báo cáo thực hành quy trình lên men một loại nấm , Chuẩn bị môi trường, phân lập và định lượng nấm men Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên động học sinh trưởng của nấm men trong quá trình nuôi cấy mẻ.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH CƠNG NGHỆ LÊN MEN GVHD: TS Nhóm thực hiện: Nhóm (Ngày 05/12, 12/11 13/12) Thành phố Hồ Chí Minh, 01/2021 DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHĨM MỤC LỤC MỤC LỤC Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập định lượng nấm men 1 Mục đích Nguyên liệu, trang thiết bị, dụng cụ Nội dung thực hành Kết nhận xét Trả lời câu hỏi: Bài 2: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên động học sinh trưởng nấm men q trình ni cấy mẻ 10 Mục đích 10 Nguyên liệu, dụng cụ, trang thiết bị 10 Nội dung thực hành 11 Kết nhận xét: 12 Trả lời câu hỏi 24 Mục lục hình ảnh Hình 1: Đo OD mẫu trắng cho men 0h .14 Hình 2: Đo OD mẫu trắng không cho men 4h 15 Hình Đo OD mẫu trắng không cho men 6h .15 Hình Đo OD mẫu trắng không cho men 23h .16 Hình Đo OD mẫu trắng khơng cho men 25h 16 Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập định lượng nấm men Mục đích - Chuẩn bị môi trường thạch đĩa để phân lập môi trường thạch nghiêng để giữ giống - Phân lập giống vi sinh vật khiết (nấm men) - Định lượng mẫu vi sinh vật khiết - Bảo quản mẫu vi sinh vật khiết Nguyên liệu, trang thiết bị, dụng cụ Nấm men bánh mì Nồi hấp (autoclave) Glucose Tủ (buồng) cấy vô trùng Peptone Tủ ấm (incubator) NaCl Cân số lẻ KH2PO4 Máy đo pH MgSO4.7H2O Kính hiển vi Cồn 95, 70 Buồng đếm tế bào HCl 0.1N Que trang (que trải) Agar, nước cất Đĩa petri Methylen blue Micropipette (100-1000l) + tip Bút marker Micropipette (20-200l) + tip Ống nghiệm Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Cốc thủy tinh 100 ml Bình tam giác 250 ml Bình định mức 100 ml Đèn cồn, giấy vệ sinh, giấy nhôm, bao tay, bút marker Nội dung thực hành Mỗi buổi thực hành chia làm nhóm, nhóm khoảng 12-13 SV Dụng cụ nhóm: cốc thủy tinh 250 ml, bình tam giác 250 ml, ống nghiệm nút bơng, ống nghiệm pha lỗng, đĩa petri, cá từ, nút cho ống nghiệm Chuẩn bị giống vsv mơi trường Mỗi nhóm cân mẫu nấm men bánh mì, mẫu 0.02 g, mẫu pha loãng phân lập nấm men, mẫu pha lỗng đếm trực tiếp kính hiển vi Nhóm pha 100 ml dung dịch HCl 0.1N dùng chung cho vào chai đựng thủy tinh 600 ml cồn 70 cho vào bình phun sương bình vịi Nhóm pha 100 ml nước muối peptone dùng chung (SPW, saline peptone water)(8.5 g/l NaCl, 1.0 g/l peptone, 100 ml nước cất cho vào cốc thủy tinh 250 ml khuấy cá từ 15 phút, sau cho vào ống nghiệm đem hấp khử trùng đánh số 1, 2, theo thứ tự 4.98 ml (ứng với độ pha loãng 10-2), 4.95 ml (ứng với độ pha loãng 10-4), 4.5 ml (ứng với độ pha lỗng 10-5 ống nghiệm khơng đem hấp khử trùng để pha loãng đếm nấm men đánh dấu 1b, 2b, 3b theo thứ tự 4.98 ml (ứng với độ pha loãng 10-2), 4.95 ml (ứng với độ pha loãng 10-4), 4.5 ml (ứng với độ pha loãng 10-5) Phần nước muối peptone lại cho vào chai nhựa đựng nước muối rửa Bọc đầu ống nghiệm đem hấp lớp giấy nhôm bọc đầu ống nghiệm không đem hấp lớp giấy nhôm Cho 12 ml nước cất vào ống nghiệm đổ thạch nghiêng, dùng bút marker đánh dấu mực nước ống nghiệm để đổ môi trường thạch nghiêng xong đổ nước đi, gắn nút bơng vào, bọc đầu ống nghiệm có nút bơng hai lớp giấy nhôm Pha 150 ml môi trường thạch Hansen (nhóm nhóm 2): 50 g/l glucose, 10 g/l peptone, 3.0 g/l KH2PO4, 2.0 g/l MgSO4.7H2O, 24 g/l agar 140 ml nước cất cho vào bình tam giác 250 ml Khuấy cá từ 15 phút, điều chỉnh pH nhiệt độ phòng HCl 0.1N Cho nước cất vừa đủ 150 ml, bọc đầu bình tam giác chứa mơi trường hai lớp giấy nhôm Tiệt trùng môi trường Cho vào nồi hấp tiệt trùng bình tam giác chứa môi trường thạch Hansen bọc đầu giấy nhôm, ống nghiệm chứa SPW bọc đầu giấy nhôm, ống nghiệm có nút bơng bọc đầu giấy nhơm, đĩa petri bọc giấy nhôm, hộp chứa pipet tip màu xanh (100-1000 l) bọc giấy nhôm, hộp chứa pipet tip màu vàng (20-200 l) bọc giấy nhôm 121C 15 phút Chuẩn bị tủ cấy trước đổ môi trường cấy vsv Xịt cồn 70 vào buồng cấy lau buồng cấy, sau thắp hai đèn cồn (chứa cồn 96) để khử trùng buồng cấy 30 phút Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng thạch hộp petri Ghi tên nhóm ngày làm TN lên ống nghiệm có nút bơng hộp petri, ghi đĩa đối chứng đĩa tỉ lệ pha loãng 10-4, 10-5 lên hộp petri Lắc nhẹ đổ mơi trường cịn ấm bình tam giác vào ống nghiệm có nút tiệt trùng bên lửa đèn cồn, đậy nút lại để đầu ống nghiệm nằm mép khay melanin để nguội tạo môi trường thạch nghiêng Đổ môi trường thạch hộp petri: nắp hộp petri, đổ nhanh mơi trường thạch cịn ấm vào với độ dày môi trường khoảng mm, đậy nắp hộp lại để yên đến môi trường nguội đông đặc lại Pha loãng phân lập nấm men Cho 0.02 g nấm men vào ống nghiệm chứa 4.98 ml SPW (tỉ lệ pha loãng 10-2) lắc máy lắc ống nghiệm Cho 50 l dung dịch ống nghiệm vào ống nghiệm chứa 4.95 ml SPW lắc (tỉ lệ pha loãng 10 -4) Cho 500 l dung dịch ống nghiệm vào ống nghiệm chứa 4.5 ml SPW lắc (tỉ lệ pha loãng 10 -5) Nhúng đầu que trải vào cốc 100 ml chứa cồn 95, hơ qua lửa để khử trùng, để đầu que trải nguội không gian vô trùng lửa đèn cồn Cho 15 l dung dịch sau pha lỗng (10-4 10-5) vào hộp mơi trường thạch, dùng que trải xoay sang phải kết hợp xoay đĩa sang trái để trải dung dịch lên bề mặt thạch Mỗi nhóm trải đĩa petri 10-4, đĩa petri 10-5, đĩa không trải để đối chứng Bao đĩa petri màng bọc thực phẩm Úp ngược hộp petri để nhiệt độ phòng 18-48 h Sau quan sát thấy khuẩn lạc mọc thạch hộp petri, chọn khuẩn lạc đơn có hình thái giống nấm men để cấy chuyền sang ống thạch nghiêng, ủ nhiệt độ phòng (28-30C) 18-48 h cho lên khuẩn lạc giữ giống tủ mát 4C Định lượng nấm men + Đếm trực tiếp (tế bào/g tế bào/ml): mật độ vsv đơn bào có kích thước lớn nấm men xác định trực tiếp buồng đếm kính hiển vi Đếm vùng buồng đếm có 25 lớn x 16 Ngun tắc đếm trực tiếp buồng đếm neubauer thủy tinh tráng bạc: Pha loãng huyền phù tế bào vsv (10-4, 10-5 10-6) cho ô lớn 16 ô nhỏ từ 10 - 50 tế bào Nhỏ giọt xanh methylen vào dung dịch pha lỗng Một buồng đếm hình vng diện tích mm2 có 25 vng lớn, vng lớn chia thành 16 ô vuông nhỏ, buồng đếm có tổng cộng có 400 vng nhỏ Độ sâu buồng đếm 0,1 mm Diện tích lớn 0,04 mm2, thể tích lớn 0,004 mm3 Rửa buồng đếm kính cồn 70 nước cất thấm khô khăn giấy giấy vệ sinh Lắc mạnh dịch huyền phù pha loãng, dùng micropipet để hút 20 l dịch huyền phù pha lỗng nhỏ vào buồng đếm, đậy kính để dịch huyền phù tràn đầy khoang đếm, sau đưa lên kính hiển vi để đếm (dùng vật kính 4 để tìm buồng đếm sau chuyển sang vật kính 40 để đếm) Đếm số lượng tế bào theo đường chéo theo góc trung tâm Với tế bào ranh giới lớn quy ước đếm tế bào cạnh bên trái Đếm lớn lấy số lượng trung bình Chụp ảnh nấm men có buồng đếm camera Đếm số lượng tế bào chết tế bào thấm màu xanh đậm thuốc nhuộm Đếm số tế bào khoanh trịn nằm này: a + b + c + d + e Số tế bào: N = A 25 : V : n (tế bào/ml), N: số tế bào ml dịch huyền phù A: số tế bào trung bình lớn V: thể tích buồng đếm (0,1 10-6 ml) 25: số ô lớn buồng đếm n: độ pha lỗng mẫu Từ tính tổng số tế bào tỉ lệ tế bào sống/chết có g mẫu men bánh mì (tế bào/g mẫu) ban đầu + Đếm khuẩn lạc (Colony Forming Unit-CFU): đếm tất số khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết Tính số lượng tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) g hay ml chất ban đầu tạo dịch huyền phù: N = A : V : Df (CFU/ml) A: số CFU trung bình đĩa petri độ pha loãng định Cồn 95, 70 Đèn cồn Nội dung thực hành Dụng cụ cho nhóm: cốc thủy tinh 250 ml, bình tam giác 250 ml có nút bơng, cá từ, cuvet nhựa Chuẩn bị môi trường lỏng để nhân giống nấm men Nhóm 1: Pha 100 ml môi trường Hansen lỏng: 50 g/l glucose, 10 g/l peptone, 3.0 g/l KH2PO4, 2.0 g/l MgSO4.7H2O 90 ml nước cất cho vào cốc thủy tinh 250 ml Khuấy cá từ, điều chỉnh pH nhiệt độ phòng HCl 0.1N Cho nước cất vừa đủ 100 ml chia vào bình tam giác 250 ml bình 50 ml Gắn nút bơng bọc đầu bình tam giác chứa mơi trường giấy nhơm, tiệt trùng 121C 15 phút Nhóm 2: Pha nước chiết giá đậu Cân 100 g giá đậu, cắt nhỏ, cho 150 ml nước vào đun sôi nhỏ lửa 30 phút Lọc lấy dịch trong, để nguội, điều chỉnh pH 5, bổ sung nước cất đến 1000 ml Pha 100ml nước chiết giá đậu có bổ sung đường cát (saccharose) 160 g/l, chia vào bình tam giác 250 ml bình 50 ml Gắn nút bơng bọc đầu bình tam giác chứa mơi trường giấy nhôm, tiệt trùng 121C 15 phút Cấy nấm men giống vào môi trường nhân giống cấp Rửa que cấy có đầu cấy vịng, nhúng đầu que cấy vào cốc chứa cồn 95 tiệt trùng đầu que cấy lửa đèn cồn Để nguội đầu que cấy vùng vô trùng tủ cấy, dùng đầu que cấy lấy 1~2 khuẩn lạc nấm men phân lập đĩa petri 0.005 g nấm men cho vào 50 ml môi trường lỏng tiệt trùng (môi trường Hansen, môi trường dịch chiết giá đậu) bình tam giác, lắc 13 Khảo sát động học sinh trưởng nấm men Nhân giống nấm men bình tam giác nhiệt độ phịng kết hợp với lắc khoảng phút với chu kỳ phút lắc lần Chụp ảnh môi trường hai bình tam giác trước lấy mơi trường đo OD đếm nấm men Dùng micropipet hút 1.4 ml môi trường bình tam giác trước cấy nấm men sau cấy nấm men h, h, h, h, 23 h, 25 h cho vào cuvet, đo OD (optical density) bước sóng 600 nm đổ môi trường cuvet vào ống nghiệm, cho giọt xanh methylen vào đếm số lượng nấm men có mơi trường buồng đếm kính hiển vi Nếu số lượng nấm men mẫu buồng đếm q nhiều pha lỗng mẫu với tỉ lệ thích hợp đếm lại Kết nhận xét: a Khảo sát động học sinh trường nấm men: Nhân giống nấm men bình tam giác lắc nhiệt dộ phịng (30oC) Dùng micropipette hút 1ml mơi trường bình tam giác trước cấy nấm men (0h) sau cấy nấm men 0h, 2h, 4h, 6h, 23h, 25h cho vào cuvet, đo OD (optical density) bước song 600 nm đếm trực tiếp số lượng nấm men có mơi trường buồng đếm kính hiển vi THỜI GIAN (giờ) 23 25 MT HANSEN (Abs) 0.156 0.161 0.287 0.522 1.141 1.127 14 MT GIÁ (Abs) TRUNG BÌNH 0.099 0.117 0.205 0.679 1.229 2.234 0.1275 0.139 0.246 0.6005 1.185 1.6805 Đồ thị động học sinh trưởng nấm men theo thời gian nuôi cấy mẻ: MT HANSEN (Abs) MT GIÁ (Abs) TRUNG BÌNH b 2.5000 2.0000 Abs 1.5000 1.0000 0.5000 0.0000 10 15 20 25 30 THỜI GIAN Thiết lập mối liên hệ OD số lượng tế bào nấm men theo thời gian nhân giống Môi trường Giá: Thời gian (giờ) Số lượng tế bào OD đếm Số lượng tế bào đếm thực tế Mẫu trắng 0.097 0 0.099 10 10 0.117 32 32 0.205 49 49 (pha loãng lần) 0.679 77 154 23 (pha loãng lần) 1.229 131 524 15 25 (pha loãng lần) 2.234 156 936 Bảng : Bảng số liệu mẫu môi trường Giá đỗ Đồ thị thể mối quan hệ OD số lượng tế bào nấm men theo thời gian Đồ thị môi trường Giá Bảng 2: Đồ thị thể mối quan hệ OD số lượng tế bào nấm men theo thời gian(MT giá) Môi trường hasen Thời gian (h) Mẫu trắng (pha loãng lần) 23 (pha loãng lần) 25 (pha loãng lần) OD Số lượng tế bào số lượng tế bào đếm thực tế 0.137 0 0.156 12 12 0.161 35 35 0.287 53 53 0.522 82 164 1.141 138 552 1.127 166 996 Bảng 3: Bảng số liệu mẫu môi trường Hasen Đồ thị môi trường Hasen 16