Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Xác định và phân tích hoàn chỉnh trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Bùi Anh Tuấn XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH HỒN CHỈNH TRÌNH TỰ HỆ GEN TY THỂ CỦA GIỐNG LỢN BẢN ĐỊA TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sỗ: 94 20 20 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS TS Nghiêm Ngọc Minh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Võ Thị Bích Thủy Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trong điều kiện chăn nuôi tại, giống lợn địa bị giảm dần số lượng, nguồn gen quý địa phương quốc gia, số giống bị tuyệt chủng đứng bờ tuyệt chủng Cho đến nay, chưa có cơng trình nghiên cứu khoa học đầy đủ hệ gen giống lợn địa Việt Nam, qua làm sáng tỏ nguồn gốc quan hệ phát sinh chủng loại, nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn tài nguyên quý Việc xây dựng sở liệu phân tử nguồn gen giống lợn chưa tiến hành khai thác cách đầy đủ Từ vấn đề cấp bách nêu trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định phân tích hồn chỉnh trình tự hệ gen ty thể giống lợn địa số tỉnh Miền Bắc Việt Nam" Mục tiêu nghiên cứu luận án - Thu liệu hoàn chỉnh hệ gen ty thể giống lợn địa Việt Nam (lợn Ỉ, lợn Móng Cái, lợn Mường Lay, lợn Hương, lợn Mường Khương lợn Hạ Lang) đăng ký Ngân hàng gen - Xác định thành phần, cấu trúc hệ gen ty thể, so sánh sai khác trình tự, xác định đặc điểm di truyền đặc trưng sáu giống lợn địa trên, qua đóng góp vào sở liệu phục vụ công tác nhận dạng bảo tồn - Xác định mối quan hệ di truyền, nhận định nguồn gốc, phát sinh chủng loại giống lợn địa Việt Nam Các nội dung nghiên cứu luận án - Điều tra, khảo sát giống, nơi cư trú, thu thập mẫu máu của sáu giống lợn địa nghiên cứu - Giải trình tự tồn hệ gen ty thể sáu giống lợn địa Lắp ráp, xác định trình tự hồn chỉnh toàn hệ gen ty thể giải - Phân tích thành phần, cấu trúc hệ gen - Nghiên cứu đa hình trình tự, so sánh trình tự hệ gen ty thể giống lợn với số giống lợn Châu Á, Châu Âu - Xây dựng phát sinh chủng loại dựa trình tự vùng D-loop trình tự hồn chỉnh hệ gen ty thể, phân tích mối quan hệ nguồn gốc phát sinh chủng loại giống lợn địa số giống lợn khác giới Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân loại q trình hóa lợn nhà Tổ tiên xa xưa lợn lợn rừng, săn bắn để cung cấp thực phẩm cho sống người nguyên thủy Tất giống lợn coi dạng Sus scrofa domestica Các chứng phát sinh chủng loại địa lý cho thấy trình hóa lợn diễn nhiều lần nhiều nơi giới Có quan điểm cho tổ tiên lợn ngày xác định lợn rừng nguyên thủy quê hương chúng vùng Đông Nam Á 1.2 Ứng dụng hệ gen ty thể nghiên cứu phát sinh chủng loại, xác định nguồn gốc Xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại nhờ trình tự mtDNA dựa ngun lý: thơng tin q trình tiến hóa thu qua phân tích liệu trình tự mtDNA sử dụng rộng rãi để nghiên cứu phát sinh chủng loại với lý sau: Thứ nhất, tiến hóa mtDNA động vật có vú diễn trước hết từ thay cặp nucleotide, mà xảy tái xếp phần hệ gen Thứ hai, tốc độ tiến hóa mtDNA cho nhanh gấp 10 lần so với DNA nhân Thứ ba, mtDNA di truyền theo dòng mẹ, đơn bội không xảy tái tổ hợp 3 1.3 Phát sinh chủng loại phân tử, xây dựng phân tích phát sinh chủng loại phân tử 1.3.1 Cây phát sinh chủng loại Cây phát sinh chủng loại biểu đồ hình nhánh biểu diễn mối quan hệ tiến hóa thực thể sinh vật, nêu lên giả thuyết sinh vật có quan hệ họ hàng với Hình học tô-pô xác định mối quan hệ thực thể đại diện phát sinh Chiều dài nhánh phản ánh mức độ quan hệ đối tượng Chỉ nhánh nối hai nút Các nút đại diện cho đơn vị phân loại (các taxon mà cụ thể trình tự DNA protein), nút giao điểm hay điểm tận hai nhiều nhánh Một đơn vị phân loại hoạt động (OTU) taxon có có mặt nút ngồi hay cịn gọi 1.3.2 Phân tích phát sinh chủng loại Phân tích phát sinh chủng loại phân tử chia làm năm bước: (1) Thu nhận trình tự, lựa chọn trình tự: thu nhận trình tự từ sở liệu bao gồm hàng ngàn họ protein sinh vật nhân thực, hay kết từ cơng cụ BLAST (2) Dóng hàng đa trình tự: Sử dụng phép dóng hàng đa trình tự nhóm trình tự tương đồng (homologous) (3) Lựa chọn mơ hình thay chuỗi DNA amino acid: Đây mơ hình mơt tả các thức thay đơn phân q trình tiến hóa (4) Xây dựng cây: Có bốn phương pháp để dựng cây: dựa vào khoảng cách, maximum parsimony, maximum likelihood suy luận Bayes Phương pháp Bayes giúp suy luận dựa mơ hình để phân tích phát sinh chủng loại MrBayes lượng giá phân bố xác suất tiên nghiệm, khả tạo thỏa mãn liệu quan sát (5) Phân tích phát sinh chủng loại: Tính xác đánh giá phân tích bootstrap Bootstrap mơ tả độ mạnh hình học tơ-pơ Việc xác định gốc giúp đánh giá tổng thể chiều hướng biến đổi Có thể xác định gốc dựa vào trung điểm nhờ nhóm đối chứng Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu Các cá thể lợn thuộc giống lợn địa Việt Nam (Ỉ, Móng Cái, Mường Khương, Mường Lay, Hương Hạ Lang) lựa chọn ngẫu nhiên đàn lợn số địa phương: Điện Biên, Lào Cai, Cao Bằng, Hải Phòng Thanh Hóa 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp điều tra dựa đặc điểm ngoại hình lợn Quan sát bên ngồi vật nhóm tiêu màu sắc lơng, da nhóm tiêu đánh giá hình dạng, đặc điểm phận thể lợn, đo đạc khối lượng, số: dài thân, vịng ngực cao vai Tiêu chí đánh giá đối chiếu với Át lát Các giống vật nuôi Việt Nam Chuyên khảo Bảo tồn khai thác nguồn gen vật Nuôi Việt Nam 2.3.2 Xác định trình tự hệ gen ty thể Tách chiết DNA, khuếch đại phân đoạn mtDNA PCR, giải trình tự hệ gen ty thể phương pháp phân đoạn (shotgun) theo nguyên lý Sanger 2.3.3 Nhóm phương pháp lắp ráp, dóng hàng trình tự, dự đốn giải hệ gen 2.3.3.1 Lắp ráp hệ gen Dữ liệu trình tự đánh giá chỉnh sửa phần mềm BioEdit v7.2.5 Các đoạn contig thu từ trình cắt gọt ghép nối lại dựa phần trình tự gối lên hai đầu đoạn phần mềm DNA Dragon v1.6.0 (SequentiX) phần mềm EditSeq (DNASTAR) 2.3.3.2 Dóng hàng đa trình tự Các trình tự vùng D-loop trình tự vùng mã hóa hệ gen ty thể vừa lắp ráp tách riêng Các đoạn trình tự lặp ngắn trước sau 5' -CGTGCGTACA-3' xác định số lượng đơn vị lặp loại bỏ Trình tự hệ gen ty thể giống lợn giới dóng hàng đa trình tự, sử dụng thuật tốn MUSCLE Xác định mơ hình tiến hóa thích hợp phần mềm MEGA7 2.3.3.3.Phân tích, giải hệ gen Phân tích giải hệ gen gen tRNA giống lợn địa Việt Nam công cụ trực tuyến Dogma Mitos Web Server Tất giải kiểm tra công cụ BLAST GenBank 2.3.4 Phân tích trình tự phương pháp xác định mức độ tương đồng trình tự Với trình tự thu được, chúng tơi tiến hành phân tích số tỷ lệ bất đối xứng loại nucleotide phần trăm loại nucleotide sử dụng phần mềm DAMBE v6.3.17 (http://dambe.bio.uottawa.ca/), với hai số độ lệch: GC skew AT skew tính tốn dựa theo cơng thức sau: 2.3.5 Phương pháp xây dựng phân tích chủng loại phát sinh 2.3.5.1 Khoảng cách tiến hóa Khoảng cách p (p-distance) cặp trình tự tính tốn sử dụng thuật tốn hai thông số Kimura phần mềm MEGA 6 2.3.5.2 Phân tích phát sinh chủng loại Trình tự vùng Dloop tồn vùng mã hóa hệ gen ty thể sử dụng riêng biệt làm liệu đầu vào để dựng phát sinh chủng loại tương ứng Phương pháp Bayes sử dụng phần mềm BEAST v1.8.3, thiết lập Yule process MCMC 10000000 để tính tốn xác suất hậu nghiệm Cây tối thích tìm phần mềm Tree Annotater v.1.8.4 Gốc xác định phương pháp sử dụng nhóm đối chứng (out - group Kiểm tra thứ tự phân nhánh tính xác phân tích bootstrap sau 1000 lần lặp lại Cuối cùng, phần mềm Figure Tree v1.4.2 sử dụng để đọc tệp tin kết xuất xây dựng phát sinh chủng loại Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chọn lựa, thu thập mẫu Tính đến Việt Nam, để nhận diện giống lợn địa nhà chọn giống chưa có sở liệu phân tử mà chủ yếu tiêu đặc điểm hình thái cơng bố phê chuẩn Để đảm bảo độ tin cậy việc thu mẫu phục vụ nghiên cứu, tiến hành khảo sát đặc điểm ngoại hình dựa nhóm tiêu là: (1) Đặc điểm lơng, da; (2) tầm vóc, khối lượng (3) hình dáng thể, số lượng núm vú a Nhóm tiêu đặc điểm lông da Ở giống Mường Lay, qua quan sát thấy phân bố màu sắc lông da thường kèm theo với số tiêu ngoại hình để tạo thành phân nhóm nhỏ (gọi tên: nhóm A+) Số lượng cá thể lợn quan sát màu sắc lơng da phân vào nhóm A+, A B theo thứ tự giảm dần tiêu đặc trưng giống Chỉ cá thể có đầy đủ tiêu giống (nhóm A A+) chọn lựa để sàng lọc nhóm tiêu 7 Bảng 3.1 Kết khảo sát đặc điểm lông, da giống lợn địa Đặc điểm màu sắc lông da Tổng số N Nhóm % Lợn Ỉ Lơng thưa, thơ Lơng, da đen khơng bóng 9 A 100 100 82 B 82,0 18 A 18,0 77 B 77,0 23 A 23,0 22 B 57,8 16 A 42,1 13 B 31,7 28 A 68,3 35 B 50,0 - Có thêm đốm trắng chân, trán, đuôi, lưng thẳng, đầu núm vú cách mặt 10-15 cm A 11,4 - Có thêm lưng võng, bụng sệ, đầu núm vú khơng sa sệ 27 A+ 38,5 Lợn Móng Cái - Thân lang đen trắng, đầu đen, tiếp giáp lông đen trắng có khoảng mờ - Thân lang đen trắng, đầu đen trán có đốm trắng, tiếp giáp lơng đen trắng có khoảng mờ Lợn Mường Khương - Màu sắc lông da đen tuyền Lông thưa mềm 100 - Màu sắc lông da đen tuyền đen có đốm trắng đầu chân, lông thưa mềm Lợn Hương - Thân chân trắng, có mảng lơng da màu đen mơng da đầu Phần tiếp giáp đen trắng rộng khoảng 2-3 cm, da đen, lơng trắng 38 - Có thêm đặc điểm: trán có điểm trắng, bốn chân có mầu trắng Lợn Hạ Lang - Bụng trắng có dải trắng vắt vai có dải đen gần giống yên ngựa - 41 Có thêm đặc điểm: Giữa trán có điểm trắng gần giống hình nêm Lợn Mường Lay - Đen tuyền, lưng thẳng, đầu núm vú cách mặt đất 10-15cm 70 (N: Số cá thể lựa chọn có đặc điểm màu sắc lơng da phù hợp với Át lát; %: phần trăm cá thể có đặc điểm phù hợp tổng số cá thể quan sát) Chỉ cá thể nhóm A A+ chọn lựa để tiến hành khảo sát nhóm tiêu chí tầm vóc, khối lượng b Đặc điểm kích thước chiều đo khối lượng Bảng 3.2 Kết khảo sát khối lượng kích thước giống lợn địa Khối lượng Dài thân Vòng ngực Cao vai ± SD 40,34 ± 0,92 51,47 ± 0,32 40,55 ± 0,22 42,68 ± 042 52,64 ± 0,92 40,43 ± 0,95 ± SD 85,76 ± 1,32 92,41 ± 1,35 86,73 ± 1,33 87,12 ± 1,33 93,94 ± 1,32 85,71 ± 1,38 ± SD 83,93 ± 1,44 90,77 ± 1,46 81,31 ± 1,42 84,34 ± 1,43 90,52 ± 1,46 83,97 ± 1,46 ± SD 39,58 ± 0,91 45,25 ± 0,93 42,56 ±0,36 43,68 ±0,98 46,14 ±0,96 43,25±0,94 Giống lợn Ỉ Móng Cái Hương Hạ Lang Mường Khương Mường Lay (ĐVT: Khối lượng: Kg; kích thước: cm) : Trị số trung bình ± SD: độ lêch chuẩn Kết cho thấy 100% cá thể khảo sát nhóm tiêu tầm vóc kích thước thể mang đặc điểm đặc trưng giống c Khảo sát nhóm tiêu hình dáng thể Bảng 3.3 Khảo sát đặc điểm hình dáng thể giống lợn địa Đặc điểm hình dáng thể (số lượng núm vú) Tổng số N % 9 100 18 15 83,3 Lợn Ỉ - Đầu to vừa phải, trán gần phẳng, mặt nhăn, nọng cổ má chảy sệ béo, mõm ngắn, - Bụng sệ, thân, chân dài cao so với lợn Ỉ Mỡ Lợn Móng Cái - Đầu to, mõm nhỏ dài, tai nhỏ nhọn, có nếp nhăn to ngắn miệng