Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.Đánh giá đáp ứng điều trị trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy người lớn theo phân nhóm nguy cơ.
BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - - LẠI THỊ THANH THẢO ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY NGƯỜI LỚN THEO PHÂN NHÓM NGUY CƠ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - - LẠI THỊ THANH THẢO ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY NGƯỜI LỚN THEO PHÂN NHÓM NGUY CƠ NGÀNH: NỘI KHOA MÃ SỐ: 9720107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BS NGUYỄN TRƯỜNG SƠN PGS TS BS PHAN THỊ XINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết trình bày luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Tác giả luận án LẠI THỊ THANH THẢO MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC SƠ ĐỒ viii ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa bạch cầu cấp dòng tủy .4 1.2 Các yếu tố nguy bạch cầu cấp dòng tủy 1.3 Sinh lý bệnh bạch cầu cấp dòng tủy .5 1.4 Đặc điểm bất thường nhiễm sắc thể đột biến gen bạch cầu cấp dòng tủy 1.5 Đặc điểm lâm sàng bạch cầu cấp dòng tủy 15 1.6 Đặc điểm cận lâm sàng bạch cầu cấp dòng tủy 17 1.7 Chẩn đốn bạch cầu cấp dịng tủy 18 1.8 Tiên lượng bạch cầu cấp dòng tủy .21 1.9 Điều trị bạch cầu cấp dòng tủy 22 1.10 Tình hình nghiên cứu giới nước 28 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thiết kế nghiên cứu 33 2.2 Đối tượng nghiên cứu .33 2.3 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 33 2.4 Cỡ mẫu nghiên cứu 33 2.5 Xác định biến số, số độc lập phụ thuộc 35 2.6 Phương pháp công cụ đo lường, thu thập số liệu 42 2.7 Quy trình nghiên cứu 43 2.8 Phương pháp phân tích liệu 48 2.9 Đạo đức nghiên cứu 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Đặc điểm lâm sàng, sinh học phân nhóm nguy theo ELN 2017 51 3.2 Đánh giá đáp ứng điều trị sau hóa trị cơng, hồn tất hóa trị tăng cường, ghép tế bào gốc, sau điều trị năm, năm năm theo phân nhóm nguy .59 3.3 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng – sinh học, đặc điểm liên quan điều trị xác suất sống cịn theo phân nhóm nguy 71 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 82 4.1 Đặc điểm lâm sàng, sinh học phân nhóm nguy theo ELN 2017 82 4.2 Đánh giá đáp ứng điều trị sau hóa trị cơng, hồn tất hóa trị tăng cường, ghép tế bào gốc, thời điểm sau điều trị năm, năm năm theo phân nhóm nguy 91 4.3 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng – sinh học, đặc điểm liên quan điều trị xác suất sống cịn theo phân nhóm nguy 103 KẾT LUẬN 114 KIẾN NGHỊ 116 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU PHỤ LỤC 2: PHIẾU CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO DỨC PHỤ LỤC 3: BẢNG THÔNG TIN CHO NGƯỜI THAM GIA NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 4: PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ, KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG VÀ ĐỘT BIẾN GEN PHỤ LỤC 5: ĐỘC TÍNH HĨA TRỊ LIỆU THEO CTCAE PHỤ LỤC 6: DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH-VIỆT TÊN VIẾT TẮT TÊN TIẾNG ANH ALT Alanine transaminase AML Acute myeloid leukemia AST Aspartate transaminase ASXL1 Additional sex combs-like TÊN TIẾNG VIỆT Bạch cầu cấp dòng tủy BCCDT Bạch cầu cấp dòng tủy BN Bệnh nhân CBF Core binding factor CD Cluster of differentiation CEBPA CCAAT-enhancer binding protein A CMV Cytomegalovirus CR Complete remission Cs Yếu tố gắn lõi Lui bệnh hoàn toàn Cộng CTCAE Common Terminology Criteria for Adverse Events Tiêu chuẩn thuật ngữ phổ biến cho biến cố có hại DFS Disease-free survival Thời gian sống không bệnh ĐBG Đột biến gen EBMT The European Society for Blood and Marrow Transplantation Hiệp hội ghép tủy máu Châu Âu ECOG Eastern Cooperative Oncology Group Nhóm hợp tác ung thư phía Đơng EFS Event free survival Thời gian sống không biến cố ELN European Leukemia Net Mạng lưới bệnh bạch cầu Châu Âu FAB French – American – British Pháp – Mỹ – Anh FISH Fluorescent in situ hybridization Lai chỗ phát huỳnh quang FLT3 Fms-like tyrosine kinase GVHD Graft versus host disease Bệnh mảnh ghép chống kí chủ ii TÊN VIẾT TẮT TÊN TIẾNG ANH TÊN TIẾNG VIỆT HiDAC High Dose Cytarabine Hóa trị cytarabin liều cao HLA Human leucocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người HSCT Hemotopoietic stem cell transplantation Ghép tế bào gốc tạo máu ITDs Internal tandem duplications LAIPS Leukemic-associated immunophenotypes Kiểu hình miễn dịch liên quan bệnh bạch cầu Lui bệnh hoàn toàn LBHT MRD Minimal residual disease Bệnh tồn lưu tối thiểu NCCN National Comprehensive Cancer Network Mạng lưới đồng thuận ung thư quốc gia Hoa Kỳ NPM1 Nucleophosmin NST Nhiễm sắc thể OS Overall survival Thời gian sống toàn RFS Relapse-free survival Thời gian sống không tái phát RT-PCR Reverse transcription quantitative real-time PCR Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược định lượng RUNX1 Runt-related transcription factor TB ± ĐLC Trung bình ± Độ lệch chuẩn TBG Tế bào gốc TKD Tyrosine kinase domain TP53 Tumor protein 53 Trung vị (Khoảng tứ phân vị) TV (KTPV) WHO World Health Organization Tổ chức y tế giới iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Dấu ấn miễn dịch phân loại bạch cầu cấp dòng tủy theo FAB 18 Bảng 1.2 Phân loại BCCDT theo FAB dựa hình thái học 19 Bảng 1.3 Phân nhóm nguy BCCDT theo NCCN 22 Bảng 2.1 Tỉ lệ lui bệnh hồn tồn sau hóa trị cơng theo phân nhóm nguy (ELN 2017) nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Đặc điểm lâm sàng lúc nhập viện .35 Bảng 2.3 Đặc điểm cận lâm sàng lúc nhập viện 36 Bảng 2.4 Phương pháp điều trị 38 Bảng 2.5 Đánh giá đáp ứng điều trị sau điều trị công theo International Working Group 39 Bảng 2.6 Các đặc điểm liên quan hóa trị độc tính hóa trị cơng 40 Bảng 2.7 Các số liên quan kết cục BN theo International Working Group 41 Bảng 2.8 Phân nhóm nguy theo ELN 2017 45 Bảng 2.9 Phác đồ điều trị BCCDT người lớn bệnh viện Truyền máu Huyết học 46 Bảng 2.10 Phác đồ điều trị BCCDT người lớn bệnh viện Chợ Rẫy .47 Bảng 3.1 Đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng bệnh đồng mắc .51 Bảng 3.2 Đặc điểm huyết đồ thời điểm chẩn đoán bệnh 52 Bảng 3.3 Phân nhóm FAB đặc điểm sinh học thời điểm chẩn đoán bệnh 53 Bảng 3.4 Phân nhóm nguy dựa vào bất thường NST .54 Bảng 3.5 Các bất thường NST kèm t(8;21) .55 Bảng 3.6 Các bất thường NST kèm inv(16) 55 Bảng 3.7 Các bất thường NST phức tạp 56 iv Bảng 3.8 Đặc điểm đột biến gen 57 Bảng 3.9 Phân nhóm nguy theo ELN 2017 58 Bảng 3.10 Đặc điểm giai đoạn hóa trị cơng 61 Bảng 3.11 Mức độ đáp ứng sau hóa trị cơng cộng dồn đợt hóa trị cơng 62 Bảng 3.12 Biến chứng liên quan đến hóa trị cơng 63 Bảng 3.13 Đặc điểm vi khuẩn, vi nấm sử dụng kháng sinh, kháng nấm 64 Bảng 3.14 Đặc điểm trình ghép TBG 65 Bảng 3.15 Mức độ đáp ứng điều trị sau hồn tất hóa trị tăng cường, ghép TBG sau năm, năm năm điều trị 66 Bảng 3.16 Đặc điểm tái phát bệnh .67 Bảng 3.17 Thời điểm tử vong 68 Bảng 3.18 Mối liên quan mức độ đáp ứng điều trị theo phân nhóm nguy dựa vào bất thường NST 69 Bảng 3.19 Mối liên quan mức độ đáp ứng điều trị theo phân nhóm nguy (ELN 2017) .69 Bảng 3.20 Mối liên quan biến cố tái phát theo phân nhóm nguy (ELN 2017) 70 Bảng 3.21 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng – sinh học theo phân nhóm nguy (ELN 2017) 71 Bảng 3.22 Mối liên quan đặc điểm liên quan điều trị theo phân nhóm nguy (ELN 2017) 72 Bảng 3.23 Thời gian sống .73 Bảng 3.24 Mối liên quan xác suất sống theo phân nhóm nguy dựa vào bất thường NST 74 v Bảng 3.25 Mơ hình hồi quy logistic LBHT sau hóa trị cơng với yếu tố 78 Bảng 3.26 Mơ hình hồi quy Cox yếu tố ảnh hưởng lên RFS 79 Bảng 3.27 Mơ hình hồi quy Cox yếu tố ảnh hưởng lên EFS 80 Bảng 3.28 Mô hình hồi quy Cox yếu tố ảnh hưởng lên OS 81 Bảng 4.1 Tỉ lệ BN theo phân nhóm nguy (ELN 2017) nghiên cứu 89 Bảng 4.2 Đặc điểm BN ghép TBG nghiên cứu 97 Bảng 4.3 OS năm theo phân nhóm nguy (ELN 2017) nghiên cứu 108 bạch cầu cấp dịng tủy chẩn đốn sau chẩn đốn bệnh, theo dõi hiệu điều trị cách chuẩn - Họ tên người cần liên hệ: Lại Thị Thanh Thảo - Số điện thoại: 0919197263 - Nghiên cứu thực tinh thần tự nguyện tham gia, người tham gia nghiên cứu người đại diện hợp pháp người tham gia nghiên cứu quyền rút khỏi nghiên cứu - Trong trường hợp người vị thành niên, việc lấy chấp thuận tham gia từ người đại diện hợp pháp Họ tên người đại diện hợp pháp: Và số điện thoại: - Thông tin hồ sơ bệnh án bệnh nhân bảo mật người làm nghiên cứu không sử dụng cho mục đích khác II CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU Tôi đọc hiểu thơng tin đây, có hội xem xét đặt câu hỏi thông tin liên quan đến nội dung nghiên cứu Tôi nói chuyện trực tiếp với nghiên cứu viên trả lời thỏa đáng tất câu hỏi Tôi chấp thuận tham gia nghiên cứu Chữ ký người tham gia: Họ tên: Chữ ký _ Ngày tháng năm _ Chữ ký người đại diện hợp pháp (đối với người tham gia từ 16 đến 18 tuổi): Họ tên: Ngày tháng năm _ Chữ ký _ Chữ ký Nghiên cứu viên/ Người lấy chấp thuận: Tôi, người ký tên đây, xác nhận bệnh nhân/người tình nguyện tham gia nghiên cứu ký chấp thuận đọc tồn thơng tin đây, thông tin giải thích cặn kẽ cho Ơng/Bà Ơng/Bà hiểu rõ chất, nguy lợi ích việc Ông/Bà tham gia vào nghiên cứu Họ tên: _ Ngày tháng năm _ Chữ ký _ PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ, KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG VÀ ĐỘT BIẾN GEN Vật liệu xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ đột biến gen Bảng Vật liệu xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ đột biến gen 11 Dụng cụ Falcon 15 Ml Falcon 50 mL Coplin Jar Eppendorf 1,5 mL Micropipet - 10 µL Micropipet 10 - 100 µL Micropipet 20 - 200 µL Micropipet 100 - 1000 µL Lam mài Lamen 22 x 22 mm Kẹp 12 Hộp nhựa 12 13 Giấy bạc 13 14 Buồng đếm Nerbauer 14 Máy in 14 15 Pipette tự động 15 Tủ lạnh 4oC 15 16 17 Đĩa 96 giếng Pipette nhựa 16 Tủ âm sâu -30oC 16 17 18 Đầu bóp cao su 18 19 Giá đựng ống nghiệm Bình xịt tia 19 10 20 Hóa chất KCl HCl 1N NaOH 1N Thiết bị Bể ổn nhiệt Máy li tâm Tủ ủ 37oC Máy khuấy từ KH2PO4 Máy đo pH NaCl Máy lai Thermo Na3C6H5O7.2H2O Buồng thao tác vô trùng Acid acetic Kính hiển vi ngược Methanol Kính hiển vi quang học Cồn 70% 10 Cân điện tử 10 Nước cất 11 Tủ sấy lam Hệ thống kính hiển vi BX51 Máy vi tính có phần mềm phân tích NST Ikaros phần mềm phân tích FISH Isis MetaSystem 11 Trypsin 2,5% 12 Giemsa 13 Democolcine solution Tupe Heparin 300UI Dầu soi kính hiển vi DAPPI PPD Môi trường Marrow Max NP40 21 22 23 Khăn mềm Gạc Hộp đựng lam Nhiễm sắc thể đồ Nhiễm sắc thể đồ (NST) đồ ghi lại hình dáng toàn NST tế bào Phương pháp sử dụng hóa chất colchicine (Demecolchin) làm ngừng trình phân bào giai đoạn metaphase, thời điểm mà NST cuộn xoắn cực đại, nhờ xác định số lượng, hình dạng cấu trúc NST Do đó, Kỹ thuật giúp phát bất thường số lượng NST, cấu trúc, bất thường phức tạp Có nhiều phương pháp nhuộm băng băng G, băng Q, băng C, băng R…Trong nhuộm băng G sử dụng rộng rãi để đánh giá bất thường số lượng cấu trúc NST Các bước thực bao gồm: Quy trình lấy mẫu ni cấy tế bào Ngun tắc: tế bào ni cấy kích thích phân chia sau 24 – 48 mẫu tủy xương Ở cuối kỳ đầu kỳ nguyên phân, NST co xoắn cực đại tập trung thoi vơ sắc Làm ngừng q trình phân chia để thu hoạch NST Cách lấy mẫu: - mL tủy xương máu ngoại biên (nếu tỉ lệ tương bào diện máu ≥ 10%) lấy tube chống đông Heparin 300 UI chuyển đến phòng xét nghiệm vòng Chuẩn bị mơi trường: MarrowMAXTM có L-Glutamine Gentamicine Sulfate, chia vào falcon 15 mL đưa 37°C trước cấy Đếm số tế bào có nhân mL mẫu buồng đếm Neubauer Pha loãng 10 µL mẫu với 90 µL PBS , hút 10 µL dịch pha loãng trộn với 90 µL Turk, hút 10 µL cho vào buồng đếm tế bào, đếm tế bào có nhân Nếu gọi M tổng số tế bào đếm lớn góc buồng đếm, số tế bào mL mẫu tính theo cơng thức: Cấy tế bào: Mỗi falcon cấy tích mL bao gồm mơi trường thể tích mẫu V (được suy từ số tế bào N) Falcon cấy ủ tủ 37°C, 5% CO2 24 – 48 Quy trình thu hoạch tế bào Nguyên tắc: Sử dụng democolcine gây ức chế hình thành thoi vơ sắc, làm cho tế bào phân chia dừng lại kì nguyên phân để thu nhận NST Dùng KCl 0,075 M sốc nhược trương để làm trương phồng phá vỡ tế bào, NST phân tán không xếp chồng lên Sơ đồ 4.1 Quy trình thu hoạch tế bào (thu nhận NST) Quy trình nhuộm băng G Nguyên tắc: Enzyme trypsine thủy phân số protein NST, làm nới lỏng cấu trúc NST, cho phép Giemsa liên kết và bắt màu với DNA, tạo vùng băng sáng tối khác đặc trưng cho NST Các băng nhạt thể vùng giàu chất nhiễm sắc G-C, băng sẫm thể vùng tập trung chất dị nhiễm sắc A-T Trước nhuộm, tiêu sau cần làm già 56°C vịng giờ, sau xử lý cốc với thời gian thích hợp: Cốc 1: Nhúng tiêu mL dung dịch trypsin 0,1% (tỉ lệ dung dịch trypsin 2,5%/dung dịch đệm phosphate pH 6,8 = 1:24) khoảng phút 10 giây – đến phút 20 giây Cốc 2: chuyển tiêu qua cốc chứa mL dung dịch đệm phosphate pH 6,8 lạnh, lắc khoảng 20 giây Cốc 3: chuyển tiêu qua cốc chứa mL dung dịch đệm phosphate pH 6,8 lạnh, lắc khoảng 20 giây Cốc 4: ngâm tiêu mL dung dịch Giemsa 10% (tỉ lệ dung dịch Giemsa/dung dịch đệm phosphate pH 6,4 = 1:9) phút Rửa tiêu vòi nước Để khơ tiêu Phân tích NST Tiêu nhuộm băng G quan sát kính hiển vi quang học, tìm tế bào kì có NST dàn ghi nhận lại tọa độ Trung bình mẫu phân tích 20 cụm NST Phát phân tích rối loạn cấu trúc NST đếm số lượng NST Lập karyotype: chụp ảnh, phóng ảnh, cắt rời NST, sau xếp cặp NST kính hiển vi quang điện tử BX51 có kết nối với hệ thống camera, thu nhận hình ảnh qua phần mềm phân tích NST (phần mềm Ikaros - MetaSystems, Đức) Mô tả kết NST BN quy ước danh pháp di truyền học quốc tế ISCN 2009 Kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang Kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) xét nghiệm nhằm phát có mặt trình tự DNA đặc hiệu NST cách sử dụng đoạn dị (probes) gắn huỳnh quang có trình tự bổ sung với đoạn DNA đặc hiệu cần phát Các tín hiệu huỳnh quang phát kính hiển vi tồn đoạn DNA đặc hiệu Kỹ thuật tiến hành theo bước sau: Sơ đồ 4.2 Quy trình kỹ thuật FISH Cách lấy mẫu Lấy - mL tủy xương tube chống đông Heparin 300 UI chuyển đến phòng xét nghiệm vòng Quy trình thu hoạch tế bào Nguyên tắc: dùng sốc nhược trương dung dịch KCl 0,075 M cho nước vào tế bào, làm tế bào căng phồng lên Sau tế bào cố định dung dịch Carnoy (Methanol:Acid acetic với tỉ lệ 3:1), rửa nhỏ tiêu Sơ đồ 4.3 Quy trình thu hoạch tế bào (kỹ thuật FISH) Lai hóa với đoạn dò đặc hiệu Đánh dấu vùng tế bào cần lai lam Các probe sử dụng lai hóa: Cytocell EVI1 breakapart, Cytocell del(5q) deletion, Cytocell del(7q) deletion, Cytocell AML1/ETO translocation, dual fusion, Cytocell CBFB/MYH11 translocation, dual fusion, Cytocell MLL breakapart Vortex nhanh spindown dung dịch Nhỏ µL dung dịch probe lên vùng đánh dấu lam Phủ lamen kích thước x mm vào vùng vừa nhỏ dung dịch probe, dán keo xung quanh lamen Đặt tiêu vào máy Thermo Brite biến tính cài nhiệt độ 77°C phút Chuyển tiêu vào hộp làm ẩm tủ ủ 37°C từ 19 – 20 tiếng đồng hồ để lai hóa Rửa sau lai hóa: Chuẩn bị dung dịch rửa probe: • Corplin jar chứa dung dịch 0,4 x SSC/0,3% NP ~ 40 đặt bể ổn nhiệt 75°C 60 phút • Corplin jar chứa dung dịch x SSC/0,1% NP ~ 40 đặt nhiệt độ phịng • Corplin jar chứa dung dịch x SSC để nhiệt độ phịng Tiến hành rửa: • Lấy tiêu sau ủ, gỡ bỏ keo lamen kẹp, cho vào corplin jar rửa phút, lắc nhẹ tiêu • Chuyển qua corplin jar rửa phút, lắc nhẹ tiêu • Để khơ tiêu bản, sau nhỏ 10 µL dung dịch DAPI 125 ng/ml lên vùng tiêu đánh dấu, để phút • Chuyển qua corplin jar rửa nhanh giây • Để khơ tiêu bản, tiếp tục nhỏ 10 µL dung dịch PPD lên vùng tiêu đánh dấu • Đậy lamen 22 x 22 mm lên vùng tiêu có PPD • Giữ tiêu hộp tránh sang tuyệt đối -20°C 45 - 60 phút trước phân tích kết Phân tích kết Quan sát phân tích bằng hệ thống kính hiển vi BX51, máy vi tính phần mềm phân tích Isis, MetaSystem RT-PCR tổ hợp gen giải trình tự gen phương pháp Sanger Ly trích RNA, tổng hợp cDNA Mẫu tủy xương máu ngoại biên lấy chống đông EDTA Thực tách chiết RNA Invitrap Spin Universal RNA Mini Kit (Stractec, Đức) theo bước sau Mẫu thực buồng ly trích xử lý loại bỏ hồng cầu dung dịch red cell lysis bufer Đếm tế bào bạch cầu buồng đếm Neubeur sau lấy lượng tế bào khoảng × 107 cho ly trích RNA Cho 900 µl Lysis Solution TR vào tube chứa cặn tế bào dùng để ly trích RNA, trộn pipette, ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm 11000 vòng, phút, nhiệt độ phòng Hút dịch cho vào tube ml (khoảng 650 µl) thêm Ethanol 96100% theo tỉ lệ 1:1, trộn pipette Chuẩn bị cột spin lọc cung cấp từ kit, hút 800 µl hỗn hợp dung dịch vào spin lọc Ly tâm 11000 vòng, phút, nhiệt độ phòng Đổ bỏ dịch, ly tâm 11000 vòng, phút, nhiệt độ phòng Chuyển spin lọc qua tube ml mới, thêm 600 µl dung dịch Wash Buffer R1 Ly tâm 9300 vòng, 30 giây, nhiệt độ phòng Chuyển Spin lọc qua tube ml mới, thêm 600 µl dung dịch Wash Buffer R2 Ly tâm 11000 vòng, phút, nhiệt độ phòng Đổ bỏ dịch dưới, ly tâm 11000 vòng, phút, nhiệt độ phòng Chuyển spin lọc vào tube 1,5 ml (tube dùng lưu trữ RNA) Thêm 30 µl Elution Buffer R giữ nhiệt độ phòng 20 phút Ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm 11000 vòng, phút, nhiệt độ phòng Bỏ spin lọc, thu RNA Tiến hành tổng hợp cDNA lưu trữ -80°C Thực pha mix phản ứng vào tube 0,2 ml đặt khay đá thành phần sau theo hướng dẫn nhà sản xuất PrimeScript RT Master Mix kit: µL Rnase Free dH2O, µL 5X PrimeScript RT Master Mix µL RNA Dung dịch ủ máy luân nhiệt ABI 2720 theo chu trình luân nhiệt sau: 37°C 15 phút, 85°C giây, trì 4°C lấy khỏi máy cDNA lưu trữ -20°C đến sử dụng Ly trích DNA Tách chiết DNA từ máu ngoại biên ReliaPrepTM Blood gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ) Sản phẩm DNA sau ly trích kiểm tra nồng độ độ tinh máy đo quang phổ hai bước sóng 260 nm 280 nm Chỉnh nhiệt độ máy ủ ổn định 56oC Trộn mẫu máu tủy cách vortex nhẹ 10 giây Cho vào ống nghiệm 1,5 ml chất sau: 20 µl Proteinase K, 200 µl mẫu máu tủy, 200 µl Cell Lysis Buffer Trộn máy vortex 10 giây Spin nhẹ máy spindown để kéo toàn dịch thành ống nghiệm xuống Ủ 10 phút 56oC Chuẩn bị cột lọc ReliaPrepTM binding column Collection tube Thêm 250 µl Binding Buffer vào ống nghiệm 1,5 ml chứa mẫu, Proteinase K Cell Lysis Buffer Trộn máy vortex 10 giây, spin nhẹ máy spindown Chuyển toàn hỗn hợp mẫu vào cột lọc chuẩn bị ly tâm tube có cột lọc 14200 rpm/phút phút Ly tâm tube có cột lọc thêm phút 14200 rpm/phút để chắn loại bỏ hết dịch phía màng Chuyển cột lọc qua Collection tube mới, thêm 500 µl Column Wash Solution ly tâm 14200 rpm/phút phút, lặp lại bước thêm lần Chuyển cột lọc vào ống nghiệm 1,5 ml (có ghi mã số, tên BN, loại mẫu ngày thực hiện) Cho 100µl Nuclease-Free Water vào cột ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm phút 14200 rpm/phút để thu DNA Mẫu DNA lại lưu trữ -180C đến -22oC năm Phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu Mỗi tube PCR tích 25 l chứa thành phần: PCR buffer, dNTP (250 M cho loại), mồi xuôi ngược (0,5 M cho loại), 1,25 U TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) cDNA/DNA, bổ sung betain theo nồng độ 1M cho phản ứng khuếch đại đoạn gen RUNX1 Tiến hành chạy phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế chuyên biệt cho gen Chu kỳ luân nhiệt máy Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Life Technologies, Hoa Kỳ) bao gồm 980C phút; theo sau 40 chu kỳ 980C 10 giây, nhiệt độ bắt cặp mồi 30 giây 720C phút kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 72oC phút, trì 4oC Sản phẩm PCR sau phát điện di thạch agarose Kiểm tra sản phẩm PCR tinh sản phẩm Điện di sản phẩm PCR thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide quan sát hệ thống chụp ảnh Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Kích thước khuếch đại gen mục tiêu tương ứng theo cặp mồi thiết kế Sản phẩm PCR sau tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất PCR giải trình tự (Cycle Sequencing) Sản phẩm PCR tinh thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi ngược (sử dụng mồi PCR) Sản phẩm sau kết tủa ethanol, hòa tan Hi-Di formanide, biến tính 95C trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết giải trình tự phân tích phần mềm SeqScape, so sánh với trình tự chuẩn gen mục tiêu GenBank để xác định NST Dữ liệu giải trình tự thơ sau phân tích phần mềm SeqScape tiến hành tổng hợp số liệu PHỤ LỤC ĐỘC TÍNH HỐ TRỊ LIỆU THEO CTCAE Bất thường Giảm neutrophil (G/L) Huyết Giảm tiểu cầu học (G/L) Thiếu máu [Hb (g/dl)] Độ Độ Độ Độ Độ GHD – 1,5 – < 1,5 0,5 – < < 0,5 - GHD - 75 50 - < 75 25 - < 50 < 25 - < 10 - 10 0,3 mg/dl hay tăng từ 1,5 - lần so với mức Giảm thèm ăn khơng thay đổi đến thói quen ăn uống Bạch cầu hạt < G/L kèm Đe dọa nhiệt độ tính lần > mạng; có 38,3ºC định hay nhiệt can thiệp độ kéo dài khẩn cấp ≥ 38ºC >3– >5– > 20 x GHT x GHT 20 x GHT Tăng > lần mức Đe dọa Tăng - hay > tính lần mức mg/dl, mạng, lọc định máu nhập viện Cung cấp Giảm ăn lượng hay đường nước miệng khơng miệng kèm giảm khơng cân thích hợp; nghiêm ăn đường trọng, suy ống; dinh dinh dưỡng dưỡng ngồi hay ruột; hay nước có định nhập viện Tử vong - Tử vong - Bất thường Lt miệng Rụng tóc Đợ Đợ Đau vừa phải lt mà khơng Khơng có ảnh triệu hưởng chứng đến lượng nhẹ thực triệu phẩm ăn chứng; vào không cần đường can thiệp miệng, nên điều chỉnh chế độ ăn uống Rụng tóc Rụng tóc ≥ 50% < 50% bình bình thường, thường, cần tóc khơng cần giả tóc giả ngụy trang Đợ Đợ Đau nặng loét làm ảnh hưởng đến lượng thực phẩm ăn vào đường miệng Đe dọa tính mạng; có định can thiệp khẩn cấp Đợ