Giáo trình enzyme

Một số enzyme tham gia trong quá trình trao đổi chất là những enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm đối với các tín hiệu trao đổi chất khác nhau bằng cách thay đổi hoạt tính xúc tác của chún

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT F7G GIÁO TRÌNH ENZYME GS.TS MAI XUÂN LƯƠNG 2005 -1- Enzyme MỤC LỤC MỤC LỤC - MỞ ĐẦU - I BẢN CHẤT PROTEIN CỦA ENZYME - II DANH PHAÙP VÀ PHÂN LOẠI ENZYME - III ĐỘNG HỌC CỦA CÁC PHẢN ỨNG ENZYME - IV NHỮNG TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG CỦA XÚC TÁC SINH HỌC - 12 Enzyme thể tính đặc hiệu cao chất chúng - 12 Xúc tác enzyme dẫn đến hình thành phức hệ trung gian enzyme chất - 12 Trung tâm enzyme tương tác đặc hiệu với chất gọi trung tâm hoạt động .- 12 Enzyme làm giảm lượng hoạt hóa cần thiết cho phản ứng - 13 Một số enzyme tham gia điều hòa tốc độ phản ứng - 14 Một số enzyme multienzyme hay phức hệ đa chức - 15 Động học phản ứng enzyme hai chất .- 15 Ảnh hưởng pH - 16 Ảnh hưởng nhiệt ñoä - 18 V ỨC CHẾ ENZYME - 19 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) - 19 Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I (noncompetitive inhibition) - 22 Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II (uncompetitive inhibition) - 23 VI CÁC CHẤT ỨC CHẾ TRAO ĐỔI CHẤT- ANTIMETABOLITE - 24 VII HỆ THỐNG MULTIENZYM VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME ĐIỀU HÒA 26 VIII HỆ THỐNG CASCADE - BIẾN ĐỔI ĐỒNG HÓA TRỊ - 29 IX HOẠT HÓA ENZYME .- 31 X TƯƠNG TÁC PROTEIN - PROTEIN - 32 XI TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME ĐỐI VỚI CƠ CHẤT .- 33 XII CƠ CHẾ TĂNG TỐC ĐỘ CÁC PHẢN ỨNG HÓA HỌC NHỜ ENZYME 36 Tăng tốc độ phản ứng tính đặc hiệu chất - 36 Sự phù hợp cảm ứng xúc tác enzyme - 38 Cơ chế tiếp cận - 38 Gây ổn định (Destabilization) .- 40 Xúc tác acid-base phối hợp - 41 XIII ISOENZYME .- 46 XIV CÁC NHÓM ENZYME .- 47 Enzyme oxy hóa - khử .- 47 Transferase - 53 Hydrolase - 55 Liase - 57 Isomerase - 58 Ligase (synthetase) .- 59 - GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme -2- XV TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ ENZYME - 60 XVI SỬ DỤNG ENZYME TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC - 65 XVII ENZYME CỐ ĐỊNH .- 68 1.Ý nghóa enzyme cố ñònh - 68 Các phương pháp điều chế enzyme cố định - 68 Một số đặc tính enzyme cố định .- 74 Ứng dụng enzyme cố ñònh - 75 - GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học -3- Enzyme MỞ ĐẦU Enzyme chất xúc tác hệ thống sinh học Chúng có khả xúc tác đặc biệt, thường mạnh nhiều so với chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác chúng mang tính đặc hiệu cao chất, làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng hóa học xảy môi trường nước điều kiện nhiệt độ pH êm dịu Enzyme chìa khóa để hiểu biết trình hoạt động sống tế bào Hoạt động trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định đường trao đổi chất mà nhờ chất dinh dưỡng bị phân hủy, lượng hóa học lưu giữ biến đổi, đại phân tử sinh học tạo từ chất tiền thân đơn giản Một số enzyme tham gia trình trao đổi chất enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm tín hiệu trao đổi chất khác cách thay đổi hoạt tính xúc tác chúng cách thích hợp Thông qua hoạt động enzyme điều hòa hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với để tạo mối quan hệ hài hòa hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc trì sống Nghiên cứu enzyme có ý nghóa thực tiển quan trọng Đối với số bệnh, đặc biệt rối loạn mang tính di truyền, thiếu hay hẵn enzyme mô Các điều kiện không bình thường xuất hoạt tính dư thừa số enzyme đặc hiệu Xác định hoạt tính số enzyme xác định huyết tương, hồng cầu mô quan trọng việc chẩn đoán bệnh Enzyme trở thành công cụ thực tế quan trọng không nhữ.ng y học mà công nghệ hóa học, chế biến thức ăn nông nghiệp Enzyme có vai trò chí hoạt động hàng ngày gia đình, ví dụ việc lau chùi chỗ bẫn công việc chế biến thức ăn GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme -4- I BẢN CHẤT PROTEIN CỦA ENZYME Phần lớn lịch sử hoá sinh học lịch sử nghiên cứu enzyme Các chất xúc tác sinh học lần phát mô tả vào năm 1800 nghiên cứu tiêu hóa thịt chất tiết dày biến đổi tinh bột thành đường nước bọt dịch chiết thực vật khác Trong năm 1850 Louis Pasteur kết luận trình lên men đường thành rượu nấm men xúc tác “ferment” Ông cho men này, mà sau gọi enzyme, chất không tách rời khỏi cấu trúc tế bào nấm men sống, quan điểm tồn nhiều năm Cho đến năm 1897 Eduard Buchner xác định dịch chiết nấm men lên men đường thành rượu chúng tách khỏi cấu trúc tế bào nấm men Phát thúc đẩy nhà sinh hóa tìm cách tách chiết nhiều enzyme khác nghiên cứu hoạt tính xúc tác chúng Công trình tách chiết tinh chế urease James Sumner năm 1926 thúc đẩy nghiên cứu tính chất enzyme đặc hiệu Sumner phát tinh thể urease cấu tạo hoàn toàn từ protein từ ông cho tất enzyme protein Ý tưởng qua ví dụ khác tiếp tục tranh cải thêm nhiều năm sau Chỉ đến năm cuối thập kỷ 1930, sau John Northrop cộng tác viên ông kết tinh pepsin trypsin xác định chúng protein quan niệm Sumner enzyme công nhận rộng rãi Ngày hoá sinh học xác định tất enzyme protein Hoạt tính xúc tác chúng phụ thuộc vào tính nguyên vẹn cấu trúc nguyên thủy protein Nếu enzyme bị biến tính bị phân ly thành phần đơn vị hoạt tính xúc tác thường bị Khi enzyme bị phân giải thành aminoacid hoạt tính xúc tác hoàn toàn không Như vậy, cấu trúc bậc một, bậc hai, bậc ba bậc bốn protein enzyme yếu tố quan trọng hoạt tính xúc tác chúng Enzyme, protein khác, có trọng lượng phân tử từ khoảng 12.000 đến 1.000.000 Một số enzyme không cần nhóm hóa học aminoacid cho hoạt tính xúc tác Một số khác cần có nhóm bổ sung gọi cofactor (bảng 1) Những cofactor ion kim loại Fe2+, Mg2+, Mn2+,hoặc Zn2+ phân tử hữu hay hữu chứa lim loại phức tạp gọi coenzyme (bảng 2) Một số enzyme đòi hỏi coenzyme vài ion kim loại cho hoạt tính Một coenzyme ion kim loại liên kết cộng hóa trị với protein enzyme gọi nhóm thêm hay nhóm prosthetic Một enzyme trọn vẹn GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học -5- Enzyme có hoạt tính xúc tác với coenzyme (hoặc) ion kim loại hợp lại gọi holoenzyme Phần protein loại enzyme gọi apoenzyme hay apoprotein Coenzyme hoạt động vật mang nhóm chức đặc hiệu Nhiều vitamin chất hữu với hàm lượng nhỏ có thức ăn chất tiền thân coenzyme Bảng Một số enzyme có chứa cần nguyên tố vô để làm cofactor Cofactor Fe hoaëc Fe3+ Cu2+ Zn2+ Mg2+ Mn2+ K+ Ni2+ Mo Se 2+ Enzyme Cytochrome Oxydase Catalase, Peroxydase Cytochrome Oxydase Carbonic Anhydrase, Alcohol Dehydrogenase Hexokinase, Glucoso-6-phosphatase, Pyruvate Kinase Arginase, Ribonucleotide reductase Pyruvate kinase Urease Dinitrogenase Glutathione peroxidase Baûng Một số coenzyme làm vật trung chuyển nguyên tử nhóm nguyên tử đặc hiệu Chất tiền thân thức Nhóm vận COENZYME ăn động vật có vú chuyển Thiamine pyrophosphate Flavine adenine dinucleotide Nicotinamide dinuclotide Coenzyme A Pyridoxal phosphate 5’Deoxyadenosylcobalamine (Coenzyme B12) GS.TS Mai Xuaân Lương Aldehyde Điện tử Thiamine (Vitamine B1) Riboflavine (Vitamine B2) Điện tử Nhóm acyl Nhóm amine Các nguyên tử H nhóm alkyl Nicotinic acid (Niacin) Acid pantothenic Pyridoxine (Vitamine B6) Vitamine B12 Khoa Sinh hoïc -6- Enzyme Biocytin Tetrahydrofolate Acid lipoic CO2 Biotin Nhóm carbon Folate Điện tử nhóm acyl Không cần có thức ăn II DANH PHÁP VÀ PHÂN LOẠI ENZYME Tên gọi enzyme thường tên gọi chất hay kiểu phản ứng mà xúc tác cộng với đuôi “ase”, ví dụ urease,, hydrolase v.v Ngoài có tên gọi truyền thống theo thói quen, không cho thấy chất hóa học phản ứng enzyme xúc tác, ví dụ pepsin, trypsin hai kiểu gọi tên nêu thiếu xác Để khắc phục tình trạng đó, Hội Hóa sinh học quốc tế đề nghị sử dụng hệ thống danh pháp phân loại sở chất phản ứng xúc tác Theo hệ thống toàn enzyme gọi tên theo chất phản ứng xúc tác chất chất cho, chất nhận phản ứng chia thành nhóm lớn; nhóm lớn lại chia thành nhiều phân nhóm; phân nhóm lại chia thành nhiều phân nhóm nhỏ hơn, bao gồm enzyme có chất tác dụng giống Mỗi nhóm, phân nhóm enzyme ký hiệu mã số đặc trưng gồm tương ứng một, hai, ba bốn số cách dấu chấm Tên gọi nhóm enzyme phân nhóm quan trọng giới thiệu bảng với chất phản ứng xúc tác Các phân nhóm nhỏ thuộc phân nhóm bảng ký hiệu mã số gồm số Ví dụ phân nhóm thứ enzyme nhóm (ký hiệu phân nhóm 1.1) có ba phân nhóm nhỏ 1.1.1, 1.1.2 1.1.3 đặc trưng cho trường hợp mà chất nhận điện tử NAD, NADP cytochrome Mã số enzyme gồm số, ví dụ: 1.1.1.29 – Glycerophosphate dehydrogenase; 2.7.1.1 – Hexokinase 3.2.1.20 – α- Glucosidase; 4.1.1.1 – Pyruvate decarboxylase; 5.3.1.1 – Triosophosphate isomerase; 6.3.1.2 – Glutamin synthetase Bảng Danh mục mã số nhóm enzyme phân nhóm chúng Nhóm Phân nhóm Phản ứng xúc tác GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học -7- Enzyme Oxydoreductase Transferase Hydrolase Liase Isomerase Ligase 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 4.1 4.2 4.3 5.1 5.2 5.3 5.4 6.1 6.2 6.3 6.4 Hydrogen hóa dehydrogen hóa =CH–OH =C=O –CH=CH– –CH–NH2 =CH–NH– NADH, NADPH Vận chuyển nhóm chức Các gốc carbon Nhóm aldehyde cetone Acyl Liên kết glycoside Nhóm methylalkyl aryl Nhóm chứa nitơ Nhóm chứa phosphore Nhóm chứa lưu huỳnh Các phản ứng thủy phân Ester Glycoside Eter Peptide Các liên kết C-N khác Các anhydrit acid Tạo liên kết đôi =C=C= =C=O =C=N– Đồng phân hóa Rasemase epimerase Xis-trans-isomerase Oxy hóa nội phân tử Transferase nội phân tử Tạo liên kết nhờ ATP –C=O ≡C–S– =C=N– ≡C–C≡ Khi tên hệ thống enzyme dài sử dụng không thuận tiện, người ta dùng tên gọi thông dụng chúng, ví dụ tên hệ thống enzyme xúc tác phản ứng ATP + D-Glucose ⎯⎯⎯→ ADP + D-Glucoso-6-phosphate ATP:glucose phosphotransferase; tên gọi cho thấy enzyme xúc tác vận chuyển nhóm phosphate từ ATP đến glucose Mã số enzyme 2.7.1.1: số cho biết enzyme thuộc nhóm thứ 2; số cho biết enzyme thuộc phân nhóm phosphotransferase; số cho biết chất nhận GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học -8- Enzyme nhóm phosphate nhó –OH; Số cuối cho biết chất nhận nhóm phosphate D-glucose Khi tên hệ thống enzyme dài dùng tên thông dụng nó, trường hợp gọi tên enzyme hesokinase III ĐỘNG HỌC CỦA CÁC PHẢN ỨNG ENZYME Bất kỳ phản ứng hóa học nào, ví dụ phản ứng A ⎯→ P, sở dó xảy nhờ phần lượng số phân tử A chứa lượng lớn số phân tử lại, làm cho chúng tồn trạng thái hoạt động Ở trạng thái dễ dàng phá vỡ liên kết hóa học tạo liên kết để làm xuất sản phẩm P Năng lượng cần để chuyển toàn số phân tử mol vật chất điều kiện định sang trạng thái kích động gọi lượng hoạt hóa Năng lượng cần thiết để chuyển phân tử tham gia phản ứng sang trạng thái trung gian giàu lượng tương ứng với đỉnh hàng rào hoạt hóa (hình 1) Tốc độ phản ứng tỉ lệ với nồng độ phân tử trạng thái trung gian Năng lượng hoạt hóa đo lượng cần thiết để chuyển phân tử lên trạng thái hoạt động Chất xúc tác làm giảm lượng hoạt hóa vốn cần để phản ứng xảy tự phát Bảng cho biết lượng hoạt hóa số phản ứng Phản ứng phân hủy peroxide hydro đòi hỏi 18.000 KCal/mol giảm xuống 11.700 có platin xúc tác giảm thấp chất xúc tác enzyme catalase Rõ ràng, catalase có hiệu nhiều so với chất xúc tác vô phản ứng Trên thực tế catalase có hiệu qủa đến mức cần giá trị lượng hoạt hóa nhỏ cho phản ứng Vì mà phân giải H2O2 catalase xảy tức khắc với tốc độ nhanh số phản ứng enzyme biết Bảng cho thấy enzyme khác giảm lượng hoạt hóa xuống mức thấp đáng kể so với chất xúc tác vô Vì lý mà phản ứng enzyme xảy với tốc độ cao điều kiện nhiệt độ sinh lý Bảng Năng lượng hoạt hóa phản ứng xúc tác enzyme chất xúc tác khác Phản ứng Phân giải peroxide hydro Thủy phân ethyl butyrate GS.TS Mai Xuân Lương Chất xúc tác không platin catalase ion hydro ion hydroxyl lipase tuyến tụy Ea (Kcal/mol) 18.000 11.700 < 2.000 16.800 10.200 4.500 Khoa Sinh học -9- Enzyme Thủy phân casein Thủy phân saccharose Thủy phân β-methylglucoside ion hydro trypsin ion hydro invertase naám men ion hydro β- glucosidase 20.600 12.000 25.000 8.000 -10.000 32.600 12.200 Khi tăng nhiệt độ lượng chuyển động nhiệt phân tử tăng lên, làm cho số phân tử có khả đạt trạng thái trung gian tăng lên Vì tăng nhiệt độ lên 10o, tốc độ phu hóa học tăng lên khoảng hai lần (Q10 = 2) Khác với tác dụng nhiệt độ, chất xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng cách làm giảm lượng hoạt hóa Sự kết hợp chất phản ứng chất xúc tác làm xuất trạng thái trung gian với mức lượng hoạt hóa thấp Khi sản phẩm hình thành, chất xúc tác Hình Biến thiên lượng tự lại giải phóng phản ứng hóa học trạng thái tự Các phản ứng enzyme tuân theo nguyên tắc chung động học phản ứng hóa học Tuy nhiên, chúng có đặc điểm riêng Một đặc điểm tượng bão hòa chất Ở nồng độ chất thấp tốc độ phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ chất Nhưng tiếp tục tăng nồng độ chất tốc độ phản ứng tăng chậm dần, nồng độ chất đạt giá trị đó, tốc độ phản ứng không tăng Trong điều kiện nồng độ enzyme yếu tố định tốc độ phản ứng Mặc dù tượng bão hòa chất đặc trưng cho enzyme, giá trị cụ thể nồng độ chất giá trị đặc trưng Thông qua nghiên cứu vấn đề ông Leonor Michaelis (1857-1949) bà Maud Menten (18791960) đề xuất vào năm 1913 phương trình diễn tả tốc độ phản GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 63 - tách chiết khác trọng lượng phân tử nên phương pháp lọc gen thường gọl phương pháp rây phân tử Ngày giới người ta sản xuất nhiều loai sephadex với kích thước hạt độ phân nhánh khác có khả tách chiết khác Những sản phẩm ký hiệu số: G-10, G-25, G-50, G-75, G-100, G-200 v.v Ví dụ dùng cột sắc ký chứa sephadex G-75 tách protein với trọng lượng phân tử 3-70.000; chứa sephadex G-100 tách protein với trọng lượng phân tử 4150.000, chứa sephadex G-200 tách protein với trọng lượng phân tử 5-800.000 Để tách chiết tinh chế enzyme ngày sử dụng phổ biến phương pháp điện di loại gel khác – polyacrylamide, agarose, tinh bột v.v bão hòa dung dịch đệm Sử dụng gel khả loại bỏ ảnh hưởng tác dụng đối lưu cho phép tách protein theo điên tích mà theo lượng hình dáng phân tử Trong việc tách chiết tinh chế enzyme Trên giới sử dụng ngày phổ biến phương pháp sắc ký hấp phụ enzyme cột chứa chất hấp phụ chọn lọc loại enzyme Phương pháp đặc biệt có giá trị việc tinh chế enzyme Ví dụ phương pháp tinh chế enzyme L-asparginase với hoạt tính cao gấp 25-30 lần so với phương pháp tinh chế khác Phương pháp sắc ký hấp phụ enzyme protein nói chung mở nhiều đường để hoàn thiện cong nghệ hóa sinh công nghệ hóa học tạo phương pháp tự động hóa phân tích sinh hóa Trong việc tách chiết tinh chế enzyme nhiệt độ thấp có ý nghóa quan trọng Ở nhiệt độ bình thường phòng thí nghiệm nhiều enzyme bị biến tính phần toàn hoạt tính Vì cản làm việc với enzyme thiết bị đặt phòng lạnh Ngày đại phận enzyme thu nhận dạng tinh thể Đối với chế phẩm cần phải bảo quản nhiệt độ thấp, tốt hết nhiệt độ đóng băng Các dung dịch enzyme tinh khiết chế phẩm enzyme dạng tinh thể sấy khô phương pháp khác Trong nhiều trường hợp dùng phương pháp sấy khô chân không với có mặt chất hút nước đó, mà tốt P2O5 Nhưng tốt là phương pháp sấy lạnh, sấy trạng thái đóng băng Bằng phương pháp protein enzyme giữ tốt tính chất vốn có chúng GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 64 - Cho đến phương pháp tách tinh chế chung cho enzyme Để tách tinh chế enzyme cần biết lựa chọn phối hợp cách có hiệu biện khác GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học - 65 - Enzyme XVI SỬ DỤNG ENZYME TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC Các chế phẩm enzyme ngày có nhiều ý nghóa công nghệ sinh học Chúng sử dụng sản xuất sinh hóa truyền thống làm bành mỳ, làm bia, sản xuất rượu loại nước hoa mà lónh vực công nghệ hóa sinh vi sinh học Các chế phẩm enzyme sử dụng rông rãi nghiên cứu sinh học với tư cách hóa chất dùng để định lượng hợp chất khác glucose, urea v.v Sự ứng dụng ngày rộng rãi kiến thức ghi nhận lónh vực y học Lần năm 1884 chế phẩm enzyme nhà khoa học Nhật Takaminhe sử dụng quy mô công nghiệp Ông dùng amylase nấm mốc Aspergiluc oryzae để đường hóa tinh bột Công trình có tác dụng thúc đẩy phát triển nhanh chóng enzyme học ứng dụng Ngày hàng loạt công ty Nhật, Hoa kỳ, Anh, Pháp nhiều nước khác sản xuất chế phẩm enzyme với độ tinh khiết cao để sử dụng công nghiệp, nông nghiệp, thực tiển phân tích y học Ta xem xét vài ví dụ ứng dụng chế phẩm enzyme thực tiển Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ thêm lượng nhỏ α-amylase (0,002-0,003% lượng bột) thu nhận từ Aspergillus oryzae Aspergillus awamori làm tăng đáng kể hương thơm vị ngon bánh mỳ, làm cho bánh nở màu bánh thêm đậm đà Làm tăng hương vị bánh kết trình tăng cường tạo melanoidin tác dụng α-amylase, làm cho hợp chất carbonyl bay giúp bánh có mùi thơm tăng lên đáng kể Các enzyme phân giải tinh bột sử dụng rộng rãi việc đường hóa tinh bột khoai tây, hạt ngũ cốc để sản xuất rượu Từ thời xa xưa người ta sử dụng bột mầm đại mạch để làm nguồn amylase nhiên mầm đại mạch thay nấm mốc Aspergillus oryzae Việc thay thúc đẩy đáng kể nghề sản xuất rượu Một số loại protease, papain, pepsin sử dụng rộng rãi công nghệ sản xuất bia để ngăn ngừa tượng bia bị đục (đặc bịêt bảo quản bia điều kiện lạnh) tượng có tên gọi lắng tủa protein-tannin gây Các enzyme phân giải protein sử dụng việc làm mềm thịt Thịt thường giữ độ cứng lâu sau vật bị giết Để cho thịt có độ mềm cần thiết, thường phải xử lý điều kiện lạnh 0±2o từ 10 GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 66 - đến 14 ngày Trong điều kiện bảo quản có 14-17% số thịt đánh giá thịt loại I Một điều kiện quan trọng để làm xuất chất lượng cần thiết thịt làm phân giải phần protein thịt tác dụng enzyme proteinase Ngàt papain enzyme proteolitic nguồn gốc vi khuẩn, nấm, thực vật dùng phổ biến việc xử lý thịt bảo quản, chủ yếu phương pháp sau đây: 1/ ngâm dung dịch enzyme; 2/ bôi bột làm mềm thịt có chứa enzyme với mì chính, muối ăn, tinh bột v.v ; 3/ Bơm dung dịch enzyme vào mô thịt Enzyme proteolitic sử dụng có kết qủa công nghệ thuộc da làm mềm da nguyên liệu Sử dụng enzyme làm tăng đáng kể chất lượng len làm nhanh trình xử lý Quá trình sản xuất da, đặc biệt trình làm mềm da nguyên liệu, hoàn toàn dựa việc sử dụng enzyme nguồn gốc động vật, thực vật vi sinh vật Đặc biệt sử dụng rộng rãi pancreatin – chế phẩm thô enzyme proteolitic tuyến tụy Người ta sử dụng enzyme nguồn gốc thực vật (papain) enzyme proteolitic thu từ nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus) vi khuẩn (Bacillus mesentericus) Trong công nghiệp sản xuất nước trái thường sử dụng enzyme phân giải pectin Chúng làm tăng đáng kể mức thu hoạch sản phẩm (8-15%), giảm độ nhớt làm cho nước trái Trong công nghệ sản xuất bánh kẹo thường dùng β-fructofuranosidase Vấn đề chỗ đường saccharose dễ bị kết tinh, ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm Dưới tác dụng β-fructofuranosidase saccharose bị phân giải, ngăn cản trình kết tinh saccharose Nhiều kinh nghiệm nhà sản xuất cho thấy chế phẩm cellulase thu từ nấm mốc có chứa hemicellulase sử dụng có hiệu việc chế biến thức ăn gia súc, làm tăng đáng kể độ hấp thụ thức ăn, giúp tăng trọng gia súc, giúp cho gà đẻ nhiều Với hỗ trợ chế phẩm enzyme cellulase phối hợp tương tự nhà sản xuất thành công việc tăng sản phẩm tinh bột từ nguyên liệu giàu tinh bột, tăng sản phẩm agar-agar từ nguyên liệu tảo biển, tăng lượïng nước trái từ cam loại trái khác Việc nghiên cứu ứng dụng enzyme y học ngày thu nhiều kết Trong phòng thí nghiệm y học người ta sử dụng loại dehydrogenase khác để làm thuốc thử đặc biệt, ví dụ dùng lactate dehydrogenase để xác định acid pyruvic acid lactic, sử dụng GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 67 - alcohol dehydroganase để xác định ethanol v.v Các chế phẩm enzyme có chứa alcoholdehydrogenase sử dụng số nước để xác định lượng cồn máu lái xe Đã nhiều năm trôi qua kể từ glucosooxydase sử dụng rộng rãi y học để xác định glucose nước tiểu máu Một lónh vực khác việc ứng dụng glucosooxydase sử dụng để loại bỏ glucose từ sản phẩm thức ăn phải bảo quản điều kiện khô Ví dụ, tồn glucose trứng dẫn đến tình trạng bột trứng chế tạo từ loại trứng có mùi vị khó chịu Đó glucose sấy khô bảo quản nhiệt độ cao dễ tác dụng với nhóm amine tự aminoacid protein bột sữa bị đen tạo hàng loạt chất có mùi vị khó chịu Vì trước sấy khô nguyên liệu trứng cần loại bỏ glucose cách xử lý glucosooxydase để sản phẩm bột trứng bền vững trình bảo quản Ổ Mỹ người ta sử dụng glucosooxydase để loại bỏ oxy khỏi đồ hộp nhiều loại nước giải khát khác nhau, ví dụ bia GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 68 - XVII ENZYME CỐ ĐỊNH 1.Ý nghóa enzyme cố định Trong năm cuối kỷ 20 bắt đầu phổ biến kỹ thuật cố định enzyme Enzyme hòa tan sau sử dụng thường lẫn vào với sản phẩm không tách Nếu tách enzyme bị hoạt tính, với lượng enzyme định sử dụng lần Sử dụng enzyme cố định có số ưu điểm sau: - Một lượng enzyme sử dụng lặp lặp lại nhiều lần thời gian dài; - Enzyme không lẫn vào sản phẩm, tránh ảnh hưởng không tốt đến chất lượng sản phẩm; - Dùng enzyme cố định dừng nhanh chóng phản ứng cần thiết cách tách khỏi chất Các phương pháp điều chế enzyme cố định Theo kỹ thuật chế tạo enzyme cố định, enzyme gắn vào vật mang Những vật mang cellulose dẫn xuất nó, hạt kính xốp, gel polyacrylamide, sephadex, collodium, tinh bột, loại allumosilicate oxide kim loại Về nguyên tắc, có phương pháp điều chế enzyme cố định: - Gắn liên kết đồng hóa trị phân tử enzyme vào chất mang không hòa tan gắn enzyme với để tạo nên đại phân tử không hòa tan (hình 16); Hình 16 Sơ đồ điều chế enzyme cô định cách đính mạch ngang nhờ tác nhân lưỡng chức đa chức GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học - 69 - Enzyme - Đính enzyme lên bề mặt chất mang vào lòng khuôn gel có kích thước lỗ nhỏ đủ để giữ enzyme, để chất khác qua lại tự (Hình 17); Hình 17 Hấp hụ enzyme bề mặt chất mang (a) lòng chất mang (b) - Hấp phụ enzyme lên chất mang không hòa tan có mang không mang điện tích (Hình 18) Hình 18 Sơ đồ hấp phụ enzyme chất mang có điện tích a/ Phương pháp gắn enzyme liên kết đồng hoá trị Đa số enzyme cố định thu phương pháp Với phương pháp thu enzyme cố định hai cách • Kết hợp phân tử protein enzyme vào chất mang không hòa tan Các chất mang để gắn enzyme phải thỏa mãn yêu cầu sau: - Có độ hòa tan thấp bền vững tác động học hóa học; - Không gây tác động kìm hãm đến hoạt tính enzyme; - Không hấp phụ phi chọn lọc protein khác; - Chất mang tốt có tính háo nước, chất mang kỵ nước gây tác dụng ức chế enzyme liên kết; GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - - 70 - Việc gắn enzyme có hiệu điện tích enzyme chất mang có dấu ngược Các chất mang loại thường polypeptide, dẫn xuất cellulose vaø dextran (DEAE-cellulose, CM-cellulose, DEAE- sephadex, CM, sephadex), agarose polimer tổng hợp khác polyacrilamide, polystyrol, polyamide chất vô silicagen, bentonit, hydroxide nhôm v.v Chất mang phổ biến dextran có liên kết ngang (Sephadex) agarose hạt (sepharose) Các hai loại chất có cấu trúc lỗ xốp khiến cho phân tử lớn xâm nhập vào gel cách dễ dàng Poliacrylamide chất mang tiện lợi vi có độ bền vững học hóa học cao Chất mang vô thường bền với nhiệt, học, với dung môi hữu với vi sinh vật, không bị biến đổi cấu hình khuôn thay đổi tính chất môi trường chung quanh Nhiều dẫn liệu cho thấy enzyme đính với khuôn vô bảo quản thường bền vững enzyme gắn với khuôn polymer hữu Tham gia tạo thành liên kết đồng hóa trị có nhóm chức phân tử protein enzyme nhóm β- γ-carboxyl –COOH acid asparaginic acid glutamic, nhóm ε-NH2 lysine, nhóm β-SH cysteine, vòng phenol tyrosine, nhân imidasol histidine, nhóm OH serine, threonine, nhóm guanidine arginine imidasol tryptophan Quá trình kết hợp enzyme xảy cách trực tiếp chất mang có chứa nhóm chức có khả liên kết trực tiếp nói phân tử protein enzyme Ví dụ gốc anhydride maleic liên kết với nhóm ε-NH2 lysine Trong trường hợp khác liên kết chất mang protein enzyme xảy sau chất mang hoạt hóa Việc hoạt hóa sơ chất mang thực nhiều cách Ví dụ, nhóm hydroxyl dextran polyoside khác hoạt hóa bromur cyan (BrCN) Sau chất mang hoạt hóa liên kết với enzyme (hình 19) GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học - 71 - Enzyme Hình 19 Gắn enzyme với vật mang hoạt hóa bromur cyan (BrCN) Các chất mang có chứa nhóm amin aminobenzoylcellulose, polyaminostyrol hoạt hóa phản ứng diazo Ví dụ, polyaminostyrol trước hết diazo hóa natri nitrit môi trường acid thành muối diazo, sau kết hợp với enzyme: R – NH2 R: Goác alkyl, aryl NaNO2/HCl R – N2+X Muoái diazo chất mang X: Gốc acid R– N2+X + Enzyme OH OH RN=N Enzyme chất mang Enzyme liên kết với chất mang hóa Enzyme liên kết với chưa hoạt hóa đãđược hoạt Phản ứng kết hợp enzyme tiến hành nhanh chóng điều kiện nhiệt độ thường dung dịch nước trung tính Nếu chất mang có chứa nhóm amin hoạt hóa cách cho tác dụng với phosgen tiophosgen để tạo thành dẫn xuất isosianat izothyosianat Các nhóm isosianat izothyosianat pH trung tính liên kết dễ dàng với nhóm ε-NH2 cuûa lysine Cl O=C R – NH2 + R – N = C = O + HCL Cl Cl S =C R – N = C = S + HCl Cl R – N = C = O + H2N - E R – NH – CO – NH - E Bằng phương pháp người ta điều chế dẫn xuất enzyme cố định trypsin, chimotrypsin, α-, β-amylase, glucoamylase Nếu chất mang có chứa nhóm –COOH CM-cellulose nhựa tổng hợp cần hoạt hóa trước gắn kết với enzyme phương pháp azit, carbodiimit GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học - 72 - Enzyme - Hoạt hóa phương phaùp azit: H2N – NH2 O - O – CH2 – C – O – CH3 CM-cellulose NaNO2 O – CH2 – C –NH– NH2 Hydrazin O E O Hydrazit E – NH2 - O – CH2 – C – N = N+- NH O - O – CH2 – C – NH – Azit Enzyme cố định Các enzyme trypsin, DNA-ase, chimotrypsin, bromelin cố định phương pháp - Hoạt hóa phương pháp carbodiimit: - O – CH2 – COOH + -OH CM-Cellucose N=C=N - + H2N – E N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide Enzyme - O – CH2 – CO-NH – E + NH - C O NH Dixyclohexylure - OH Vì phản ứng xảy môi trường acid yếu (pH=5) nên phương pháp đặc biệt thuận lợi enzyme có tính acid pepsin • Kết hợp đồng hóa trị phân tử enzyme với chất mang Cố định enzyme cách liên kết đồng hóa trị thực nhiều cách khác nhau: 1/ Liên kết đồng hóa trị tạo nhóm phản ứng vật mang enzyme; số trường hợp vật mang cần hoạt hóa sơ bộ; 2/ Các phân tử enzyme sau hấp phụ chất mang nằm lòng phân tử chất mang liên kết với nhờ tính lưỡng chức tính đa chức chất phản ứng Người ta thường dùng aldehyde glutaric để gắn nhóm amin lysine phân tử enzyme Ví dụ, trypsin cố định trypsin điều chế bằnh cách dùng aldehyde glutaric 2% để liên kết phân tử enzyme gắn chúng vào aminoethylcellulose b/ Phương pháp “gói” enzyme khuôn gel GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học - 73 - Enzyme Để gói enzyme vào khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hóa học gel có mặt đồng thời enzyme Sau hoàn thành trình trùng hợp enzyme bị giữ gel Gel có enzyme nghiền nhỏ cách ép qua rây có lỗ nhỏ sấy khô nhiệt độ thấp Dẫn xuất enzyme loại lần Bernfeld (1933) thu cách trùng hợp acrylamide với N,N’-methylenbisacrylamide Phương pháp thường dùng chất trùng hợp thu dễ tạo thành dạng hạt tùy thuộc điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác Sau số phương pháp “gói” enzyme • Các gel hình thành từ polymer tổng hợp acrylamide, hydroxyethyl-2-metacrylate, tạo phức cua ethyleneglycol-dimetacrylate, polyvinyl, polyuretan Enzyme hòa tan phân tán dung dịch monomer sau trùng hợp có mặt hay nhiều tác nhân tạo phức cua Gel cắt thành màng đặt giá thể rắn, nghiền thành bột sau loại trừ nước Alginate caraghenan lấy từ rong biển thường có khả tạo gel tốt thuận lợi để bao gói enzyme tế bào nguyên vẹn • Các enzyme bị “nhôùt” lỗ nhỏ sợi tổng hợp Với cách người ta cho dịch lỏng chảy bên sợi, hạn chế phân cực bề mặt bịt lấp thường gặp với màng Một nhũ tương cellulose triacetate methylene chlorua enzyme dung dịch đệm có chứa glycerol ép qua khuôn lọc áp suất nitơ Các sợi khỏi khuôn nhúng vào bể đông tụ có chứa toluel, sau làm khô chân không Các sợi bền với acid yếu kiềm yếu, lực ion cao chịu số dung môi hữu Tuy nhiên phương pháp thích hợp enzyme khó bị hoạt tính dung môikhông hòa lẫn với nước • Phương pháp gói enzyme bao vi thể (microcapsul) Enzyme gói bao vi thể có màng bán thấm tạo từ polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản khuếch tán enzyme đủ lớn để chất vào sản phẩm phản ứng dễ dàng Có nhiều phương pháp gói enzyme microcapsul Sau phương pháp Cho dung dịch loãng chứa enzyme GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học - 74 - Enzyme monomer ưa nước dung môi hữu không hòa lẫn nước để tạo nhũ tương, sau thêm monomer kỵ nước để gây phản ứng trùng hợp tạo màng bao quanh giọt lỏng nhỏ Thường phải thêm vào tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương để điều chỉnh capsul có kích thước mong muoỏn tửứ ủeỏn 100 àm ã Phửụng phaựp tien polymer để gói chất xúc tác sinh học Cố định enzyme phương pháp có ưu điểm sau: - Quá trình gói đơn giản điều kiện nhẹ nhàng; - Các chất tiền trùng hợp không chứa monomer vốn gây ảnh hưởng xấu đến enzyme gói; - Cấu trúc lưới gel điều chỉnh cách dùng tiền polymer có chiều dài chuỗi bất kỳ; - Các tính chất hóa lý gel (như cân tính háo nườc tính kỵ nước, chất ion) định hướng trước cách chọn tiền polymer thích hợp vốn tổng hợp hóa học điều kiện vắng mặt enzyme Dưới ví dụ phương pháp tiền polymer Đó phương pháp tạo liên kết chéo tiền polymer cách chiếu tia cực tím để gói enzyme Khi chiếu tia cực tím gần lên dung dịch có chứa chất tiền polymer enzyme tạo liên kết chéo gốc tiền polymer gel hình thành bao lấy enzyme Sư gói enzyme phương pháp tiến hành điều kiện nhẹ nhàng, tránh thay đổi pH kiềm acid, thời gian lại nhanh, vòng từ 3-5 phút Với phương pháp gói enzyme, tế bào vi sinh vật bào quan c/ Cố định enzyme phương pháp hấp phụ chất mang có điện tích Với phương pháp enzyme hấp phụ chất có hoạt tính bề mặt than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin, polyacrylamide, nilon, polystyrol v.v số nhựa trao đổi ion, silicagen, thủy tinh Trong trường hợp chất mang lỗ enzyme đính vào chất mang thành lớp bề mặt; chất mang có lỗ phân tử enzyme xâm nhập vào lỗ Một số đặc tính enzyme cố định Việc cố định làm thay đổi đáng kể nhiều tính chất enzyme độ bền, tính đặc hiệu, đặc điểm động học Thông thường việc cố định làm tăng GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 75 - đáng kể độ bền enzyme Ví dụ, cố định protease làm tăng độ bền với nhiệt gấp chục nghìn lần Sau cố định độ bền với nhiệt enzyme tăng lên mà phạm vi nhiệt độ tối thích enzyme mở rộng Nhiệt độ cao làm cho enzyme bị biến tính, cấu trúc bậc ba enzyme bị phá vỡ enzyme bị hoạt tính Khi enzyme cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang trình biến tính bị ngăn cản, làm cho enzyme chịu nhiệt độ cao Trong trương hợp enzyme thủy phân protein, ví dụ papain trypsin cố định làm ngăn cản phần hoàn toàn tương tự phân Điều có ý nghóa thực tế giúp làm tăng thời gian làm việc enzyme Sự biến đổi đặc điểm động học enzyme việc cố định gây minh họa qua ví dụ enzyme glutamate dehydrogenase: enzyme cố định màng collagen số Michaelis dành cho acid glutamic tăng lần, tác dụng hoạt hóa ADP tăng lên đáng kể Một nguyên nhân làm biến đổi tính chất enzyme chúng cố định thay đổi phản ứng môi trường Enzyme thường cố định chất mang có điện tích Ví dụ chất trao đổi anion mang điện tích âm bao quanh môi trường giàu proton, pH lớp nằm kế sát với enzyme cố định thấp so với pH môi trường dung dịch Điều làm cho đường cong phụ thuộc pH hoạt tính enzyme cố định chất mang anionit, cationit trung tính khác Ứng dụng enzyme cố định a/ Trong công nghiệp - Từ năm 1969 Wilson xây dựng thành công xưỡng thực nghiệm để sản xuất liên tục glucose glucoamylase cố định; - Từ 1971 người ta thành công việc dùng chimotrypsin cố định carboxymethylcellulose để làm động tụ sữa thay cho renin đắt tiền; - Enzyme rasemase cố định sử dụng để chuyển toàn Daminoacid thành L- aminoacid tương tứng, làm tăng giá trị dinh dưỡng sản phẩm lên gấp đôi - Làm nước trái cách xử lý enzyme phân giải pectin hay thủy phân protein bia protease hoàn toàn thực cột chứa enzyme cố định tương ứng GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 76 - - Cố định enzyme glucoisomerase cột hoàn toàn có hiệu việc ngăn ngừa chuyển hóa glucose thành fructose, làm cho độ nước giải khát bị giảm Nhờ cố định enzyme glucoisomerase việc thu nhận xirô gluco-fructose ngày trở thành quy trình công nghiệp quan trọng phổ biến Độ chịu nhiệt cao enzyme cho phép thực trình sản xuất nhiệt độ 60-70o, làm giảm đáng kể khả nhiễm khuẩn thiết bị enzyme b/ Trong y học - Urease gắn vi tiểu cầu sử dụng có hiệu để loại trừ urea máu thận nhân tạo; - Vi tiểu cầu chứa catalase thay cách có hiệu số catalase bị thiếu - Đưa vi tiểu cầu có gắn enzyme L-asparaginase vào thể có khả ức chế phát triển số u ác tính phát triển u phụ thuộc vào có mặt L-asparagin c/ Trong phân tích hóa sinh Glucoamylase gắn đồng hóa trị với polystyrol dùng để xác định tự động glucose; tục; Điện cực urease cố định dùng để xác định tự động urea dòng liên Điện cực alcoholoxydoreductase cố định dùng để xác định methanol, ethanol dung dịch nước Cố định enzyme tạo khả nghiên cứu hàng loạt vấn đề lý thuyết enzyme học Vi dụ cố định enzyme sử dụng để ngăn cản phối hợp ngẫu nhiên phần đơn vị enzyme oligomer Sử dụng việc cố định giải vấn đề liệu enzyme dạng phần đơn vị có hoạt tính hay không Nếu phần đơn vị trạng thái cố định có hoạt tính qua so sánh hoạt tính enzyme với hoạt tính oligomer cố định thu thông tin có gía trị vai trò tương tác phần đơn vị việc thực chức enzyme Ngày ta biết rõ phần lớn enzyme nội bào hoạt động môi trường tương tự gel chúng “gói” màng ti thể, lục lạp quan tử khác Vì vậy, enzyme cố định mô hình tốt để nghiên cứu hoạt động enzyme Kỹ thuật cố định không dùng cho chế phẩm enzyme mà dùng cho tế bào vi sinh vật nguyên vẹn Để cố định tế bào vi sinh vật GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Enzyme - 77 - người ta thường dùng gel polyacrylamide, cellulose, caraganine vật liệu khác Đáng lưu ý nhiều trường hợp hoạt tính enzyme tế bào cố định cao nhiều so với enzyme tự Các tế bào cố định chí thực trình sinh hóa tinh vi phức tạp Ví dụ tế bào Rhisobium lupini nốt sần lupin vàng giữ lâu hoạt tính cố định đạm chúng GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh hoïc