Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘIChu Thị Minh HảiNGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PROTEIN NS1 CỦA VIRUS DENGUE ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN SINH PHẨM CHẨN ĐỐNChun ngành: Cơng nghệ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Chu Thị Minh Hải NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PROTEIN NS1 CỦA VIRUS DENGUE ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN SINH PHẨM CHẨN ĐỐN Chun ngành: Cơng nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2018 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057204938321000000 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình tơi nghiên cứu, học viên Chu Thị Minh Hải, chuyên ngành Thạc sĩ Công nghệ sinh học, Viện công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hoàn thành hướng dẫn PGS.TS Trương Quốc Phong Một số nhiệm vụ nghiên cứu thành tập thể đồng cho phép sử dụng.Các kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố luận văn khác Tác giả luận văn Chu Thị Minh Hải i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Đầu tiên tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Trương Quốc Phong – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, người hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực đề tài, người dạy kiến thức quý báu thực tiễn thái độ, phương pháp làm việc khoa học Tôi xin cảm ơn giúp đỡ, bảo động viên anh/chị /em làm phịng thí nghiệm proteomic, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Họ tạo điều kiện tốt cho tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện công nghệ Sinh học, Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy suốt năm học qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân, họ người sát cánh, động viên tơi vượt qua khó khăn để hoàn thành luận văn cách tốt Do điều kiện, khả thời gian thực đề tài có hạn đề tài khơng thể tránh khỏi sai sót Tơi mong nhận đóng góp thầy cô bạn để đề tài hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Chu Thị Minh Hải ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1.Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết giới Việt nam 1.1.1.Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết giới 1.1.2.Tình hình dịch SXHD diễn khu vực Đông Nam Á 1.1.3.Tình hình dịch bệnh SXHD diễn Việt Nam 1.1.4 Diễn biến thể lượng virus Dengue máu người bênh sốt xuất huyết ……………………………………………………………… ….10 1.2 Đặc điểm virus Dengue 12 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc di truyền virus Dengue 12 1.2.2 Đặc điểm protein virus Dengue 14 1.2.2.1 Protein cấu trúc 14 1.2.2.2 Protein không cấu trúc 14 1.3 Protein NS1 virus Dengue 15 1.3.1 Đặc điểm protein NS1 16 1.3.2.Vai trò ứng dụng NS1 19 1.3.2.1.Ứng dụng tạo vaccine chống SXHD 19 1.3.2.2 NS1 mục tiêu cho thuốc chống virus 20 1.3.2.3.Ứng dụng chẩn đoán DENV 20 iii 1.4 Một số phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue 21 1.4.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng 22 1.4.1.1 Sốt xuất huyết Dengue 22 1.4.1.2 Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo 23 1.4.1.3 Sốt xuất huyết Dengue nặng 23 1.4.2 Phương pháp phân lập virus 23 1.4.3 Phương pháp chẩn đoán dựa phát acid nucleic 24 1.4.3.1 Phương pháp RT-PCR 24 1.4.3.2 Phương pháp Real-time RT-PCR 25 1.4.4 Chẩn đoán qua xét nghiệm huyết 25 1.4.4.1 Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu(Hemagglutination Inhibition) 25 1.4.4.2 Phương pháp miễn dịch enzyme phát kháng thể IgM (MACELISA)………………… 26 1.4.4.3 Phương pháp chẩn đoándựa protein kháng nguyên NS1 27 Chƣơng II: VẬT LỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1.Vật liệu 32 2.1.1 Mẫu RNA virus Dengue 32 2.1.2.Vector tách dòng 32 2.1.3.Vector biểu 33 2.1.4.Vật chủ biểu 34 2.2 Mơi trường – Hóa chất 35 2.3 Thiết bị 36 2.4 Phương pháp nghiên cứu 36 2.4.1 Phương pháp vi sinh 36 2.4.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 36 2.4.1.2 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 37 2.4.1.3 Phương pháp tạo tế bào khả biến 37 2.4.1.4 Biểu protein NS1 tái tổ hợp vi khuẩn E coli BL21(DE3) 38 iv 2.4.2 Phương pháp sinh học phân tử 38 2.4.2.1 Phương pháp tạo cDNA mã hóa gen NS1 enzyme phiên mã ngược38 2.4.2.2 Phương pháp khuếch đại gen mã hóa NS1 PCR 39 2.4.2.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 40 2.4.2.4 Phương pháp tạo cấu trúc pJET1.2::NS1 41 2.4.2.5 Biến nạp vào tế bào E coli 42 2.4.2.6 Cắt DNA plasmid enzyme giới hạn 42 2.4.2.7 Tinh vector pET22b(+) đoạn gen mã hóa NS1 43 2.4.2.8 Thiết kế vector biểu pET22b(+)::NS1 44 2.4.3 Phương pháp hóa sinh 45 2.4.3.1 Phương pháp điện di gel agarose 45 2.4.3.2 Phương pháp điện di SDS – PAGE 45 2.4.3.3 Phương pháp tách chiết protein thể tan 46 2.4.3.4 Phương pháp tách chiết protein thể vùi 47 2.4.3.5 Phương pháp Western blot 47 2.4.3.6 Phương pháp tinh protein 48 2.4.4 Phương pháp Tin-Sinh học 49 2.4.4.1 Phương pháp thiết kế mồi 49 2.4.4.2 Phương pháp sử dụng phần mềm MultAlin 50 2.4.4.3 Phương pháp sử dụng phần mềm NEBcutter V2.0 50 2.4.4.4 Phương pháp sử dụng phần mềm FastPCR 50 2.4.4.5 Phương pháp sử dụng phần mềm BLAST 51 2.4.4.6 Phương pháp sử dụng phần mềm Translate Tool 51 2.4.4.7 Phương pháp sử dụng phần mềm Quantity One 50 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.2 Kết RT-PCR khuếch đại gen mã hóa NS1 56 3.3 Kết tách dịng gen mã hóa NS1 57 3.4 Kết tạo cấu trúc biểu mang gen mã hóa protein NS1 58 3.4.1 Xử lý vector pET22b pJET1.2::ns1 enyme giới hạn 59 v 3.4.2 Chèn gen ns1 vào vector pET22b biến nạp vào E.coli 60 3.5 Chọn dòng E.coli mang cấu trúc biểu pET22b::ns1 61 3.5.1 Kết kiểm tra plasmid PCR với mồi đặc hiệu cho gen ns1 62 3.5.2 Kiểm tra plasmid cách cắt enzyme giới hạn 62 3.5.3 Giải trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu pET22b::ns1 63 3.6 Biểu protein NS1 E.coli 66 3.7 Khảo sát điều kiện biểu protein NS1 tái tổ hợp 67 3.7.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng - IPTG 67 3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 68 3.7.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 69 3.7.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng 70 3.8 Kết tinh Protein 68 3.9 Ứng dụng chế tạo thử nghiệm que thử phát nhanh kháng thể đặc hiệu kháng virus Dengue từ huyết 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AP : Alkaline Phosphatase AuNPs : Gold nanoparticles (hạt nano vàng) BCIP : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : Base pairs (cặp bazo nitơ) cDNA : Complementary Deoxyribonucleic acid (DNA bổ sung) DI : Deion E.coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked ImmonuSorbent Assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme) EtBr : Ethidium Bromide HCSD : Hội chứng sốc Dengue HI : Hemagglutination Inhibition (phương pháp ức chếngưng kết hồng cầu) IgG : Immunoglobulin G IgM : Immunoglobulin M IPTG : Isopropyl β-D-1-Thioglactopyranoside Kb : Kilo base kDa : Kilo Dalton LB : Luria Bertani (môi trường LB) NPT : Nitro Blue Tetrazolium vii NSP : Non-Structural Protein (protein phi cấu trúc) OD : Optical Density (mật độ quang) PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di gel polyacrylamide) PBS : Phosphate Buffered Saline (dung dịch đệm muối phosphat) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PVDF : Polyvinylidene fluoride RNA : Ribonucleic acid R-Nase : Ribonuclease RT-PCR : Revese Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng phiên mã ngược) SD : Sốt Dengue SDS : Sodium Dodecyl Sulfate Sol : Solution SXHD : Sốt xuất huyết Dengue TAE : Tris - Axit acetic - EDTA TEMED : Tera Mehylethylen Ediamine WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thơng tin trình tự hai đoạn mồi thiết kế đặc hiệu gen ns1 virus Dengue 55 Bảng 3.2 Kết tinh gen NS1 vector pET22b sau cắt enzyme giới hạn 60 ix