Nghiên ứu tổng hợp protein ns1 của virus dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘIChu Thị Minh HảiNGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PROTEIN NS1 CỦA VIRUS DENGUE ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN SINH PHẨM CHẨN ĐỐNChun ngành: Cơng nghệ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Chu Thị Minh Hải

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PROTEIN NS1 CỦA VIRUS DENGUE ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN

SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là công trình do chính tôi nghiên cứu,

h c viên Chu Th Minh H i, chuyên ngành Thọ ị ả ạc sĩ Công nghệ sinh h c, Vi n công ọ ệngh Sinh h c, Công ngh ệ ọ ệ Thực phẩm, Trường Đại h c Bách Khoa Hà N i hoàn ọ ộthành dưới s ự hướng d n cẫ ủa PGS.TS Trương Quốc Phong M t s nhi m v ộ ố ệ ụnghiên c u là thành qu t p th ứ ả ậ ể và đã được đồng s cho phép s d ng.Các k t qu ự ử ụ ế ảtrình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công b trong các luố ận văn khác

Tác giả ận văn lu

Chu Thị Minh H i ả

LỜ I CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự ố ắ c g ng n l c c a b n thân, tôi ỗ ự ủ ả

đã nhận được s ng hự ủ ộ, giúp đỡ và hướng d n t n tình c a các th y cô giáo, gia ẫ ậ ủ ầđình và bạn bè

Đầu tiên tôi xin bày t lòng biỏ ết ơn chân thành và sâu sắc nh t t i PGS.TS ấ ớTrương Quốc Phong – Giám đốc Trung tâm Nghiên c u và Phát tri n Công ngh ứ ể ệ

Sinh học, Trường Đại h c Bách khoa Hà Nọ ội, người đã hướng d n tôi trong suẫ ốt

quá trình nghiên c u và thứ ực ện đề tài, người đã dạhi y tôi nh ng ki n th c quý báu ữ ế ứ

trong thự c tiễn cũng như thái độ, phương pháp làm việc khoa h c ọ

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ, ch bỉ ảo động viên c a các anh/ch /em làm tủ ị ại

phòng thí nghi m proteomic, Trung tâm Nghiên c u và Phát tri n Công ngh Sinh ệ ứ ể ệ

học, Trường Đạ ọi h c Bách khoa Hà N i H ộ ọ đã luôn tạo điều ki n t t nh t cho tôi ệ ố ấ

trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo c a Vi n công ngh Sinh h c, ủ ệ ệ ọ

Công ngh ệ thự c phẩm, Trường Đại h c Bách khoa Hà Nọ ội đã ả gi ng d y tôi trong ạ

suốt những năm học qua

Cuố i cùng, tôi xin g i l i cử ờ ảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân, h là ọ

những người luôn sát cánh, động viên tôi vượt qua những khó khăn để có th hoàn ể

thành luận văn một cách tốt nh t.ấ

Do điều ki n, kh ệ ả năng và th i gian th c hiờ ự ện đề tài có hạn đề tài không th ể

tránh kh i nh ng sai sót Tôi r t mong nh n s ỏ ữ ấ ậ ự đóng góp của các th y cô và các ầ

bạn để đề tài này đượ c hoàn thiện hơn nữa

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nộ i, ngày tháng 4 năm 2018

Học viên

Chu Thị Minh H i ả

MỤ C LỤC

Trang Trang ph ụbìa

Lờ i cảm ơn

Lời cam đoan

Danh m c các ký hi u, các ch vi t t t ụ ệ ữ ế ắ

Danh mụ c các bảng

Danh m c các hình ụ

M Ở ĐẦU

Chương I: TỔNG QUAN 3

1.1.Tình hình d ch b nh sị ệ ốt xuất huy t trên th giế ế ới và tại Việt nam 3

1.1.1.Tình hình dịch bệnh sốt xuất huy t trên th gi 3 ế ế ới 1.1.2.Tình hình d ch SXHD di n ra t i khu vị ễ ạ ực Đông Nam Á 6

1.1.3.Tình hình dịch bệnh SXHD di n ra tễ ại Việt Nam 7

1.1.4 Diễn ế thể ện lượng virus Dengue trong máu ngườbi n hi i bênh s t xu ố ất huyết ……… ….10

1.2 Đặc điểm của virus Dengue 12

1.2.1 Đặc điểm hình thái c u trúc và di truy n cấ ề ủa virus Dengue 12

1.2.2 Đặc điểm protein của virus Dengue 14

1.2.2.1 Protein c u trúc 14 ấ 1.2.2.2 Protein không c u trúc 14 ấ 1.3 Protein NS1 c a virus Dengue 15 ủ 1.3.1 Đặc điểm c a protein NS1 16 ủ 1.3.2.Vai trò và ng d ng c a NS1 19 ứ ụ ủ 1.3.2.1 ng d ng t o vaccine ch ng SXHD 19 Ứ ụ ạ ố 1.3.2.2 NS1 là m c tiêu cho thu c ch ng virus 20 ụ ố ố 1.3.2.3 ng d ng trong chỨ ụ ẩn đoán DENV 20

1.4 Một số phương pháp chẩn đoán sốt xuất huy t Dengue 21 ế

1.4.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng 22

1.4.1.1 Sốt xuất huy t Dengue 22 ế 1.4.1.2 Sốt xuất huy t Dengue có d u hi u c nh báo 23 ế ấ ệ ả 1.4.1.3 Sốt xuất huy t Dengue nế ặng 23

1.4.2 Phương pháp phân lập virus 23

1.4.3 Phương pháp chẩn đoán dựa trên phát hi n acid nucleic 24 ệ 1.4.3.1 Phương pháp RT-PCR 24

1.4.3.2 Phương pháp Real-time RT-PCR 25

1.4.4 Chẩn đoán qua xét nghiệm huy t thanh 25 ế 1.4.4.1 Phương pháp ngăn ngưng kế ồt h ng c u(Hemagglutination ầ Inhibition) 25

1.4.4.2 Phương pháp miễn d ch enzyme phát hi n kháng th IgM (MAC-ị ệ ể ELISA)……… 26

1.4.4.3 Phương pháp chẩn đoándựa trên protein kháng nguyên NS1 27

Chương II: VẬT LỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1.Vật liệu 32

2.1.1 M u RNA virus Dengue 32 ẫ 2.1.2.Vector tách dòng 32

2.1.3.Vector bi u hi n 33 ể ệ 2.1.4.V t ch bi u hi n 34 ậ ủ ể ệ 2.2 Môi trường Hóa ch t 35 – ấ 2.3 Thiết bị 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu 36

2.4.1 Phương pháp vi sinh 36 2.4.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh v t 36 ậ 2.4.1.2 Phương pháp giữ ố gi ng vi sinh v t 37 ậ 2.4.1.3 Phương pháp tạ ếo t bào kh bi n 37 ả ế

2.4.2 Phương pháp sinh học phân t 38 ử 2.4.2.1 Phương pháp tạo cDNA mã hóa gen NS1 b ng enzyme phiên mã ằ ngược38 2.4.2.2 Phương pháp khuếch đại gen mã hóa NS1 b ng PCR 39 ằ

2.4.2.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 40

2.4.2.4 Phương pháp tạo c u trúc pJET1.2::NS1 41 ấ 2.4.2.5 Biến n p vào t bào E coli 42 ạ ế 2.4.2.6 C t DNA plasmid b ng enzyme gi i h n 42 ắ ằ ớ ạ 2.4.2.7 Tinh sạch vector pET22b(+) và đoạn gen mã hóa NS1 43

2.4.2.8 Thiết kế vector bi u hi n pET22b(+)::NS1 44 ể ệ 2.4.3 Phương pháp hóa sinh 45

2.4.3.1 Phương pháp điện di trên gel agarose 45

2.4.3.2 Phương pháp điện di SDS PAGE 45 –

2.4.3.3 Phương pháp tách chiết protein th tan 46 ể 2.4.3.4 Phương pháp tách chiết protein th vùi 47 ể 2.4.3.5 Phương pháp Western blot 47

2.4.3.6 Phương pháp tinh sạch protein 48

2.4.4 Phương pháp Tin-Sinh học 49

2.4.4.1 Phương pháp thiết kế ồ m i 49

2.4.4.2 Phương pháp sử ụ d ng ph n m m MultAlin 50 ầ ề 2.4.4.3 Phương pháp sử ụ d ng ph n m m NEBcutter V2.0 50 ầ ề 2.4.4.4 Phương pháp sử ụ d ng ph n m m Fastầ ề PCR 50

2.4.4.5 Phương pháp sử ụ d ng ph n m m BLAST 51 ầ ề 2.4.4.6 Phương pháp sử ụ d ng ph n m m Translate Tool 51ầ ề 2.4.4.7 Phương pháp sử ụ d ng ph n m m Quantity One 50 ầ ề Chương 3: KẾT QU VÀ TH O LU N 53 Ả Ả Ậ 3.2 Kết quả RT-PCR khuếch đại gen mã hóa NS1 56

3.3 Kết quả tách dòng gen mã hóa NS1 57

3.4 Kết quả ạ ấ t o c u trúc bi u hi n mang gen mã hóa protein NS1 58 ể ệ 3.4.1 X lý vector pET22b và pJET1.2::ử ns1 ằ b ng enyme giới hạn 59

3.4.2 Chèn gen ns1 vào vector pET22b và bi n n p vào ế ạ E.coli 60 3.5 Ch n dòng ọ E.coli mang c u trúc bi u hi n pET22b::ấ ể ệ ns1 61 3.5.1 K t qu ki m tra plasmid b ng PCR v i mế ả ể ằ ớ ồ ặi đ c hiệu cho gen ns1 62 3.5.2 Kiểm tra plasmid bằng cách cắt bằng enzyme gi i h n 62 ớ ạ 3.5.3 Giải trình t ự đểkiểm tra cấu trúc bi u hi n pET22b::ns1 63 ể ệ 3.6 Bi u hi n protein NS1 trong ể ệ E.coli 66 3.7 Khảo sát các điều ki n bi u hi n protein NS1 tái t h p 67 ệ ể ệ ổ ợ 3.7.1 Kh o sát s ả ự ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - IPTG 67 3.7.2 Kh o sát s ả ự ảnh hưởng của tỷ ệ ấ l c p gi ng 68 ố 3.7.3 Kh o sát s ả ự ảnh hưởng của nhiệ ột đ 69 3.7.4 Kh o sát s ả ự ảnh hưởng của thời gian cảm ứng 70 3.8 Kết quả tinh s ch Protein 68 ạ 3.9 ng d ng ch t o th nghi m que th phát hi n nhanh kháng th Ứ ụ ế ạ ử ệ ử ệ ể đặc hiệu kháng virus Dengue t huyừ ết thanh 69

KẾ T LUẬN VÀ KIẾ N NGHỊ 72

TÀI LIỆU THAM KH O 73 Ả

DANH MỤ C CÁC CH ẾT TẮT ỮVI

AP : Alkaline Phosphatase

AuNPs : Gold nanoparticles (hạt nano vàng)

BCIP : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : Base pairs (cặp bazo nitơ)

cDNA : Complement y Deoxyribonucleic acid (DNA ar bổ sung)

E.coli : Escherichia coli

ELISA : Enzyme-Linked ImmonuSorbent Assay (Thử nghiệm hấp phụ

miễn dịch liên kết enzyme) EtBr : Ethidium Bromide

HCSD : Hội chứng sốc Dengue

HI : Hemagglutination Inhibition (phương pháp ức chếngưng kết hồng

cầu) IgG : Immunoglobulin G

IgM : Immunoglobulin M

IPTG : Isopropyl β-D-1-Thioglactopyranoside

LB : Luria Bertani (môi trường LB)

NPT : Nitro Blue Tetrazolium

NSP : Non-Structural Protein (protein phi cấu trúc)

OD : Optical Density (mật độ quang)

PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di trên gel

polyacrylamide) PBS : Phosphate Buffered Saline (dung dịch đệm muối phosphat) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PVDF : Polyvinylidene fluoride

RNA : Ribonucleic acid

SXHD : Sốt xuất huyết Dengue

TAE : Tris - Axit acetic - EDTA

TEMED : Tera Mehylethylen Ediamine

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

DANH M C Ụ CÁC HÌNH Hình 1.1 Các qu c gia và khu vố ực có nguy cơ bùng phát dịch SXHD trên toàn th ế

gi i, 2012 4 ớHình 1.2 S ố lượng các ca mắc SXH được thông báo cho WHO hằng năm 5 1955-2010 5 Hình 1.3 S ố lượng trung bình các trường h p m c SXHD c a 30 quợ ắ ủ ốc gia/lãnh thổ

có dịch cao nh t, 2004-2010 5 ấHình 1.4 S ca m c SXHD và t l t vong do SXHD cố ắ ỉ ệ ử ủa các quốc gia thu c vùng ộĐông Nam Á, 1985-2009 7 Hình 1 5 S phân b cự ố ủa các serotype của virus Dengue t i Việt Nam 8 ạHình 1.6 T l m c SXHD và s ca ch t do SXHD gây ra, 1985-2014 9 ỉ ệ ắ ố ếHình 1 7 Tình hình nhiễm Dengue khu vực Phía Nam 10Hình 1.8 Đường bi u di n th hiể ễ ể ện lượng virus Dengue trong máu người bệnh sốt

Hình 1 9 H gen c a virus Dengue và polyprotein cệ ủ ủa nó 13 Hình 1 10 C u trúc cấ ủa virus Dengue 13 Hình 1 11 C u trúc hấ ạt virus Dengue chưa trưởng thành và trưởng thành ( A: Hạt virus Dengue chưa trưởng thành; B: Hạt virus Dengue đã trưởng thành) 14 Hình 1.12 Các protein của virus Dengue 15 Hình 1.13 C u trúc NS1 d ng dimer và d ng hexamer 17 ấ ạ ạHình 1.14 Quá trình trưởng thành c a NS1 trong quá trình xâm nhi m c a virus ủ ễ ủDengue 19 Hình 1.15 So sánh các phương pháp chẩn đoán dựa trên độ tin c y và tính kh thi ậ ả

của chúng [18] 22 Hình 1 16 Nguyên lý của phương pháp MAC-ELISA 27 Hình 1.17 C u t o que th phát hi n nhanh virus Dengue theo nguyên lí sấ ạ ử ệ ắc kí miễn d ch 29 ịHình 2 2 C u trúc vector pET-22b(+) 34 ấ

Hình 3 1 So sánh các trình t gen mã hóa NS1 cự ủa virus Dengue type 1 bằng ph n ầ

m m MultAlin 54 ềHình 3 2 Kết quả ểm tra tính đặc hiệ ki u c a c p m i NS1-ủ ặ ồ D1-F/R 56 Hình 3.3 Kết quả PCR khuếch đại gen mã hóa NS1 57 Hình 3 4 A-K t qu ế ả điện di plasmid sau khi tách (1-6:plasmid c a 6 khu n lủ ẩ ạc đã

chọn); B- K t quế ả ể ki m tra PCR (1-4: S n ph m PCR c a plasmid cả ẩ ủ ủa 4 dòng 1-4 tương ứng; L: Thang chu n 100bp); C- K t qu c t plasmid dòng s 2 b ng BamHI ẩ ế ả ắ ố ằ

và SalI (2: S n phả ẩm cắt plasmid dòng số 2 bằng enzyme giới hạn; L: Thang chuẩn) 58 Hình 3 5 -K t qu cA ế ả ắt vector bằng enzyme giới hạn (L: ladder 1 kb; 1:

pJET1.2::ns1; 2: pET22b); - K t qu tinh sB ế ả ạch gen ns1 và pET22b sau khi cắt (L: ladder 1 kb; 1: ns1; 2: pET22b) 60 Hình 3 6 Kết quả ế bi n n p vào E.coli c a h n h p sau khi n i pET22b(+) v i ns1ạ ủ ỗ ợ ố ớ 61 Hình 3 7 Kết quả tách plasmid của các dòng khuẩ ạc (Đườn l ng ch y 1-ạ 10 tương

ứng v i plasmid tách ra t các dòng khu n l c t 1-10) 61 ớ ừ ẩ ạ ừHình 3 8 A - K t qu ki m tra plasmid mang gen ns1 b ng PCR (1-10: S n phế ả ể ằ ả ẩm PCR của 10 dòng khu n l c đánh s 1-10; - : M u ki m ch ng âm; L- ladder ẩ ạ ố ẫ ể ứ

100bp); B - Kết quả ể ki m tra plasmid (10) mang gen ns1 b ng enzyme giằ ới hạn BamHI và SalI; L-Lader 1kb 62 Hình 3 9 Kết quả ả gi i trình t ự đoạn gen chèn trong vector pET22b(+)và trình t ựaxit amin suy di n cễ ủa đoạn gen đã giải trình t (RBS-v trí bám c a ribosome; ự ị ủBamHI và SalI là v trí cị ắt của hai enzyme giới hạn) 64 Hình 3 10 Kết quả so sánh trình t ự gen đã chèn vào vector pET22b trong nghiên

c u này v i các trình t gen trên NCBI 65 ứ ớ ựHình 3 11 A- K t qu ế ả điện di SDS-PAGE c a mủ ẫu protein thu đượ ừc t dòng E.coli BL21(DE3) tái tổ ợ h p mang cấu trúc pET22b::ns1 Đường ch y 1, ph protein dạ ổ ịchchiết từ E coli mang cấu trúc pET22::ns1; Đường ch y 2, ph protein dạ ổ ịch chiết từ

E coli không mang genns1; B- Kết quả western blot c a mủ ẫu protein tương ứng 66

Hình 3 12 Khảo sát s ự ảnh hưởng c a nủ ồng độ IPTG đến s bi u hi n c a protein ự ể ệ ủNS1 trong vi khuẩn E.coli Đường ch y 1-ạ 8 tương ứng là v i nồng độ IPTG là 0,05 ớmM; 0,1 mM; 0,3 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1,0 mM; 1,3 mM và 1,5 mM 68 Hình 3 13 Kh ảo sát s ự ảnh hưởng c a tủ ỷ ệ ấ l c p giống đến s bi u hi n cự ể ệ ủa protein NS1 trong E.coli 69 Hình 3 14 Khảo sát s ự ảnh hưởng c a y u t nhi t đ n s bi u hi n c a protein ủ ế ố ệ ộ đế ự ể ệ ủNS1 trong vi E.coli 70 Hình 3 15 Khảo sát s ự ảnh hưởng c a th i gian c m ứng đế ự ểủ ờ ả n s bi u hi n c a ệ ủprotein NS1 trong vi khu n E.coli 71 ẩ

M Ở ĐẦU

S t Dengue (SD), s t xu t huy t Dengue (SXHD) và h i ch ng s c Dengue ố ố ấ ế ộ ứ ố(HCSD) là b nh do virus Dengue gây ra, b nh lây lan t ệ ệ ừ người sang người, vector truy n b nh là muề ệ ỗi Aedes aegypti Trong su t nhi u th p kố ề ậ ỷ qua, t l m c b nh ỉ ệ ắ ệ

SD, SXHD và HCSD v n không ngẫ ừng tăng lên, hiện nay chưa có vắc xin phòng

ngừa cũng như chưa có thuốc đặc tr Theo T ị ổchức Y tế Thế ớ gi i (WHO) hi n t i có ệ ạkho ng 3,9 t ả ỷ người chiế- m kho ng ả hơn 40% dân s ốthế ới, ở gi các qu c gia có khố í

h u nhiậ ệt đới và c n nhiậ ệt đới đang có nguy cơ mắc b nh SXHD Dengue là mệ ột trong nh ng virus nguy hi m nhữ ể ất đe dọa đến hơn 1/3 dân số thế giới ở các vùng nhiệt đới và c n nhiậ ệt đới Theo WHO, có t 390 ới triệu trường h p m c SD mợ ắ ỗi năm trên toàn thế ớ gi i và có kho ng 3.9 ả % người nhi m dengue b ch t hễ ị ế ằng năm

T i Vi t Nam, riêng t ạ ệ ừ đầu năm 2017 đến 8/2017 đã có 80.555 trường h p mợ ắc SXH và trong đó có 22 trường h p t vong [21], [22] ợ ử

Protein NS1 c a virus Dengue là mủ ột glycoprotein có độ tương đồng và tính

b o th cao, t n t i c d ng liên k t màng (k c trong t ả ủ ồ ạ ả ở ạ ế ể ả ở ế bào cũng như ở trên b ề

m t c a t bào) và d ng ti t ra ngo i bào, xu t hi n trong huy t thanh b nh nhân ặ ủ ế ạ ế ạ ấ ệ ế ệnhiễm virus Dengue giai đoạn s m, có th phát hiớ ể ện trước khi hình thành các kháng thể Dengue IgM và IgG Hi n nay vi c chệ ệ ẩn đoán virus Dengue có nhiều phương pháp như: Làm các xét nghiệm c n lâm sàng; các xét nghi m mi n dậ ệ ễ ịch như phát

hi n kháng nguyên NS1 (ELISA-ệ NS1) đã được s dử ụng để phát hi n protein NS1 ệ

của virus Dengue, tuy nhiên phương pháp này không thể đị nh týp, sinh phẩm đắt Phương pháp huyết thanh l c phát hi n kháng th b ng k ọ ệ ể ằ ỹthuật Mac-ELISA, hoặc phân lập virus thường cho k t qu ế ảchậm không phù h p trong chợ ẩn đoán và điều trị, chủ ế y u ph c v cho công tác giám sát d ch t K thu t sinh h c phân t Nested ụ ụ ị ễ ỹ ậ ọ ửRT-PCR, real-time RT-PCR để chẩn đoán virus Dengue đã được phát tri n và ng ể ứ

d ng trong chụ ẩn đoán Tuy nhiên các phương pháp này vẫn chưa được áp d ng ph ụ ổ

bi n và ng d ng th c ti n t i Vi t Nam do chi phí cao, h n ch v trang b ế ứ ụ ự ễ ạ ệ ạ ế ề ị và đội ngũ nhân viên làm xét nghiệm Vi c t o ra mệ ạ ột phương pháp phát hiện nhanh, chính xác virus Dengue ở giai đoạn s m nhi m b nh là vô cùng quan tr ng và c n thi tớ ễ ệ ọ ầ ế, góp phần cho các bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều tr chính xác, hi u qu và kị ệ ả ịp

Xuất phát t ừ tình hình đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên c u t ng ứ ổ

h p Proteins NS1 virus Dengue ng d ng phát tri n sinh ph m chợ ứ ụ ể ẩ ẩn đoán” để phục

v phát tri n b sinh ph m chụ ể ộ ẩ ẩn đoán nhanh virus Dengue phù hợp điều ki n tệ ại Việt Nam

M c tiêu cụ ủa đề tài:

- Tạo được protein NS1 tái t hổ ợp để ứ ng d ng phát tri n kit chụ ể ẩn đoán nhanh

N i dung nghiên cộ ứu:

- Tách dòng gen mã hóa protein NS1 từ virus Dengue

- T o c u trúc bi u hi n tái t h p phù h p ch ng ch ạ ấ ể ệ ổ ợ ợ ủ ủE.coli

- Biểu hi n và tinh s ch protein NS1 ệ ạ

- S d ng NS1 tái t h pt o th nghi m que th phát hi n nhanh kháng th ử ụ ổ ợ ạ ử ệ ử ệ ể

đặc hi u virus Dengue t huy t thanh ệ ừ ế

Chương I: ỔT NG QUAN 1.1 Tình hình d ch b nh s t xu t huy t trên th giị ệ ố ấ ế ế ớ i và tại Vi t nam ệ

1.1.1 Tình hình d ch b nh s t xu t huy t trên th gi ị ệ ố ấ ế ế ới

S t Dengue (SD), s t xu t huyố ố ấ ết Dengue (SXHD) và h i ch ng s c Dengue ộ ứ ố(HCSD) là b nh do virus Denguegây ra, b nh lây lan t ệ ệ ừ người sang người, vector truy n b nh là ề ệ muỗi Aedes aegypti Trong su t nhi u th p kố ề ậ ỷ qua, t l m c b nh ỉ ệ ắ ệ

SD, SXHD và HCSD v n không ng ng ẫ ừ tăng lên, hiện nay chưa có vắc xin phòng

ngừa cũng như chưa có thu c đố ặc trị

Theo T ổ chức Y t ế Thế ớ gi i (WHO) hi n t i có kho ng ệ ạ ả hơn 3.9 t ỷ người - chiếm kho ng ả hơn 40% dân s th gi i, các qu c gia có khí h u nhiố ế ớ ở ố ậ ệt đới và c n ậnhiệt đới đang có nguy cơ mắc b nh Sệ XHD Ước tính có t 390 triới ệu trường hợp

m c SD mắ ỗi năm trên toàn th gi i Hế ớ ằng năm, có khoảng hơn 500.000 trường hợp

ca m c Sắ XHD nghiêm tr ng c n ph i nh p vi n Tọ ầ ả ậ ệ rong đó, m t t l r t l n(kho ng ộ ỉ ệ ấ ớ ả90%) là tr ẻ em dưới 5 tuổi Và kho ng 5% cả ủa các trường h p nhi m Dengue b ợ ễ ịchết hằng năm[17], [16], [22]

D ch Sị D được ghi nh n l n u tiên ậ ầ đầ vào năm 1635 tại phía Tây của nước Pháp và đại dịch SXHD được ghi nh n t i Philippines vào nhậ ạ ững năm 1953-1954

và tại Thái Lan năm 1958 [16] Trước năm 1970, chỉ có 9 qu c gia xu t hi n d ch ố ấ ệ ịSXHD Ngày nay, SD và SXHD đã ảnh hưởng đến hơn 100 quốc gia và vùng lãnh thổ trên toàn th gi iế ớ , trong đó có 20 nước châu Phi, 42 nước Châu Mỹ, 7 nước Đông Nam Á, 4 nước phía đông Địa Trung Hải và 29 nước thu ckhu v c Tây Thái ộ ựBình Dương Đặc bi tệ , Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương là hai khu v c b nh ự ị ảhưởng nghiêm tr ng nh t vọ ấ ới hơn 2,3 triệu trường hợp được công b nhi m SXHD ố ễtrong năm 2010 [17] Hằng năm, có hằng trăm nghìn ca nhiễm SXHD nghi m trong ệ

và có khoảng 20.000 trường h p t vong do m c Sợ ử ắ XHD[15] D ch b nh s t xuị ệ ố ất huyết đang gia ng thườtă ng xuyên, trong th i kì d ch di n ra, t l m c bờ ị ễ ỉ ệ ắ ệnh đố ới i v

những người trước đây chưa từng ti p xúc v virus Dengue lên tế ới ới 40% đến 50%

và n n kinh t c a h u hề ế ủ ầ ết các nước nhiệt đới trên toàn th gi i S ế ớ ựxuất hi n và lan ệtruy n c a 4 serotype virus Dengue t châu Á t i châu M , châu Phi và các vùng ề ủ ừ ớ ỹ

Địa Trung Hải đã cho thấy nguy cơ xảy ra một đại dịch toàn c u [15] ầ

Hình 1.1: Các qu c gia và khu vố ực có nguy cơ bùng phát dịch SXHD trên toàn thế

giới, 2012 [17]

Trong 50 năm qua, s mố ca ắc b nh ệ SXHD đã tăng lên kho ng 30 l n trên ả ầtoàn c u, và s ầ ự gia tăng mở ộng đị r a lí c a d ch SD t i các qu c gia mủ ị ớ ố ới Trong giai đoạn mười năm, con số ắc SD/SXHD đượ m c báo cáo cho T ch c Y t th gi i ti p ổ ứ ế ế ớ ế

tục tăng theo cấp s nhân T ố ừ năm 2000 đến năm 2008, số ca mắc SD/SXHD được báo cáo là 1.656.870, g p 3,5 lấ ần giai đoạn 1990-1999 (479.848 ca) Trong năm

2008, có 69 qu c gia có s hi n di n c a SD/SXHD t p trung ố ự ệ ệ ủ ậ ở Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương và châu M [16] ỹ

Năm 2008 số ca mắc SD/SXHD được ghi nh n t i Châu Mậ ạ ỹ, Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương đã vượt quá 1,2 tri u và con s này là 2,3 triệ ố ệu vào năm

2010 Gần đây, số ca mắc SD/SXHD được báo cáo ngày càng gia tăng Riêng tại châu Mỹ năm 2010 đã ghi nhận 1,6 triệu trường h p sợ ốt Dengue trong đó 49.000 trường h p là s t Dengue n ng[18] ợ ố ặ

Không nh ng s ca mữ ố ắc SD tăng lên hàng năm ở các khu vực đã có SD, mà ngày càng có nhi u khu v c m i có b nh nhân m c SD, và con s ề ự ớ ệ ắ ố gia tăng ở ốc độ tbùng nổ Năm 2010 những ca SD đầu tiên được ghi nhận đầu tiên t i Pháp và ạ

1.800 ca được ghi nhận và thêm năm quốc gia khác của châu Âu cũng ghi n ậh n

1.1.2 Tình hình d ch SXHD di n ra t i khu vị ễ ạ ực Đông Nam Á.

Trong s 2,5 t ố ỉ người trên toàn th giế ới đang sống trong các qu c gia và khu ố

vực có nguy cơ mắc SXHD thì có kho ng 1,3 t ả ỉ ngườ ối s ng khu vở ực Đông Nam Á [16] K t ể ừ năm 2000, dịch SXHD đã lan rộng t i nhi u qu c gia trong khu vớ ề ố ực này, năm 2003 chỉ có 8 qu c gia gố ồm Bangladesh, Ấn Độ,Indonesia, Maldives, Myanmar, Sri Lanka, Thái Lan và Timor-Leste d ch SXHD có ị nhưng đến năm 2009 thì t t c các qu c gia trong khu vấ ả ố ực đều đã xuất hiện các trường h p nhi m SD ợ ễ[18]

Các quốc gia trong vùng Đông Nam Á được chia thành 4 vùng khí h u riêng ậ

bi t v i kh ệ ớ ả năng lan truyền b nh SXHD khác nhau D ch SXHD là m t trong ệ ị ộ

nh ng các vữ ấn đề quan trọng đối v i s c kh e cớ ứ ỏ ủa người dân các quở ốc gia như Indonesia, Myanmar, Sri Lanka, Thái Lan, Timor-Leste, nơi có khí hậu nhiệt đới gió mùa và cũng là vùng xích đạo nơi nuỗi Aedes aegypti ph bi n t thành th cho ổ ế ừ ị

t i nông thôn, ớ ở đây có nhiều serotype virus lưu hành và SXHD là một trong nh ng ữnguyền nhân hàng đầu gây nh p viậ ện cũng như gây ra các ca tử vong tr em [18] ở ẻ

Theo báo cáo c a WHO cho th y, t l các ca t vong trong khu v c này ủ ấ ỉ ệ ử ở ự

x p x khoấ ỉ ảng 1%, nhưng ở Ấn Độ, Indonesia và Myanmar D ch b nh x y ra các ị ệ ả ởkhu vực cách xa các vùng thành thị thì tỉ ệ l các ca t vong có th ử ểlên tới 3-5% [18]

Tại Indonesia, nơi hơn 35% dân số ố s ng các khu v c thành thở ự ị, đã có 150.000 ca mắc SXHD vào năm 2007 với hơn 25.000 trường hợp được xác nh n là ậ

t ừthủ đô Jakarta và Đông Java Tỉ ệ ử vong đạt xấ l t p x 1% [18] ỉ

T i Thái Lan, dạ ịch SXHD được x y ra trên c 4 vùng: phía B c, vùng Trung ả ả ắtâm, Đông Bắc và phía Nam Trong tháng 6 năm 2007, dịch b nh bùng phát các ệ ở

t nh: Trat, Bangkok, Chiangrai, Phetchabun, ỉ Phitsanulok, Khamkaeng Phet, Nakhon Sawan và Phit Chit T ng s ca mổ ố ắc SXHD được báo cáo t ừ tháng 1 đến tháng 11 năm 2007 là 58.836 trường h p, t l t vong t i Thái Lan là 0,2% [18] ợ ỉ ệ ử ạ

Hình 1.4: S ốca mắ c SXHD và t l t vong do SXHD c a các qu c gia thu c vùng ỉ ệ ử ủ ố ộ

l m c SXHD thệ ắ ấp hơn so với các khu v c còn lự ại do điều ki n khí h u.ệ ậ Những năm

đầu SXHD ch xu t hi n mỉ ấ ệ ở ột vài địa phương với các d ch nh , s ổ ị ỏ ố người m c ắ

b nh ít, t l t vong cao Nhệ ỷ ệ ử ững năm sau, SXHD lan rộng trên nhi u t nh thành về ỉ ới

s ca bố ệnh ngày càng gia tăng Đỉnh cao là các năm 1983, 1987 với qui mô toàn

quốc Tỷ ệ ắ l m c chung cho c ả nước từ 41,02 (1981) đến 462,24/100.000 dân (1987)

Do công tác điều tr ị đạt được nhi u ti n b nên t l t vong gi m t 2,7 (1983) ề ế ộ ỷ ệ ử ả ừ

xu ng còn 0,16 (1994)/100.000 dân ố

Năm 1996, SXHD được ghi nh n trong 44 trên 53 t nh thành trong c ậ ỉ ả nước Năm 1998, dịch SXH bùng phát 19 t nh thành phía Nam v i 119429 ca m c ở ỉ ớ ắ(438,9/100000 dân) và 342 ca chết (1,26/100000 dân) [4]

T ừ năm 1998, chương trình quốc gia phòng ch ng s t xu t huyố ố ấ ết đã được thành lập và đã cải thi n nhi u trong vệ ề ấn đề ể ki m soát, chẩn đoán và điều tr b nh ị ệTuy nhiên, SXHD chưa có chiều hướng gi m trong nhả ững năm gần đây.

Theo báo cáo của C c Y t d phòng t i hộụ ế ự ạ i ngh tăng cư ng công tác phòng, ị ờchống s t xu t huy t cho các t nh/TP khu v c phía nam ngày 15/08/2012, tính t ố ấ ế ỉ ự ừđầu năm 2012 đến 15/08/2012, c ả nước ghi nhận hơn 39.987 trường h p m c SXH ợ ắ

t i 52 tạ ỉnh/TP, tăng 35,3% so với cùng kỳ năm 2011, trong đó có 26 trường h p t ợ ửvong Các t nh có trên 3000 ca m c là TP H ỉ ắ ồ Chí Minh, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, An Giang Năm 2013, ịch SXH tăng mạ d nh các t nh khu v c mi n ở ỉ ự ềTrung và Tây Nguyên Tích lũy số ca m c SXH các t nh mi n Trung là 3.593 ca ắ ở ỉ ề(tăng 130%), Tây Nguyên: 339 ca (tăng 73%) và các tỉnh phía Nam: 35.374 ca (tăng 14%)

Ở nước ta hiện đang lưu hành đồng th i c b n typevirus Dengue gây b nh ờ ả ố ệSXH là: D1 (30%), D2 (26%), D3 (20,3%) và D4 (23,6%), đặc bi t type D4 đã xuất ệ

hi n c khu v c mi n Nam và mi n Trung C 4 type này luân phiên nhau gây nên ệ ở ả ự ề ề ả

d ch b nh, theo các nhà chuyên môn, d ch SXHD di n ra có tính chu kì, c ị ệ ị ễ ứ 3 năm

lại có 1 lần bùng phát dịch bệnh

Hình 1 5: S phân b c a các serotype c a virus Dengue tự ố ủ ủ ại Việt Nam

D4

D2

Theo k t qu giám sát c a Vi n Pasteur TP H ế ả ủ ệ ồ Chí Minh được báo cáo tại

h i nghộ ị, trong 7 tháng đầu năm 2012, tại khu v c phía Nam tình hình b nh SXH ự ệ

di n bi n khá ph c t p Các chuyên gia d ch t nhễ ế ứ ạ ị ễ ận định nguyên nhân c a d ch ủ ịSXH gia tăng trên diện r ng là do bộ ệnh chưa có vắc-xin phòng ngừa, chưa có thuốc

đặc tr và m t trong nh ng nguyên nhân quan tr ng dị ộ ữ ọ ẫn đến tình tr ng bùng phát ạ

d ch trên di n r ng do s ị ệ ộ ựchủ quan, lơ là, thiếu ý th c cứ ủa người dân trong phòng, chống d ch b nh dù bị ệ ệnh SXH không quá khó để phòng tránh

Hình 1.6: T l m c SXHD và s ca ch t do SXHD gây ra, 1985-2014 ỉ ệ ắ ố ế

(ngu n: Vi n Pasteur ồ ệ – Ban điều hành d án sự ốt xuất huyết)

Tính đến 24/7/2016 đã có có 48.798 ca, x y ra trên 48 trong 63 t nh thành ả ỉtrên c ả nước, có 17 ca t vong và tính riêng khu vử ực Tây Nguyên đã có 7.500 ca mắc SXHD, trong đó Gia Lai có 3.081 ca; Dak Lak: 1.865 ca; Kon Tum: 1.387 ca

và Dak Nông: 1.079 ca ( C c Y T D Phòng-B Y T - ụ ế ự ộ ế Ban ĐHQG SXH) Ngoài khu v c Tây Nguyên thì tình hình d ch b nh SXHD di n ra các t nh thành phía ự ị ệ ễ ở ỉNam là rất thường xuyên và nghiêm tr ng, d ch SXH x y ra ọ ị ả ở đây ở ọ m i thời điểm trong năm nhưng đặc bi t t p trung vào các tháng ệ ậ mùa mưa trong năm ừ t tháng 6 đến tháng 11

Hình 1 7: Tình hình nhiễ m Dengue khu vực Phía Nam

(Ngu n: Vi n Pasteur ồ ệ – Ban ĐHDA SXH)1.1.4 Di ễn biến thể hiệ n lư ợng virus Dengue trong máu ngườ i ệnh ốt b s

xuất huy t ế

Hình 1.8: Đườ ng bi u di n th hiể ễ ể ện lượng virus Dengue trong máu người bệnh sốt

xuất huyết (ph n ng cả ứ ủa cơ thể ề ặ v m t miễn dịch học (kháng nguyên Dengue NS1, kháng thể IgM và IgG) cho phép chọn phương pháp thích hợp để ẩn đoán SXH ch vào từ ng thời điểm cụ ể th

Đểchẩn đoán sớm b nh SXH, trong nhệ ững ngày đầu bệnh nhân đang sốt, chúng ta có thể dùng các phương pháp cấy virus, tìm AND c a virus Dengue b ng ủ ằ

ph n ng chuả ứ ỗi polymerase, tìm kháng nguyên NS1 Đểchẩ đoán bện nh SXH giai ởđoạn muộn chúng ta dùng phương pháp tìm các kháng thểIgM và IgG Nhìn vào đường bi u diể ễn lượng virus Dengue trong máu, chúng ta thấy 2 ngày trước khi s t, ố

lượng virus tăng đột bi n và kho ng ngày s t th ế ả ố ứ 2, lượng virus đạt tối đa Sau đó

lượng virus giảm đi cũng rất nhanh Thực ra, đường bi u di n này th hi n ợng ể ễ ể ệ lưvirus cao hơn ngưỡng chúng ta phát hiện được Ngay sau khi b ịmuỗi đốt, virus Dengue đã nhiễm vào cơ thể ngườ ị đố ồi Sau khi vào cơ thểi b t r , virus Dengue sinh sôi rất nhanh Th i gian t khi b mu i đờ ừ ị ỗ ốt đến khi s t g i là thố ọ ời gian b nh Thủ ệ ời

gian ủ ệ b nh kéo dài t 3-ừ 14 ngày, thông thường là t 4-7 ngày Tính t khi b ừ ừ ịmuỗi

đố ớt t i khi s t, lưố ợng virus trong cơ thể ngày càng nhi u ề [23]

1.2. Đặc điểm c a virus Dengue ủ

Virus Dengue là nguyên nhân gây ra b nh SXH m t b nh truy n nhiệ – ộ ệ ề ễm gây nên nhi u thi t h i v ề ệ ạ ề người cũng như nền kinh t cế ủa các nước nhiệt đới và c n ậnhiệt đới mà cho đến nay vẫn chưa có vaccine cũng như thuốc điều tr cho b nh ị ệnày Vào năm 1943, Ren Kimura Susumu Hotta lvà ần đầu tiên đã phân lập được virus Dengue

Virus Dengue là thành viên trong chi Flavivirus thuộc h ọ Flaviridae Virus Dengue có kháng nguyên k t h p b ế ợ ổ thể, trung hòa và ngăn ngưng kế ồt h ng c u ầ

D a vào s khác bi t giự ự ệ ữa các điểm quyết định kháng nguyên, người ta chia virus Dengue ra làm 4 type khác nhau M c dù 4 type Dengue có tính ch t kháng nguyên ặ ấkhác nhau nhưng chúng có mộ ốt s quyết định kháng nguyên chung, nh t là các ấkháng nguyên ngăn ngưng k t h ng c u, nên chúng có hiế ồ ầ ện tượng ngưng kết chéo

gi a các type B n type khác nhau cữ ố ủa virus Dengue được gọi là các “Serotype” vì

m type có s ỗi ự tương tác khác nhau với kháng th trong huy t thanh cể ế ủa người Các Seorotype được đặt tên là: DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4 (hiện nay đã phát hi n thêm serotype ệ thứ 5 tại Ấn Độ) [9] Các serotype này tương tự nhau, h ệgen c a chúng gi ng nhau khoủ ố ảng 65% Người b nh sau khi m c m t trong các ệ ắ ộserotype Dengue s có kh ẽ ả năng miễn d ch suị ốt đờ ới v i loại đã mắc nhưng đố ới v i 3 serotype còn l i thì kh ạ ả năng miễn d ch ch ị ỉ duy trì được trong 2-3 tháng sau khi

m c b nh ch không ph i suắ ệ ứ ả ốt đời nên một người có th mể ắc SXHD lên đến 4 l n, ầnhưng khả năng này rất hi m khi x y ra ế ả

1.2.1. Đặc điểm hình thái c u trúc và di truyấ ề n của virus Dengue

H gen cệ ủa virus Dengue chỉ ồ g m m t sộ ợi RNA đơn, được g i là RNA cọ ảm

ứng dương vì nó có thể ự tr c ti p dế ịch mã để ạ t o ra protein H gen c a virus Dengue ệ ủ

có g n 11 kbầ , đầu 5’ của s i RNA h ợ ệ gen có mũ và đầu 3’ không có đuôi polyA Khi sợi RNA được d ch mã s t o thành m t polypeptide dài sau ị ẽ ạ ộ đó chuỗi polypeptide này được c t b i các enzyme khác nhau t o thành 10 lo i protein trong ắ ở ạ ạ

đó có 3 protein cấu trúc và 7 protein không c u trúc[10] ấ

Hình 1 9: H gen c a virus Dengue và polyprotein c a nó [12] ệ ủ ủ

H virus Dengue có d ng g n gi ng hình cạt ạ ầ ố ầu, có đường kính x p x 50 nm ấ ỉLõi c a virus là l p nucleocapsid ủ ớ có đường kính 30nm, chứa 32 capsome Bao xung quanh lõi nucleocapsid của virus Dengue m t llà ộ ớp lipid kép đượ ấ ừ ậc l y t v t ch ủ

g i là v virus G n vào v c a virus là 180 b n sao c a 2 glycoprotein màng (M) ọ ỏ ắ ỏ ủ ả ủ

và v (E), các protein này hình thành nên m t l p b o v ỏ ộ ớ ả ệ bên ngoài đồng th i kiờ ểm soát quá trình xâm nhiễm c a virus vào trong các t bào củ ế ủa con người [12]

Hình 1 10 : Cấ u trúc c a virus Dengueủ

(ngu n: Dengue Viruses-Nature.com) ồ

H virus Dengue ạt chưa trưởng thành được bao ph bủ ởi 60 trimer không đối

x ng nhau c a heterodimer c a ti n thân protein màng(prM) và protein v (E), ứ ủ ủ ề ỏchúng nhô ra như các gai trên bề ặ ủ m t c a h t virus ạ Đố ới v i các h t virus Dengue đã ạtrưởng thành thì b m t hề ặ ạt virus thườ g trơn nhẵn n và l p màng c a nó hoàn toàn ớ ủđược bao b c b i m t l p v protein [12] ọ ở ộ ớ ỏ

Hình 1 11 : Cấ u trúc hạt virus Dengue chưa trưởng thành và trưởng thành ( A: Hạt virus Dengue chưa trưởng thành; B: Hạt virus Dengue đã trưởng thành) [12]

1.2.2. Đặc điểm protein c a virus Dengue ủ

- Tiền thân c a protein màng ủ (prM): protein này được enzyme protease

c a t bào v t ch phân củ ế ậ ủ ắt để ạo thành protein màng trưở t ng thành Kích thước c a nó kho ng 24 kDa ủ ả

- Protein v ỏ (E): ế ợ K t h p v i protein màng t o thành l p v bên ngoài ớ ạ ớ ỏ

b o v h t virus và ki m soát quá trình xâm nhi m c a virus vào t bào ả ệ ạ ể ễ ủ ế

vật chủ Kích thước kho ng 60 kDa ả

1.2.2.2 Protein không c u trúc ấ

H t virus Dengue g m có 7 protein không c u trúc: NS1, NS2A, NS2B, ạ ồ ấNS3, NS4A, NS4B, và NS5 Quá trình x ử lý để ạ t o thành các protein không cấu trúc riêng biệt được th c hi n nh s k t h p c a c enzyme c a t bào v t ch và ự ệ ờ ự ế ợ ủ ả ủ ế ậ ủ

ph c h p enzyme protease NS2B-NS3 c a virus Dengue Ngoài ho t tính protease ứ ợ ủ ạ

là một protein đa chức năng, nó có cả ho t tính c a enzyme RNA polymerase và ạ ủ

ho t tính c a enzyme methyltransferase ạ ủ – enzyme liên quan đến quá trình gắn mũ vào các s i RNA Vai trò cợ ủa protein NS1 được bi t là c n thi t cho quá trình sao ế ầ ếchép RNA c a viruủ s, nhưng cho đến nay vẫn chưa được hiểu rõ nhưng có mộ ốt s nghiên c u cho th y r ng, khi NS1 b t bi n s ứ ấ ằ ị độ ế ẽ ảnh hưởng t i quá trình khớ ởi động

t ng h p mổ ợ ạch dương RNA Các protein không cấu trúc còn l i hoạ ặc chưa hiểu rõ

hết hoặc vẫn chưa tìm ra được chức năng của chúng [6]

Hình 1.12: Các protein c a virus Dengue[10] ủ1.3. Protein NS1 của virus Dengue

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên c u t p trung vào nghiên c u ứ ậ ứcác đặc tính c a protein NS1 nh m ph c v cho nhi u mủ ằ ụ ụ ề ục đích khác nhau Gilda

trong vector pET28a với đuôi 6xHis ở đầu N Protein NS1 được bi u hi n trong ể ệ

Escherichia coli strain Rosetta d ng th ở ạ ể vùi, có kích thước khoảng 46 kDa, và đã được tinh s ch b ng s c kí ái l c metal-ạ ằ ắ ự chelating (IMAC) dưới điều ki n bi n tính ệ ếHuy t thanh t bế ừ ệnh nhân dương tính với Dengue đã thể ệ hi n ph n ng v i protein ả ứ ớNS1 tái t h p này khi th c hiổ ợ ự ện ELISA và Western blot Protein rNS1 được s ử

d ng tr c tiụ ự ếp để gây mi n d ch ễ ị ở chuột Kháng th ể đa dòng đượ ạc t o ra t ừ chuột gây miễn dich đã phản ứng v i kháng nguyên NS1 t nhiên c a virus Dengue type ớ ự ủ

1 [4]

Danielle Ferreira de Oliveira; et al, (2013) đã sử ụng pET28a để d tách dòng

và bi u hi n protein NS1 trong E.coli BL21 DE3 Protein bi u hiể ệ ể ện có kích thước

hi n thành công full-gene mã hóa NS1 NS1 ệ này được bi u hi n m c cao (10 30 ể ệ ở ứ –mg/l) và được tinh sạch cũng như tái cấu trúc.Protein NS1 đã được tinh s ch và th ạ ửnghi m ELISA v i 19 m u kháng th ệ ớ ẫ ể đơn dòng khác nhau kháng lại NS1 đều có

ph n ng xả ứ ảy ra Hơn thế ữ n a, khi th nghi m v i huy t thanh c a 17 b nh nhân ử ệ ớ ế ủ ệ

m c s t Dengue lắ ố ần đầu thì có 15 m u b nh (88%) th ẫ ệ ểhiện ph n ng mi n d ch vả ứ ễ ị ới NS1 tái tổ ợ h p này và 16 b nh nhân (100%) m c sệ ắ ốt Dengue l n 2 [3] ầ

C R Parrish, et al, (1990), tách dòng thành công trong virus vaccinia,

protein NS1 đượ ạc t o ra trong nghiên cứu này được c ng thêm 61 amino axit c a ộ ủprotein NS2A của virus dengue và NS1 đượ ạc t o ra t n tồ ại ở ạ d ng dimer[5]

Gen mã hóa cho protein NS1 có độ tương đồng cao, gen này có chi u dài ề

1056 nucleotide, mã hóa cho 352 amino axit NS1 của virus Dengue là một glycoprotein có độ tương đồng và tính b o th ả ủ cao Protein này có 12 Cysteine có tính b o th cao cho toàn b NS1 c a Flavivirus, các Cysteine này t o thành 6 cả ủ ộ ủ ạ ầu di-sunfit trong phân t ửNS1[7], [5], [3] Gen mã hóa cho NS1 g m 1056 nucleotide, ồ

mã hóa cho 352 amino acid, kích thước monomer c a NS1 kho ng 46-50 kDa, tùy ủ ảthuộc vào tr ng thái glycosid hóa và s t n tạ ự ồ ại ở các tr ng thái oligomer khác nhau ạ

của nó, hai d ng ph bi n c a NS1 là d ng dimer và d ng hexamer ạ ổ ế ủ ạ ạ

C u trúc dimer c a NS1 có 3 mi n riêng biấ ủ ề ệt: đầu tiên là m t miộ ền “cuộn

gấpβ” (β –roll) k ị nước được hình thành b i 2 phân t -ở ử β hairpins đan xen với nhau, theo sau là m t miộ ền “cánh” (“Wing”) và cuối cùng là miền trung tâm “bậc thang”

β (β-ladder) đư c hình thành b i 18 chuợ ở ỗi β không song song được s p x p thành ắ ế

m t d i liên t c ch y d c theo chi u dài c a phân t dimer [14] Ba mi n này tộ ả ụ ạ ọ ề ủ ử ề ạo nên mặt “trong” và mặt “ngoài” của phân t ử NS1, “mặt trong” là mặt k ị nước còn

“mặt ngoài” là mặt ưa nước [1]

Hình 1.13: C u trúc NS1 d ng dimer d ng hexamer [14] ấ ạ và ạ

Protein NS1 t n t i c d ng liên k t màng (k c trong t ồ ạ ả ở ạ ế ể ả ở ế bào cũng như ởtrên b m t c a t bào) và d ng ti t ra ngo i bào [7] NS1 khi m i t o ra nó t n tề ặ ủ ế ạ ế ạ ớ ạ ồ ại ở

dạng monomer tan, sau đó nó được dimer hóa trong lưới n i ch [2]ộ ất Trong lưới

n i chộ ất, NS1 đồng thời được glycosid hóa bằng cách thêm vào các đường manose, quá trình glycosid hóa này r t quan tr ng cho s polymer hóa sau này c a NS1 Sau ấ ọ ự ủkhi biến đổi xong ở lưới nội chất NS1 được v n chuyậ ển đến mạng lưới Golgi và ti p ế

tục được biến đổi nhiều hơn và t o thành d ng hexamer [3] ạ ạ

NS1 là một glycoprotein đa chức năng, ạd ng n i bào có vai trò quan tr ng ộ ọtrong quá trình sao chép RNA ủc a virus, tuy nhiên vai trò chính xác c a nó trong ủquá trình này là như thế nào thì vẫn chưa được xác định rõ D ng ti t và d ng liên ạ ế ạ

k t trên b m t c a t bào có kh ế ề ặ ủ ế ả năng gây đáp ứng miễn d ch cao ị cũng như bảo v ệvirus tr n thoát kh i h ố ỏ ệ thống mi n d ch t nhiên c a v t ch [7] Trong quá trình ễ ị ự ủ ậ ủxâm nhi m, NS1 có th gây ra mễ ể ột đáp ứng mi n d ch d ch th r t m nh, NS1 có ễ ị ị ể ấ ạthể được phát hi n trong huy t thanh c a b nh nhân b nhi m Dengue và nệ ế ủ ệ ị ễ ồng độNS1 trong các b nh nhân b s t xu t huy t n ng ệ ị ố ấ ế ặ cao hơn so với các bệnh nhân chưa

b xu t huy t[3] ị ấ ế

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên c u t p trung vào nghiên cứ ậ ứu các đặc tính c a protein NS1 nh m ph c v cho nhi u mủ ằ ụ ụ ề ục đích khác nhau Beti Ernawati Dewi; et al, đã nghiên cứu tách dòng và bi u hi n thành công protein NS1 ể ệ

c a virus dengue serotype 2 trong ủ E.coli, NS1 tái t hổ ợp này đã được s dử ụng đểgây mi n dễ ịch ở chuộ ạt t o ra kháng th , kháng th ể ể này đã được ki m tra là có kh ể ảnăng đáp ứng mi n d ch v i NS1 c a bễ ị ớ ủ ệnh nhân Năm 2013, Danielle Ferreira de Oliveira; et al đã sử ụ d ng pET28a để tách dòng và bi u hi n protein NS1 rong ể ệE.coli BL21 DE3 Ngoài ra, Jau-Ling Huang; et al, đã tách dòng biểu hi n thành ệcông full-gene mã hóa NS1, protein NS1 đã được tinh sạch và th nghi m ELISA ử ệ

v i 19 m u kháng th ớ ẫ ể đơn dòng khác nhau kháng lại NS1

Hình 1 14: Quá trình trưởng thành c a NS1 trong quá trình xâm nhiủ ễm của virus

Dengue [8]

1.3.2. Vai trò và ứng dụng của NS1

Chính những đặc điểm và vai trò c a NS1 trong quá trình sao chép RNA củ ủa virus Dengue cũng như vai trò trong quá trình xâm nhi m cễ ủa virus Dengue vào t ếbào v t ậ chủ đã mở ra nhi u ng d ng trong y sinh h c, nh ng nghiên c u v vai trò ề ứ ụ ọ ữ ứ ềsinh lí c a protein Nủ S1 đã giúp con người tìm ra được các phương pháp chẩn đoán

và điều tr ị cũng như tạo ra các loại vaccine để phòng b nh SXHD ệ

1.3.2.1 Ứng d ng t o vaccine ch ng SXHD ụ ạ ố

Trong quá trình xâm nhi m cễ ủa virus Dengue, NS1 th hi n giể ệ ống như một

m c tiêu cho quá trình phát tri n ch t o vaccine b i vì các t bào b nhiụ ể ế ạ ở ở ế ị ễm Dengue có m t c protein NS1 liên k t v i màng sinh ch t và dặ ả ế ớ ấ ạng NS1 được trưng

di n b i các phân t MHC l p I NS1 th hiệ ở ử ớ ể ện như một m c tiêu cho các kháng th , ụ ể

nó có th thu hút các protein b ể ổthể và các t bào mi n dế ễ ịch để giết ch t các t bào ế ếlây nhi m Ngoài ra, các epitope cễ ủa NS1 được liên k t v i MHC l p I là m c tiêu ế ớ ớ ụ

c a các t bào lympho T Do vủ ế ậy, một lượng l n các vaccine tiớ ểu đơn vị được nghiên c u d a trên protein NS1 (vaccine DNA, virus tái t hứ ự ổ ợp, protein được tinh

với NS1 được thu h i và tinh s ch t các t bào Vero nhi m Dengue có th t o ra ồ ạ ừ ế ễ ể ạmiễn d ch ị b o v cho chu t kh i s xâm nhi m cả ệ ộ ỏ ự ễ ủa Dengue Vào năm tiếp theo, Zhang và c ng s ộ ự đã chứng minh r ng gây mi n d ch chu t v i các protein c u trúc ằ ễ ị ộ ớ ấ

và protein NS1 tái t hổ ợp được bi u hi n trong t bào nhân th c cể ệ ế ự ủa Dengue đã tạo nên s kháng l i các b nh viêm não gây nên b i quá trình xu t huy t não do virus ự ạ ệ ở ấ ếDengue gây ra Năm 1995, một protein dung h p bao g m NS1 và protein v ợ ồ ỏ được

bi u hi n trong ể ệ E.coli đã đượ ử ụng để ạo ra vaccine và đã gây ra miễn dịc s d t ch bảo

v cho chu [2] D a trên nh ng công trình tiên phong này, vi c s d ng d ng tái ệ ột ự ữ ệ ử ụ ạ

t hổ ợp của protein NS1 để làm vaccine s h a h n kh ẽ ứ ẹ ả năng phòng chống lây nhiễm virus Dengue trong tương lai là rất cao

1.3.2.2 NS1 là mục tiêu cho thuốc chống virus

NS1 có vai trò quan tr ng trong quá trình sao chép RNA cọ ủa virus Dengue do

đó nó có thể làm m c tiêu cho các li u pháp hóa tr Các báo cáo gụ ệ ị ần đây cho thấy

r ng, thu c kháng virus nhằ ố ằm ụ m c tiêu protein NS1 có liên quan t i s can thiớ ự ệp

c a chính quá trình N-glycosyl hóa c a protein NS1 ủ ủ Theo đó, chất ức ch ếsulfonium-ion glycosidase đã được nghiên c u v i m c tiêu gi m s sao chép cứ ớ ụ ả ự ủa DENV Gần đây, đã có báo cáo cho thấy r ng h p ch t 6-O-butanoyl ằ ợ ấcastanospermine có khả năng gây nên sự ộn gấcu p sai c u trúc c a các protein trong ấ ủlưới n i ch t c a các t bào b nhi m DENV d n t i quá trình sao chép c a virus b ộ ấ ủ ế ị ễ ẫ ớ ủ ịsuy giảm Ngoài ra, cũng chính hợp chất này tác động kháng l i virus là do s ạ ự ức chế ự s N-Glycosyl hóa đã cho thấy hi u qu b o v chuệ ả ả ệ ột dưới điều ki n ệ in vivo

1.3.2.3 Ứng d ng trong chụ ẩn đoán DENV

SXHD có ph ổ triệu ch ng lâm sàng khá r ng, m t s tri u ch ng lâm sàng ứ ộ ộ ố ệ ứ

hầu như tương tự ớ v i các tri u ch ng gây nên b i các b nh nhi m trùng c p tính ệ ứ ở ệ ễ ấkhác Do v y, vi c chậ ệ ẩn đoán chính xác là cả ộ m t thách th c Vi c phát hi n các hứ ệ ệ ạt DENV trong canh trường t bào là rế ất khó khăn, tương đối nguy hi m và t n nhi u ể ố ềthời gian, công sức Ngoài ra, giai đoạn các hạt DENV lưu thông trong máu là ng n ắ

M c dù s phát hi n h gen virus cung c p mặ ự ệ ệ ấ ột phương pháp chẩn đoán nhanh, độ

nhạy cao nhưng ệvi c th c hi n lự ệ ại khó khăn, đòi hỏi các thi t b hiế ị ện đại, đắ ềt ti n và

độ nh y cạ ủa phương pháp di truyền h c gi m xu ng sau khi m t lo t các tri u ọ ả ố ộ ạ ệ

thanh h c d a trên kh ọ ự ả năng phát hi n IgM ho c/và IgG s dệ ặ ử ụng ELISA đã được miêu t ả và là đại diện cho đề xu t thay th ấ ế phương pháp chẩn đoán DENV.

Protein NS1 được ti t ra b i các t bào nhi m DENV và d ng hòa tan c a ế ở ế ễ ạ ủprotein NS1 có th ể được phát hi n trong máu k t ệ ể ừ ngày đầu tiên m c b nh cho tắ ệ ới

t n ngày th chín, th m chí NS1 có th ậ ứ ậ ể được phát hiện trong giai đoạn mà RNA của DENV không th phát hiể ện được b ng RT-PCR và kháng th ằ ể IgM đặc hi u cho các ệprotein c u trúc vấ ẫn chưa có mặt trong máu Hơn thế ữ n a, NS1 là m t trong s các ộ ốprotein có tính b o th cao nh t trong b n serotype Dengue nên viả ủ ấ ố ệc ứng d ng NS1 ụphát hi n s xâm nhi m cệ ự ễ ủa DENV trên người là r t kh quan vì nó có th phát hiấ ả ể ện đượ ấ ảc t t c ch không ph i m t lo i ứ ả ộ ạ

Việc xem NS1 như mộ ất d u chu n trong chẩ ẩn đoán sớm đã đưa ớ ự t i s phát triển c a m t s l ng l n b sinh ph m chủ ộ ố ượ ớ ộ ẩ ẩn đoán DENV Sự lưu hành của NS1 trong máu là m t m c tiêu r t thích hộ ụ ấ ợp để chẩn đoán nhanh và sớm s lây nhiự ễm DENV do vậy phương pháp xét nghiệm mi n d ch liên k t enzyme (ELISA) b t gi ễ ị ế ắ ữNS1 cũng có thể là một phương pháp tố ểt đ ki m tra phát hi n s m DENV ể ệ ớ

1.4 Mộ t số phương pháp chẩn đoán sốt xu t huy t Dengue ấ ế

Hiện nay, v i s phát tri n m nh m c a khoa h c k thuớ ự ể ạ ẽ ủ ọ ỹ ật Đặc bi t là các k ệ ỹthuật trong Y-Sinh đã tạo ra nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh m i m ra tri n ớ ở ể

v ngọ điều tr nhanh và chính xác ị các ệb nh khác nhau, giúp gi m thiả ểu nguy cơgây ửt vong cho con người SXHD là m t trong các b nh cộ ệ ần được chẩn đoán sớm vì hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc tr và vaccine phòng bị ệnh nên n u khi m c b nh mà ế ắ ệkhông được chẩn đoán sớm thì s ẽ có nguy cơ dẫn đến bi n ch ng nế ứ ặng hơn dẫn đến

xu t huy t nấ ế ội mô cũng như ộh i ch ng s c ứ ố Dengue ẫn đế ử d n t vong Vi c chệ ẩn đoán sớm và chính xác SXHD giúp các Bác sĩ tránh được vi c s d ng l m d ng ệ ử ụ ạ ụcác loại kháng sinh cũng như có phác đồ điều tr phù hị ợp đạt hiệu qu ảcao

Hình 1.15: So sánh các phương pháp chẩn đoán dựa trên độ tin c y và tính kh ậ ảthi

c a chúng [18] ủ1.4.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng[18]

B nh s t xu t huy t Dengue có bi u hiệ ố ấ ế ể ện lâm sàng đa dạng, di n bi n nhanh ễ ếchóng t nh n n ng Bừ ẹ đế ặ ệnh thường khởi phát đột ng t và di n bi n qua ba giai ộ ễ ếđoạn: giai đoạn sốt, giai đoạn nguy hiểm và giai đoạn h i ph cồ ụ và được chia làm 3

mức độ: ốS t xu t huy t Dengue; S t xu t huy t Dengue có d u hi u c nh báo và ấ ế ố ấ ế ấ ệ ả

S t xu t huyố ấ ết Dengue n ng Do v y, tùy m i mặ ậ ỗ ức độ khác nhau mà có các d u ấ

hi u lâm sàng và cệ ận lâm sàng đểchẩn đoán SXHD

1.4.1.1 Sốt xuất huy t Dengue ế

 Chẩn đoán Lâm sàng

B nh nhân có d u hi u sệ ấ ệ ốt cao đột ng t, liên t c t 2-7 ngày và có ít nh t 2 ộ ụ ừ ấtrong các dấu hi u sau: ệ

- Biểu hi n xu t huy t có th ệ ấ ế ể như nghiệm pháp dây thắt dương tính, chấm

xu t huyấ ết ở dưới da, chảy máu chân răng hoặc chảy máu cam

- Nhứ ầu, chán ăn, buồc đ n nôn

- Đau cơ, đau khớp, nhức hai hố ắt m

 Chẩn đoán cận lâm sàng

- Hematocrit bình thường (không có bi u hiể ện cô đặc máu) hoặc tăng

- S ố lượng ti u cể ầu bình thường hoặc hơi giảm

- S ố lượng b ch cạ ầu thường giảm

1.4.1.2 Sốt xuất huy t Dengue có d u hi u c nh báo ế ấ ệ ả

Bao g m các tri u ch ng lâm sàng c a s t xu t huy t Dengue, kèm theo các ồ ệ ứ ủ ố ấ ế

- Xét nghiệm máu: Hematocrit tăng cao; Tiểu c u gi m nhanh chóng ầ ả

1.4.1.3 Sốt xuất huy t Dengue n ng ế ặ

Khi ngườ ệi b nh có m t trong các bi u hi n sau: ộ ể ệ

- Thoát huyết tương nặng dẫn đến s c gi m th tích (S c s t xu t huyố ả ể ố ố ấ ết Dengue), ứ ị ở d ch khoang màng ph i và ổ ụổ b ng nhi u ề

- Xuất huyế ặt n ng

- Suy t ng ạ

1.4.2. Phương pháp phân lập virus

Phân l p virus t các m u b nh phậ ừ ẫ ệ ẩm đã được chẩn đoán lâm sàng, mẫu vật đượ ấy trong giai đoạn 6 ngày đầc l u c a b nh ủ ệ và được x lý ngay M u b nh phử ẫ ệ ẩm thích hợp để phân l p virus bao g m: huy t thanh ho c huyậ ồ ế ặ ết tương đượ ấc l y t ừ

b nh nhân, mô t thi trong ệ ử các trường h p t vong ho c Muợ ử ặ ỗi đượ ấ ừc l y t các khu

v c b d ch b nh Các m u vự ị ị ệ ẫ ật dùng để phân l p virus có th b o qu n 4-8 ậ ể ả ả ở °Ctrong thời gian 48h và có th b o qu n th i gian dài nhi t đ -70 [16] ể ả ả ờ ở ệ ộ °C

Gần đây, phương pháp nuôi cấ ế bào đượ đượ ử ụy t c c s d ng rộng rãi để phân

l p virus Dengueậ Nó được coi là tiêu chu n vàng trong chẩ ẩn đoán SD/XHD Phương pháp này dùng để đị nh type huy t thanh trong chế ẩn đoán SD/SXHD, tuy nhiên phương pháp này mất nhi u th i gian, t 7-10 ngày K t qu cề ờ ừ ế ả ủa phương pháp này được ghi nh n b i k t qu c a hình nh cậ ở ế ả ủ ả ủa phương pháp mi n d ch ễ ị

hu nh quang ỳ Phương pháp nuôi cấ ếy t bào m t nhi u th i gian do ph i nuôi c y t ấ ề ờ ả ấ ếbào C6/36 của Aedes albopictus sau khi có đượ, c chai t bào mế ọc dàn đều m t lộ ớp

đẹp mới dùng để cho ra t m plate T ấ ế bào đã cho ra tấ hai ngày đượm c mọc đều đẹp

có th gây nhiể ễm virus Dengue Tấm plate đã được gây nhiễm virus Dengue được

gi trong t m 28ữ ủ ấ oC m t tu n, theo dõi s h y ho i t bào cộ ầ ự ủ ạ ế ủa virus Dengue, sau

đó cấy chuy n sang t m thêm m t tu n nể ấ ộ ầ ữa trước khi làm k thu t mi n d ch hu nh ỹ ậ ễ ị ỳquang K ỹ thuật nuôi c y và mi n d ch huấ ễ ị ỳnh quang c n có kính hiầ ển vi đảo ngược

và kính hi n vi huể ỳnh quang Định type huy t thanh c virus Dengue b ng k ế ủa ằ ỹthuật

hu nh quang gián ti p[13]ỳ ế Phương pháp này có nhược điểm t n nhi u th i gian, ố ề ờnhân viên thực hiện phải đư c đào tợ ạo t ốt

1.4.3. Phương pháp chẩn đoán dựa trên phát hi n acid nucleic ệ

1.4.3.1 Phương pháp RT -PCR

T nhừ ững năm 1990, phương pháp RT PCR đã đượ- c phát triển Phương pháp này có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy virus và ti t ki m th i gian T t c ế ệ ờ ấ ảcác xét nghi m trên phân t nucleic acid dệ ử ựa trên 3 bước cơ bản: tách chi t acid ếnucleic, tinh s ch và khuạ ếch đại acid nucleic[16] Nhi u phòng thí nghiề ệm đã sử

dụng phương pháp RT-PCR v i b mớ ộ ồi đặc hi u nhóm virus Dengue chung khu ch ệ ế

đại vùng gen lõi ti n màng (C-ề prM) để phát hi n virus Dengue ệ và sau đó là kỹ thu t ậnested PCR để đị nh type huy t thanh c a virus Dengue S n phế ủ ả ẩm được chạy điện

di trên gel agarose có s d ng thu c nhuử ụ ố ộm EtBr và so sánh v i thang chu n Các ớ ẩtype khác nhau của virus Dengue s có khẽ ối lượng khác nhau vì v y các type s ậ ẽđược định dựa vào độ dài của băng sản phẩm Kích thước c a các dủ ải băng DNA xác định b ng cách so sánh v i trằ ớ ọng lương phân tử chu n bpẩ , cho phép định danh

là 511 bp và đặc hi u typevirus Dengue 1 là 482 bp, virus Dengue 2 là 119 bp, virus ệDengue 3 là 290 bp và virus Dengue 4 là 392 bp [19]

1.4.3.2 Phương pháp Real -time RT- PCR

Phương pháp real-time RT-PCR là phương pháp được s dử ụng để định lượng RNA và s d ng c p mử ụ ặ ồi đặc hi u cho m type cệ ỗi ủa virus Dengue Công d ng c a ụ ủ

đầu dò hu nh quang có th phát hi n các s n ph m c a ph n ng b i m t máy PCR ỳ ể ệ ả ẩ ủ ả ứ ở ộ

đặc bi t mà không c n th c hiệ ầ ự ện điện di Nhiều phương pháp real time PCR đã được phát tri n d a trên k thu t TaqMan ho c SYBR Green TaqMan real-time ể ự ỹ ậ ặPCR có tính đặc hiệu cao để có th lai tể ạo các đầu dò Hơn nữa, mồi và đầu dò đã được công b có th phát hiố ể ện đượ ấ ảc t t c các chu i c a virus Dengue: s nh y c m ỗ ủ ự ạ ả

-c a mủ ồi và đầu dò d a trên s ự ự tương đồng c a chúng v i trình t củ ớ ự ủa gen đích của virus được phân tích SYBR Green real-time PRC l i có nhiạ ều ưu điểm hơn ở ự s đơn giản c a thi t k t m i cũng như quy trình nhưng lủ ế ế ồ ại kém đặc hi u[16] ệ

Phương pháp real-time RT-PCR “singleplex” có thể phát hiện được m t lo i ộ ạtype huy t thanh m i l n th c hi n xét nghi m, hoế ỗ ầ ự ệ ệ ặc “multiplex” có thể phát hiện được m t lúc nhi u type huyết thanh Tuy nhiên độộ ề nh y c a multiplex real-time ạ ủRT-PCR lại kém hơn độ nh y cạ ủa phương pháp Nested RT-PCR [18] Phương pháp đòi hỏi th c hi n trên máy Real time PCR chuyên d ng ự ệ ụ

1.4.4 Chẩn đoán qua xét nghiệm huy t thanh ế

1.4.4.1 Phương pháp ngăn ngưng kế ồt h ng c u(Hemagglutination Inhibition) ầ

Nguyên lý c a k thuủ ỹ ật ngăn ngưng kế ồt h ng c u ( ) virus Dengue k t hầ HI là ế ợp

v i kháng th c hi u, h ng c u ng ng t do trong dung d ch không k t h p vớ ể đặ ệ ồ ầ ỗ ự ị ế ợ ới kháng nguyên gây hiện tượng không ngưng kế ồt h ng c u (h ng c u l ng xu nầ ồ ầ ắ ố g đáy

gi ng) ế

Để th c hi n xét nghi m HI ch c n các thi t b t i thi u, th c hiự ệ ệ ỉ ầ ế ị ố ể ự ện đúng sẽcho kết quả đáng tin cậy, vì kháng th t n t i trong thể ồ ạ ời gian dài (trên 50 năm) [16] Trong l n ầ sơ nhiễm, kháng th ể ngăn ngưng kết h ng c u phát hiồ ầ ện được vào kho ng ngày th 4, th 5 sau khi m c bả ứ ứ ắ ệnh và tăng mạnh trong hai tu n ti p theo ầ ếKhi m c Dengue lắ ần đầu thì hi u giá trong huy t thanh l y lúc h i phệ ế ấ ồ ục không vượt quá hi u giá 1/640 mệ ặc dù đôi khi cũng gặp trường h p r t cao 1/5120 Sau khi mợ ấ ắc

Dengue l n 2, 3 hoầ ặc 4 thì đáp ứng kháng th có hi u giá rể ệ ất cao, thường kho ng ả1/5120 Hi u giá kháng th ệ ể cao như vậ ồ ạy t n t i nhi u tháng sau khi b nhi m trùng, ề ị ễ

rồi sau đó giảm dần nhưng còn tồn t i suạ ốt đời Do đó khó có thể làm m t chộ ẩn đoán huyết thanh n u ch d a trên m t m u máu duy nh t Ph n l n các tác gi u ế ỉ ự ộ ẫ ấ ầ ớ ả đềcho r ng hi u giá lằ ệ ớn hơn hoặc b ng 1/1280 có th coi là b nhi m virus Dengueằ ể ị ễ Nói chung phương pháp HI là không đặc hi u cho typevirus gây b nh và có phệ ệ ản

ứng chéo không ch trong các type Dengue mà v i c các Flavivirus khác Do v y ỉ ớ ả ậkhông th dùng ph n ể ả ứng này để xác định type huyết thanh được [18]

Phương pháp HI hiện nay không được áp dụng để xét nghiệm xác định SD/SXHD n a vì c n ph i l y máu kép nên khó th c hi n, và m u máu ữ ầ ả ấ ự ệ ẫ thứ 2 phải cách mẫu máu đầu tiên 7 ngày nên phương pháp này chỉ dùng để nghiên c u hứ ồi

c u không phứ ục vụ cho việc chẩn đoán để điều tr SD/SXHD.ị

1.4.4.2 Phương pháp miễ ịn d ch enzyme phát hi n kháng th IgM (MAC-ELISA) ệ ểMac-ELISA hi n là xét nghi m ch y u hi n nay trong xét nghiệ ệ ủ ế ệ ệm SXH Đây

là m t xét nghiộ ệm đơn giản, cho k t qu ế ả sau 2 ngày và không đòi hỏi thi t b phế ị ức

t p Mac-ELISA d a trên nguyên t c phát hi n các kháng th c hi u v virus ạ ự ắ ệ ể đặ ệ ới Dengue trong m u huy t thanh xét nghi m b ng cách tóm b t chúng ra kh i dung ẫ ế ệ ằ ắ ỏ

d ch có s d ng kháng th kháng IgM cị ử ụ ế ủa người được g n vào pha r n N u kháng ắ ắ ếthể IgM trong huy t thanh b nh nhân là kháng th kháng virus Dengue, thì nó s ế ệ ể ẽ

g n v i kháng nguyên Dengue ắ ớ được cho thêm vào trong bước tiếp theo và được phát hi n b ng cách cho thêm cệ ằ ơ chấ ủa enzyme được cho vào để ạt c t o ph n ng ả ứmàu [16]

Hình 1 16: Nguyên lý của phương pháp MAC-ELISA [18]

Kháng th IgM xu t hiể ấ ện trước kháng th IgG và có th ể ể được phát hi n t ệ ừngày th 5 c a b nh Tuy nhiên, mứ ủ ệ ức độ hình thành IgM nhanh hay ch m khác nhau ậ

gi a các b nh nhân Hi u giá kháng th IgM trong nhiữ ệ ệ ể ễm virus tiên phát cao hơn khá nhi u so v i nhiề ớ ễm virus thứ phát [16]

Trong chẩn đoán nhiễm Dengue, xét nghi m Mac-ệ ELISA có độ nh y thạ ấp hơn

so v i HI Tuy nhiên, so v i xét nghi m HI, xét nghi m Mac- ớ ớ ệ ệ ELISA có ưu điểm là thường ch c n l y máu m t lỉ ầ ấ ộ ần và đúng thời điểm, vì th sai s c a Mac- ELISA là ế ố ủchấp nhận được Tuy nhiên, do kháng th IgM t n t i trong th i gian dài, nên k t ể ồ ạ ờ ế

qu ả Mac ELISA dương tính vớ- i các m u huyẫ ết thanh đơn không có nghĩa chắc chắn là bệnh nhân đang nhiễm Dengue K t qu ế ả dương tính này khẳng định r ng ằ

bệnh nhân đã từng nhiễm virus Dengue trong kho ng t ả ừ 2 đến 3 tháng trước Vì

v y, xét nghi m Mac- ELISA r t có giá tr trong giám sát tình hình SXH, và vậ ệ ấ ị ẫn đang áp dụng cho chương trình quốc gia giám sát trọng điểm SXH hi n nay [16] ệ

1.4.4.3 Phương pháp chẩn đoán dự a trên protein kháng nguyên NS1

Những năm gần đây, protein không c u trúc ấ NS1của DENV đã thu hút nhiều

s quan tâm c a các nhà khoa h c v vai trò cự ủ ọ ề ủa nó như là mộ ất d u chu n sinh hẩ ọc trong chẩn đoán sớm s lây nhi m c a DENV NS1 c a DENV là m t protein có ự ễ ủ ủ ộtính b o th cao, t n tả ủ ồ ại ở ả ạ c d ng bám màng t bào và d ng ti t ra ngoài V d ng ế ạ ế ới ạtiết nó được tìm th y v i nấ ớ ồng độ cao trong huy t thanh c a b nh nhân nhi m ế ủ ệ ễ