Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xác định tỷ lệ nhiễm trùng do Clostridium difficile ở những bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh. Phân tích các đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi khuẩn kỵ khí Clostridium difficile gây bệnh.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ NỘI ĐẶNG THỊ THÙY DƢƠNG XÁC ĐỊNH CĂN NGUYÊN GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Clostridium difficile ĐỐI VỚI TIÊU CHẢY LIÊN QUAN ĐẾN KHÁNG SINH TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN Ở HÀ NỘI Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 62420107 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2017 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Bùi Thị Việt Hà TS Vũ Thị Thu Hƣờng Phản biện: ……………………………………… …………………………………… Phản biện: ……………………………………… ……………………………………… Phản biện: ……………………………………… …………………………………… Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam, - Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Tiêu chảy sau dùng kháng sinh đƣợc định nghĩa tình trạng tiêu chảy xảy có liên quan đến việc sử dụng kháng sinh gây phá vỡ cân hệ vi khuẩn đƣờng ruột làm phát triển mức vi khuẩn có hại sinh độc tố Trong số tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh, Clostridium difficile (C difficile) nguyên nhân nhiễm trùng quan trọng chiếm từ 10-25% ca tiêu chảy sau dùng kháng sinh, 90-100% ca viêm đại tràng giả mạc liên quan đến kháng sinh C difìcile trở thành nguyên gây nhiễm trùng phổ biến nƣớc Châu Âu Châu Mỹ gần hai thập kỉ qua Theo CDC, 20 bệnh nhân nằm viện có bệnh nhân mắc phải nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế MRSA giảm tỉ lệ nhiễm trùng C difficile tiếp tục tăng lên nhanh chóng Ngồi ra, nghiên cứu dịch tễ học phân tử giới có mối liên quan mức độ nghiêm trọng bệnh với kiểu gen vi khuẩn điển hình nhƣ típ vi khuẩn C difficile BI/NAP1/027 đƣợc xác định nguyên gây nhiều vụ dịch lớn Châu Âu Bắc Mỹ vào đầu kỉ XXI Do vậy, việc nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử C difficile gây bệnh cần thiết cho điều tra vụ dịch tiêu chảy bệnh viện phát típ chủng vi khuẩn có khả gây vụ dịch Trong khi, nhiều nƣớc nhƣ Anh, Mỹ, Ai-xơ-len có hệ thống giám sát tiêu chảy bệnh viện nói chung tiêu chảy C difficile nói riêng ngày đƣợc mở rộng trở thành bắt buộc, nhận thức nguyên gây bệnh Châu Á hạn chế Một số nghiên cứu thời gian gần bƣớc đầu xác định C difficile tác nhân truyền nhiễm nƣớc Nhật Bản, Trung quốc, Singapore, Hàn Quốc Thái Lan Tại Việt Nam, vai trò gây bệnh vi khuẩn kỵ khí nói chung C difficile chƣa đƣợc quan tâm mức Một nguyên nhân thực trạng thiếu chứng, sở khoa học chứng minh vai trò gây bệnh vi khuẩn Trong đó, nƣớc ta, kháng sinh thƣờng bị lạm dụng bệnh viện cộng đồng Thêm vào đó, mơi trƣờng bệnh viện đơng đúc, biện pháp phòng chống nhiễm khuẩn thƣờng hiệu lực Các yếu tố yếu tố làm tăng nguy nhiễm trùng C difficile Từ năm 2012, có vài nghiên cứu nƣớc báo cáo ca bệnh điển hình C difficile bƣớc đầu xác định tỉ lệ nhiễm trùng C difficile nhƣng lƣợng mẫu nhỏ bệnh viện Do chƣa phản ánh đƣợc tình hình nhiễm trùng C difficile khu vực Hơn chƣa có nghiên cứu phân tích đặc điểm dịch tễ học chủng C difficile gây bệnh nƣớc ta Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Xác định nguyên gây bệnh vi khuẩn Clostridium difficile tiêu chảy liên quan đến kháng sinh số bệnh viện Hà Nội” MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1) Xác định tỷ lệ nhiễm trùng Clostridium difficile bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh 2) Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử vi khuẩn kỵ khí Clostridium difficile gây bệnh Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3.1 Ý nghĩa khoa học - Đây số nghiên cứu Việt Nam xác định tỉ lệ nhiễm trùng C difficile bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh Kết khơng góp phần bổ sung thông tin bị thiếu hụt tiêu chảy sau dùng kháng sinh mà cung cấp chứng chứng minh vai trò gây bệnh quan trọng vi khuẩn C difficile nhƣ nhóm vi khuẩn kỵ khí gây bệnh nói chung đƣợc quan tâm Việt Nam - Kết phân loại đặc điểm dịch tễ học phân tử C difficile gây bệnh sở khoa học để xác định mối tƣơng quan kiểu gen chủng vi khuẩn gây bệnh bệnh viện bệnh viện khu vực 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Tỉ lệ nhiễm trùng C difficile bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh bệnh viến lớn Hà Nội 24,9% Đây chứng thuyết phục cho thấy cần thiết phải tiến hành xét nghiệm phân tìm C difficile gây bệnh ca bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh Kết xét nghiệm giúp cho bác sỹ lâm sàng việc xử trí, lựa chọn liệu pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân bị tiêu chảy sau dùng kháng sinh, đồng thời giúp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện tốt giảm gánh nặng cho ngành y tế - Kết phân loại đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng C difficile gây bệnh phát đƣợc típ vi khuẩn gây bệnh phổ biến bệnh viện Hà Nội trf, 017, cc835, og39 dự đoán típ gây vụ dịch trf Đây thông tin quan trọng giúp cho nhà dịch tễ học, nhà quản lý y tế có biện pháp phòng chống dịch bệnh xảy PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Đề tài tiến hành nghiên cứu đối tƣợng bệnh nhân có độ tuổi từ 15 tuổi trở lên, bị tiêu chảy sau dùng kháng sinh bệnh viện Hà Nội bao gồm bệnh viện Bạch Mai, Nhiệt Đới, Lão Khoa bệnh viện Đống Đa Các kỹ thuật, thí nghiệm đƣợc thực phịng Vi khuẩn Kỵ khí, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng Luận án thực nội dung nghiên cứu Một xác định tỉ lệ nhiễm trùng C difficile bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh hai phƣơng pháp nested PCR nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố Trong nội dung này, chúng tơi có tiến hành đánh giá hiệu năng, xác định giới hạn phát môi trƣờng Cycloserine – Cefoxitine – Manitol –Agar (CCMA) nuôi cấy phân lập C difficile so sánh hai phƣơng pháp nuôi cấy nested PCR Hai phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng C difficile gây bệnh hai phƣơng pháp phân loại phân tử PCR ribotyping giải trình tự gen slpA (slpAST) NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1) Luận án cơng trình nghiên cứu Việt Nam phân loại phân tử chủng C difficile gây bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh quần thể ngƣời lớn, lƣu hành bốn bệnh viện Hà Nội thành típ ribotype 10 phân nhóm slpAST Trong ribotype phổ biến trf, 017, cc835 og39, phân nhóm slpAST phổ biến fr-01 Luận án có vai trị nhƣ bƣớc thúc đẩy hƣớng nghiên cứu dịch tễ học phân tử C difficile quần thể khác vùng miền khác nƣớc ta 2) Kết luận án Việt Nam xuất hai phân nhóm slpAST so với phân nhóm cơng bố giới fr-23 fr-24 Trình tự gen slpA chủng đƣợc đăng ký ngân hàng Genbank với mã tƣơng ứng LC176667 LC189481 Kết có ý nghĩa quan trọng việc điều tra nguồn gốc chủng gây bệnh lƣu hành vùng miền nƣớc, nƣớc khu vực toàn giới BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án bao gồm 149 trang có trang mở đầu, 33 trang tổng quan, 19 trang vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu, 60 trang kết bàn luận CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh 1.2 VI KHUẨN Clostridium difficile 1.2.1 Đặc điểm sinh học 1.2.2 Độc tố C difficile 1.2.2.1 Độc tố TcdA TcdB Hai độc tố A B hai dấu ấn cho chẩn đoán nhiễm trùng C difficile Các chủng mang hai độc tố hai độc tố có khả gây bệnh (A+B+, A-B+, A+B-), chủng không sản xuất độc tố (A-B-) khơng có khả gây bệnh Trong đó, dịng A+B+ A-B+ hai dòng gây bệnh phổ biến 1.2.3 Cơ chế gây bệnh C difficile gây bệnh nhờ độc tố TcdA TcdB Các độc tố có khả gây độc gây bệnh lý tế bào 1.2.4 Các bệnh C difficile gây 1.2.5 Các yếu tố nguy nhiễm trùng C difficile 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƢỚC 1.3.1 Trên giới 1.3.1.1 Tình hình nhiễm trùng C difficile 1.3.1.2 Dịch tễ học phân tử chủng C difficile gây bệnh 1.3.2 Trong nƣớc Trong vài năm gần đây, số nghiên cứu nƣớc đƣa đƣợc quy trình xét nghiệm bƣớc cho chẩn đoán nhiễm trùng C difficile, báo cáo ca bệnh điển hình, tỉ lệ nhiễm trùng C difficile số lƣợng mẫu nhỏ bệnh viện 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG DO Clostridium difficile 1.4.1 Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố Phƣơng pháp gồm bƣớc: nuôi cấy phân lập C difficile từ phân sau xác định chủng vi khuẩn C difficile sinh độc tố 1.4.2 Phƣơng pháp khuếch đại gen phát gen sinh độc tố trực tiếp từ mẫu phân Các kỹ thuật thƣờng dùng nested PCR, multiplex PCR, real time PCR để phát gen sinh độc tố A B C difficile 1.4.3 Các phƣơng pháp khác 1.4.3.1 Kỹ thuật trung hòa độc tố tế bào 1.4.3.2 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzym 1.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI PHÂN TỬ VI KHUẨN Clostridium difficile GÂY BỆNH 1.5.1 Phƣơng pháp phân loại phẩn tử PCR ribotyping Phƣơng pháp phân loại chủng C difficile dựa sai khác số lƣợng chiều dài vùng ITS rADN 16S 23S 1.5.2 Phƣơng pháp phân loại phân tử giải trình tự gen slpA Phƣơng pháp phân loại chủng C difficile dựa sai khác trình tự nucleotide gen 1.5.3 Các phƣơng pháp khác CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Định nghĩa ca bệnh - Bệnh nhân đƣợc xác định tiêu chảy sau dùng kháng sinh C difficile có đầy đủ chứng lâm sàng xét nghiệm nhƣ sau: có tiền sử sử dụng kháng sinh vịng tuần, có tiêu chảy phân lỏng nƣớc, kết xét nghiệm mẫu phân dƣơng tính với gen sinh độc tố 2.1.2 Cỡ mẫu, thời gian địa điểm nghiên cứu - Cỡ mẫu tối thiểu: 322 mẫu Tiến hành thu thập mẫu phân thu thập thông tin bệnh nhân từ tháng 1/ 2013 đến tháng 12/ 2015 bệnh viện: Bạch Mai, Nhiệt Đới, Lão Khoa, Đống Đa 2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU: mô tả cắt ngang 2.3 CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 2.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.4.1 Chủng vi khuẩn - Các chủng vi khuẩn đƣợc mua từ công ty Microbiologics, Minnesota, Mỹ Các bào tử C difficile tinh khiết đƣợc tạo phòng Vi khuẩn kỵ khí, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng 2.4.2 Sinh phẩm Các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi, nested PCR, PCR ribotyping, giải trình tự gen, kit tách chiết DNA QIAgen Stool minikit, sinh phẩm tách chiết DNA QIAgen DNA minikit, kit tinh sản phẩm PCR QIAgen 2.4.3 Môi trƣờng nuôi cấy: Môi trƣờng CCMA, GAM – HT, TSA 2.5 NỘI DUNG VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG 2.5.1 Đánh giá hiệu xác định giới hạn phát môi trƣờng CCMA 2.5.2 Nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố 2.5.2.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ mẫu phân 2.5.2 Xác định chủng vi khuẩn C difficile phân loại độc tố 2.5.3 Kỹ thuật nested PCR 2.5.4 Kỹ thuật PCR ribotyping 2.5.5 Kỹ thuật giải trình tự gen slpA CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 HIỆU NĂNG VÀ GIỚI HẠN PHÁT HIỆN CỦA MƠI TRƢỜNG CCMA 3.1.1 Tính suất Năng suất môi trƣờng CCMA so với GAM- HT PR = 0,97 Kết chứng tỏ môi trƣờng CCMA có suất cao 3.1.2 Tính chọn lọc Hệ số chọn lọc môi trƣờng CCMA SF > Mơi trƣờng CCMA có tính ức chế tồn phần với 21 chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí hiếu kỵ khí tùy tiện, đặc biệt với C sordellii lồi có độ tƣơng đồng cao hệ gen với C difficile Các kết cho thấy mơi trƣờng CCMA thích hợp để khôi phục C difficile từ mẫu bệnh phẩm phân C difficile C difficile triệu chứng lâm sàng Do vậy, đòi hỏi cần thiết phải tiến hành thƣờng quy xét nghiệm phát C difficile gây bệnh ca tiêu chảy sau dùng kháng sinh bệnh viện nƣớc ta Kết xét nghiệm giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đốn xác ca bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh nói chung tiêu chảy C difficile nói riêng 3.3.2 Tỉ lệ CDI theo kiểu độc tố Tỉ lệ nhiễm trùng dòng vi khuẩn C difficile mang kiểu độc tố A+B+ 8,1% (31/382), dòng vi khuẩn C difficile A-B+ 10,2% (39/382) ca tiêu chảy sau dùng kháng sinh Nhƣ dòng vi khuẩn C difficile A-B+ dòng gây bệnh phổ biến bệnh viện lớn Hà Nội ta năm 2013 đến 2015 3.3.3 TỈ LỆ CDI THEO CÁC ĐẶC ĐIỂM VỀ NHÂN KHẨU HỌC Bảng 10 Tỉ lệ CDI theo đặc điểm nhân học Tất bệnh nhân Các ca CDI (n = 382) (n = 95) Đặc điểm n % n % Nữ 241 63,1 42 29,8 Giới tính Nam 141 36,9 53 21,9 15 – 24 22 5,76 22,7 25 -34 39 10,2 11 28,2 35 -44 42 11 21,4 45-54 59 15,5 12 20,3 Tuổi 55-64 87 22,8 19 21,8 65-74 66 17,3 21 31,8 75 -84 54 14,1 12 22,2 >=85 13 3,4 46,2 Hà Nội 166 43,5 47 28,3 Nơi Tỉnh khác 211 55,2 48 22,8 11 Bảng 3.11 Mối liên quan đặc điểm nhân học CDI Các ca CDI Đặc điểm ORa P 95% CI n % Giới tính Nữ 42 29,8 1,505 0,089 0,936 – 2,419 Nhóm tuổi >= 85 46,2 2,69 0,071 0,878– 8,286 >= 75 18 26,9 1,1 0,677 0,624 – 2,067 >= 65 39 29,3 1,43 0,142 0,885 - 2,319 >= 55 58 26,4 1,21 0,432 0,752– 1,945 >= 45 70 25,1 1,05 0,869 0,617 – 1,768 >= 35 79 24,6 0,92 0,788 0,491 – 1,715 >= 25 90 25,0 1,13 0,811 0,406 – 3,164 Nơi Hà Nội 47 28,3 1,34 0,22 0,839 – 2,142 Chú thích: tỉ suất chênh OR đƣợc tính so với nhóm bệnh nhân cịn lại theo đặc điểm, theo phân tích đơn biến, 95%CI: khoảng tin cậy 95%, p đƣợc tính theo test thống kê 2 Fisher exact 3.3.3.1 Tỉ lệ CDI theo giới tính Tỉ lệ CDI nhóm nữ giới cao 7,9% so với nhóm nam giới (29,8% so với 21,9%, p = 0,089) (Bảng 3.10) Tỉ lệ CDI nữ giới cao so với nam giới từ 4,6% – 15,2% qua năm Tại bệnh viện, tỉ lệ CDI nhóm nữ giới cao so với nam giới từ 2,8% đến 11,5% Kết phân tích mối liên quan đặc điểm giới tính CDI cho thấy nhóm nữ giới có nguy CDI cao 1,5 lần (95% CI: 0,936 – 2,419) so với nam giới (Bảng 3.11) 3.3.3.2 Tỉ lệ CDI theo tuổi Độ tuổi trung trung bình quần thể nghiên cứu 55,9 tuổi (15 – 93 tuổi) Tỉ lệ CDI cao nhóm tuổi 85 tuổi 46,1%, tiếp đến nhóm tuổi 65-74 tuổi 31,8% thấp nhóm tuổi 44 – 55 tuổi 20,3% (Bảng 3.10) Kết phân tích mối liên quan cho thấy nhóm tuổi 65 tuổi có nguy CDI cao 1,42 lần (95% CI 12 0,885– 2,319) so với nhóm tuổi dƣới 65 tuổi Lịch sử tuổi cao yếu tố nguy cho CDI Tỉ lệ CDI cao ngƣời 65 tuổi đƣợc lặp lại nghiên cứu Kết cung cấp thông tin cho bác sĩ lâm sàng việc xác định nhóm tuổi cần thiết để tiến hành xét nghiệm chẩn đoán nguyên ca bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh viêm đại tràng giả mạc 3.3.3.3 Tỉ lệ CDI theo nơi Kết Bảng 3.10 cho thấy tỉ lệ CDI nhóm bệnh nhân Hà Nội cao 5,6% so với nhóm bệnh nhân tỉnh lẻ (28,3% so với 22,7%, p= 0,242) 3.3.4 Tỉ lệ CDI theo tiền sử sử dụng kháng sinh Bảng 14 Tỉ lệ CDI theo tiền sử sử dụng kháng sinh Đặc điểm Từng loại kháng sinh Carbapenem Cephalosporin Quinolone Macrolid linezoline Metronidazole Vancomy -cin Penicillin Ureidopenicilin Tất bệnh nhân (n=382)b n % Các ca CDI (n = 95) n % ORa P 95% CI 159 46,2 37 23,3 0,875 0,604 0,527–1,451 145 42,2 37 25,5 1,15 0,59 0,696–1,897 136 39,5 34 25,0 1,076 0,775 0,648–1,786 88 25,6 24 27,3 1,274 0,398 0,726–2,234 53 15,4 9,4 0,283 0,0064* 0,107–0,746* 45 13,1 10 22,2 0,885 0,749 0,417–1,876 43 12,5 11,0 12 27,9 1,249 0,544 0,608–2,562 10 26,3 1,135 0,747 0,525–2,451 38 13 Kết hợp kháng sinh Aminogly -coside Clindamy -cin loại loại ≥ loại 31 9,01 11 35,5 1,84 0,122 0,839–4,037 2,3 37,5 1,92 0,372 0,447–8,243 101 138 29,4 40,1 22 33 21,8 23,9 0,98 0,939 0,592–1,625 105 30,5 28 26,7 1,217 0,466 0,717–2,063 a Chú thích: : tỉ suất chênh OR đƣợc tính so với nhóm bệnh nhân thuộc nhóm cịn lại theo đặc điểm, theo phân tích đơn biến; b: Trong tổng số 382 bệnh nhân có 38 bệnh nhân không rõ loại kháng sinh sử dụng; P: đƣợc tính theo test thống kê 2 Fisher exact; *: Có ý nghĩa thống kê p 1) Các kháng sinh cho thấy có tác dụng giảm nguy cho CDI metronidazole, vancomycin carbapenem (có OR