nuôi

1.1.3 Thành phầ n Bã đậu nành:

Bã đậu nành ch a nhi u thành phứ ề ần dinh dưỡng, theo B nông nghi p Hoa K ộ ệ ỳ(Cẩm nang “Dinh dưỡng người, thông tin d ch v Nông Nghi p s ị ụ ệ ố 16/8”) công bốthành phần bã đậu như sau:

B ng 1.1 Thành ph ả ần dinh dưỡ ng trên 100g bã đậ u nành t ướ

Theo công b c a Li Bo và c ng s (2012) thì thành ph n hóa h c c a okara ố ủ ộ ự ầ ọ ủ

s ph thu c vào s ẽ ụ ộ ố lượng giai đoạn nước chi t xu t t ế ấ ừ đậu nành và lượng nước tiếp

tục được b ổ sung để trích xu t các thành ph n chiấ ầ ết dư Nó cũng phụthuộc vào các

giống đậu nành và các phương pháp sản xu t, g m: 46,3% chấ ồ ất xơ, 17,8% protein, 5,9% lipid, tro 3,9%, 2,6% đường kh , 0,22% flavone và 6,7% m M t s thành ử ẩ ộ ố

ph n cầ ủa đậu nành khác cũng có khả năng hiện di n trong ệ Bã đậu nành, bao g m: ồisoflavones, lignans, phytosterol, counestans, saponin và phytates

1.1.4. Protein Bã đậu nành

Yuporn Puechkamut và Woralak Panyathitipong công b protein trong Bã ố

đậu nành gi m kh ả ả năng hòa tan vào nước do tr i qua các quá trình nghiả ền cơ học

và nhi t làm bi n tính protein Nghiên cệ ế ứu cũng kết luận protein trong bã đậu và protein đậu nành thương mại tương đồng v kh ề ả năng tạo nhũ tương tuy nhiên độ

b n h ề ệ nhũ tương của bã đậu bền hơn do quá trình cơ học và nhiệt làm thay đổ ấu i ctrúc hình c u ầ protein tăng số nhóm phân c c hình thành m t l p màng b n chự ộ ớ ề ặt xung quanh gi t ch t béo t ọ ấ ừ đó làm ổn định h ệ nhũ tương [32]

Bên cạnh đó, sự ác độ t ng bởi cơ học và nhiệt độ làm tăng tương tác protein- protein và thúc đẩy hình thành lớp màng không khí và nước nên tăng khả năng tạo

và gi bữ ọt của protein Bã đậu nành

Khi chi t tách protein trong ế Bã đậu nành b ng NaOH 2N thì hi u su t thu hằ ệ ấ ồi protein của bã ướ ẽ cao hơn bã khô (12,9g/100g BĐ và 12,3g/100g BĐ) Còn các t s tính ch t khác (ấ ổn định h ệ nhũ tương, khả năng tạo và gi b t) gữ ọ ần như giống nhau

đố ới protein bã đậu khô và bã đậu ưới v t

Nghiên cứu trên cũng đã phân tích thành phần axit amin có trong protein Bã

đậu nành ướt như sau:

B ng 1.2 B ng so sánh thành ph n axit amin trong protein ả ả ầ Bã đậ u nành

ướ t và h t đ u nành [32] ạ ậ

Nhận th y t l ấ ỷ ệ axit amin trong bã đậu hầu như thấp hơn có với axit amin trong hạt đậu nành ngo i tr m t s axit amạ ừ ộ ố in như : Cystein, Threonine, Glycine

a Th y phân protein b ng axit ủ ằ

y phân kh c nghi t, dùng axit HCl n cao và

thủy phân nhiở ệt độ 100-120oC trong th i gian 24-48 gi S n phờ ờ ả ẩm thu được ch ủ

y u là các axit amin t ế ự do dướ ại d ng hydrogenclorate M t s axit amộ ố in như serine, threonin bị phá h y mộủ t ph n, tryptophan b phá h y hoàn toàn, glutamine và ầ ị ủasparagine phân ly thành axit glutamic và axit asparic và NH4+

Ưu điểm: Đơn giản, d th c hi n ễ ự ệ

Nhược điểm: c n thi t b chầ ế ị ịu được nồng độ axit cao, x lí ch t th i sau quá ử ấ ảtrình th y phân t n kém, ph n ủ ố ả ứng không có tính đặc hi u và quá trình thệ ủy phân làm phá h y m t s axit amin.ủ ộ ố

Phương pháp sử ụ d ng NaOH nồng độ 4-8N, th y phân trong th i gian dài 24-ủ ờ

48 gi và nhiờ ệ ột đ > 100oC

Ưu điểm: Đơn g ải n, d th c hi n ễ ự ệ

Nhược điểm: c n thi t b chầ ế ị ịu được nồng độ ề ki m cao, x lí ch t th i sau quá ử ấ ảtrình th y phân t n kém và nguy h i tủ ố ạ ới môi trường, gây hiện tượng racemic hóa gi m giá tr ả ị dinh dưỡng và quá trình th y phân làm phá h y m t s axit ủ ủ ộ ốamin như cystein, serine, treonine

g m protein, peptide, axit amin ồ

Ưu điểm: Phương pháp có tính đặc hi u cao, ph n ng xệ ả ứ ảy ra trong điều ki n ệ

ôn hòa, thiết bị đơn giản

Nhược điểm: hi u su t th y phân th p và th i gian th y phân kéo dài ệ ấ ủ ấ ờ ủ

Nhược điểm: Chi phí cao hơn so với phương pháp hóa học

Đây là phương pháp được s d ng ph bi n ngày này, nh ng ch phử ụ ổ ế ữ ế ẩm enzyme thương mại được b sung vào các quá trình thu h i protein t ph ph m ổ ồ ừ ụ ẩtrong quá trình sản xu ất

Phương pháp sấ y

Bã đậu nành tươi có độ ẩ m l n cùng vớ ới hàm lượng chất dinh dưỡng trong đó

r t phù h p cho vi khu n gây th i phát triấ ợ ẩ ố ển Do đó, vấn đề ả b o quản bã đậu nành là

vấn đề được quan tâm Nhi u tác gi ề ả ở nước ngoài (Chung và c ng s , 1978; ộ ựFujigami và c ng s , 1980; Hirotsuka và c ng s ộ ự ộ ự , 1987) đã nghiên cứu ch sế độ ấy

để kéo dài th i gian b o qu n ờ ả ả bã đậu nành

Bã đậu nành được th i ra t quá trình s n xu t s a đ u nành dả ừ ả ấ ữ ậ ở ạng ướt, độ ẩ m cao 70-85% ẩm được chuy n vào thi t b s y phù h p v i công su t t ng nhà máy ể ế ị ấ ợ ớ ấ ừ

Bã đậu này, thường được s y b ng thi t b sấ ằ ế ị ấy băng tải ở nhiệt độ 70-90oC trong

thời gian dài đưa ẩm v 10-ề 12% Sau đó bã khô được bán cho các nhà máy s n xuả ất

thức ăn chăn nuôi phđể ối trộn với các thành ph n khác t o h n h p thầ ạ ỗ ợ ức ăn gia súc Phương pháp được s d ng t ử ụ ừ lâu đời và đượ ức ng d ng r ng rãi do tính ch t ụ ộ ấđơn giản cuaa phương pháp Tuy nhiên, phương pháp này tiêu tốn nguồn năng lượng vô cùng l n mà s n ph m sau quá trình lớ ả ẩ ại đem lạ ợi l i nhu n không cao ậChính vì v y, hiậ ện nay người ta đang nghiên cứu tìm ki m nh ng giế ữ ải pháp đem lại

hi u qu ệ ả cao hơn

Phương pháp lên men

Để ậ t n dụng lượng l n xenluloza còn sót trong ớ Bã đậu nành, người ta đã tiến hành nghiên c u lên ứ men Bã đậu nành b ng n m m c Nh ằ ấ ố ờ đó, lượng gluxit trong

bã đậu b phân gi i t o axit pyruvic và CHị ả ạ 3CHO, t ừ đó tổng h p t o axit xitric Axit ợ ạxitric là loại axit có độ chua nhẹ, tan trong nước Axit xitric được ứng d ng trong ụngành công ngh ệthực phẩm như bánh kẹo, nước giải khát…Ngoài ra, axit xitric còn được s d ng trong các ngành công nghiử ụ ệp khác như mỹ ph m, y hẩ ọc, dược ph m, ẩphim nh và trong s n xuả ả ất chất tẩ ửa.y r

Phương pháp lên men đậu nành cũng đượ ức ng d ng trong s n xuụ ả ất tương Bã

đậu nành được lên men b i n m m c b ở ấ ố ổ sung vào như: Aspergillus, Mucor,

trình sản xu ất

Các ch ế độ(nhiệt độ, pH, thời gian ) được điều ch nh phù h p v i lo i n m m c s ỉ ợ ớ ạ ấ ố ử

d ng ụ Việ ậc t n d ng ụ Bã đậu nành trong s n xuả ất tương đã đem lại ngu n lồ ợi lớn cho doanh nghi p ệ

Phương này tận dụng được nguồn dinh dưỡng trong bã đậu và năng lượng c n thi t ầ ế

r t th p Bên c nh nhấ ấ ạ ững ưu điểm đó, thì việc s vi sinh vử ật lên men bã đậu cần nhi u thề ời gian cũng như có những r i ro (nhi m các lo i vi sinh v t khác không ủ ễ ạ ậmong mu n), khó kiố ểm soát quá trình

1.2 H enzyme protease ệ

1.2.1. Định nghĩa

Protease là nhóm enzyme xúc tác th y phân liên k t peptide, là lo i liên kủ ế ạ ết chủ ế y u trong phân t protein và polypeptide ử

Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên k t peptide (-ế CO NH- - )n trong phân t ử protein, polypeptide đến s n ph m cu i cùng là các axit amin Ngoài ả ẩ ố

ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên k t este và v n chuyế ậ ển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease th y phân phân t Protein ủ ử

Protease c n thi t cho các sinh v t s ng, rầ ế ậ ố ất đa dạng v ềchức năng từ ức độ m

t bào, ế cơ quan đến cơ thể nên được phân b r t r ng rãi trên nhiố ấ ộ ều đối tượng t vi ừsinh v t (vi khu n, nậ ẩ ấm và virus) đến th c vự ật (đu đủ ứa ) và độ, d ng v t (gan, d ậ ạdày bê ) So với protease động v t và th c v t, protease vi sinh v t có nhậ ự ậ ậ ững đặc điểm khác biệt Trước h t h protease vi sinh v t là m t h th ng r t ph c t p bao ế ệ ậ ộ ệ ố ấ ứ ạ

g m nhi u enzyme r t gi ng nhau v c u trúc, khồ ề ấ ố ề ấ ối lượng và hình d ng phân t nên ạ ử

rất khó tách ra dưới dạng tinh th ng nh ể đồ ất

Cũng do là phức h g m nhi u enzyme khác nhau nên proteasevi sinh v t ệ ồ ề ậthường có tính đặc hi u r ng rãi cho s n ph m thu phân triệ ộ ả ẩ ỷ ệt để và đa dạng

1.2.2. Phân loại protease

D a vào v trí phân c t các liên k t peptide cự ị ắ ế ủa protease, người ta chia protease thành 2 loại:

Exo peptidase: là nhóm protease xúc tác phân c t các liên kắ ết ở đầ u mạch polypeptide, có th ể là đầu cu i C hoố ặc đầu cu i N, s n ph m t o ra là phân t nh ố ả ẩ ạ ử ỏnhư axit amin, dipeptide

Endo peptidase: là nhóm protease xúc tác phân c t các liên k t peptid nắ ế ội

m ch, s n ph m t o ra là các phân t ạ ả ẩ ạ ử lượng vừa và lớn

1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính c a protease ủ

Ả nh hư ởng nhiệt độ ớ t i th y phân ủ

Nhiệ ột đ có ảnh hưởng l n t i kh ớ ớ ả năng xúc tác của protease Nhi t đ ng v i ệ ộ ứ ớ

hoạ ột đ enzym cao nhất được gọi là nhiệ ột đ ối ưu củ t a enzym và tùy thu c vào lo i, ộ ạcũng như ngu n enzyme Ngoài ra nó còn có th ồ ể thay đổi tu thuỳ ộc cơ chất, pH môi trường, th i gian ph n ờ ả ứng,…

Nhiệ ột đ mà enzym b m t hoàn toàn ho t tính g i là nhiị ấ ạ ọ ệt độ ớ ạ Ở t i h n nhiệt độ

t i h n enzym b bi n tính, ít có kh ớ ạ ị ế ả năng phục hồi, thường nhiệt độ ớ ạ t i h n kho ng ả90-950C Ngượ ạ ởc l i, nhiệt độ dưới 00C hoạt độ enzyme tuy b giị ảm nhưng lại có thể tăng lên khi nâng nhi t đ lên ệ ộ

i v i ch ph m Neutrase kho ng nhi ng thích h p 40-60

nhiệ ột đ n m ngoài kho ng này thì ho t tính enzyme gi m xu ng ằ ả ạ ả ố

Ả nh hư ởng c a pH ủ

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến ph n ng enzym, do ả ứ ảnh hưởng đến

mức độ ion hoá trung tâm hoạt động của enzym, cơ chất Giá tr ị pH môi trường tương ứng v i hoớ ạt độ enzym cao nh t g i là pH tấ ọ ối ưu của enzym và thay đổi tùy thuộc ngu n enzym M t s enzym có pH tồ ộ ố ối ưu rất th p (pepsin, proteinase axit ấ

c a vi sinh v ) ho c khá cao (ủ ật, ặ substilizin có pH tối ưu >10) Ngoài ra pH tối ưu

c a m t enzym còn ph ủ ộ ụ thuộc vào nhi u y u t ề ế ố khác như cơ chất, tính ch t dung ấ

Theo k t qu nghiên c u c a Dey và Dora [13] khi tế ả ứ ủ ối ưu các điều điện để

thủy phân protein trong ph ệế li u tôm b ng protease cho thằ ấy khi tăng nồng độ

enzyme t ừ 1% đến 1,5% thì hi u su t thệ ấ ủy phân tăng, nhưng khi tiếp tục tăng nồng

độ lên n a thì hi u su t th y phân hữ ệ ấ ủ ầu như không thay đổi

Ngoài ồng độ cơ chấ ối đa còn phụthuộ ạ ủa cơ chất

Ả nh hƣ ởng c a các ch t ho t hóa và kìm hãm ủ ấ ạ

Tính hoạt động c a m t s enzym protease còn ph ủ ộ ố ụthuộc vào s có m t cự ặ ủa các ion kim lo i và m t s h p ch t khác M t s trong nh ng chạ ộ ố ợ ấ ộ ố ữ ất đó có tác dụng làm tăng tính hoạt động c a enzym, còn m t s khác l i có tác d ng kìm hãm ho t ủ ộ ố ạ ụ ạ

động c a các enzyme ủ

Protease của Aspergillus awamori 78 2 b kìm hãm b i các ion Co– ị ở 2+, Fe2+, Cu2+,

Hg2+, Ca2+, Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+ và EDTA (etylen diamin tetraaxetic)

Protease I, II,III của Aspergillus oryzae không b kìm hãm b i các ion Baị ở 2+, Ca2+,

Mn2+, Mg2+, Zn2+, nhưng bị kìm hãm b i các ion kim loở ại khác như

Cu2+,Co2+,Cd2+,Fe3+ Protease của Bacillus subtilis ị ấ b m t ho t tính b i h p ch t tạ ở ợ ấ ạo

phức và khi nồng độ urê cao, ngoài ra nó b kìm hãm b i EDTA Conovalov và ị ởDorokhow nghiên cứu ảnh hưởng c a thành phủ ần nước qu n hoả đế ạt độ ủ c a enzym protease nh n th y ion Naậ ấ + và Ca2+ là ch t hoấ ạt hoá enzym protease Đường có tác

d ng kích thích enzym proteasụ e, ngượ ạc l i axit có tác d ng c ch enzym protease ụ ứ ếChất chát có nồng độ 0.02 % có tác d ng kìm hãm s hoụ ự ạt động c a enzym ủprotease

1.2.4 M ột số chế phẩm protease thương mại:

Flavourzyme là m t ph c h p enzyme thộ ứ ợ ủy phân protein đượ ừ

phân c t nắ ộ ạ ử peptide (endoprotease và exopeptidase)

để chuyển hóa protein đế ận đơn vịn t cu i cùng là acid amin ố

Nhiệt độ ối ưu cho Flavourzyme hoạt độ t ng là kho ng 50ả OC – 55OC, pH tối ưu

là t 5.0 7.0 và có kh ừ – ả năng chịu mặ b t hoấ ạt ở 75 ºC trong 10 phút

k m trong trung tâm hoẽ ạt độ

đượ ổn địc ức ch S ế ự ổn định c a Neutrase ủ ® ở

m t nhiộ ệt độ nhất định b ị ảnh hưởng b i lo i và nở ạ ồng độ ủ c

qu n nhiả ở ệt độ 3-5 ° C, Neutrase ® s có ho t tính ít nh t là mẽ ạ ấ ột năm sau khi bảo

1.3. Protein thủy phân và ho t tính ch ng oxy hóa c a protein th y phân ạ ố ủ ủ

Protein th y phân là h n h p s n ph m th y phân protein, bao g m các ủ ỗ ợ ả ẩ ủ ồ axitamin t do, các polypeptide, các peptide v i chi u dài m ch khác nhau và c các ự ớ ề ạ ảprotein chưa bị ủ th y phân [7 ]

Hình 1.2 H n h p protein th y phân ỗ ợ ủ

Không ch có peptide và các ỉ axit amin thu đượ ừc t quá trình th y phân protein ủ

có ho t tính ch ng oxy hóa mà bạ ố ản thân protein cũng có ho t tính ch ng oxy hóa ạ ố[7] Trong phân t ử protein đã chứa s n nhẵ ững đoạn peptide có ho t tính sinh hạ ọc Tuy nhiên, khi n m trong m ch protein (hay polypeptide) các ho t tính này t n tằ ạ ạ ồ ại dưới d ng ti m ạ ề ẩn, không được th hiể ện Khi được gi i phóng ra kh i m ch b ng ả ỏ ạ ằcách th y phân vủ ới enzyme đặc hiệu, các đoạn peptide và các axit amin t do này s ự ẽthể ện đượ hi c ho t tính c a chúng [26, 30] ạ ủ

Các axit amin t ự do thường th hi n ho t tính ch ng oxy hóa không cao trong ể ệ ạ ố

thực ph m và các h ốẩ ệth ng sinh h c; s phân gi i triọ ự ả ệt để protein t o thành các ạ axitamin t ự do thường làm gi m ho t tính ch ng oxy hóa [14, 19 ả ạ ố ]

Hoạt tính ch ng oxy hóa cố ủa các peptide thường cao hơn so với các axit amin

t do, kh ự ả năng đó có liên quan tới tính chất đặc biệt được hình thành t thành ph n ừ ầ

c u t o, tính ch t v t lý và s ấ ạ ấ ậ ự ổn định c a các peptide [25] Liu và Chiang (2008) ủnghiên c u ho t tính chứ ạ ống oxy hóa, đặc điểm, tính ch t c a s n ph m th y phân t ấ ủ ả ẩ ủ ừ

h t v ng tách béo K t qu ạ ừ ế ả thu được s n ph m là các peptide ng n m ch, có kh i ả ẩ ắ ạ ốlượng phân t kho ng 4 - 6 kDa, có ho t tính ch ng oxy hóa cao và có tác d ng làm ử ả ạ ố ụ

gi m huy t áp Bên cả ế ạnh đó nghiên cứu còn cho th y ho t tính ch ng oxy hóa cấ ạ ố ủa

s n ph m th y phân ph ả ẩ ủ ụthuộc vào lo i enzyme th y phân và các thông s c a quá ạ ủ ố ủtrình th y phân ủ như nhiệt độ, pH, t l ỷ ệ enzyme/cơ chất (E/S) và th i gian th y phân ờ ủ[19]

- Phầ ớn l n các peptide ch ng oxy hóa có ngu n g c th c ph m có khố ồ ố ự ẩ ối lượng kho ng 500 - 800 Da, m t s peptide có khả ộ ố ối lượng phân t 8 - 15 kDal Trong ử

thành ph n c u t o c a các peptide này có ch a các ầ ấ ạ ủ ứ axit amin k ị nước như valine, leucine tại đầu nitơ tận cùng và proline, histidine, tyrosine, tryptophan, methionine trong thành phần chu i [29] ỗ

- Các axit amin k ị nước như valine và leucine có thể làm tăng sự tương tác

giữa peptide và axit béo để loại gốc tự do [15]

- Hoạt tính ch ng oxy hóa c a histidine trong chuố ủ ỗi peptide được xác định là

do kh ả năng cho hydro, giữ ố g c peroxy lipid, ho c kh ặ ả năng tạo ph c kim lo i cứ ạ ủa vòng imidazol [17]

Thành ph n ầ axit amin và v trí s p x p c a cị ắ ế ủ ác axit amin trong chu i peptide ỗ

s quyẽ ết định kh ả năng chống oxy hóa c a các peptide Vì vủ ậy, khi thay đổ ịi v trí

s p x p và thành ph n các ắ ế ầ axit amin s ẽ làm thay đổi ho t tính ch ng oxy hóa cạ ố ủa các peptide [19, 29]

- Trong chu i peptide, axit amin histidỗ ine và proline đóng vai trò quan trọng trong hoạt động ch ng oxy hóa và peptide có c u trúc proline - histidine - histidine ố ấ

có kh ả năng chống oxy hóa cao hơn Hơn thế ữ n a peptide này có s ự tương tác với các ch t chấ ống oxy hóa tan trong lipid như - tocopherol, BHA và làm tăng hoạt tính chống oxy hóa c a chúng [14 ủ ]

- Tripeptide chứa 2 axit amin tyrosine có ho t tính chạ ống oxy hóa cao hơn so

với tripeptide chứa 2 axit amin histidine trong h ệthống peroxy hóa của linolic [18]

- N u lo i g c histidine cế ạ ố ủa đầu carbon t n cùng c a chu i peptide thì hoậ ủ ỗ ạt tính ch ng oxy hóa s gi m trong khi lo i g c leucine ố ẽ ả ạ ố ở đầu nitơ tận cùng thì không ảnh hưởng t i ho t tính ch ng oxy hóa [29] ớ ạ ố

Gần đây, trong mộ ốt s thí nghiệm đã cho thấy okara là m t ngu n tiộ ồ ềm năng

c a các thành ph n ch ng oxy hóa (Amin & Mukhrizah, 2006), th y r ng m t s ủ ầ ố ấ ằ ộ ố

s n ph m th y phân protease t okara có kh ả ẩ ủ ừ ả năng hoạt động ch ng oxy hóa ố(Yokomizo, Takenaka, và Takenaka, 2002) K t qu nghiên c u c a Préstamo và ế ả ứ ủ

c ng s ộ ự (2007) đã kiểm tra được tác động c a okara chuủ ở ột đã kết lu n r ng: okara ậ ằ

có th ể có ích như một thành ph n ph b sung vào kh u phầ ụ ổ ẩ ần ăn và có thể ả b o v ệ

môi trường ru t v kh ộ ề ả năng chống oxy hóa và probiotic (Jimeınez- Escrig, Tenorio, Espinosa-Martos, & Rupérez, 2008) Trong mô ph ng các ỏ điều ki n sinh ệ

lý, okara có th gi i phóng các peptide có ho t tính sinh h c tiể ả ạ ọ ềm năng (JiménezEscrig và c ng sộ ự, 2010) Đặc biệt, protein được cô đặ ừ okara và thu được t c kết

-t a, -ti p -theo cho enzyme -thủ ế ủy phân để gi i phóng peptide có ho t tính sinh hả ạ ọc tiềm năng [22]

CHƯƠNG II ẬV T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vậ t liệu nghiên c u: ứ

2.1.1. Bã đậu nành

Bã đậu nành đượ ấc l y t nhà máy sừ ữa đậu nành Vinasoy B– ắc Ninh Bã đậu sau khi l y t ấ ừ nhà máy thì được b o qu n lả ả ạnh Trước khi ti n hành thí nghiế ệm ần clàm rã đông bã đậ ởu nhiệt độ phòng Bã đậu sau rã đông chia thành 2 phần M t ộ

ph n tr c tiầ ự ếp đem thủy phân M t phộ ần đem sấy ở nhiệt độ 125oC – 135oC trong 1

gi ờ trước khi đem thủy phân

2.1.2. Các chế phẩn enzyme thương mại

Các ch phế ẩm enzyme protease được s n xu t t ả ấ ừ công ty Novozym, Đan

M ch: Ch ph m Flavourzyme và ạ ế ẩ Chế phẩm Neutrase

2.2. Hóa chất

- huy t thanh bò ABS ế

- Dung dịch TCA 3% - thuốc thử Folin

- K2HPO4 và KH2PO4 - HCl đậm đặc

- dung d ch Nyhidrin ị - dung d ch Pyridine 20% ị

- Na2CO3; NaOH CuSO; 4

2.3. Thiết bị

Tên thiết bị Tên thiết bị

B n nhi t ể ổ ệ Cân điệ ửn t 4 s ố

Máy đo quang ph ổ

Nhiệt kế

2.4. Phương pháp xác định hoạ t đ ộ protease c a các ch ủ ế phẩ [7m , 20]

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein) bởi enzym Sau đó diệt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng axit tricloaxetic Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine

Hoạt độ protease được xác định ở những pH tối ưu của protease trong chế phẩm Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym xúc tác chuyển hóa được một lượng casein tương đương với 1µmol tyrosine (0,181mg tyrosine) trong 1 phút ở 30oC

 Chuẩn bị dung dịch đệm phosphate có pH 7 :

● Dung dịch A là dung dịch mono orthophosphat 0,2M: hòa tan 36,14g NaH2PO4.2H2O bằng nước cất và định mức đến 1000ml

● Dung dịch B là dung dịch dinatri hydrophosphat 0,2M: hòa tan 71,7g

Na2HPO4.12H2O bằng nước cất và định mức tới 1000 ml

 Chuẩn bị dung dịch enzyme 1g/lít: Cân 0,1g chế phẩm Flavourzyme hoặc Neutrase hòa tan vào dung dịch đệm pH 7 và định mức tới 100 ml

Dựng đường chuẩn tyrosin:

Dung dịch gốc tyrosin 0,001M: cân 0,0181g tyrosine hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N và định mức tới 100ml Các dung dịch khác được pha loãng từ dung dịch gốc được sử dụng để dựng đường chuẩn tyrosine

Hút 1ml mỗi dung dịch tyrosin nồng độ trên cho vào ống nghiệm, bổ sung 5ml dung dịch Na2CO3 0,5M và 1ml dung dịch Folin (pha loãng 4 lần) lắc đều giữ ở

nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó đo màu trên máy ở bước sóng 750nm Với ống đối chứng thay 1ml tyrosin bằng 1ml nước cấte

tyrosine Dựng đường chuẩn

Tyrosine 0,001M (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,5 HCl 0,2N (ml) 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4 3,5 Tyrosine (µmol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30

Kết quả đo OD hiển thị trong bảng sau:

Tyrosine

(µmol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30

OD 0,108 0,142 0,212 0,234 0,403 0,468 0,712

Phương trình đường chuẩn tyrosin y = 2,1603x +0,0509; R2 = 0,9966

y là giá trị OD đo tại bước sóng λ= 750 nm

x là nồng độ tyrosine tính theo [µmol /ml]

 Thủy phân bằng chế phẩm enzyme

Ống thí nghiệm: cho 2ml dung dịch casein vào mỗi ống nghiệm đặt vào bể

ổn nhiệt 50oC trong 10 phút Sau đó, bổ sung 0,5ml dung dịch Neutrase 1g/l (hoặc Flavourzyme 1g/l) vào mỗi ống nghiệm và giữ ở 50oC trong 10 phút Cuối cùng dừng phản ứng bằng cách cho 4,5ml dung dịch axit tricloaxetic 5% lắc đều giữ ở 50oC trong 30phút Ly tâm hỗn hợp phản ứng với tốc độ 6000 v/phút trong 10 phút, định lượng thể tích dịch trong nhận được và nồng độ protein hòa tan thông qua đường chuẩn tyrosin Ống đối chứng: tiến hành như trên, nhưng thay th 0,5ml dung d ch ế ịenzyme Neutrase (Flavourzyme) bằng dung dịch enzym đã vô hoạt

f: hệ số pha loãng dịch thủy phân;

7: thể tích dịch phản ứng trong ống nghiệm [V casein + V e + V TCA ] (ml);

1000: hệ số qu đổi thể tích ra 1 gam chế phẩm enzyme;y

10: thời gian thủy phân (phút);

2.5. Phương pháp xác định độ ẩm ủc a nguyên li u ệ

hơi hết ( sấy đến lượng không đổi)

Hộp nhôm được s y khô 105ấ ở 0C trong 4 gi ờ và cân (chính xác đến 0,0001g) (M) Cân kho ng 3g ả Bã đậu nành cho vào h p nhôm và cân (Mộ 1) Đặt h p nhôm ộvào t sủ ấy ở nhiệt độ 55-600C trong 2 gi Sau 2 gi nâng nhi t lên 105ờ ờ ệ oC s y trong ấ

vòng 2 gi ờ Sau đó lấy h p nhôm ra làm ngu i trong bình hút m và cân Ti p tộ ộ ẩ ế ục

s y h p kho ng 30 phút r i l i làm ngu i và cân l i Quá trình s y s k t thúc khi ấ ộ ả ồ ạ ộ ạ ấ ẽ ếsai lệch giữa hai l n cân không quá 0,001gầ -M2

Tính kế t qu : ả

Độ ẩ m c a m u (W) đư c tính theo công th c: ủ ẫ ợ ứ

W (%) = x 100

Trong đó:

M1: Khối lượng h p nhôm và mộ ẫu trước khi s y (g); ấ

M2: Khối lượng h p nhôm và m u sau khi s y (g); ộ ẫ ấ

M: Khối lượng hộp nhôm ban đầu (g)

2.6. Phương pháp xác định protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng màu giữa protein với huốc tthử Folin Phương pháp này sử dụng kết hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc tyrosine, tryptophane, hystidine để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm [20]

Chuẩn bị hóa chất :

Dung dịch A: cân 2,8598 g NaOH +14,3084 g Na2CO3 hòa tan trong 500ml nước cất

Dung dịch B: cân 1,4232 g CuSO4.5H2O trong 100 ml

Dung dịch C: cân 2,853 Natritatrate.2(H2O) trong 100ml nước cất

Dung dịch Lowry (tỷ lệ thể tích các dung dịch A: B: C = 100: 1: 1): Lấy 40

ml dung dịch A + 0,4ml dung dịch B + 0,4 ml dung dịch C

Thuốc thử Folin từ thuốc thử folin 2N pha loãng 2 lần ta được dung dịch : thuốc thử folin 1N

Dung dịch chuẩn BSA 100mg /l: cân 0,01 g BSA hòa tan bằng nước cất và định mức đến 100ml Các dung dịch khác được pha loãng từ dung dịch gốc được sử dụng để dựng đường chuẩn albumin Pha loãng theo bảng

(ml)

Xây dựng đường chuẩn albumin:

Cho 1ml dung dịch albumin vào mỗi ống nghiệm và bổ sung 1,4 ml dung dịch Lowry và lắc đều bằng máy vortex, để mẫu trong bóng tối 20 phút Sau đó, bổ sung 0,2 ml thuốc thử Folin 1N và trộn đều mẫu bằng máy vortex và để trong bóng tối 30 phút Cuối cùng đo hấp thụ quang ở bước sóng 750nm Kết quả đo được:

Đường chuẩn albumin lập được:

Hình 2.2 Đường chuẩn albumin

Phương trình albumin: y= 0,0044x + 0,0713

Trong đó: x là nồng độ protein (albumin, mg/l)

y: là giá tr ị OD đo được

Đánh giá lượng protein thu được trong m u sau th y phân: ẫ ủ

= X * f* V *10P -3

Trong đó:

P: lượng protein có trong m u (mg); ẫX: Nồng độ protein hòa tan tương ứng giá tr ị OD theo đường chu n ẩBSA [mg/ml];

f: h s pha loãng; ệ ốV: Thể tích dịch thu được sau ly tâm (ml)

Xác định nồng độ protein trong dịch trong sau thủy phân:

Tiến hành các bước như ở phần xây dựng đường chuẩn, nhưng thay 1 ml dịch albumin bằng 1ml dịch trong sau thủy phân của mẫu thí nghiệm

2.7. Phương pháp xác định axit amin trong d ch sau th y phân b ng ị ủ ằ

Ninhydrin[23]

Nguyên tắc: Bản chất của phương pháp là dùng Ninhydrin tác dụng với các α axit

amin nói chung và tạo phức chất màu tím rồi đem so màu trực tiếp và có thêm Pyridine làm chất ổn định

Dung dịch chuẩn axit amin Pha dung dịch glutamic 1mg/ml Các dung dịch : khác được pha loãng từ dung dịch gốc được sử dụng để dựng đường chuẩn glutamic Pha loãng theo bảng

Axit glutamic 1mg/ml (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Nồng độ glutamic (mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Xây dựng đường chu n axit amin ẩ

+ Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,1 ml dịch glutamic với các nồng độ khác nhau vào các ống nghiệm, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml Ninhydrin 2% và

1ml Pyridine 20% Ngâm các ống nghiệm vào các cốc có nhiệt độ 70-75oC trong 7-10 phút Sau đó lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng Sau 30 phút đo màu dung dịch bằng máy đo quang điện ở bước sóng 570 nm với cuvet 1cm + Mẫu đối chứng: cách tiến hành như mẫu thí nghiệm, nhưng thay thế 0,1 ml dịch glutamic bằng 0,1 ml nước cất Từ kết quả thu được dựng đường thẳng biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch với giá trị OD thu được.

+ Kết quả dựng đường chuẩn:

X: nồng độ axit amin tính theo [mg/ml]

Đánh giá lượng axit amin thu nhận được trong d ch trong sau th y phân: ị ủ

TNaa= X * f *V (mg)

Trong đó:

TNaa: lượng axit amin thu nhận được khi th y phân (mg) ủ

X: Nồng độ tương ứng giá tr ị OD theo đường chu n a/a [mg/ml] ẩf: h s pha loãng ệ ố

V: Thể tích dịch thu được sau ly tâm (ml)

Cách tiến hành xác định lượng axit amin trong các mẫu thí nghiệm :

Tiến hành các bước như ở phần lập đường chuẩn, nhưng thay 0,1 ml dịch glutamic bằng 0,1ml dịch trong sau thủy phân

2.8. Phương pháp xác định ho t tính chạ ống oxy hóa b ng DPPH: ằ

dung môi hữu cơ, không phân hủy, không phả ứn ng với oxy, có độ ấ h p thụ cực đại tại 517nm

CCTHH: 18H22N5O6

Pha dung d ch DPPHị

Dung dịch th ử DPPH được pha trong dung môi Methanol 99% có nồng độ 62,5µM

- Cân chính xác 0.0025g b t DPPH vào cộ ốc đong thể tích 100ml

- Thêm vào 100ml MeOH 99% vào c c hòa tan bố ằng đữa thủy tinh

Chú ý: Sau khi pha xong c n cho vào bình th y tinh có nầ ủ ắp đậy t i màu do DPPH ố

được pha trong MeOH nên d ễ bay hơi, có màu tím nên dễ ị ấ b m t màu khi g p ánh ặsáng

D ch cị ần xác định ho t tính chạ ống oxy hóa được s y t i khấ ớ ối lượng không đổi

Abs: Độ ấ h p th c a m u ụ ủ ẫ

Cách xác định IC50 c a ủ th y phân ủ

S d ng hàm TREử ụ ND trong EXCEL để xác định giá tr IC50 d a trên các giá tr ị ự ị

100 µl, 200 µl, 300 µl

2.9. Sơ đồ nghiên c u th y phân ứ ủ Bã đậu nành b ng các ch ằ ế phẩm protease

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thu h i protein s d ng enzyme ồ ử ụ

Bã đậu nành ướt/khô

Phối trộn BD và nước (m/w) Điều ch nh pH ỉ

L c, ly tâm ọ

Dịch trong

Thể tích Định

lượng protein

Định lượng axit amin

Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Các thông số công ngh nghiên c u: ệ ứ

- Nghiên c u ứ ảnh hưởng c a t l ph i trủ ỷ ệ ố ộn BĐ ướt và nước (w/v): 1:2; 1:4; 1:6, 1:8, 1:10

- Nghiên c u ứ ảnh hưởng c a ch khu y t i quá trình thủ ế độ ấ ớ ủy phân BĐ ướt: tĩnh, khuấy liên t c, khuụ ấy gián đoạn

- Nghiên cứ ảnh hưởu ng của nồng độ enzym: 10, 20, 30, 40 (U/g BĐ)

- Nghiên c u k t h p 2 lo i enzym Neutrase và Flavourzyme trong th y phân ứ ế ợ ạ ủ

bã đậu ướt

- Khảo sát t l phỷ ệ ối trộn BĐ khô và nước so sánh với BĐ ướt

Các chỉ tiêu đánh giá:

- Lượng axit amin trong dịch th y phân ủ (g/100g BĐ)

- Hiệu su t thu hấ ồi protein trong bã đậ (g/100g BĐu )

- Hiệu su t thấ ủy phân protein trong bã đậu (%)

- Hoạt tính chống oxy hóa ( giá tr IC50) ị

Nghiên cứ u ảnh hưởng c a các y u t t i th y phân protein trong ủ ế ố ớ ủ Bã đậu nành b ng các ch ằ ếphẩm enzyme

M u thí nghi m: cân vào mẫ ệ ỗi ống nghi m 30g ệ Bã đậu nành ướ , sau đó bổtsung nước cất để đạ ỷ t t l t ệ ừ 1:2; 1:4; 1:6, 1:8, 1:10 và điều ch nh tỉ ới pH 7 Sau đó cho vào mỗi ống 2ml dịch enzyme và để vào b n nhi t 50ể ổ ệ oC, th y phân trong ủvòng 6h K t thúc th y phân bế ủ ằng cách đun sôi cách thủy ở nhiệt độ 90-95oC trong vòng 5-10 phút để vô ho t enzyme Cu i cùng l c và ly tâm m u, thu d ch trong và ạ ố ọ ẫ ịxác định ho t tính chạ ống oxy hóa, lượng protein, lượng axit amin

Mẫu đối ch ng không có tác d ng c a enzyme: mứ ụ ủ ẫu đối chứng được th c hiự ện như trên, nhưng thay thế 2 ml d ch enzyme b ng 2 ml dị ằ ịch enzyme đã được vô hoạt

ở 90-95oC trong vòng 5-10 phút

Sau khi l a chự ọn được giá tr thích h p nh t, chúng tôi l a ch n s d ng trong ị ợ ấ ự ọ ử ụnghiên c u yứ ế ố ếu t ti p theo

Cách xác đị nh lư ng protein nh n đư c do th y phân (P ợ ậ ợ ủ TP)

D ch trong nh n ị ậ được sau ly tâm được đo độ ấ h p th quang bư c sóng ụ ở ớ750nm, t ừ đó ta tính được lượng protein hòa tan trong m u thí nghi m (Pẫ ệ TN) và trong mẫu đối ch ng không có tác d ng c a enzyme (Pứ ụ ủ ĐC) Lượng protein thu nh n ậđược do th y phân s là hi u s c a chúng: ủ ẽ ệ ố ủ

Xác định lƣợng protein trong BĐ đƣa vào thủy phân (Pht)

Cân 30g bã đậu cho vào ng fancol th ố ể tích 45ml Sau đó thêm vào trong ống

300 ml NaOH 2N ngâm qua đêm ở nhiệt độ phòng Sau đó, ta giữ ở bình n nhiổ ệt ở

800C trong vòng 2-3 gi , ti p t c làm ngu i xu ng nhiờ ế ụ ộ ố ệt độ phòng r i l c và ly tâm ồ ọ

v i tớ ốc độ 6000v/phút trong kho ng 20 phút thu dả ịch Định lượng th tích d ch nhể ị ận được và nồng độ protein trong d ch chi t, t ị ế ừ đó xác định được lượng protein trong

Bã đậu nành đưa vào thủy phân

H =tp x 100%

Trong đó: Htp: Hiệu suất thủy phân, %

PTP: lượng protein thu nhận được do th y phân (mg); ủ

Pht: lượng protein trong Bã đậu nành ớtrư c khi th y phân (mg); ủ

Xác định lƣợng protein t chi t (Pự ế tc)

Cân 30g bã đậu cho vào bình tam giác thể tích 500ml Sau đó thêm vào thểtích nước và điều chỉnh pH tương ứng v i m u trong kh o sát và ti n hành th y ớ ẫ ả ế ủphân cùng ki n (th i gian, nhiệ ờ ệt độ) tương ứng v i m u thí nghi m K t thúc quá ớ ẫ ệ ế